Dosage des polyphénols du thé vert et du thé noir par

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SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE EN BIOLOGIE ET BIOTECHNOLOGIE
Dosage des polyphénols du thé vert et du thé noir
par Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)
Auteur : Sarah Le Cleach
Tuteur : Béatrice Gargadennec-Legouin
Master 2 Biologie – Gestion & Marketing
UFR Sciences Pharmaceutiques et Biologiques
Université de Rennes 1 – UFR SVE
Université de Rennes 1
Janvier 2015
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Remerciements
Je tiens à remercier sincèrement Béatrice Gargadennec-Legouin, mon tuteur qui, par
sa disponibilité et ses précieux conseils, m’a donné un encadrement de qualité lors de la
réalisation de ce projet.
Note des responsables du diplôme : « Le tuteur chercheur a pour rôle de conseiller l’étudiant,
l’orienter dans ses recherches bibliographiques, l’aider à comprendre les articles, en faire une synthèse de
manière logique et rigoureuse. Il ne peut vérifier toutes les citations et interprétations de l’étudiant. Il
ne peut donc s’engager vis-à-vis d’éventuelles erreurs. »
Dosage des polyphénols du thé vert et du thé noir par Chromatographie Liquide Haute Performance
(HPLC)
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S. Le Cleach*
Master Biologie-Gestion & Marketing, UFR SVE Sciences de la vie et de l’environnement, Université de Rennes 1, Campus
de Beaulieu, Bâtiment 13, 263 avenue Général Leclerc, 35042 Rennes Cedex, France
Résumé
Le thé vert et le thé noir, les deux variétés de thé les plus consommées, contiennent de
nombreux composés bioactifs d’intérêt dont les polyphénols. Ces molécules organiques suscitent
l’intérêt des scientifiques et des industriels étant donné leurs propriétés antioxydantes, antiinflammatoires et leur capacité à prévenir et traiter certains cancers. Ainsi, l’analyse des polyphénols
représente un enjeu majeur pour établir des liens plus étroits entre la consommation de thé et la
réduction de certaines pathologies. Parmi les techniques analytiques existantes, l’HPLC s’avère être
une méthode de choix pour analyser ces composés bioactifs dans le thé. Il est donc primordial de
déterminer les conditions chromatographiques optimales pour séparer, identifier et quantifier les
polyphénols du thé et de définir en amont une extraction adaptée aux spécificités du thé.
Sommaire
Partie 1 : Généralités sur les polyphénols issus des aliments
1.
Les polyphénols de l’alimentation ...............................................................................................6
2.
Les polyphénols du thé vert et du thé noir ................................................................................9
Partie 2 : Le dosage des polyphénols du thé par HPLC
1.
Extraction des polyphénols du thé ........................................................................................... 10
2.
Analyse des polyphénols du thé par HPLC ............................................................................. 13
3.
Analyse des polyphénols du thé par UHPLC .......................................................................... 22
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Table des abréviations
HPLC : Chromatographie Liquide à Haute Performance
RP-HPLC : Chromatographie Liquide à Haute Performance en Phase Inverse (Reverse)
HPLC-UV : Chromatographie Liquide à Haute Performance couplée à un détecteur UV
HPLC-MS : Chromatographie Liquide à Haute Performance couplée à un spectromètre de masse
UHPLC : Chromatographie Liquide à Ultra Haute Performance
GC : Gallocatéchine
C : Catéchine
CG : Catéchine gallate
GCG : Gallocatéchine gallate
EGC : Épigallocatéchine
EC : Épicatéchine
ECG : Épicatéchine gallate
EGCG : Épigallocatéchine gallate
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Introduction
Le thé vert, issu des feuilles de Camellia sinensis var. sinensis, est l’une des boissons les plus
consommées à travers le monde. Elle constitue une source importante d’antioxydants et serait à
l’origine de divers bénéfices sur la santé (Castro et al., 2010).
Selon leur mode de production et leur composition chimique, les thés commerciaux sont
généralement répartis en quatre catégories : le thé vert non fermenté, le thé Oolong et Pachong
partiellement fermentés, le thé noir et rouge complètement fermentés et le thé blanc légèrement oxydé
(Wang et al., 2003). Alors que le thé vert et le thé Oolong sont préférés au Japon et en Chine, le thé
noir issu des feuilles de Camellia sinensis var. assamica, est majoritairement consommé en Inde, Europe
et Afrique.
Des études récentes ont établi un lien entre la réduction du risque de cancer et de maladies
cardiovasculaires avec la consommation de thé (Roman et al., 2013). D’autres effets bénéfiques du thé
ont également été mis en évidence comme son pouvoir antioxydant et anti-inflammatoire (Lee et al.,
2000). Ces propriétés sont en partie, attribuées aux alcaloïdes et aux composés phénoliques (Peng et
al., 2008). Afin d'étudier ce lien éventuel entre la consommation de thé et l’impact sur notre santé,
l’analyse des polyphénols est primordiale (Bae et al., 2014).
Il existe plusieurs méthodes pour caractériser les polyphénols du thé : la chromatographie
liquide haute performance couplée à un détecteur UV (HPLC-UV) ou couplée à un spectromètre de
masse (HPLC-MS), la détection électrochimique (ECD), la spectrométrie de masse par ionisation, la
chromatographie gazeuse couplée à un MS (Bae et al., 2014). Selon Robbins (2003), dans les trente
dernières années, la technique analytique qui a prédominé pour la séparation et l’identification de
composés phénoliques est l’HPLC en phase inverse.
Cette synthèse bibliographique est un état des lieux des connaissances actuelles sur le dosage
des polyphénols du thé par chromatographie liquide haute performance (HPLC). À travers ce rapport,
les polyphénols de notre régime alimentaire seront dans un premier temps décrits avec un focus sur
les polyphénols du thé. La deuxième partie exposera les différentes techniques de dosage par HPLC
des polyphénols du thé vert et du thé noir en étudiant l’extraction, les conditions chromatographiques
ainsi que les résultats qualitatifs et quantitatifs.
