suite - SFEAP

SOCIÉTÉ FRANÇAISE D'ÉLECTROPHORÈSE &
D'ANALYSE PROTÉOMIQUE
n°40, Décembre 2005
Association loi 1901.
Membre du Conseil International des
Sociétés d'électrophorèse (ICES).
Siège Social :
http://sfeap.free.fr
ESPCI, LECA
10 rue Vauquelin
75005 PARIS.
Responsable de la publication : Hubert Hondermarck ; Rédacteur en chef : F.Xavier Desvaux
Rédacteur adjoint : Michel Perrot
Éditorial
Deux mois et demi déjà depuis le symposium de Montpellier, qui a été une réussite totale. Les organisateurs ont
réussi le tour de force de réunir des scientifiques d’horizons parfois très différents, en gardant une homogénéité
remarquable. Un grand merci à eux! Ils ont ouvert la voie de futurs symposiums, qui seront sans nul doute tout aussi
intéressants. L’essentiel de ce numéro sera consacré au compte rendu de ce congrès, et de celui de Munich (4e Congrès international HUPO) rédigé par les lauréats des bourses attribuées par la SFEAP.
Cette année a vu aussi un changement du Conseil d’administration de notre société, conformément à ses statuts.
Réservez dès aujourd’hui sur vos agendas les
dates du prochain congrès à Saint Malo, la cité
corsaire, qui se tiendra du 16 au 18 octobre
prochain.
Et puisque c’est la saison, je profite de l’occasion
pour vous souhaiter de très joyeuses fêtes, et une très
bonne et heureuse année 2006.
F.Xavier Desvaux
Sommaire
Montpellier, l'aqueduc Saint Clément (Photo D.Godfrin)
Le mot du nouveau Président .................................................................................................................
Le nouveau Conseil d'Administration ....................................................................................................
Le Club Jeune de la SFEAP.......................................................................................................................
Compte-rendu de la 1ère journée thématique du Club Jeune............................................................
Le Symposium de Montpellier...................................................................................................................
Compte-rendu du Symposium de Montpellier......................................................................................
Compte rendu du congrès HUPO (Munich, 2005) ................................................................................
Nos partenaires...........................................................................................................................................
Pour les prochaines manifestations, reportez vous au site http://sfeap.free.fr
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Le mot du président
L'intérêt pour l'analyse du protéome et la protéomique est actuellement en pleine
expansion et cette vague de fond traverse tous les domaines des sciences biologiques
tant aux niveaux académique qu'industriel. Dans ce contexte, une société savante
comme la nôtre a un rôle important à jouer comme instrument d'information, de rassemblement et d'aide.
Information. Il y a tout d'abord une réelle demande d'information sur les projets
en cours et l'évolution des méthodologies attenantes. Pour répondre à cette attente, la
SFEAP organise deux journées scientifiques chaque année (l'une en Février, l'autre en
Juin). L'année passée, les thématiques retenues étaient "Protéines membranaires" et
"Applications biomédicales de la protéomique". Pour 2006 nous organiserons une
journée sur "Les problèmes analytiques en spectrométrie de masse et protéomique" le 9
Mars. Pour la seconde, à ce stade, les suggestions sont les bienvenues. De plus, la lettre
de la SFEAP (merci à Xavier Desvaux !) ainsi que notre site Web http://sfeap.free.fr
(merci à Michel Perrot !) sont également des moyens d'information très utiles.
Rassemblement. L'organisation d'un congrès, chaque année, permet de rassembler les adhérents et d' échanger les expériences, difficultés, réussites et projets de
chacun. En 2006, le congrès organisé dans le cadre de la SFCBA a Montpellier a clairement été un grand succès. En 2007, notre congrès annuel sera organisé à St-Malo du
16 au 18 Octobre par Charles Pineau. Enfin, on peut souligner que le "Club jeunes" de la
SFEAP, qui a été créé l'an dernier, rencontre un vif succès (merci à Clémence Belleannée) et ce dynamisme de notre "sang neuf" est clairement de très bon augure pour
l'avenir de notre société.
Aide. Outre l'aide qu'apporte la SFEAP en diffusant l'information et en organisant des congrès et journées scientifiques, le forum d'échange email
"[email protected]" permet à chacun de s'adresser à l'ensemble des membres
de la communauté pour des questions spécifiques. De plus, il faut rappeler que les
adresses électroniques des membres du CA sont sur le site Web de la SFEAP et que chacun
de nous sera heureux de répondre aux questions et interrogations. Le rôle d'une société
comme la nôtre peut également être de participer à la mise en place de programmes
nationaux et internationaux et de représenter en quelque sorte la communauté protéomique Française. Notre Société participe ainsi aux réflexions en cours au sein du
réseau national des génopoles, de HUPO (notre correspondant vis à vis de cette organisation est Pierre Legrain) ou de EuPA (Société européenne de protéomique- correspondant Thierry Rabilloud) et cet aspect de l'activité de notre Société- notamment sur le
plan international- devrait être amené à s'intensifier dans les années à venir ne
serait-ce que par la multiplication des programmes et initiatives liés à la protéomique.
Enfin, en terme d'aide, la Société continuera à attribuer des bourses pour participer
aux congrès nationaux et internationaux ; cette action s'amplifiera même puisque lors
de sa réunion de Montpellier le CA a décidé d'augmenter le nombre de bourses. Je vous
informerai dans un prochain mail du nombre et de la nature des bourses qui seront
proposées en 2006.
Il me reste à rappeler que notre Société ne peut fonctionner que grâce à et par ses
adhérents et leur implication. Propositions, idées ou suggestions visant à maintenir un
esprit et un fonctionnement novateurs et nécessaires à la constante adaptation de
notre Société sont donc les bienvenus.
Hubert Hondermarck
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Le nouveau Conseil d’Administration
Hubert HONDERMARCK , président
ERI-8 INSERM, UPRES-EA 1033, bâtiment SN3
Université des Sciences et Technologies de Lille
59655 Villeneuve d'Ascq
Tel : (+33) (0)3 20 43 40 97 ; Fax : (+33) (0)3 20 43 40 38
Bernard MONSARRAT , vice-président
IPBS, Centre national de la recherche scientifique
205 Route de Narbonne,
31077 Toulouse Cedex 4
Tel : (+33) (0)5 61 17 59 00 ; Fax : (+33) (0)5 61 17 59 93
Marc BONNEU, trésorier
1 rue Camille Saint Saëns,
33077 Bordeaux Cedex
Tel : (+33) (0)5 56 99 90 18 ; Fax : (+33) (0)5 56 99 90 68
Jean-Jacques DIAZ, secrétaire
Laboratoire de Biologie Moléculaire et Endocrinologie,
INSERM U369
Faculté de Médecine Lyon-Laennec, Rue Guillaume
Paradin,
69372 Lyon Cedex 08
Tel : (+33) (0)4 78 77 87 17
Stéphanie DESCROIX, secrétaire adjoint
ESPCI, LECA, Allergie & Environnement
10 rue Vauquelin, 75005 Paris
Tel : (+33) (0)1 40 79 46 44 ; Fax : (+33) (0)1 40 79 46 54
Clémence BELLEANNEE (présidente du CJSFEAP)
UMR INRA-CNRS 6175,
37380 Nouzilly
Tel : (+33) (0)2 47 42 79 49 ; Fax : (+33) (0)2 47 42 77 43
Christine BRUN
Laboratoire de Génétique et Physiologie du Développement
UMR6545 CNRS, Case 907
Parc Scientifique et Technologique de Luminy
13288 MARSEILLE, Cedex 09
Tel : (+33) (0)4 91 26 93 22 ; Fax : (+33) (0)4 91 82 06 82
Jérôme GARIN
ERM 0201 CEA Grenoble
17, rue des martyrs
38054 Grenoble
Tel : (+33) (0)4 38 78 96 56 ; Fax : (+33) (0)4 38 78 98 08
Alain JACQUIER
Unité de Génétique des Interactions Macromoléculaires, URA 2171-CNRS
Département des Biotechnologies, Institut Pasteur, 28,
rue du Dr. Roux
75724 Paris Cedex 15
Tel : (+33) (0)1-4061 3205 ; Fax : (+33) (0)1-4568 8790
Dominique JOB
UMR CNRS 2847/BayerCropSciences
14-20, rue Pierre Baizet
69009 Lyon
Tel : (+33) (0)4 72 85 21 79 ; Fax : (+33) (0)4 72 85 22 97
Jean LABARRE
Laboratoire de physiogénomique, Service de Biochimie et Génétique Moléculaire
DBJC/DSV Centre de Saclay
91191 Gif sur Yvette Cedex
Tel : (+33) (0)1 69 08 22 31 ; Fax : (+33) (0)1 69 08 47 12
Pierre LEGRAIN
Département de Biologie Joliot Curie
CEA Saclay
91191 Gif-sur-Yvette
Tel : (+33) (0)1 69 08 40 35 ; Fax : (+33) (0)1 69 08 43 89
Thierry RABILLOUD
DRDC/ICH INSERM U548 CEA Grenoble
17, rue des martyrs
38054 Grenoble
Tel : (+33) (0)4 38 78 32 12 ; Fax : (+33) (0)4 38 78 98 03
Jean-Louis ROCCA
Université Claude Bernard (Lyon I), bat. 308
43 Bvd du 11 Novembre 1918
69622 Villeurbanne Cedex
Tel : (+33) (0)4 72 44 82 17 ; Fax : (+33) (0)4 72 43 10 78
Véronique SANTONI
INRA / ENSA-M
Biochimie & Physiologie Moléculaire des Plantes,
34060 Montpellier Cedex 1
Tel : (+33) (0)4 99 61 20 20 ; Fax : (+33) (0)4 67 52 57 37
Bertrand SERAPHIN
CGM-CNRS
Avenue de la Terrasse
91198 Gif sur Yvette Cedex
Tel : (+33) (0)1 69 82 38 84 ; Fax : (+33) (0)1 69 82 38 77
Alain VAN DORSSELAER
Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique
ECPM, 25, Rue Becquerel, 67087 Strasbourg Cedex 2
Tel : (+33) (0)3 90 24 27 82 ; Fax : (+33) (0)3 90 24 27 81
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Club-Jeunes
Le Club Jeunes de la SFEAP a fêté son 1er anniversaire en septembre dernier. Ce club en plein
essor a pour objectif de créer un réseau de
relations entre les jeunes protéomistes pour qu’ils
puissent échanger leur expérience, leurs problèmes et leurs solutions à des difficultés rencontrées en protéomique. Tous les étudiants (Master,
thèse), post doctorants, jeunes chercheurs et
jeunes recrutés de moins de 35 ans membres de la
SFEAP peuvent adhérer à ce club et participer aux
diverses rencontres organisées dans l’année.
Le 16 juin 2005, une première journée thématique a été organisée à Lyon sur « La mise en
évidence de modifications post-traductionnelles
par l’utilisation de l’électrophorèse 2D ». Les 55
membres du CJSFEAP qui étaient présents ont pu
assister à des présentations de spécialistes qui ont
suscité l’engouement de tous.
Une rencontre conjointe entre le Club Jeunes de
la SFSM et le Club Jeunes de la SFEAP a également
été organisée à l’occasion du 1er Symposium de
Chimie et Biochimie Analytique de Montpellier le
25 septembre 2005. Cette journée qui a regroupé
une soixantaine de personnes a été l’occasion
d’assister à des présentations de membres de
chacun des deux clubs, de partager des connaissances et favoriser les échanges entre les deux
Club Jeunes.
A noter sur vos tablettes :
La prochaine rencontre du Club Jeunes SFEAP se
déroulera à l’ESPCI le 10 mars 2006 (le lendemain
de la journée thématique co-organisée par la
SFEAP et la SFSM), avec la possibilité de passer la
nuit en Auberge de Jeunesse pour une ambiance
plus conviviale et à moindre coût. Cette journée
sera l’occasion pour quelques étudiants (en
thèse…) de présenter leurs travaux en cours dans
un environnement moins formel que celui d’un
congrès, ainsi que de renouveler une partie du
bureau et d’accueillir les nouveaux membres …
Venez nombreux !
La prochaine journée thématique « Outils informtiques appliqués à la protéomique » aura lieu fin
mai 2006. Des précisions vous seront communiquées en début d’année 2006.
Contact : [email protected]
Informations : http://cjsfeap.free.fr/
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Compte-rendu de la 1ère Journée thématique
du Club-Jeunes
Mise en évidence de modifications posttraductionnelles par l’utilisation de
l’électrophorèse 2D
En la belle et ensoleillée ville de Lyon a eu lieu, le 16
juin 2005, la première journée thématique du
Club-Jeunes de la SFEAP.
La qualité des orateurs et l’importance croissante
pour
l’étude
des
modifications
posttraductionnelles ont motivé tout de même 55
inscriptions. La bonne humeur générale et une
organisation sans faille ont marqué le déroulement
de la journée et la disponibilité des intervenants
s’est traduite par un riche échange et des discussions scientifiques qui se sont prolongées lors des
pauses café et du repas.
Cette première journée est sans conteste un succès
qui appelle à récidive. Elle n’aurait pas été possible
sans le soutien financier de la SFEAP, de SigmaAldrich (repas du midi et du soir), ni sans le prêt des
locaux par Bayer Cropscience.
Encore grand merci à tous les orateurs de la
journée pour leurs présentations de qualité : ils se
sont montrés didactiques, disponibles, riches
d’enseignement pour les jeunes protéomiciens et
ont abordé des sujets assez variés pour intéresser
d’un point de vue thématique la totalité des auditeurs.
Les orateurs et le titre de leur présentation ont été
dans l’ordre chronologique :
Thierry Rabilloud, DRDC/ICH, INSERM U 548 :
Introduction . Mise en évidence de modifications
post-traductionnelles
par
l’utilisation
de
l’électrophorèse 2D : exemple des suroxydations
des cystéines
Paulette Decottignies, Chimie des Protéines, Institut de Biochimie et Biophysique Moléculaire et
Cellulaire, UMR 8619 : Réduction de ponts disulfures: recherche de nouvelles cibles de thiorédoxine et de glutarédoxine
Virginie Redeker, ESPCI, CNRS UMR 7637 : Analyse
de la diversité biochimique des tubulines : caractérisation de deux polymodifications : la polyglutamylation et la polyglycylation
Klaus Herick, Sigma : Analyse des Phosphopeptides
et Quantification en Spectrométrie de masse
Raymonde Joubert-Caron, Laboratoire de Biochimie des Protéines et Protéomique, EA 3408 : Stratégie d’étude du phosphoprotéome : Utilisation des
gels bidimensionnels et de la chromatographie
d’affinité pour interroger la partie cachée du
protéome
Klaus Herick, Sigma : Puces à Protéines
Sabrina Laugesen, Proteomics Laboratory, UMR
1199 INRA : L’étude des modifications posttraductionnelles : the bottelneck of proteomics
Et enfin un grand merci à tous les participants pour
leur esprit positif et leur bonne humeur.
Ils se reconnaîtront sur la photo.
Le bureau du Club-Jeunes.
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Le Symposium de Montpellier
Symposium de Chimie et Biologie Analytiques : un bilan prometteur.
Le Premier Symposium de Chimie et de Biologie
Analytiques a rassemblé 700 participants au Corum
de Montpellier du Dimanche 25 Septembre au Jeudi
29 Septembre 2005.
biologie. Par exemple, le développement très prometteur dans les années qui viennent de l’imagerie
par spectrométrie de masse a été abordé par A.
BRUNELLE
Cette manifestation a atteint l’objectif que
s’étaient fixé quatre sociétés savantes (AFSEP, SBCN,
SFEAP et SFSM) en décidant de tenir ensemble par
ce symposium leurs manifestations annuelles :
permettre par leur rassemblement dans un même
lieu à toutes les personnes impliquées dans le
contrôle analytique une actualisation de leurs compétences et leur croisement.
- le domaine de recherches toujours majeur de
l’accroissement des possibilités des couplages
GC/GC/MS et LC/LC/MS a été traité par le biais de 3
conférences sur les avancées chromatographie/
spectrométrie de masse dans la recherche des
peptides et des protéines : celles de I. WILSON et G.
BRIAND mais aussi celle de J-P CHERVET qui a
notamment permis d’évaluer ces avancées dans le
couplage LC/MS en matière de sensibilité
Le bilan scientifique du Symposium est
largement positif.
Les conférences prononcées sur des thématiques
très diverses ont rencontré un grand écho auprès
des congressistes ; une mention spéciale doit être
décernée à la conférence inaugurale du Professeur
R.G. COOKS qui a fait découvrir des perspectives très
prometteuses de la spectrométrie de masse pour la
miniaturisation de cette technique ainsi que pour
son aptitude à constituer une technique préparative
de séparation de protéines.
Durant le symposium, la présentation a été faite
d’exemples de contrôle analytique dans des
domaines très divers :
- le fait que les couplages chromatographiespectrométrie de masse soient utilisés dans des
secteurs très différents de ceux relevant de la chimie
et de la biologie dans lesquels son emploi est bien
établi : Science de l’Evolution (Conférence de J-J
JAEGER), restauration d’œuvres d’art, études spatiales,…
- le domaine des études plus fondamentales a été
évoqué à travers deux contributions se rapportant
d’une part à l’apport de la chimie théorique en spectrométrie de masse (Docteur M. YANEZ) et la mise au
point de nouvelles phases stationnaires pour les
séparations chromatographiques par une approche
sol-gel (Docteur. A.MALIK)
- Caractéristique importante du symposium ,la
plupart des thématiques abordées ont concerné des
domaines relevant à la fois de la chimie et de la
- tout contrôle analytique nécessite deux étapes
initiales ; trois conférences ont concerné ces deux
étapes : celle de M-C HENNION sur la préparation de
l’échantillon et celles de G. DESMET et K. ALBERT sur
les procédures de séparation
- évidemment, une part importante des thématiques abordées ont eu trait au contrôle analytique
dans les études protéomiques et ce sous différentes
facettes. Deux d’entre elles se rapportent à deux
thématiques bien particulières : la protéomique
végétale évoquée par M. ZIVY et le recours à la
bioinformatique pour l’identification des protéines
illustré par A . ESTREICHER. Toutefois, l’essentiel des
présentations en protéomique a relevé des deux
secteurs constituant le cœur des travaux du
contrôle analytique en protéomique. Il s’agit
d’abord, de diverses avancées structurales : tagging
électrochimique (N. LION), miniaturisation des outils
de contrôle (J. ROSSIER) et possibilités accrues de
contrôle par l’emploi de biochips (J-P CLOAREC) et
méthodologiques : mise en évidence de modifications multisites de protéines (O. JENSEN) et mise en
évidence de nouvelles classes de protéines (C.
ROLANDO). Il s’agit ensuite de deux interventions
sur des acquis récents en matière de contrôle analytique dans des applications de recherches cliniques
à travers trois conférences présentées par M. DUNN
(transplantation du cœur), H. HONDERMARCK
(contrôle dans le développement du cancer du sein)
et S.D. PATTERSON ( apport dans la démarche de
Drug Development).
.../...
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Le Symposium de Montpellier
Symposium de Chimie et Biologie Analytiques : un bilan prometteur
(suite et fin).
- contribution active des congressistes ainsi qu’en
témoigne le nombre élevé de communications par
affiche (340).
- implication très forte de l’ensemble des sociétés
industrielles concernées par le contrôle analytique.
Dans le hall d’exposition, il y a eu 45 stands. Deux
faits sont à noter à propos de ces sociétés : d’abord
leur taille très diverse (société implantée des deux
côtés de l’Atlantique mais aussi start-up courageusement créé par quelques chimistes grâce à la procédure de l’essaimage) et ensuite le souci de certaines
sociétés d’assurer un plein succès à la manifestation
ce qui s’est traduit par une contribution supplémentaire de Thermo Electron (apéritif dinatoire du
Dimanche 25), Waters (participation à la mise en
place de la soirée de gala animée (!) et réussie),
Bruker Daltonique (fourniture des sacs à dos pour les
congressistes : format inédit et sympathique pour
recueillir les documents du symposium),Vivascience
(financement des prix Poster),…
Deux autres manifestations de taille plus réduite
se sont également tenues le Dimanche 25 Septembre à l’occasion du Symposium : la journée de formation de la SFSM sur : « La quantification en spectrométrie de masse (J-P ANTIGNAC et E. RATARHAO)
ainsi que la réunion des clubs jeunes de la SFSM et
de la SFEAP.
Certes, le Symposium a donc été à tous égards un
succès. Notre sentiment forgé durant sa préparation
et confirmé par son excellent déroulement est que
ce succès résulte pour une large part de ce que le
contrôle analytique en chimie et biologie est récemment devenu une discipline majeure et ce pour
plusieurs raisons : nécessité de l’acquisition simultanée des connaissances fondamentales et de leur
croisement dans les divers domaines que sont : la
chimie, la chimie analytique, la biochimie, la biologie
et l’informatique, ensuite, possibilités d’application
dans des secteurs d’activités cruciaux et variés et
enfin, existence pour répondre à ce défi d’une communauté scientifique à l’échelle nationale à la fois
jeune et ayant la taille requise.
Un constat de l’audience acquise par les travaux
des chercheurs de notre communauté et de leur
intérêt réside dans le soutien très conséquent que
divers partenaires nous ont apporté : Collectivités
locales (Région Languedoc-Roussillon, Conseil
Général
de
l’Hérault
et
Communauté
d’agglomération de Montpellier), Acteurs institutionnels de la recherche scientifique (CNRS, INRA,
Pôle Européen de Montpellier et Société Française
de Chimie)et Industries pharmaceutiques (SanofiAventis et Servier).
La conclusion qui s’impose à l’issue du Symposium se situe dans une perspective dynamique.
Dans des temps très proches, de nouveaux concepts
et des applications inédites vont surgir. Dans le
concert international, nos quatre sociétés savantes
tant par le travail de leurs membres que par le
renforcement des liens entre elles, assumeront leur
mission en répondant à ces nouveaux défis.
Jean-Louis AUBAGNAC ([email protected])
et Christine ENJALBAL ([email protected])
( UMR 5810- cc19 – Université de Montpellier II –
34095 Montpellier Cedex 5).
Entrée du musée du vieux Montpellier. (Photo D.Godfrin)
A l’issue de ce Symposium, il est possible d’en
dégager les principales caractéristiques :
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Compte-rendu du Symposium de Montpellier
Merci aux boursiers de la SFEAP, J.-X. Roca Martinez, L. Negroni, Y. François, C. Broussard,
C.Loussert, M. Wisztorski, M.Couvet, D. Lapaillerie pour les résumés qu'ils ont fait des
principales sessions du Symposium de Montpellier
Conférence plenière du lundi 26 septembre
2005
“ Proteomics of the transplanted heart”
Michael J. DUNN
Michael J. DUNN, président de la « British
Society for Proteome Research » est professeur de
protéomique biomédicale de la fondation scientifique irlandaise à l’institut Conway de recherche
biomoléculaire et biomédicale située à l’Université
de Dublin. Éditeur en chef du journal «Proteomics»
et membre fondateur de HUPO (HUman Proteome
Organisation), ses travaux ont permis de développer les techniques de protéomique, de
l’électrophorèse sur gel et de leurs applications.