Sarah Le Cleach – Master Biologie-Gestion & Marketing – SBBB – Janvier 2015
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Partie 1 : Généralités sur les polyphénols issus des aliments
1. Les polyphénols de l’alimentation
a) Définition et rôles des polyphénols
Au sens strictement chimique du terme, les « polyphénols » devraient se restreindre aux
structures qui comportent au moins deux groupements phénoliques, quel que soit le nombre de
groupes hydroxyles qu’ils portent chacun (Quideau et al., 2011).
Métabolites secondaires des plantes, les polyphénols constituent un groupe complexe de
molécules (Manach et al., (2004). Leurs principales fonctions sont d’inhiber le développement de
pathogènes, de décomposer certains micro-organismes et d’avoir une fonction de protection contre le
rayonnement UV et le stress oxydatif (Scalbert et al., 2002).
Nous assistons actuellement à une véritable émergence de leur rôle dans la prévention des
maladies dégénératives comme le cancer et les maladies cardio-vasculaires. De plus, la reconnaissance
de leurs propriétés antioxydantes et de leur action sur une large catégorie d’enzymes explique
l’engouement des industriels de l’agroalimentaire pour ces molécules (Manach et al., 2004).
b) Classification des polyphénols
D’après Motilva et al. (2013), il n’existe pas de classification universelle des polyphénols. De
nombreux auteurs ont donc proposé leur propre segmentation. Par exemple, Crozier et al. (2010) ont
séparé ces composants en deux catégories : les flavonoïdes et les non flavonoïdes. Manach et al. (2004)
distinguent six sous-classes de flavonoïdes (Figure 1).
Figure 1: Classification des polyphénols et segmentation des flavonoïdes (d'après les données de Manach et
al.,2004)
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c) Les sources alimentaires de polyphénols
Les polyphénols sont des micronutriments que l’on retrouve amplement dans notre régime
alimentaire (Manach et al., 2004). Ce sont également les antioxydants les plus abondants dans notre
alimentation (Tapiero et al., 2002).
Les fruits, les légumes, les noix, le vin, les oignons et le thé en sont des sources importantes (Motilva
et al., 2013). Selon les aliments, différents types de polyphénols vont être présents (Tableau 1).
Tableau 1 Exemples de différentes sources alimentaires des polyphénols
Classification
Acides phénoliques
Flavonoïdes
Stilbènes
Lignanes
Exemples
Acide gallique
Flavanols
Flavones
Flavonols
Flavanones
Anthocyanidines
Isoflavones
Resvératrol
Matairesinol
Sources alimentaires
Noisettes, épices
Thé, cacao
Huile d’olive, persil
Oignons, thé
Orange
Fruits rouges
Soja, légumineuses
Raisin, vin
Graines de lin
Les flavonoïdes sont les polyphénols les plus abondants dans notre alimentation. Ils sont
majoritairement représentés par la myricétine, la quercétine et la kaempférol (Figure 2) qui
appartiennent à la sous-classe des flavonols. La quercétine est le flavonol principal de notre régime et
est particulièrement abondant dans les oignons et dans le thé à hauteur de 10 à 25 mg/L (Tapiero et
al., 2002).
R1=OH, R2=OH, R3=OH : myricétine
R1=OH, R2=OH, R3=H : quercétine
R1=H, R2=OH, R3=H : kaempférol
Figure 2: Structure chimique commune de la
myricétine, quercétine et kaempférol
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d) La biosynthèse des polyphénols
Les polyphénols possèdent deux voies principales de biosynthèse1 : la voie du shikimate et la voie de
l’acétate (Figure 3).
Figure 3 : Les voies de biosynthèse des polyphénols
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http://spiral.univ-lyon1.fr/ensccf/files_m/M158/Files/4483_858.pdf
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2. Les polyphénols du thé vert et du thé noir
a) Vue d’ensemble
En général, les feuilles de thé vert contiennent environ 36% de polyphénols (Perva-Uzunalic
et al., 2006). Les classes principales des polyphénols présents dans le thé vert sont les flavanols et les
flavonols. Ils constituent 16 à 30% du poids sec de la feuille fraîche. Parmi les flavanols, les flavan-3ols, qui sont également connus sous le nom de catéchines, représentent les constituants
polyphénoliques majoritaires (Komes et al., 2010).
Les jeunes pousses contiennent de 200 à 340 mg de catéchine, gallocatéchine et ses dérivés par
gramme de feuilles sèches. Dans le thé noir, leur teneur est réduite de moitié environ en raison de leur
oxydation en polyphénols plus complexes pendant la fermentation.
Les feuilles de Camellia sinensis var. sinensis et de Camellia sinensis var. assamica contiennent environ huit
catéchines : la catéchine (C), l’épicatéchine (EC), la gallocatéchine (GC), l’épigallocatéchine (EGC), la
catéchine gallate (CG), la gallocatéchine gallate (GCG), l’épicatéchine gallate (ECG) et
l’épigallocatéchine gallate (EGCG) (Yang et al., 2007). Perva-Uzunaic et al., (2006) segmentent ces huit
catéchines en deux catégories : les catéchines primaires et les catéchines secondaires (Tableau 2). Parmi
les 36% de polyphénols totaux, l’épigallocatéchine gallate (EGCG) est la forme prédominante dans le
thé vert avec une teneur dans les feuilles comprise entre 48 et 55%.