Sa conférence était axée sur l’utilisation de la
protéomique pour le suivi de patients ayant subi
une greffe du cœur. Les problèmes cardiaques
sont parmi les causes majeures de mortalité en
Europe et en Amérique du Nord. La greffe est
devenue la solution pour le traitement de pathologies cardiaques avancés. Cependant, les problèmes
de rejets des organes greffés représentent le
paramètre crucial pour la survie des patients. Ainsi,
La survie à long terme est souvent compromise par
des maladies de type Tx-CAD (Transplant associated coronary artery disease) qui affecte 42% des
greffés dans les 5 ans. Les méthodes de diagnostic
concernant ce type d’évolution de la greffe sont
difficiles à utiliser et le laboratoire de M. Dunn a
réalisé une analyse protéomique à partir
d’échantillon de sérum de manière à rechercher
des marqueurs biologiques capables de suivre
l’évolution de la greffe. Afin de contourner la
vaste gamme dynamique de protéines
contenues dans le sérum, les travaux ont été
orientés vers la mise en évidence d’une réaction immunitaire dirigée contre les protéines
issues des cellules endothéliales. L’approche
protéomique a permis d’identifier la vimentine et l’anticorps correspondant comme
marqueur capable de prédire les patients qui
risquent de développer des complications de
ce type.
Dans une seconde partie, les travaux de M.
Dunn se sont orientés sur des patients qui dix ans
après la greffe n’ont pas contracté de complications de type Tx-CAD. L’hypothèse mise en place
est que ces patients expriment des protéines qui
«protègent» la greffe du développement de
Tx-CAD. Des biopsies ont été réalisées de manière à
comparer les différents types de patients greffés.
L’analyse a montré que la présence de HSP27
diphosphorylée est un facteur associé au bon
pronostic suite à la transplantation cardiaque.
Ainsi, la compréhension du mécanisme protecteur
ouvre de nouvelles perspectives d’étude concernant la greffe du cœur.
Les travaux de M. Dunn s’inscrivent dans un
contexte médical qui montre l’intérêt de l’analyse
protéomique dans un domaine qui cherche perpétuellement à améliorer la compréhension des
phénomènes pathologiques et la qualité des soins
apportés aux patients. La protéomique permet
d’ouvrir de nouvelles perspectives dans le
domaine médical et les applications dans la recherche de cibles thérapeutiques se font nombreuses.
Ici, l’originalité vient de la recherche d’agents
protecteurs chez des patients ne développant pas
de complications, un concept qui va peut-être
permettre de trouver un moyen de stabiliser les
greffes du cœur.
J.-X. ROCA MARTINEZ
Page 9
Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite)
Conférence plénière : How to Cope with a
Dynamic range of 1010 in proteomics.
J.P. Chervet, R. Swart, G. Trementin.
J.P. Chervet a présenté une revue des techniques utilisées dans le cadre de l’analyse Topdown (de la protéine entière à l’identification,
souvent basée sur l’électrophorèse 2D) et de
l’analyse Bottom-up (de l’hydrolysat de peptides à
l’identification, basée sur la chromatographie
liquide). La séparation des mélanges complexes de
peptides par chromatographie multidimensionnelle permet l’identification de protéines par
dizaines, voire centaines, mais les informations
associées à la protéine entière (PM, pI) sont
perdues lors de l’hydrolyse. L’approche Top-down
via les gels 2D conserve cette information mais est
laborieuse et n’est que partiellement automatisable. Les progrès en terme d’appareillages chromatographiques (chromatographie multidimensionnelle entièrement automatisée, nanoLC reproductible) et en terme de phase solide (colonne
monolithique et silice 1.5 µm) permettent raisonnablement une approche Top-down basée sur la
chromatographie liquide. J.P Chervet a détaillé les
intérêts d’une analyse Top-down en 3D-LC. Dans
cette configuration, le mélange protéique est
séparé par une chromatographie orthogonale
(IEX- puis RP-HPLC). Les fractions obtenues sont
digérées et les peptides résultants analysées par
nanoLC-MS/MS. Cette 2D-LC des protéines avant
digestions permet notamment d’augmenter la
gamme dynamique et la couverture de séquence
des protéines identifiées.
L. Négroni, IFR50, Nice
NB: en spectrométrie de masse, le terme Top-down désigne
l’analyse MS et MS/MS de protéine entière (sans digestion
enzymatique). Cette approche est une application croissante des
appareils haute résolution.
Conférence plenière : The evolving role of
proteomics in drug development
Scott D. PATTERSON
Le professeur S.D. Patterson, un des pionniers de
la recherche protéomique, occupe au sein de la
société AMGEN® la place de directeur de département scientifique. Il a développé les technologies
de la protéomique (telle que la spectrométrie de
masse), pour caractériser de nouveaux médicaments.
Au cours de sa conférence, S.D. Patterson a
présenté l’utilisation de « l’outil protéomique » au
sein d’une société pharmaceutique.
Les études cliniques sont divisées en quatre
phases de recherche dans le cadre du développement d’un médicament : la validation de
l’innocuité de la molécule, la validation des doses
utilisées, la validation de l’efficacité et de la
tolérance à grande échelle et enfin le recueil de
données sur l’utilisation après commercialisation
(source : AMGEN®, www.amgen.fr). La phase discutée par S.D. Patterson est l’analyse des relations
entre dose et effet thérapeutique de la molécule
active sur le patient. Cette étape implique la
connaissance de la pharmacocinétique (PC) et de
la pharmacodynamique (PD) de la molécule.
L’utilisation des technologies de protéomique
permet d’identifier des biomarqueurs de ces deux
paramètres (PC et PD). De plus, cet outil peut
permettre la validation de cibles potentielles d’un
médicament, d’augmenter la compréhension de
son mécanisme, de son devenir dans l’organisme,
ainsi que ses interactions possibles avec d’autres
voies métaboliques. L’identification de ces biomarqueurs peut être réalisée selon 3 approches :
- la spectrométrie de masse : qui permet la
surveillance d’élements de faible masse (tels que
des fragments issus de phénomènes de protéolyse
consécutive à la réponse du patient).
- l’immunodétection en plaque et chimioluminescence : qui permet l’étude de la présence, tant
qualitative que quantitative, dans le sang (ou
d’autres fluides), de protéines associées à la voie
métabolique visée par le médicament
- la cytométrie de flux : qui permet de suivre
l’action de la molécule active au sein de la cellule
(flux calcique, pH intracellulaire, potentiel de membrane,...).
L’impact de la protéomique sur la recherche
pharmaceutique, et plus précisément sur le développement de nouveaux médicaments, est incontestable. Cependant, l’utilisation de ces approches
nécessite une grande reproductibilité des expériences ainsi qu’une adéquation des techniques
«haut débit». C’est sur ce coté méthodologique
qu’a insisté P.D. Patterson dans la suite de sa .../...
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Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite)
présentation, relevant l’importance du nombre de
répétions des expériences, l’incidence du patient
et de son environnement.
En conclusion, la potentialité de la protéomique
dans la recherche pharmaceutique n’est plus à
démontrer et quand la technique gagnera en
sensibilité et en reproductibilité, elle pourra
permettre d’identifier, à haut débit, des biomarqueurs protéiques pouvant être utilisés dans les
diagnostics, référencer des maladies, localiser des
protéines comme des cibles potentielles de médicaments.
En remarque personnelle, je rajouterai que cette
conférence nous a permis d’envisager la
protéomique sous un angle différent. Dans le
milieu académique, la protéomique est plutôt
utilisée dans le but de répondre à une question
biologique spécifique comme : l’état de phosphorylation d’une protéine, ou l’implication d’une
interaction protéine dans l’adressage subcellulaire.
Au travers de cet exposé, c’est la protéomique en
tant qu’outil de l’industrie pharmaceutique qui a
été présentée, mettant en relief des problématiques propres à cette application.
C.Loussert
Modifications post-traductionnelles
Cette session, au cours de laquelle la phosphorylation a tenu une place de choix, a donné la parole
à quatre intervenants.
La première conférence de cette cession a fait
intervenir Ole Jensen (Protein Research Group,
Danemark). Celui-ci a présenté les améliorations et
nouveautés apportées par son équipe à la phosphoprotéomique, dans le but d’identifier les modifications subies par les protéines dans des conditions données et expliquer leur fonction.
Le fractionnement multidimensionnel de
l’échantillon a notamment été mis en avant. Ainsi,
l’utilisation successive de plusieurs micro-colonnes
(IMAC, puis chromatographie sur colonne POROS
R1, R2 et R3 et enfin sur poudre de graphite) avant
l’analyse par spectrométrie de masse permet un
enrichissement séquentiel en phosphopeptides.
C’est aussi le cas lors de la combinaison d’une
IMAC avec une chromatographie échangeuse de
cations (SCX: Strong Cation Exchange Chromatography). D’autre part, la technique de dépôt sur cible
peut être optimisée en utilisant comme matrice un
mélange d’acide phosphorique et de DHB, conduisant à une meilleure détection des phosphopeptides par MALDI-MS. Ole Jensen a par ailleurs
insisté sur l’aspect multidimensionnel de l’analyse
en spectrométrie de masse. Ainsi la LC-MS par
spectrométrie de masse IT-FTICR permet la détection et le séquençage des phosphopeptides avec
une précision et une spécificité exceptionnelles,
grâce respectivement aux analyses MS2 et MS3. Il
sera ainsi possible de différencier par exemple une
Lysine acétylée d’une Lysine triméthylée, de même
masse nominale. L’analyse des données issues de la
spectrométrie de masse permet notamment, grâce
au logiciel VEMS mis au point par R. Matthiesen, de
traiter des résultats de protéomique quantitative,
de séquençage de novo et d’analyser les
séquences fonctionnelles. Grâce à ce logiciel, il est
possible d’assigner des modifications posttraductionnelles à la séquence peptidique.
Les résultats présentés par Ole Jensen s’appuient
plus particulièrement sur deux études. La première
vise à déterminer les résidus phosphorylés du
récepteur à l’EGF sous différentes conditions de
culture. Les récepteurs à l’EGF issus des différentes
cultures cellulaires (HeLa ou ECV304) sont précipités, séparés par SDS-PAGE et digérés à la trypsine.
Les mélanges peptidiques obtenus sont fractionnés afin d’augmenter le nombre de phosphopeptides détectables. La stratégie analytique retenue
pour cela est une analyse par spectrométrie de
masse MALDI en tandem, précédée d’un enrichissement séquentiel en phosphopeptides sur
des colonnes miniaturisées évoquées auparavant.
Elle a conduit à la découverte d’un nouveau site de
phosphorylation, révélé des phosphorylations
constitutives, et montré que le nombre et les positions des phosphorylations sur les récepteurs à
l'EGF variaient en fonction de la stimulation. La
deuxième étude qui a illustré cette conférence
concerne la phosphoprotéomique quantitative,
avec pour modèle d'étude les protéines de levure
impliquées dans la voie de signalisation des phéromones. Cette étude vise à identifier et quantifier les
modifications de l’état de phosphorylation de ces
protéines. Pour cela, les protéines extraites de deux
Page 11
Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite)
cultures cellulaires, l’une marquée par des isotopes
stables (SILAC) et l’autre traitée aux phéromones,
sont digérées. L’enrichissement en phosphopeptides se fait par chromatographie échangeuse de
cations et IMAC, et leur identification par spectrométrie de masse IT-FTICR (LC-MS3). Sur plusieurs
centaines de phosphopeptides identifiés, 139 sont
régulés différentiellement lors de la réponse aux
phéromones, parmi lesquels on trouve des régulateurs de la transcription et du cycle cellulaire. Les
récepteurs, les protéines kinases et leurs substrats
sont identifiés. Ces deux exemples démontrent
d’une part la possibilité d’analyser de manière
systématique, par spectrométrie de masse, des
molécules impliquées dans des voies de signalisation ; et d’autre part la possibilité de faire de la
phosphoprotéomique fonctionnelle quantitative
en utilisant la spectrométrie de masse.