Tableau 2 : Classification des catéchines d'après les données de Perva-Uzunaic (2006)
Catéchines primaires
épicatéchine (EC)
épicatéchine gallate (ECG)
épigallocatéchine gallate (EGCG)
épigallocatéchine (EGC)
Catéchines secondaires
catéchine (C)
catéchine gallate (CG)
gallate catéchine (GC)
gallocatéchine gallate (GCG)
D’après Peng et al., 2008, la quantité de catéchines varie selon plusieurs facteurs
environnementaux tels que la variété, le mode de culture du thé ou encore le climat. L’acide gallique
est le neuvième polyphénol majoritairement trouvé dans le thé.
b) Les rôles des polyphénols du thé
Le thé vert a été étudié pour sa capacité à prévenir et à traiter une variété de cancers comme
celui du sein et de la peau. Il a aussi été étudié pour sa capacité à prévenir le développement de maladies
cardiovasculaires en diminuant les taux de cholestérol. La consommation de thé vert serait également
corrélée à la perte de poids, à la protection de la peau contre les effets néfastes du soleil et à
l’amélioration des fonctions cognitives (Roman et al., 2013). De plus, d’autres effets bénéfiques du thé
ont été soulignés telles que ses propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et anti-obésité. Ces effets
ont été partiellement attribués aux alcaloïdes de purine et principalement aux composés phénoliques
(Peng et al.,2008).
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Partie 2 : Le dosage des polyphenols du thé par HPLC
De nombreuses études se sont focalisées sur la détermination des catéchines et de la caféine du
thé par électrophorèse capillaire, bien que l’HPLC soit l’approche la plus utile pour les analyses de
routine et la recherche des constituants du thé non volatiles, ce qui inclut les catéchines et les alcaloïdes
(Fernandez et al., 2000). Rahim et al. (2014) affirment que l’HPLC est la méthode la plus utilisée pour
l’analyse des catéchines, de l’acide gallique, des alcaloïdes et de la théanine du thé.
1. Extraction des polyphénols du thé
a) Les facteurs d’extraction
L’extraction, qui est le procédé initial de l’analyse des polyphénols du thé, est une étape
essentielle dans la récupération et la purification des composés phénoliques. Des facteurs tels que le
thé, le type de solvant, le ratio solvant/matériel à extraire, le couple temps/température ou encore le
pH influencent l’efficacité et la qualité de l’extraction (Bae et al., 2014).

Le thé
D’après Perva-Uzunalic et al. (2006), le climat, la saison, la variété de thé ou encore l’âge de la
feuille sont autant de paramètres responsables de la variation de la composition du thé. Bae et al. (2014)
ont identifié des conditions d’extraction optimales selon le type de thé à analyser.
Type de thé
Thé vert
Thé Oolong
Thé noir
Temps d’extraction
(min)
123
98
105
Température
d’extraction
70°C
70°C
71°C
Solvant
Ethanol (75%)
Ethanol (69%)
Ethanol (63%)
Au delà du type de thé (vert, Oolong ou noir), certains auteurs ont pris en compte un autre paramètre,
à savoir la forme sous laquelle se trouve le thé. Komes et al., (2010) ont démontré que l’extraction
aqueuse était la plus efficace à 80°C avec une durée d’extraction différente selon le thé analysé : 5
minutes (thé en poudre), 15 minutes (thé en sachet) et 30 minutes (thé sous forme de feuilles libres).

Le type de solvant
Pour l’analyse des catéchines de thés verts commerciaux, Friedman et al., (2006) ont mis en
évidence que l’éthanol aqueux était un solvant efficace pour l’extraction des composés du thé. Rusak et
al., (2008) ont également affirmé que l’éthanol aqueux (40%) a été le solvant d’extraction le plus efficace
lors d’une durée d’extraction prolongée de 30 minutes pour l’ensemble des thés en sachet. PervaUzunalic et al. (2006) ont expérimenté différents solvants d’extraction pour un thé bas de gamme en
sachet. En effet, l’eau, l’acétone, le méthanol, l’éthanol, l’acétonitrile ainsi que des mélanges de solvants
aqueux ont été testé à différentes concentrations (25, 50, 80 % v/v) afin d’identifier le solvant optimal
pour cette extraction spécifique des composés phénoliques du thé.
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
Le couple temps / température
Selon Komes et al., (2010), une eau à température plus élevée associée à une durée d’extraction
courte ou alors une eau à température plus basse associée à une durée d’extraction plus longue sont les
combinaisons optimales pour l’extraction des composés bioactifs du thé.
À travers son étude sur l’extraction des composés actifs du thé vert, Perva-Uzunalic et al. (2006)
ont démontré qu’une température de 95°C couplée à une durée d’extraction de 5 à 10 minutes ou bien
qu’une température moyenne de 60 à 80°C couplée à une durée d’extraction de 20 minutes étaient les
combinaisons optimales pour extraire les polyphénols du thé. D’après leur analyse, les quantités
maximales de catéchines majoritaires du thé vert analysées ont été obtenues après 20 minutes à 80°C
et après 10 minutes à 95°C.
D’autres auteurs étudient l’influence des facteurs décrits précédemment de façon simultanée.
À travers leur étude sur l’extraction des composés actifs du thé, Perva-Uzunalic et al. (2006) ont testé
l’influence de plusieurs paramètres tels que la durée d’extraction (80°C, 95°C) et le solvant (eau,
acétone, acétonitrile). L’efficacité de l’extraction a également été mesurée en décomposant cette
dernière en plusieurs étapes. Les combinaisons optimales des facteurs d’extraction ont été déterminées
à une température de 80°C pour une durée de 20 minutes et à 95°C pour une durée de 10 minutes avec
comme solvant l’eau.
b) Méthodes d’extraction
 Extraction par solvant aqueux
Les chercheurs qui ont choisi d’extraire les polyphénols du thé par solvant aqueux suivent une
démarche expérimentale commune (Figure 4).
Bronner et Beecher (1998), ont extrait les polyphénols d’un thé noir en sachet Lipton et d’un thé
vert en sachet Dragon Well. Pour le thé noir, un sachet de thé a été mis en présence de 237 mL d’eau
bouillante durant 3 minutes. Pour le thé vert, 0,25g de thé ont été mis en présence de 80 mL d’eau
bouillante durant 3 minutes également. Les deux infusions de thé obtenues ont été filtrées sur filtre
nylon et injectées par HPLC.