J. Lemoine nous a présenté des travaux effectués
sur un spectromètre de masse modifié au sein du
laboratoire de Spectrométrie Ionique et Moléculaire (Villeurbanne, France). Un piège à ions quadripolaire a été couplé à un laser UV dont on peut
faire varier la longueur d’onde: on obtient ainsi une
trappe ionique pouvant faire du CID (CollisionInduced Dissociation) ou du LID (Laser-Induced
Dissociation). Pour un même peptide phosphorylé,
il a été constaté une perte de neutres caractéristique de -80 Da (HPO3) ou -98 Da (H3PO4) en CID,
et une perte de chaîne latérale d’acide aminé
aromatique en LID à 220 nm. Des expériences de
LID/CID MS3 ont été réalisées. Elles consistent à
introduire un site radicalaire par photodissociation
à 220 nm sur le spectre CID des ions précurseurs
mono et diprotonés de peptides phosphorylés
possédant un résidu d’acide aminé aromatique. La
spectrométrie de masse LID/CID MS3 engendre
une forte inhibition de la perte du phosphate, ce
qui permet d’accéder à la séquence et à la localisation de la phosphorylation sur le peptide.
L’équipe de C. Rolando (Equipe Physico-Chimie
pour l’Analyse et la Biologie, Villeneuve d’Ascq,
France) a développé des réactifs visant à enrichir
un échantillon en protéines oxydées/glycosylées
et/ou détecter ces dernières sur gel. L’acide phenylborique et l’acide hydroazino-benzoïque, permettant respectivement de reconnaître les glycosy-
lations et les oxydations, sont couplés par
l’intermédiaire d’un bras espaceur (spacer arm) à
une biotine en vue d’un isolement par affinité, ou à
une sonde fluorescente permettant la détection et
la quantification sur gel d’électrophorèse. Le réactif
détectant les glycoprotéines (ASC-GLY-FLUO) est 5
fois plus sensible que l’APS (Acide Périodique
Schiff ). Parallèlement, cette équipe a cherché à
améliorer les propriétés séparatives des gels
électrophorétiques, en testant plusieurs paramètres tels que la quantité de cross-linker, la
composition en monomères (l’hexaethylcellulose
au lieu du dextran) ou encore l’introduction de
monomères hydrophobes pour la séparation des
protéines membranaires. La photopolymérisation
et la "dépolymérisation" ont aussi été étudiées.
Enfin, C. Rolando nous a présenté le développement et l’optimisation de divers complexes
fluorescents, permettant de lier les protéines de
différentes façons.
N. Delcourt (Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier, France) a présenté une étude
visant à comparer les phosphoprotéomes de
neurones en culture induits par 2 types d’agents
neuroprotecteurs: l’IGF1 (Insulin-like Growth
Factor-1) et le PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase
Activating Polypeptide), qui sont à l’origine de
cascades de signalisation différentes. Après traitement des cultures neuronales par l’un ou l’autre de
ces neuroprotecteurs, les cellules sont lysées et
l’extrait protéique total enrichi en phosphoprotéines par chromatographie d’affinité sur colonne
de métal (PMAC). Des expériences de Western blot
et de marquage au 32P ont démontré la capacité
de la colonne à retenir les protéines phosphorylées
et à enrichir un sous-protéome, mais aussi une
absence de spécificité absolue vis-à-vis des protéines phosphorylées. Après cette étape
d’enrichissement en phosphoprotéines, celles-ci
sont séparées par électrophorèse bidimensionnelle, mettant en évidence une augmentation
importante de l’intensité et du nombre de spots
protéiques après traitement à l’IGF1 ou au PACAP.
Les spots prélevés sur les gels issus d’un traitement
à l’IGF1 ou au PACAP ont permis d’identifier environ 75 protéines différentes à partir de leur empreinte peptidique massique (MALDI-TOF). Une
grande proportion d’entre elles étant commune
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Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite)
aux deux traitements, ceci démontre que des
molécules neurotrophiques aussi différentes que
l’IGF1 et le PACAP sont capables de modifier un
pool commun de protéines dans les neurones, bien
qu’à l’origine de cascades de phosphorylation
extrêmement
différentes.
L’existence
de
mécanismes anti-apoptotiques communs médiés
par ces deux traitements a donc été suggérée, de
même que celle d’une transactivation entre le
récepteur de l’IGF1 et celui du PACAP.
M.Couvet
Session développements en protéomique
Cette session montrait l’apport de la
spectrométrie de masse dans les développements
de nouvelles stratégies d’analyses.
Dans la conférence « from DNA microarrays to
chips for proteomics : surface chemistry,
implementation methods, characterization. »
Jean-Pierre Cloarec (Laboratoire d’Electronique,
Optoélectronique et Microsystème, École centrale,
Lyon) a présenté les développements effectués au
sein de son laboratoire et notamment le passage
de la technologie de fabrication de puces à ADN à
la conception et réalisation de puces à protéines.
Ce passage nécessite des transferts de
technologie. Le but de ces développements est de
s’affranchir des limites de détection, d’augmenter
la gamme dynamique, de diminuer le temps
d’analyse, de faire de la détection sans marquage
et de diminuer le temps de développement de la
puce, tout en évitant des prix trop élevés.
L’un des premiers points évoqués fût la
modification de la surface avec une
fonctionnalisation et une optimisation des
supports adaptés à l’immobilisation des
oligopeptides. Une difficulté supplémentaire est
liée à la fragilité des peptides. Il est impératif de
conserver les biomolécules avec leur géométrie. Si
la chimie de surface n’est pas adaptée, des
interactions secondaires peuvent apparaître et
rendre la surface non contrôlable et non stable.
Pour stabiliser la surface, des travaux ont été
menés concernant la formation de monocouches
ou couches mono-assemblées. L’application de
silane permet la formation de monocouches
mono-assemblées avec une protection de la
terminaison pour éviter les réactions secondaires
puis une fonctionnalisation biologique et une
inactivation des terminaisons non fonctionnalisées. Par ailleurs, l’utilisation de la technique de
microcontact printing permet d’avoir deux fonctionnalités sur une seule puce.
Pour la synthèse de peptides, tout le processus a
du être réadapté pour passer petit à petit d’une
synthèse à l’échelle macroscopique à une
synthèse sur microsystème.
D’autres travaux sont également menés pour
utiliser des moyens de détection autre que la
fluorescence. Les systèmes envisagés reposent sur
des détections de type enzymatique, clivage par
photo- induction et couplage LC-MS. Le
développement d’un système de microréacteurs
permet la diminution des quantités de réactifs et
donc de limiter le coût.
La dernière étape dans ces développements est
de vérifier si le peptide immobilisé va réagir de
même façon qu’un peptide classique.
D’autres axes de recherche sont en cours. La
possibilité de fabriquer des puces à anticorps est
explorée mais pour l’instant l’orientation de
l’anticorps sur la surface reste problématique.
Les perspectives de ces travaux sont de
s’affranchir de la détection par fluorescence au
profit de couplage avec LC-MS ou MALDI, la
possibilité de faire des micro-ELISA pour effectuer
un typing rapide d’échantillons sanguins et enfin
le développement de systèmes intégrés de type
Lab-on-Chip.
La deuxième conférence portait sur une
approche originale en plein essor : L’imagerie par
spectrométrie de masse. Le groupe dirigé par
François Berger travaille actuellement pour
adapter la technologie SELDI-TOF à cette
approche en réalisant des analyses directes de
sous-protéomes à partir de l’apposition de tissus
frais ou de coupes fraiches d’organes sur les
surfaces chromatographiques des barrettes SELDI.
Les résultats obtenus par apposition directe
montrent des spectres plus riches que lors
d’analyse de lysats cellulaires. De plus l’analyse
peut s’effectuer en quelques minutes car cela ne
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Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite)
nécessite que de quelques secondes d’apposition
pour avoir des résultats et pouvoir différencier
des tumeurs de différents types.
En conclusion, l’apport de surface chromatographique dans l’analyse directe de tissu va
permettre la distinction de différents profils provenant de différents grades de cancer difficilement différenciables par les techniques
d’anatomopathologie.
La troisième conférence, de Joëlle Vinh avait
pour objet l’utilisation de la spectrométrie de
masse de type FT-ICR pour l’analyse protéomique
des HUVEC (cellules endothéliales de la veine
ombilicale humaine) dans le but d’établir une
carte de référence. Ce modèle est très représentatif des événements biologiques dans l’ensemble
des vaisseaux du corps humain. Des analyses en
électrophorèse bidimensionnelle ont permit
d’identifier environ 140 spots, mais la carte reste
incomplète et extrêmement complexe. Pour obtenir une carte plus détaillée, le choix a été fait
d’utiliser la combinaison des techniques
d’électrophorèse bidimensionnelle et LC-LTQ-FT
MS/MS. La découpe du gel 2D se fait en aveugle
par carré de 1 x 1 cm² puis les peptides digérés
sont séparés par couplage LC-LTQ-FT. Un séquençage automatique des fractions est réalisé en
mode MS/MS. L’identification est réalisée par
interrogation d’une banque uniprot-swissprot
non indexée avec des paramètres d’identification
des protéines assez discriminants. Les résultats
montrent que pour un carré où un seul spot est
détecté en bleu de Coomassie et trois en argent,
20 peptides différents sont identifiés au total par
la technique de couplage.
Au total cette technique permet l’identification
de 567 protéines non redondantes. Dans les
perspectives, l’utilisation de la chromatographie
liquide en deux dimensions a été évoquée pour
réduire la complexité des échantillons.
Pour conclure cette session, Sandrine Sagan de
l’université Paris 6 nous a présenté ses travaux sur
une méthode de quantification directe des
peptides internalisés, par spectrométrie de masse
MALDI-TOF. Les CPP (cell penetrating peptide)
sont des peptides capables de passer les membranes biologiques des cellules selon un
mécanisme protéine-indépendant mal connu.
Comme exemple de CPP on peut citer les pénétratines, les Arg 9…Tous possèdent des acides
aminés basiques qui sont essentiels pour
l’internalisation dans les cellules.
La quantification s’avère difficile car il faut
distinguer les peptides intracellulaires, les
peptides liés à la membrane, et les peptides qui
peuvent se trouver dégradés ou modifiés.
Classiquement des techniques de radiomarquages sont utilisées pour détecter les peptides
vecteurs à l’intérieur des cellules. Le problème est
que ces résultats sont indirects, généralement peu
quantitatifs et des artefacts sont possibles.
Une nouvelle méthode de quantification directe
par spectrométrie de masse a été développée en
utilisant un peptide porteur d’isotope stable
comme calibrant. Après une incubation avec le
peptide vecteur sous forme hydrogène, des
lavages et un traitement à la trypsine, les cellules
sont additionnées d’une quantité connue de
peptides sous forme deutérés, lysées puis chauffées 15 minutes à 100°C. Les billes greffées à la
streptavidine, qui ont permis de purifier les
peptides internalisés et les calibrants, sont directement déposées dans la matrice HCCA sur la cible
MALDI-TOF pour analyse.
Cette méthode est simple, rapide et reproductible. Elle permet :
- Une quantification directe des CPP
- Une discrimination non ambigüe des peptides
- L’analyse des dégradations
- L’étude de l’internalisation relative des peptides
- La quantification d’un cargo transporté par un
CPP.