Certains auteurs ont réalisé cette extraction sur une durée beaucoup plus longue. En effet, Peng et al.
(2008) ont réalisé une extraction des polyphénols du thé en infusant 0,1g dans 50 mL d’eau chauffée à
90°C pendant 30 minutes. Les filtrats ont été dilués dans 100 mL. La solution a ensuite été filtrée sur
un filtre nylon de 0,45 µm et analysée par HPLC. D’autres équipes, comme Guillarme et al. (2010) ont
infusé des quantités plus importantes de thé à savoir 2g de Lipton Ceylan en sachet dans 200 mL d’eau
bouillante durant 5 minutes. Après un refroidissement à température ambiante, l’échantillon a été filtré
sur filtre nylon de 0,45 µm et injecté tel quel pour l’UHPLC-UV et dilué au 10ème avec de l’eau pure
pour l’UHPLC-MS.
Naldi et al. (2014), ont infusé 1g de thé dans 50 mL d’eau à 85°C durant 15 minutes.
L’échantillon a ensuite été filtré sur filtre en papier, puis sur un filtre syringue (0,22µm). Le filtrat a
été dilué au dixième, au centième ou au deux centième selon la teneur en catéchine dans l’eau. Wu et
al. (2012) ont infusé 2g de thé en présence de 100 mL d’eau chauffée à reflux pendant 2h. L’infusion a
été filtrée sur filtre membrane de polyvinylideme difluoride d’épaisseur 0,45 µm.
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Figure 4 : Représentation schématique de l'extraction par solvant aqueux des polyphénols du thé
 Extraction par solvant hydroalcoolique
Perva-Uzunalic et al. (2006), ont extrait les polyphénols du thé en utilisant un solvant organique.
Dans un ballon à fond rond, 1g de thé vert a été mis en présence de 40 mL d’éthanol à 60% et de 5 mL
d’HCL 6 M. Le mélange est laissé 2h à 95°C et agité de manière constante.
L’hydrolysat est refroidi, filtré dans une fiole de 50 mL et dilué avec de l’éthanol à 60% jusqu’au trait.
Un mélange d’eau et d’éthanol a été utilisé par Friedman et al. (2006) pour extraire les
composés phénoliques des thés analysés. Dans une fiole équipée d’un condenseur à reflux, 1,5g de thé
ont été mis en présence de 50 mL de mélange éthanol/eau en suivant les proportions 80:20 (v:v). Le
mélange a ensuite été chauffé dans un bain d’eau à 60°C durant 15 minutes. Il s’en est suivi une
sonication pendant 5 minutes. Après refroidissement, le mélange a été extrait deux fois avec le même
solvant. Les surnageants ont été combinés puis filtrés sur filtre nylon de 0,45 µm.
Rusak et al. (2008), ont fait varier les paramètres d’extraction des polyphénols du thé en
mesurant l’influence de la durée d’extraction et de la concentration en éthanol aqueux (10,40 et 70%).
Pour ce faire, 2g de thé ont été mis en présence de 200 mL d’éthanol aqueux à 10, 40 et 70%. Le
mélange a été infusé à 5, 15 ou 30 minutes. L’infusion a ensuite été filtrée sur une passoire à thé.
 Conclusion
Il existe un grand nombre de techniques pour extraire les polyphénols du thé. De ce fait, la méthode
de Bronner et Beecher (1998) semble être une méthode simple, rapide et peu coûteuse qui peut-être
mise en place au cours d’une séance de travaux pratiques. Une durée d’extraction inférieure à 5 minutes
et l’utilisation d’eau constituent les deux avantages principaux de cette technique d’extraction.
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2. Analyse des polyphénols du thé par HPLC
Couplée à un détecteur UV, la Chromatographie Liquide Haute Performance en phase inverse (RPHPLC) est la méthode de choix pour analyser les catéchines du thé (Guillarme et al., 2010). L’analyse
des polyphénols du thé par HPLC se décompose en trois étapes clés qui sont la séparation,
l’identification et la quantification.
2.1.
Conditions chromatographiques
Toutes les conditions chromatographiques utilisées par les auteurs sélectionnés sont répertoriées dans
le Tableau 3.
2.1.1. Choix de la phase stationnaire : la colonne HPLC
Pour analyser les polyphénols du thé tels que les catéchines, les colonnes C18 monomériques
avec groupement polaire sont préférables car elle permettent une meilleure sélectivité (Guillarme et
al., 2010). En effet, El-Shahawi et al. (2012) ont utilisé une colonne C18 PartiSphere (250 mm X 4,6
mm, 5 µm) fournie par Whatman® pour séparer les constituants de 29 échantillons de thés
commerciaux ; tout comme Komes et son équipe en 2010 et Rusak et al. en 2008 qui ont séparé quatre
catéchines, trois flavonols et un flavone en 41 minutes. Ce temps d’analyse a été divisé par deux par
Wang et al. (2001) qui ont effectué une analyse des flavonols de thé vert et de thé noir sur une colonne
C18 RP Kingsorb (150 mm X 4,6 mm, 5µm) fournie par Phenomenex® . D’autres auteurs comme Peng
et al. (2008) ont utilisé une colonne amide C16 Discovery RP-Amide (150 mm X 4,6 mm, 5µm) fournie
par Supelco® et ont analysé quatorze composés de Camellia sinensis var assamica et de Camellia sinensis
var sinensis en 45 minutes.
2.1.2. Phase mobile et gradient d’élution
Le solvant d’élution employé pour l’analyse des polyphénols du thé est généralement réalisé à
partir de deux phases mobiles comme le démontrent Friedman et son équipe en 2006. En utilisant
comme solvant A une solution d’acétonitrile et comme solvant B une solution de phosphate de
potassium à 20 mmol/L à un débit de 1 mL/min, sept catéchines, quatre théaflavines et trois alcaloïdes
de quatre thés différents ont été séparés en 70 minutes.