M. Wisztorski
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Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite)
Protéomique des Plantes
et des Microorganismes
Michel ZIVY (INRA Gif-sur-Yvette)
La protéomique en biologie végétale : un outil à
l’intersection entre la génomique, la génétique et la
physiologie
Michel a commencé sa présentation en rappelant que les végétaux contrairement aux animaux
devaient obligatoirement s’adapter sur place pour
faire face à un environnement défavorable. Dans
un 1er temps, il a rappelé que la protéomique
descriptive permet d’établir un inventaire des
protéines présentes à un moment donné. La
protéomique "inventaire" permet en plus de caractériser ces protéines : identification de la structure
primaire, correction des annotations des
séquences génomiques, preuve expérimentale de
l’expression du gène, localisation de la protéine,
composition des complexes protéiques, modifications post-traductionnelles. Dans la protéomique
descriptive l’objet de l’analyse est donc uniquement centré sur la protéine en elle-même.
A contrario, la protéomique comparative est
basée sur l’analyse des modifications du protéome
en réponse par exemple à un stress. L’objet analysé
dans ce cas est la relation entre les protéines et les
phénomènes physiologiques mis en œuvre face à
ce stress. Pour illustrer ses propos, Michel a montré
un travail de son labo concernant l’étude comparative de la feuille de maïs en réponse à la sécheresse.
Cette réponse est fonction du type cellulaire et du
stade de différenciation. Au cours de son développement, la zone d’élongation de la feuille de
maïs pousse les cellules les plus anciennes vers
l’extrémité de la feuille. Lors du stress hydrique, la
croissance foliaire est ralentie et la taille de la zone
d’élongation est réduite. Le découpage de la feuille
de maïs en différents segments correspondants
aux différents états de différenciation va permettre
d’étudier la croissance liée au développement de
la plante versus un stress hydrique modéré et
sévère. Au total, 250 gels ont été générés et 850
spots ont été analysés. Il en résulte que la COMT est
exprimée de façon différentielle avec une concentration plus élevée dans le cas d’un déficit hydrique
faible que dans un déficit hydrique important. La
quantité de COMT que l’on peut observer résulte
donc de sa synthèse spontanée avant le stress. La
synthèse de la lignine qui est reliée à celle de la
COMT est quand à elle réprimée lors du stress
hydrique.
Cette étude a permis de montrer des variations
d’expression du protéome selon le stade de croissance cellulaire et des réponses du maïs au déficit
hydrique.
Mauld LAMARQUE (CNRS, Montpellier)
Inventaire protéomique de la vacuole digestive du
parasite Plasmodium falciparum
Après avoir rappelé les risques de la malaria
engendrés par Plasmodium falciparum, M.
Lamarque a retracé le cycle de vie extrêmement
complexe du parasite dans le moustique puis dans
le foie de l’homme jusqu’à son envahissement
dans les globules rouges. Par la suite, elle a décrit la
vacuole digestive du parasite dans ce stade érythrocytaire, de son rôle primordial dans la dégradation de l’hémoglobine des érythrocytes en hème
toxique pour le parasite et de sa conversion en
hémozoïne inoffensive pour lui. Elle s’est donc
intéressée à ce compartiment cellulaire et tout
particulièrement à en faire l’inventaire protéique
(peu connu en dehors des protéases de
l’hémoglobine) par une approche protéomique
classique. Ceci dans le but de comprendre les
mécanismes d’action de drogues développées au
sein de son laboratoire ainsi que de trouver de
nouvelles cibles thérapeutiques. Elle a d’abord
isolé la vacuole digestive puis réalisé un gel SDSPAGE monodimensionnel qui a ensuite été
découpé de manière systématique en une soixantaine de bandes. Ces bandes ont été digérées à la
trypsine et les peptides générés ont été analysés
par LC-MS-MS.
Avec 2 analyses indépendantes, 177 protéines
ont été identifiées dont 51 jouent un rôle dans la
synthèse protéique du parasite. Parmi les protéines
restantes, 63 ont été identifiées avec au moins 2
peptides et 54 avec 1 seul peptide. La majorité des
protéines identifiées étaient connues comme
appartenant à la vacuole digestive. Mauld a
focalisé son attention sur 37 protéines hypothétiques décrites dans la banque de données
Page 15
Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite)
plasmoDB. Après analyse bio-informatique, 16 de
ces protéines ont été retenues, fusionnées avec la
GST et 13 ont été purifiées par affinité avec succès.
Ces 13 protéines fusionnées ont ensuite été localisées par immunofluorescence dans la vacuole
digestive pour tenter de leur assigner une fonction.
Abdelkader NAMANE (Institut Pasteur Paris)
Différentes approches en spectrométrie de masse
quantitative pour l’étude de l’ordre d’assemblage des
protéines dans les particules pré-ribosomales
A. Namane s’est intéressé aux protéines intervenant dans les complexes pré-ribosomaux et
surtout l’ordre dans lequel s’associent les protéines
qui assurent la maturation des particules pré-60S
chez la levure. Par une approche TAP-TAG, il a ainsi
mis en évidence que la protéine Rlp24 ne pouvait
s’accrocher au complexe que si la protéine Nog1
était déjà présente dans le complexe naissant. Ce
résultat conforte ainsi l’hypothèse que
l’association des protéines pré-ribosomales était
séquentielle. De plus, en mutant Nog1, la protéine
Sss1 s’accumule ce qui suggère qu’elle appartient
à un complexe qui intervient en amont de la déplétion de Nog1 alors que Nog2 appartiendrait à un
complexe en aval de cette déplétion.
Ensuite avec la méthode SILAC, il a pu mettre
également en évidence les protéines du complexe
qui s’associent en amont et en aval d’une souche
de levure déplétée en Nog1. Cette méthode par
rapport au TAP-TAG permet de quantifier les protéines identifiées appartenant au complexe. Enfin à
la différence des 2 précédentes méthodes où il est
nécessaire de faire 1 gel monodimensionnel suivi
d’une MS simple, il a évoqué la méthode iTRAQ
pour retrouver les résultats précédents.
Au final, la méthode SILAC répétée de nombreuses fois a permis d’identifier 31 protéines
spécifiques du pré-ribosome ainsi que 39 autres
protéines non spécifiques. L’iTRAQ réalisé une
seule fois a permis d’identifier 27 protéines préribosomales et 79 autres protéines non préribosomales. Parmi les protéines pré-ribosomales,
19 ont été retrouvées à la fois par la méthode SILAC
et iTRAQ. Ceci démontre d’une manière générale
que les techniques employées dans les études de
complexes protéomiques ne sont pas exhaustives
et que les méthodes SILAC et iTRAQ sont 2
méthodes quantitatives complémentaires pour
étudier la dynamique des complexes moléculaires.
Néanmoins, il est nécessaire de répéter les expériences pour valider les mesures de quantification
réalisées, d’être plus reproductible dans la préparation des échantillons et d’augmenter la sensibilité
pour voir les complexes peu abondants. Il ne faut
pas aussi perdre de vue de toujours valider la
protéine identifiée pour vérifier que cette protéine
appartient bien au processus de maturation et qu’il
ne s’agit pas d’un contaminant.
Véronique SANTONI (INRA Montpellier)
Apport de la protéomique dans l’étude de la méthylation de la Lys et du Glu impliquées dans la régulation de l’expression des aquaporines
V. Santon nous a parlé de la régulation des aquaporines. Ces protéines canaux à 6 domaines transmembranaires de la membrane plasmique transportent l’eau et les petits solutés au travers de
cette membrane. Ces protéines sont présentent
dans tous les règnes mais le monde végétal
possède le plus grand nombre de gènes codant
pour des aquaporines et diverses localisations
subcellulaires. Il est connu que des modifications
post-traductionnelles
régulent
le
degré
d’ouverture et de fermeture de ces canaux ainsi
que l’adressage de ces protéines. Pour son étude,
Véronique a choisi de travailler sur un organe
majeur de l’absorption de l’eau, les racines
d’Arabidopsis thaliana riches en aquaporines. Elle a
étudié les modifications post-traductionnelles qui
régulent les aquaporines.
Elle a mis en évidence 6 isoformes d’aquaporines
de la membrane plasmique par ESI-MS/MS dont
certaines sont homologues à plus de 92% comme
PIP2.1 et PIP2.2.
Par la suite, elle a montré la présence de modifications post-traductionnelles à l’aide d’un
western-blot anti-PIP sur un gel d’électrophorèse
bidimensionnelle. L’anticorps a révélé une dizaine
de PIP en chapelet avec des pI détectés très
éloignés des pI théoriques. Par homologie avec les
banques de données et à l’aide de l’outil bioinformatique FindMod (disponible sur le serveur
Page 16
Expasy), il s’avère que les peptides non matchés en
analyse par spectrométrie de masse de ces PIP
immunoréactives correspondent à des phosphorylations (+80 Da) et à des méthylations (+14 Da).
Il a alors été prédit que la Met en N-terminal était
clivée ou acétylée, que des phosphorylations
étaient présentes en C-terminal sur les acides
aminés Ser277 et Ser280 et que des méthylations
non encore décrites chez les aquaporines étaient
situées en N-terminal sur la Lys3 et le Glu6 avec
parfois une diméthylation pour Lys3. L’utilisation
de divers mutants démontrent que la diméthylation de Lys3 est un marqueur de l’expression
des aquaporines à la membrane plasmique tandis
que la triméthylation de Lys3 ou la monométhylation de Glu6 conduisent à l’expression de ces
protéines dans les compartiments intracellulaires.
Elle a montré également une interaction entre
Glu6 et Lys3 : Glu6 conditionne le degré de méthylation de Lys3. Par ailleurs, quelque soit le degré
de méthylation des aquaporines, le transport de
l’eau n’est jamais altéré. Par contre, les mutants
montre une accumulation des aquaporines au sein
du réticulum endoplasmique ce qui suggère que
les méthylations sont bien impliquées dans les
mécanismes d’adressage avec une localisation à la
membrane plasmique dans les cas d’une diméthylation de la Lys et une localisation à la membrane du réticulum dans le cas d’une triméthylation. Les perspectives de ce travail sont maintenant de mettre en évidence les méthyltransférases impliquées ainsi que les partenaires
protéiques des aquaporines en fonction de leur
site et/ou degré de méthylation comme cela a été
réalisé pour les histones.
Cédric BROUSSARD
Applications biomédicales et
pharmaceutiques
Cette session a été ouverte par l’excellente
présentation d’Hubert Hondermarck. Lors d’une
introduction atypique, en se référant au tableau
Agnès Sorel représentée en Vierge par Jean Fouquet
Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite)
d’Agnès Sorel, il nous a présenté le sein comme un
élément de vie (l’enfant), d’attraction sexuelle (les
anges rouges) mais aussi de mort (les anges noirs).
Son travail, porte d’une part sur la recherche de
marqueurs spécifiques du cancer du sein et,
d’autre part, sur la découverte de nouvelles cibles
thérapeutiques.
Actuellement, le cancer du sein affecte une
femme sur huit en Europe et aux Etats-Unis. Parmi
les cancers, le cancer du sein est la première cause
de mortalité chez la femme.
Les objectifs du travail présenté par Hubert Hondermarck sont multiples. D’abord, mettre en
évidence de nouveaux marqueurs permettant
d’assurer la détection précoce du cancer du sein.
Ensuite, découvrir des marqueurs capables
d’effectuer un typage permettant d’adapter les
traitements en les rendant plus efficaces. Enfin,
découvrir des mécanismes de signalisation mis en
place lors du processus de cancérisation.
Les protéines issues de cellules saines ou
cancéreuses ont été séparées par électrophorèse
mono ou bidimensionnelle, puis identifiées par
spectrométrie de masse. L’analyse comparative des
gels d’électrophorèse a révélé un nombre limité de
variation confirmant que les cellules cancéreuses
sont moléculairement peu différentes des cellules
saines. Toutefois, cette analyse différentielle a mis
en évidence des différences qui ont été ensuite
Page 17
Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite)
validées par Western Blot ou par immunohistochimie sur des biopsies tumorales provenant de
plusieurs centaines de patientes.
Cette approche a permis de montrer une diminution de la quantité de deux protéines dans les
cellules cancéreuses : la serine protease inhibitor
Maspin et de la molecular chaperone 14-3-3. En
utilisant la LC/MS/MS, une autre protéine, absente
dans les cellules saines, a été mise en évidence
spécifiquement dans les cellules cancéreuses.
Etonnamment, cette protéine a été identifiée
comme étant le Nerve Growth Factor (NGF).
L’expression spécifique de cette protéine dans les
cellules du cancer du sein a été validée par Western
Blot et tissue array. Une analyse de l’expression du
gène du NGF a, par ailleurs, démontré l’absence de
transcrit au niveau des cellules saines. Ainsi, du fait
de sa présence spécifique dans les cellules du
cancer du sein, le NGF apparaît comme un
marqueur tumoral d’exception avec un intérêt
clinique potentiel.
Le NGF a également un effet sur la prolifération
des tumeurs. En effet, il stimule les cellules pour
leur multiplication, il est mitogène et antiapoptotique. Le NGF intervient dans une boucle
autocrine produite par les cellules cancéreuses qui
assurent ainsi leur prolifération.
Chez la souris SCID, l’inhibition de la voie de
signalisation du NGF se traduit par une forte diminution de la croissance des cellules cancéreuses et
une diminution corrélée des tumeurs et des métastases. En conclusion, le NGF et sa voie de signalisation se retrouvent présenter un intérêt clinique
potentiel pour le traitement des cancers du sein.
A la question pourquoi y a-t-il de l’expression du
NGF au niveau du sein ? Hubert Hondermarck en
se référant au tableau ci-contre nous rappelle que
le sein est une partie du corps particulièrement
sensible.
La session s’est poursuivie par l’exposé d’Alain
Beck. En biotechnologie, la production d’anticorps
monoclonaux pour des utilisations thérapeutiques
est en plein essor. À ce jour, une vingtaine
d’anticorps ont déjà reçu une AMM (Autorisation
de Mise sur le Marché) et une centaine est en cours
d’évaluation pré-clinique.
L’insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R)
est une protéine surexprimée dans de nombreux
Gabrielle d'Estrées et l'une de ses soeurs,
École de Fontainebleau
©RMN/René-Gabriel Odéja
types de cellules tumorales. Actuellement, des
anticorps monoclonaux humanisés dirigés contre
cette protéine ont été produits dans des cellules
CHO. Afin de valider la structure des anticorps
produits, une analyse de la structure primaire des
anticorps a été réalisée par microséquençage,
spectrométrie de masse et carte peptidique. De
manière surprenante, les chaînes lourdes, outre les
modifications post-traductionnelles attendues,
contenaient une séquence de 24 acides aminés
surnuméraires. Cette séquence additionnelle
correspond à la traduction d’un intron localisé
entre les domaines constant et variable de la
chaîne lourde. Cette différence n’avait pas pu être
mise en évidence par les méthodes analytiques
traditionnelles comme l’électrophorèse monodimensionnelle ou l’isoélectrofocalisation. Un bon
conseil : « Pour valider une structure ou identifier
des anomalies, mieux vaut utiliser plusieurs technologies différentes ».
Un exposé plein de suspense, celui de Nicolas
Sommerer, nous a présenté une cartographie de
gels 2D de protéines de salive humaine. Cette
étude a montré que l’alpha amylase précédemment décrite comme étant très stable, se retrouvait
dans le gel au niveau d’une soixantaine de spots.
Une analyse fine par carte peptidique de chacun
des spots a montré la présence d’amylase native
glycosylée ou non glycosylée, et d’amylase
présentant des délétions au niveau des extrémités
N et/ou C terminale. De manière tout à fait surprenante, certains spots ne peuvent s’expliquer que
par des délétions simples ou multiples : Il n’y a pas
eu que “le machouilleur de parafilm” qui a salivé…
Page 18
Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite)
Cette session s’est achevée par la communication orale d’Olivia Dekeyzer dont l’objectif était de
nous présenter l’utilisation de l’approche SELDITOF pour identifier des bio-marqueurs associés à
une pathologie cardio-vasculaire. Cette étude qui a
d’abord été mise au point à partir de 4 échantillons
contrôle et de 4 échantillons de patients atteints, a
révélé l’existence de 7 pics différentiellement
exprimés. Ces 7 pics ont été validés en utilisant 15
nouveaux échantillons contrôle et 15 échantillons
de patients atteints. Chaque pic a ensuite été
purifié à l’aide d’une colonne de chromatographie
puis séparé sur gel d’électrophorèse, et enfin
analysé en MALDI-TOF et LC-MS/MS. Hélas, les
résultats étant valorisables, ils n’ont pu être portés
à notre connaissance !
D. Lapaillerie
Analyse à haut et moyen débit
Cette session a débuté par la présentation de
Joël Rossier (DiagnoSwiss SA, Suisse) sur
«l’opportunité de miniaturiser les outils d’analyse
protéomique et de diagnostique : Off-Gel IEF –
nanoLC MS/MS et immuno-analyse en microfluidique ».
Dans son introduction, M. Rossier a bien distingué l’analyse protéomique, dont le but est de
trouver de nouvelles protéines (méthode non
spécifique, détection universelle), et le diagnostic
dont le but est de mesurer la présence d’une
protéine spécifique dans l’échantillon (sélectivité
par affinité, détection spécifique).
La première partie de cet exposé a été
consacrée à la miniaturisation dans l’analyse
protéomique. M. Rossier a décrit une méthode qui
met en oeuvre l’utilisation de la focalisation isolectrique Off-Gel (IEF) afin de réaliser une préconcentration efficace des protéines et/ou des
peptides et ainsi avoir une analyse MS/MS de
qualité. Cette méthode consiste dans un premier
temps à faire sur l’échantillon une “immunodéplétion” afin d’éliminer certaines protéines
(albumine, IgG, IgA…) puis une IEF entre les pH 4
et 7. Quatre fractions de protéines (résolution de
0,15 unité pH) sont ensuite récupérées et digérées
individuellement. Chaque digestion de protéines
est soumise à une IEF (pH 3 à 10) et séparée en 15
fractions (résolution de 0,4 unité pH). Chaque
fraction de peptides est enfin analysée par LCMS/MS. Des applications sur le plasma humain, le
fluide amniotique et la découverte de protéines
dégénératives dans le liquide cérébro-spinal ont
illustré les bons résultats de cette méthode.
La deuxième partie a été consacrée à la miniaturisation pour des applications en diagnostique.
Le principe consiste à miniaturiser des immunoanalyses (diminution des volumes d’échantillon,
amélioration des limites de détection, diminution
du temps d’analyse) à l’aide d’un dispositif microfluidique. Le protocole mis en place consiste dans
un premier temps à pré-concentrer la protéine
étudiée avec l’utilisation de micro-canaux de 50
nL greffés avec des anticorps et l’utilisation d’une
enzyme puis de réaliser une détection ampérométrique in-situ. La miniaturisation dans ce domaine
est donc plus simple lorsque la molécule étudiée
est connue et lorsque l’amplification du signal est
possible.
La deuxième conférence de cette session a été
présentée par William D. Van Dongen (TNO Quality of Life, Pays-Bas) et a porté sur la « mise en
œuvre de stratégies analytiques complètes dans
la recherche sur le métabolome ».
La métabolomique est une nouvelle étape de
compréhension dans la recherche sur le génome.
D’un point de vue biochimique, le métabolome
est l’analyse des métabolites constituant la cellule
et son étude permet de mieux comprendre les
fonctions biologiques.
Cette conférence a eu pour sujet le développement par TNO d’une nouvelle plate-forme compatible pour l’analyse du métabolome de microorganismes. Cet outil permet d’obtenir une
analyse chimique complète, un prétraitement et
une étude multivariée des données. Les principales techniques analytiques mises en œuvre avec
cet outil sont la GC-MS, et la LC-MS.
M. Van Dongen a ensuite détaillé les résultats
obtenus sur l’étude du métabolome du B. Subtilis
Page 19
Compte-rendu du Symposium de Montpellier
(suite et fin)
en indiquant que la combinaison de ces deux
méthodes analytiques a permis l’analyse
d’environ 98% de ses métabolites disponibles
commercialement. Ceci en validant les méthodes
suivant la sensitivité, la robustesse et la
quantification. L’amélioration des résultats dans ce
domaine de recherche passera par un
développement de nouvelles techniques
analytiques
compatibles
et
par
un
approfondissement dans l’analyse des données.
Cette session s’est poursuivie par la conférence
de
Julia
Chamot-Rooke
(DCMR, Ecole
Polytechnique, Paris) qui a porté sur la “electron
capture dissociation” (ECD) de peptides dérivés
avec une charge fixe : caractérisation des
modifications post-traductionnelles ».
L’interaction sucre (ou phosphate)-acide aminé
étant très labile, ceci représente un véritable
problème de l’analyse structurale (localisation du
groupement) de ces peptides en spectrométrie de
masse. Les résultats présentés dans cette
conférence ont porté sur la caractérisation de
glycopeptides et phosphopeptides dérivés par
des espèces acétyl phosphonium (TMPP-Ac), et
analysés en Nanospray-ECD et en MALDI-SORI
CAD. L’étude a été réalisée sur un spectromètre de
masse 7.0 Brucker Apex III FT-ICR équipé de deux
sources, nanospray et MALDI.
Cet exposé a été consacré à la description du
couplage entre un spectromètre de masse à
trappe ionique et un laser UV OPO réglable. Le
principe de ce couplage consiste au passage du
rayon laser directement dans la trappe ionique
préalablement forée de deux trous de 2
millimètres de diamètre. A chaque longueur
d’onde (compris entre 215 et 700nm), les ions
parents sont dans un premier temps isolés dans le
piège, puis irradiés avec le laser pour être
finalement analysés à l’aide du spectromètre de
masse. Ce couplage permet donc d’enregistrer des
coupes spectrales mais aussi de réaliser des
expériences permettant plusieurs étapes
d’analyse comme LID/LID, CID/LID et LID/CID (LID :
Laser Induced Dissociation, CID : Collision Induced
Dissociation). Une application sur ce nouveau type
d’appareillage a été réalisée pour déterminer les
propriétés optiques et structurales sur des
peptides métalliques. D’autre part, il a été montré
que les spécificités de ce couplage permettent de
proposer des perspectives intéressantes dans le
domaine de la chimie analytique avec le
développement de la LIRD (Laser Induced
Radicalar Dissociation).
Yannis FRANCOIS
L’analyse sur les glycopeptides dérivés TMPP-Ac
en MALDI-SORI CAD, a permis, sur des composés
cationiques chargés une fois (sur le
phosphonium), d’obtenir sur les ions précurseurs
des spectres contenants principalement les ions a
et b portant le glycan. Dans ces conditions, la
localisation des emplacements de glycolisation
est donc possible. L’étude ECD a été effectuée sur
des composés doublement chargés et a permis
d’obtenir une série d’ions c couvrant la séquence
entière. Par contre, il apparaît que l’efficacité de la
fragmentation est meilleure sur les résultats des
expériences d’ECD sur des formes non dérivées.
Des résultats similaires ont été obtenus pour les
phosphopeptides, mais l’étude en ECD s’avère être
plus efficace avec ces phosphopeptides.
La dernière conférence de cette session a été
donnée par Rodolphe Antoine (Laboratoire de
Spectrométrie
Ionique
et
Moléculaire,
Villeurbanne). Cette conférence avait pour objet le
“couplage d’une trappe ionique avec un laser UV
OPO : étude de la photodissociation de
peptides”.