D’autres auteurs utilisent le même solvant pour leurs deux phases mobiles mais dans des
proportions différentes. Par exemple, Roman et al. (2013) ont utilisé un mélange d’acétonitrile, d’eau
et d’acide phosphorique aux proportions respectives de 50/950/1 pour le solvant A et de 350/650/1
pour le solvant B. À un débit de 0,96 mL/min, ils ont séparé sept catéchines du thé vert en 13 minutes.
Bae et al. (2014) ont aussi utilisé une phase mobile à base d’acétonitrile avec un mélange acide acétiqueacétonitrile (A) et acide acétique-eau (B).
Des publications plus anciennes ont séparé et déterminé le contenu des principales catéchines
d’infusions du thé noir Lipton et du thé vert Dragon Well en suivant trois gradients : acétonitriletampon acétate (A), méthanol-tampon acétate (B) et acétonitrile-tampon acétate- acide ascorbique (C)
à un débit de 0,7 mL/min (Bronner et Beecher, 1998).
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2.1.3. La détection UV
L'éventail des longueurs d'onde des flavanols, flavones et isoflavones, s'échelonne entre 254
nm-280 nm2. Komes et al. (2010) détectent un maximum d’absorbance à 278 nm, tout comme Roman
et al. (2013). Des analyses s’effectuent à des longueurs d’onde relativement proches comme Wu et son
équipe (2012) qui détectent un maximum d’absorption à 270 nm. D’autres auteurs s’éloignent plus de
ce maximum d’absorption comme El-Shahawi et al. (2012) fixé à 205 nm et Yang et al. (2007) à 231
nm.
2.2.
Étalonnage
Les constituants des infusions de thé ont été identifiés grâce aux solutions standards injectées
dans l’HPLC (Figure 4) et aux données de la littérature scientifique qui fournit des données sur les
temps de rétention des composés.
300


250


mAU
200

150




 
 


100

50
0
3


11

45
10
7,5
15
13
20
18
Temps (minutes)
Figure 5 : Représentation schématique du chromatogramme des standards de catéchines et de l’acide gallique
1 = acide gallique (AG), 2 = gallocatéchine (GC), 3 = théobromine (Tb), 4= épigallocatéchine (EGC), 4 = catéchine
(C), 5 = catéchine (C), 6= caféine, 7= épigallocatéchine gallate (EGCG), 8 = épicatéchine (EC), 9 = gallocatéchine
gallate (GCG), 10 = épicatéchine gallate (ECG), 11 = catéchine gallate (d’après les données de Wang et al.,
2003)
2
http://www.academia.edu/1127801/Analyse_de_quelques_tannins_v%C3%A9g%C3%A9taux_utilis%C3%A9s_pour_la_fa
brication_des_cuirs
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Tableau 3 : Conditions chromatographiques de l'HPLC utilisées pour le dosage des polyphénols du thé et de d'autres espèces bioactives
Phase stationnaire
Référence
Colonne
Bae et al., 2014
Roman et al., 2013
C18
Dimensions
Marque (Fabriquant)
150 mm X 4,6 mm, 3 µm Scherzo SS-C18 (Waters)
Ascentis Phenyl 100 mm X 3,0 mm, 3 µm Ascentis Phenyl (Supelco)
Phase mobile
T°C colonne Débit (mL/min)
30°C
0,4
35°C
0,96
El-Shahawi et al., 2012
C18
250 mm X 5,0 mm, 5 µm PartiSphere 5 (Whatman)
32°C
1,0
Wu et al., 2012
C18
250 mm X 4,6 mm, 5 µm Luna (Phenomenex)
30°C
0,7
Komes et al., 2010
C18
250 mm X 4,6 mm, 5 µm Pinnacle II (Restek)
np
1,0
Rusak et al., 2008
C18
250 mm X 4,6 mm, 5 µm Zorbax RX-C18 (Agilent Technologies)
Peng et al., 2008
C16
150 mm X 4,6 mm, 5 µm Discovery RP-Amide (Supelco)
Yang et al., 2007
C18
150 mm X 4,6 mm, 5 µm
Friedman et al., 2006
C18 (ODS)
NP
1,0
30°C
35°C
40°C
0,8
40°C
1,0
250 mm X 4,0 mm, 5 µm Inertsil ODS-3v (GL Sciences)
30°C
1,0
Cat.
No.25396-96 Mightysil (Kanto chemical Co. Inc.)