Une rue de Montpellier (photo D. Godfrin)
Page 20
Montpellier
Si vous n’avez pas eu le temps de visiter la ville de
Montpellier je vais essayer de vous en faire respirer
l’air.
C’est le côté un peu secret de la ville que j’ai humé
le matin et le soir en me rendant de notre hôtel au
Forum. Car ce qui caractérise Montpellier se sont ses
nombreux hôtels particuliers datant du 18ème siècle
dont la plupart restent fermés. Le premier soir après
avoir assisté aux conférences nous sommes entrés
dans le musée du vieux Montpellier mais l’heure
était tardive et il était fermé. Cependant un petit
groupe écoutait attentivement une guide lui expliquer qu’il fallait oser s’introduire le matin derrière le
facteur ou suivre une personne pour visiter ces
hôtels si particuliers.
Franchissez le portail en bois, souvent décoré d’un
heurtoir et une entrée vous conduira à un escalier
monumental, disait- elle.
Chaque hôtel en possède un
simple ou double dont le style
lui est propre et qui fait la fierté
de ses habitants. Proche de cet
escalier une cour pavée
emprisonnée entre les hauts
murs de la maison conserve la
fraîcheur au sein des étés très
chauds du midi méditerranéen.
La ville compte plusieurs
dizaines de ces hôtels dont
vous avez pu voir les portes et
les grandes fenêtres donnant
sur les rues étroites et fraîches
de la vieille ville de Montpellier,
qui a une forme d’écusson. Je ne vous décrirai pas la
place de la comédie car je pense que tout comme
moi vous l’avez traversée au moins le matin pour
vous rendre de votre hôtel au forum et soir dans le
sens inverse en vous arrêtant dans un de ces petits
restaurants si nombreux dans cette ville estudiantine.
Texte de H. Sénéchal
Photos de D. Godfrin
Page 21
Compte-rendu du Congrès HUPO de Munich
Le 4e congrès d’HUPO (Human Proteomics
Organisation) s’est déroulé à Munich (Allemagne) du
28 aout au 1er septembre 2005. Plus de 2000
participants de 69 pays différents étaient présents à
ces journées, plus de 1000 posters ont été affichés
durant les 3 sessions prévues à cet effet et 109
communications orales ont été présentées. Un
programme dense, varié et complet nous a été
proposé durant ces quatre jours où nous avons assisté
à:
- une journée de formation sur les différentes
techniques de protéomique en « vogue » (2D DIGE,
MudPIT, MALDI, LC-MS /MS) ainsi que sur les
thématiques importantes abordées en protéomique
(Modifications
post-traductionnelles,
analyses
quantitatives, études bioinformatiques),
- des sessions plénières qui ont suscité
l’engouement de tous grâce à la participation de
grands noms de la protéomique,
- des sessions parallèles traitant des différents
domaines pour lesquelles les outils de protéomique
sont utilisés (Recherche de biomarqueurs en
cancérologie, développement d’outils cliniques pour
les diagnostics, utilisation d’anticorps pour la
caractérisation de pathologies, le développement des
nanotechnologies, …
Lors de la cérémonie d’ouverture, les organisateurs
du congrès -le président d’HUPO, John Bergeron
(Canada) ainsi que Matthias Mann (Allemagne) et
Angelika Görg (Allemagne)- ont pris la parole pour
définir l’enjeu et les objectifs de ce 4e congrès
d’HUPO. John Bergeron a insisté sur la nécessité de ne
pas voir la Protéomique comme un outils à générer
des bases de données inexploitées mais comme le
moyen d’accéder au Graal et percer le mystère de
certains systèmes biologiques. C’est pourquoi ce
4ème congrès a été orienté sur la thématique : « From
defining the proteome to understanding function ».
Alors que Matthias Mann, décrivait la protéomique
comme "une jeune adolescente pleine d’énergie,
pleine de ressources et qui ne demande qu’à
s’émanciper ", Samir Hanash (USA) - une des figures
historiques de la protéomique - insistait sur
l’importance d’organiser et d’homogénéiser les
recherches ainsi que d’intégrer les résultats pour
former un consensus de développement en
protéomique.
Les pionniers de la protéomique
Parmi les conférences plénières, une session a été
dédiée aux pionniers qui ont donné vie aux termes
«protéomique» et « spectrométrie de masse ». Parmi
ceux-ci, Patrick O’Farrell qui est à la l’origine de la
séparation bidimensionnelle, nous a présenté ses
travaux…de thèse (1969-1974) ! Ses travaux étant
basés sur l’expression précoce et tardive du génome
des bactériophages, l’absence de complexité du
mélange et l’inexistance du suffixe « omics » ne
nécessitaient alors pas de haute technique de
résolution. S’intéressant par la suite à l’ensemble
complexe des protéines exprimées dans les cellules
eucaryotes, le passage entre une simple résolution 1D
à la séparation 2D s’imposait. O’Farrell nous a retracé
avec beaucoup d’humour le contexte ainsi que les
différentes étapes qui se sont succédé pour aboutir
avec succès en 1974 à la 1ère séparation 2D. Après le
refus de publication de ses travaux par le journal JBC
qui lui a répondu que « The paper is more appropriate
for publication in a journal specializing in
biochemical methods… » soutenu par l’avis du
referee de l’article :« I found the study, as presented to
this manuscript, to be "analysed" far beyond the
physical limits of the measurements, to be hightly
speculative in places, and to be extrapolated, in terms
of usefulness, far beyond what the author has any
reason to expect », O’Farrell a eu, avec cette
technique, le succès que nous lui connaissons
aujourd’hui du fait de la grande sensibilité de
détection de protéines issues de mélanges
complexes et la possibilité de l’appliquer à de
nombreux systèmes biologiques. A 25 ans, le
doctorant O’Farrell donnait des cours de
protéomique à des « étudiants » répondant aux noms
de Fotis Kafatos, Bruce Ames, et Peter Gieduscheck. Ça
laisse rêveur…
Page 22
Compte-rendu du Congrès HUPO de Munich
En ce qui concerne le domaine de
la Spectrométrie de Masse, John
Fenn (USA) est un des pionniers de
l’ionisation par électrospray qui a
remporté le Prix Nobel de Chimie en
2002 avec Koichi Tanaka (Japon) et
Kurt Wüthrich (Suisse) grâce au
développement de méthodes de
désorption-ionisation douces pour l'analyse par spectrométrie de masse des macromolécules biologiques
telles que les protéines. Aujourd'hui, c’est grâce à ces
travaux, que d’importantes techniques chimiques que
sont que la spectrométrie de masse et la résonance
magnétique nucléaire (RMN) sont utilisées pour
l'analyse des biomolécules.
Du haut de ses 86 ans, John Fenn nous a présenté
une rétrospective des découvertes qui ont été faites
en spectrométrie de masse pour l’identification et
l’analyse structurale de macromolécules.
Ses travaux ont commencé en 1960 avec l’aide de
Bob Drake et de Michel Boudart par la conception du
précurseur de l’électrospray. (Figure ci contre).
Entouré de ses étudiants (M.Yamashita, C.M. Whitehouse et M. Mann), John Fenn a réalisé un travail
important sur les brouillards et les aérosols soumis à
des champs électriques intenses. Le principe de
l’électrospray avait déjà été envisagé en 1968 par
Malcolm Dole, lors d’études sur les faisceaux de gros
ions moléculaires désolvatés
par des gaz
inertes. C’est en
utilisant un gaz
desséchant à
contre-courant
que John Fenn
a pu, en 1984,
observer des ions produits sous pression atmosphérique. Puis, il a étudié l’ionisation de polyéthylène
glycols de très hautes masses moléculaires et portant
plus de mille charges positives. Il a par la suite appliqué sa méthode aux molécules de taille moyenne
(peptides et polysaccharides), puis aux protéines. De
cette technique, les modes ion-spray et nanospray ont
été développés, permettant l’étude de mélanges de
plus en plus complexes et la détection de quantités
de matière toujours plus faibles (de l’ordre de la
zemptomole, soit 10-21 mole).
Protein atlas
Le séquençage et l’annotation du génome humain
nous orientent vers une ère post-génomique où un
intérêt grandissant est porté sur les produits des
22118 gènes séquencés. Mathias Uhler est venu à
Munich présenter le projet HPR (Human Proteome
Resource) qui a
pour objectif la
production
systématique
d’anticorps
dirigés contre
les produits de
l’ensemble du
génome afin
de constituer une banque d’anticorps. Ce projet a
débuté en juillet 2003 et a permis de générer une
banque de plus de 700 anticorps qui ont servi à
étudier l'expression et la localisation des protéines
dans 48 tissus humains normaux et 20 tissus
cancéreux. Pour ne citer que quelques chiffres, 576
coupes immunohistochimiques (représentant 20
Giga) ont été digitalisées pour chacun des 700
anticorps puis analysées et annotées à temps plein
par 26 pathologistes afin de quantifier et de localiser
les protéines spécifiques des différents types cellulaires. Tous les résultats de ces analyses ont été regroupés dans une base de données accessible en ligne sur
le site www.proteinatlas.org. Cette première version
qui contient plus de 400 000 images de coupes
immunohistochimiques de haute résolution est une
importante source de connaissance pour l’étude
fonctionnelle de protéines et la découverte de
nouvelles cibles thérapeutiques en recherche médicale.
Les « Equilizer beads » de Righetti ou
Comment atteindre la face cachée de l’iceberg ?
Le congrès de Hupo s’est clôturé par un véritable «
One man show » à l’italienne avec Pier-Giorgio
Righetti de l’Université de Vérone sur le devant de la
scène. Ce personnage haut en couleur nous a
présenté une nouvelle technologie très prometteuse
permettant de concentrer les protéines peu
représentées dans un mélange complexe de protéines (comme par exemple le serum) en déplettant les
protéines majoritaires.
Page 23
Compte-rendu du Congrès HUPO de Munich
(suite)
Les protéines minoritaires représentent en moyenne 46% d’un protéome total contre 13% pour les
protéines abondantes. Par exemple, dans le blanc
d’œuf, 6 protéines représentent à elles seules 99% en
masse du protéome total. Afin de connaître la composition des 1% de protéines noyées et de faire
immerger la face cachée de l’iceberg, Pier-Giorgio
Righetti a mis au point une méthode consistant à
équilibrer la concentration des protéines avant séparation. Cette méthode est basée sur l’utilisation de
billes recouvertes d’une librairie de peptides hexamériques ligands réalisés à partir des 20 acides
aminés naturels (contenant donc en principe 64
millions de ligands différents). Ces ligands étant
capables de capturer tous les composants d’un
mélange protéique, la concentration des protéines
très faiblement représentées est augmentée par
rapport aux protéines majoritaires.
En effet, après séparation bidimensionnelle de
protéines de sérum humain seulement 195 spots sont
détectés contre 523
avec la même quantité
d’échantillon traité sur ces billes.
Lors de la cérémonie de clôture, John Yates et Peipei
Ping nous ont présenté un diaporama haut en couleur
sur Long Beach (Californie) où se déroulera le 5e
congrès d’HUPO du 28 octobre au 1er novembre
2006. Des prix ont été décernés à diverses personnalités pour leur contribution dans le domaine de la
protéomique.
D’un point de
vue personnel,
ce congrès a été
très
enrichissant et formateur. Enrichissant
par
l’abondance
des informations qui ont été présentées (que ce soit
sous forme de posters ou de communications orales)
et par les rencontres qui sont privilégiées dans ce
genre de congrès, et formateur car ce congrès a été
pour moi l’occasion de présenter mes travaux dans la
langue de Shakespeare (…ou presque).
Au niveau touristique, ce congrès m’a donné
l’opportunité de visiter Munich ("By night" essentiellement), de savourer la bière allemande en terrasse et d’
"apprécier" la gastronomie Bavaroise à la soirée de
gala de HUPO (photo ci-dessus). Je garderai un très
bon souvenir de ce congrès dont je vous ai fait
partager quelques séquences le temps de ces
quelques lignes…
Je tiens vivement à remercier la SFEAP de m’avoir attribué cette
bourse. Elle m’ a permis de rencontrer toutes les "pointures" qui sont à
l’origine du concept de la « protéomique », et de me familiariser avec
toutes les techniques de pointe qui sont actuellement développées
de part le monde dans ce domaine.
Clémence Belleannee
L’objectif ultime de HUPO (Human Proteome
Organisation) est l’amélioration de la santé humaine
par l’utilisation de la protéomique, un domaine
devenu très intéressant grâce aux avancées technologiques importantes et aux multiples applications
dans la recherche biomédicale. Soulignant le thème
de la fonction biologique des protéines, « From defining the proteome to understanding function », le 4e
congrès HUPO s’est déroulé à Munich (Allemagne) du
28 Août au 1er Septembre 2005 avec plus de 2000
participants de 69 pays et 1050 résumés soumis et
acceptés soit pour des communications orales (109)
soit pour des présentations sous forme d’affiche (941
posters).
Ce congrès a commencé officieusement le 28 Août
avec une journée « éducationnelle » dédiée aux
jeunes chercheurs. Plusieurs centaines de participants y ont assisté dans l’intérêt de réviser,
d’apprendre ou même de découvrir les bases de la
protéomique. A l’attente de tous, les organisateurs
Angelika Gorg et Mathias Mann ont proposé un
programme scientifique riche en informations dont
les objectifs étaient de faciliter l’étude et la caractérisation des protéines dans les différents protéomes
ainsi que l’identification de biomarqueurs potentiels
et de cibles thérapeutiques. Une attention particulière a été portée sur l’application et la standardisation des protocoles utilisés en protéomique. Ce
programme a été présenté sous 4 volets :
i) Techniques protéomiques basées ou non sur gel :
Dans un premier temps les invités ont rappelé sous
forme d’un cours concentré les grands principes de
l’électrophorèse
bidimensionnelle
(2D),
l’électrophorèse différentielle (DIGE), la technologie
d’identification des protéines en plusieurs dimensions (MudPIT), la chromatographie liquide bidimensionnelle (2DLC) et multi-dimensionnelle (MDLC).
Page 24
Compte-rendu du Congrès HUPO de Munich
(suite)
Dans un second temps d’autres aspects plus
pratiques ont été abordés tels que la préparation des
échantillons, la solubilisation, la précipitation et la
digestion des protéines, le pré-fractionnement, les
multiples méthodes de détection, les avantages de la
détection en fluorescence, l’automatisation, etc.
Toutes ces informations nous ont prouvé dès le début
du congrès le besoin des pionniers de la protéomique
à initier les jeunes chercheurs de ce domaine en
pleine expansion.
ii) Identification des protéines :
Dans cette partie du programme les chercheurs
d’une équipe Danoise dirigée par le professeur Peter
Roepstorff nous ont montré les avancées dans
l’identification de protéines par MALDI-TOF MS. Après
une description détaillée de cette technologie et de
l’utilisation de la PMF (peptide mass fingerprint) dans
la protéomique, une attention très particulière a été
portée sur l’analyse des résultats et les problèmes qui
leurs sont liés (les pics faux positifs, les
contaminations, les calibrations, etc.). Pour résoudre
ces difficultés, il a été proposé le programme
«PeakErazor» (http://welcome.to/GPMAW) basé sur le
simple concept de comparer toutes les valeurs de
masse à une base de données comprenant une liste
de contaminants connus. Ceci permet d’éliminer ces
derniers et de corriger le spectre de masse mettant en
évidence des pics avec des valeurs statistiques
correctes.
iii) Phospho-protéomique :
Des modifications post-traductionnelles ou PTM
peuvent affecter la majorité des protéines eucaryotes.
Plusieurs de ces modifications (phosphorylation,
glycosylation, acétylation, etc.) qui régulent l’activité
des protéines, leur localisation et leur stabilité dirigent
des processus cellulaires fondamentaux. Pour
caractériser et quantifier les PTM et, tout
particulièrement la phosphorylation, différentes
techniques protéomiques ont été utilisées telles que
MALDI MS et MS/MS, ESI MS et MS/MS, etc. Il a été
signalé que l’enrichissement des échantillons en
protéines phosphorylées et l’optimisation de la
préparation des échantillons sont primordiaux pour
détecter les signaux PTM en calculant les différences
de masses (?m). De plus, pour l’enrichissement et la
purification des phospho-peptides, les orateurs ont
proposé d’effectuer une chromatographie d’affinité
avec des métaux immobilisés (IMAC) en utilisant des
colonnes de dioxyde de titanium (TiO2).
iv) Bioinformatique pour la protéomique :
Jour après jour, la nécessité de nouveaux outils
informatiques et leurs importance dans la
protéomique augmentent. Dans l’objectif de nous
proposer les nouveautés en terme de recherche dans
les bases de données et de logiciels protéomiques,
deux intervenants de l’Institut Européen de
Bioinformatique (EMBL-EBI) et l’Institut Swiss de
Bioinformatique (SIB) ont présenté l’avancement des
travaux de leurs organismes. D’une part, différents
aspects ont été développés allant de la recherche
d’une séquence protéique sur Swiss-Prot jusqu’à la
classification fonctionnelle (GO), l’identification
(PRIDE) et même la détermination des interactions
(IntAct) des protéines. D’autres part, les orateurs ont
insisté sur l’importance de la variabilité et de la
reproductibilité des données, sur la nécessité de
valider et d’interpréter correctement les résultats
obtenus par MS en les confirmant avec d’autres
techniques et en choisissant le logiciel
bioinformatique approprié.
La 1ère journée intense en informations et en
partage de connaissances sur les différentes
applications dans le domaine de la protéomique s’est
achevée avec la réception de bienvenue organisée
avec la participation de 59 compagnies exposant leur
produit et service au cours du congrès.
La cérémonie d’ouverture du congrès a eu lieu le
29 Août annonçant le début du congrès. Lors de cette
cérémonie plusieurs intervenants ont souligné
l’importance de la protéomique pour la recherche
fondamentale et appliquée et l’intérêt de favoriser le
transfert de la recherche fondamentale vers
l’appliquée tout particulièrement dans le domaine
des sciences du vivant. « HUPO est la conséquence de
la vision et du défi des scientifiques de tous les
domaines », c’est avec ces mots que J. Bergeron, le
président de HUPO, a commencé son discours en
précisant que la protéomique a beaucoup avancé
dans l’étude des pathologies humaines grâce à l’aide
et à la participation des scientifiques tels que les
organisateurs de ce congrès. Le président de la
fondation de la recherche allemande (DFG), Prof. E.L.
Winnacker, a insisté à son tour sur l’importance de la
protéomique et les besoins dans ce domaine pour
étudier les intérêts biologiques et pathologiques des
protéines. Il a ensuite consacré le restant de son
discours au développement de la recherche en
Allemagne et en Europe précisément dans le
Page 25
Compte-rendu du Congrès HUPO de Munich
(suite et fin)
domaine de la protéomique. Il s’avère que l’Union
Européenne aurait besoin de 7000 scientifiques
jusqu’à l’an 2010 et que le gouvernement allemand a
décidé dans cet objectif de financer la recherche à
raison de 380 millions d’euros par an. Le Prof.
Winnacker considère que toutes les activités en
Allemagne et dans l’UE sont importantes pour lancer
des collaborations et que le congrès HUPO jouit d’une
bonne réputation pour faciliter ce genre de contact
due à la communauté scientifique et aux organisateurs.
protéomes, phosphoprotéomes, les protéines membranaires, etc. Cette année, en plus des initiatives en
cours, d’autres propositions ont été soumises aux
siège principal de HUPO et sont en cours de validation : i) HUPO Cancer Proteomics, ii) Disease
Biomarker Initiative, iii) Kidney Biomarker Initiative et
iv) Cardiovascular Biomarker Initiative. S. Hanash a
terminé son discours en précisant que l’organisation
du proteome humain existe grâce à l’aide financière
et au soutien provenant du gouvernement, des
fondations et surtout des industries.
S. Hanash, le fondateur de HUPO, est intervenu à la
fin de la cérémonie d’ouverture pour parler en détail
des initiatives de HUPO en cours et des critères pour
proposer de nouvelles initiatives. Les membres
conseillers de ces projets se sont réunis la veille du
congrès à Munich pour déterminer ces critères
(www.hupo.org). Selon S. Hanash le besoin de rechercher des informations à partir du protéome sont
essentielles et cette recherche serait favorisée si nous
joignons nos efforts car aucune personne ou même
aucun pays ne pourrait le faire tout seul. Il considère
que la protéomique est un « pool » de technologies
très diverses mais insuffisantes et pour pousser ces
techniques à leurs limites il faudrait prendre des initiatives et surtout collaborer. Les initiatives de HUPO au
cours des deux dernières années se sont focalisées sur
3 tissus : le foie, le cerveau et le sérum/plasma. Les
progrès réalisés dans ces projets sont satisfaisants et
ils sont menés avec rigueur dans l’identification des
protéines et même dans la redéfinition de certains
gènes (non identifié dans le génome) à travers la
protéomique. Une autre initiative a été de créer un
catalogue d’anticorps validés issus de différentes
sources et de construire un Atlas de protéines utiles
pour la localisation et l’expression des protéines
humaines dans les cellules normales et pathologiques. Les demandes de l’année dernière au
cours du 3e Congrès à Pékin avaient été faites dans le
but d’élargir les initiatives pour étudier d’autres tissus
tels que le muscle, les reins, les poumons, les seins, la
prostate et les fluides biologiques (urine, salive, CSF,
etc.) ainsi que des sub-protéomes comme les glyco-
Une conférence plénière a été présentée par John
Yates III, un des pionniers de la spectrométrie de
masse. L’orateur a souligné l’importance et les limites
de l’utilisation de la spectrométrie de masse pour les
études biologiques. Il a insisté dans un premier temps
sur l’identification des cibles en effectuant des multidigestions enzymatiques. Dans un second temps, il a
évoqué la recherche ciblée des sites de phosphorylation par MudPIT et a proposé le fractionnement pour
faciliter l’étude de la phosphorylation et pour
augmenter la résolution et la sensibilité des spectres
tout en projetant dans une analyse protéomique
spécifique à chaque organe.
Un autre maître de la spectrométrie de masse et
l’un des organisateurs du congrès, Mathias Mann, a lui
aussi présenté les avancées dans ce domaine plus
précisément à l’interface LC/MS. Il a accentué
l’importance de la protéomique quantitative par
marquage isotopique in vitro soit avec chromatographie d’affinité ICAT, soit sans SILAC. Les exemples
proposés concernaient l’étude de la phosphorylation
dans des lignées cellulaires cancéreuses incubées
avec des acides aminés marqués. Il a ciblé plus
particulièrement les récepteurs tyrosine kinases de la
famille ErbB activés avec le facteur de croissance EGF,
il a suivi la cinétique de phosphorylation en étudiant
les phospho-peptides par MS
Je tiens à remercier le Société Française d’Electrophorèse et
d’Analyse Protéomique de m’avoir attribué une bourse pour
participer au congrès international HUPO 2005.
Garabet YERETSSIAN.
Merci aux boursiers de la SFEAP, Clémence Belleannée et Garbet Yeretssian pour les résumés
qu'ils ont fait du Congrès HUPO de Munich
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Nos partenaires
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accordent leur soutien à la SFEAP
en souscrivant comme partenaire. Nous les
remercions pour leur concours.
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