Sharma et al., 2005
C18
250 mm X 4,0 mm, 5 µm Lichrocart
35°C
1,0
Wang et Helliwell., 2001
C18
150 mm X 4,6 mm, 5 µm Kingsorb (phenomenex)
30 °C
1,0
Bronner et Beecher, 1998
C18
250 mm X 4,6 mm, 5 µm Alltima (Alltech)
ambiante
0,5
Solvant A
Solvant B
Solvant C
Gradient d'élution
0-21 min : 5% A à 20% A
21-30 min : 20% A à 25% A
CH3COOH/CH3CN
CH3COOH/H2O
30-32 min : 25% A à 100% A
(1/99, v/v)
(1/99, v/v)
32-39 min : 100% A
39-40 min : 100% A à 5% A
40-45 min : 5% A
CH3CN/H2O/H3PO4
CH3CN/H2O/H3PO4
0 min : 0% A et 0% B
(50/950/1, v/v/v + 0,1g/L EDTA) (350/650/1, v/v/v + 0,1g/L EDTA)
9 min : 100% A et 100% B
0 min : 90% A et 10% B
CH3CN à 5% + 0,035% CF3COOH CH3CN à 50% + 0,025% CF3COOH
10 min : 20% B
(v/v)
(v/v)
10-30 min : 20% B à 40% B
0-14 min : 95% A et 5% B
14-25 min : 5% B à 15% B
CH2O2 (aqueux)
ACN
25-53 min : 15% B à 35% B
53-65 min : 35% B à 85% B
0-20 min : 2% B à 32% B
20-30 min : 32% B à 40% B
3% CH2O2
CH3OH
30-40 min : 95% B
40-45 min : 95% B
0 min : 90/10/0
10 min : 70/30/0
H2O/ACN/CH2O2
H2O/ACN/CH3OH/CH2O2
ACN/CH2O2
20 min : 0/100/0
(94/5/1, v/v)
(50/24,5/24,5/1, v/v)
(99/1, v/v)
36 min : 0/0/100
41 min : 0/0/100
0-4 min : 2% B
H3PO4 (85%) et H2O
4-21 min : 2% B à 9% B
CH3CN
(0,05:99,95, v:v)
21-32 min : 9% B à 23% B
32-45 min : 23% B
0-7 min : 90% A et 10%B
CH3CN + H3PO4 à 0,05%
CH3CN à 5% ou à 50% (v/v)
7-10 min : 10% B à 15% B
(v/v)
10-20 min : 15% B à 70% B
0-7 min : 7% A et 93% B
7 min-20 min : 10% A
20 min - 25 min : 15% A
CH3CN
KH2PO4
25 min - 30 min : 20 % A
45 min - 70 min : 25% A
70,1 min - 75,0 min : 40% A
75,1 min - 90,1 min : 7% A
0-10 min : 10 à 30% A et 90 à
70% B
10-15 min : 30 à 35% A et 70 à
CH3CN/0,1% H3PO4 dans eau
CH3OH/0,1% H3PO4
65% B
(w/v)
(w/v)
15-18 min : 35 à 20% A et 65 à
80% B
18-20 min : 20 à 10% A et 80 à
90% B
30% CH3CN
np
dans tampon KH2PO4 à 0,025M
0-18 min : 12% A à 21% A
CH3CN/tampon acétate dans
CH3OH aqueux/tampon acétate
18-40 min : 21% A à 65% A
eau (0,7 mL/min)
(0,5 mL/min)
0-40 min : 30% B à 50% B
np = non précisé
15
λ détecteur
270 nm
278 nm
205 nm
270 nm
278 nm
268 nm
280 nm
374 nm
310 nm
350 nm
210 nm et 280 nm
231 nm
200 à 700 nm
210 nm
370 nm
de 210 nm
©
2.3.
Analyse des polyphénols et de la caféine du thé vert
2.3.1. Les catéchines
Quelles que soient les conditions chromatographiques utilisées, les catéchines du thé suivent
un ordre d’élution similaire où la gallocatéchine (GC) est éluée en premier et la catéchine gallate (CG)
en dernier (Figure 5). Cependant, les temps d’élution de chacune des catéchines varient en fonction des
conditions établies par les auteurs (Tableau 4).
GC
EGC
C
EC
EGCG
GCG
ECG
CG
Figure 6 : Représentation schématique de l'ordre d'élution des catéchines du thé
Le thé vert possède une plus grande quantité de catéchines que le thé noir. C’est ce qu’a
démontré Bae et al. (2014) qui a estimé cette quantité à hauteur de 49,18 mg/g contre 1,48 mg/g dans
le thé noir. D’autres chercheurs ont conclu que la quantité en catéchines s’élevait entre 96 et 696 mg/g
de thé (Friedman et al. 2006). Selon le thé vert analysé, la quantité totale de catéchines variait entre
0,113 mg/g de thé et 43,3 mg/g de thé d’après l’étude de El-Shahawi et al. (2012). Yang et al. (2007)
ont analysé sept catéchines dans le thé vert (GC, EGC, C, EC, EGCG, GCG, ECG) et ont trouvé un
contenu total en catéchines de 10,81%.
L’EGCG est la catéchine dont la quantité est la plus élevée dans les infusions de thé et l’EC est
celle qui est en quantité la plus faible (Bronner et Beecher, 1998). En effet, le contenu en EGCG d’un
thé vert commercial varie entre 22 et 53 mg/g de thé commercial (Namal Senanayake, 2013). ElShahawi et son équipe (2012) ont mesuré pour l’EGCG une concentration comprise entre 1,01 et 43,3
mg/g. Komes et al. (2010) ont déterminé que l’EGCG était la catéchine prédominante avec une
concentration comprise entre 94,54 et 357,07 mg/L.
Wu et son équipe (2012) ont analysé quatre catéchines du thé vert et ont également conclu que
l’EGCG était présent en plus grande quantité, suivi de l’ECG, de l’EGC et de l’EC (Tableau 6). Les
quantités des composés analysés dans l’ordre décroissant sont les suivantes :
EGCG>EGC>ECG>EC>C>caféine (El-Shahawi et al., 2012)
2.3.2. Les acides phénoliques et les flavonols
D’après les résultats qualitatifs des autres composés phénoliques du thé (Tableau 5), l’acide
gallique est élué avant les catéchines et les flavonols sont élués avec les catéchines. Komes et al. (2010)
ont déterminé une concentration en acide gallique comprise entre 2,41 ± 0,24 et 14,70 ± 1,63 mg/L
selon le thé analysé (Tableau 6).
Les quantités de flavonols calculées par rapport au poids sec des feuilles de thé vert étaient comprises
entre 0,83-1,59, 1,79-4,05 et 1,56-3,31 g/kg pour la myricétine, la quercétine et la kaempférol
respectivement (Wang et Helliwell, 2001).
16
©
2.3.3. Les alcaloïdes de purine
Yang et al. (2007) ont analysé 3 alcaloïdes de purine (théophylline, théobromine, caféine) et ont trouvé
une quantité totale d’alcaloïdes de purine de 2,99%. Le principal alcaloïde de purine du thé vert est la
caféine avec une concentration de 2,985 ± 0,0008% et la quantité totale d’alcaloïdes de purine
déterminée était de 2,97%, ce qui est en adéquation avec le résultat précédent (Peng et al., 2008).
Tableau 4 : Résultats qualitatifs des catéchines du thé - Temps de rétention (minutes) – nd : non déterminé
Référence
Couplage
Bae et al., 2014
UV
Roman et al., 2013
UV
UV
Wu et al., 2012
UV et MS
Rusak et al., 2008
UV
Peng et al., 2008
UV
Yang et al., 2007
UV
Sharma et al., 2005
UV
UV
Conditions de l'HPLC
GC
Temps de rétention des catéchines (min)
EGC
C
EC EGCG GCG ECG CG
Colonne : C18 (150 mm X 4,6 mm, 3 µm)
T°C colonne : 30°C
Débit : 0,4 mL/min
nd 12,1 nd 16,8 20,5
Détection UV : 270 nm
Temps de run total (min) : <32
Colonne : Ascentis Phenyl (3,0 mm X 100 mm, 3 µm)
Débit : 0,96 mL/min
2,7 3,7 4,1 4,9 5,5
Temps de run total (min) : 13
Colonne : C18
Débit : 1,0 mL/min
nd 7,3 11,2 15 15,8
Temps de run total (min) :
Colonne C18 (250 mm X 4,6 mm, 5 µm)
Débit : 0,7 mL/min
13,9 17,9 20,5 25,5 nd
Temps de run total (min) : 44,10*
T°C colonne : NS
Débit : 1,0 mL/min
nd 10,5 nd
nd
14
Détection UV :280 nm
Colonne C16
T°C colonne : 30°C, 35°C, 40°C
Débit : 0,8 mL/min
18,6 25,5 26,6 30 34,1
Débit : 1,0 mL/min
3,48 5,6 7,37 12,8 13,2
Colonne C18 (250 mm x 4,0 mm, 5µm)
Débit : 1,0 mL/min
nd 5,75 7,6 10,1 11,3
T°C colonne : ambiante
Débit : 0,5 mL/min
nd 10,5 nd 18,2 15
Temps de run total (min) : 24,1
nd
25,4 26,4
5,7
6,8
nd
nd
20,6
nd
31,3 40,4 41,2
16,5
19
nd
36,5 38,7 42,5
15,7 18,5
nd
nd
16,9
nd
nd
24,1
nd
17
©
Tableau 5: Analyse qualitative des composés phénoliques (hors catéchines) et des principaux alcaloïdes de purine du thé – Temps de rétention (min)
Temps de rétention d'autres composés bioactifs du thé (min)
alcaloïdes de purine
flavonols
Référence
Bae et al., 2014
Roman et al., 2013
Wu et al., 2012
KAEMPFEROL
AG
Cf
Tb
Tp
UV
Colonne : C18 (150 mm X 4,6 mm, 3 µm)
Débit : 0,4 mL/min
Temps de run total (min) : <32
5,2
12,6
nd
nd
nd
nd
nd
nd
4,5
nd
nd
nd
nd
nd
10
19,83
12,42
nd
11,32
20,17
12,6
15,63
nd
nd
nd
3,07
9,65
3,85
5,15
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
5,0
9,0
17,0
nd
10,95
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
23
25,5
28
nd
8,5
3,2
nd
nd
nd
nd
nd
20
8
11
nd
nd
nd
Colonne : Ascentis Phenyl (3,0 mm X
100 mm, 3 µm)
Débit : 0,96 mL/min
UV
UV et MS
UV
Sharma et al., 2005
UV
Wang et Helliwell, 2001
UV
UV
Rusak et al., 2008
UV
Friedman et al ., 2006
QUERCÉTINE
Conditions de l'HPLC
Peng et al., 2008
Yang et al ., 2007
MYRICÉTINE
Couplage
UV
UV
Débit : 0,7 mL/min
Colonne C16
T°C colonne : 30°C, 35°C, 40°C
Débit : 0,8 mL/min
Temps de run total (min) :45
Colonne C18 (250 mm x 4,0 mm, 5µm)
Débit : 1,0 mL/min
Détection UV : 210
Colonne C16
Débit : 0,8 mL/min
Colonne : C18
Débit : 1,0 mL/min
Temps de run total (min) :
T°C colonne : NS
Débit : 1,0 mL/min
Détection UV :280 nm
Débit : 1,0 mL/min
Colonne : C18 (250 mm X 4,0 mm, 5
µm)
Débit : 1,0 mL/min
Temps de run total (min) : 90,1
M3OR M3O glu Q3OGR gal Q3OGR glu
33,21
34,95
35,51
36,51
Q3R
38,49
M3OR : Myricétine-3-O-rhamnosyglucoside; M3O glu : Myrécitine-3-O-glucoside;
Q3OGR gal : Quercétine-3-O-glucosyl-rhamnosyl-galactoside; Q3OGR glu : Quercétine-3-O-glucosyl-rhamnosyl-glucoside;
Q3R : Quercétine-3-rutinoside; Q3D gal : Quercétine-3-D-galactoside
K3OR : Kaempferol-3-O-rutinoside; K3O gal : Kaempferol-3-O galactoside;
K3O glu : Kaempferol-3-O-glucoside
18
Q3D gal K3OR K3O gal K3O glu
39,99
42,15
42,89
44,1
©
Tableau 6 : Résultats quantitatifs des polyphénols et des alcaloïdes de purine contenus dans le thé vert
Réf.
Couplage
Conditions extraction
Solvant : éthanol
T°C : 70°C
Durée :90 min
Bae et al., 2014
UV
Rusak et al., 2008
UV
Solvant : éhanol aqueux (40%)
Durée : 30 min
Roman et al., 2013
UV
Solvant : Diluent 2*
Durée : 15 min
UV
Solvant : eau
T°C : 100°C
Durée : 30 min
Thé analysé
Thé vert
Long Jing
{en sachet}
(Chine)
réf. : SRM 3254 (standard du NSTI)
{en poudre lyophilisée}
(USA)
Thé vert White Needle
{feuilles libres}
(Chine)
UV
Peng et al., 2008
UV
Yang et al., 2007
UV
Thé vert Franck
{en sachet}
Taylors of Harrogate
{en sachet}
(Royaume-Uni)
Long Jing
{feuilles libres}
(Chine)
Long Jing
{feuilles libres}
(Chine)
Thé vert
{feuilles libres}
(Chine)
Solvant : eau
T°C : 80°C
Durée : 3 min
Solvant : eau
T°C : 90°C
Durée : 30 min
Solvant : eau
T°C : 90°C
Durée : 30 min
Sharma et al., 2005
UV
Solvant : méthanol aqueux
(70%)
Durée : 30 min
Bronner et Beecher,
1998
UV
Solvant : eau
T°C : 100°C
Durée : 20 min
Thé vert Sullah
{feuilles libres}
(Inde)
Thé vert Dragon Well
{en sachet}
(Chine)
GCG
GC
CG
Total
acide phénolique
AG
Cf
0,47 ± 2,3
nd
7,05 ± 3,3
1,80 ± 0,8
nd
4,97 ± 1,7
20,50 ± 1,2
nd
nd
187 ± 1,8
43,1 ± 1,7
10,2 ± 0,4
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
8,38 ± 0,43
51,6 ± 1,12
13,1 ± 1,12
3,06 ± 0,18
8,01 ± 1,2
nd
111 ± 2,1
nd
23,1 ± 0,31
nd
nd
9,5
43,3
13,9
nd
nd
nd
nd
nd
1,97
nd
nd
5,77 ± 0,32
202,29 ± 16,51
58,65 ± 3,80
19,80 ± 1,01
EGC
C
EC
EGCG
mg/g de thé
6,00 ± 4,0
nd
5,48 ± 1,4
11,04 ± 0,7
mg/g de thé
59,6 ± 0,1
nd
nd
mg/g de thé
25,5 ± 0,64
1,31 ± 0,14
mg/g de thé
24,9
2,58
Thé vert Twinings of London
{en sachet}
(Royaume-Uni)
Komes et al., 2010
catéchines
ECG
Unités
Tb
Tp
235,94 ± 18,73
27,58 ± 2,41 114,98 ± 9,18 326,80 ± 25,55 166,42 ± 7,55 9,31 ± 0,73
192,12 ± 16,31
nd
1073,15
184,33 ± 14,37
24,99 ± 1,64 89,43 ± 7,21 191,59 ± 12,18 75,35 ± 4,28
5,23 ± 0,47
114,37 ± 11,24
nd
683,29
2,41 ± 0,24
151,73 ± 13,78
21,58 ± 1,11
8,57 ± 0,87
nd
31,14 ± 3,95 141,94 ± 6,54 357,07 ± 19,64 178,11 ± 9,64
nd
137,23 ± 12,62
nd
845,49
14,70 ± 1,63
246,71 ± 20,05
66,91 ± 0,94
27,01 ± 0,36
69,71 ± 2,12
43,72 ± 2,25 62,50 ± 5,26 209,95 ± 13,71
nd
nd
17,94 ± 0,36
nd
403,82
6,49 ± 0,52
248,38 ± 9,62
63,53 ± 2,11
15,71 ± 1,35
% ± standard deviation sur 3 mesures
1,04 ± 0,01
0,10 ± 0,01
0,22 ± 0,01
3,60 ± 0,13
0,69 ± 0,10
nd
1,61 ± 0,02
0,14 ± 0,01
nd
0,13 ± 0,01
2,98 ± 0,01
0,01 ± 0,01
ND
% ± moyenne des 3 réplicats
2,02 ± 0,01
0,46 ± 0,005 0,71 ± 0,003
3,51 ± 0,003
1,24 ± 0,004 1,33 ± 0,002
1,54 ± 0,03
nd
10,81
nd
2,72± 0,001
0,27 ± 0,01
ND
mg / g de poids sec
33
1,38
9,5
59,2
3,58
nd
nd
nd
106,66
110
46
5,5
1,99
mg/L
nd
40
nd
20
90
50
nd
nd
nd
nd
nd
nd
mg / L
Légende :
*Diluent 2 : EDTA (200 mg) + 2L eau + 2mL acide phosphorique (85%)
nd : non déterminé
ND : non détecté
19
©
2.4.
Analyse des polyphénols et de la caféine du thé noir
2.4.1. Les catéchines
Le thé noir contiendrait une quantité moindre de catéchines par rapport au thé vert, à savoir
1,48 mg/g. Les raisons de ces différences de quantités de catéchines s’expliquent par l’oxydation et la
polymérisation des catéchines par des enzymes dérivées des feuilles de thé pendant la production de
thé noir à partir de la fermentation du thé vert (Bae et al.,2014).
Les constituants majeurs du thé noir identifiés sont, comme pour le thé vert, l’ECG, l’EC,
l’EGCG et l’ECG (Bronner et Beecher, 1998) dont les concentrations suivent l’ordre décroissant
suivant : EGCG > ECG > EGC > EC. Peng et al. (2008) ont également affirmé par leurs résultats que
le composé phénolique majoritaire du thé noir était l’EGCG et que l’EC possédait la concentration la
plus faible. Le contenu en EGCG d’un thé noir commercial avoisine les 4,0 mg/g de thé (Namal
Senanayake, 2013).
Yang et al. (2007) ont analysé 7 catéchines d’un thé noir de variété Kucha (GC, EGC, C, EC,
EGCG, GCG, ECG) et ont trouvé un contenu total en catéchines de 12,46%. Wu et al., (2012) ont
chiffré à 280 mg/g de thé la concentration des catéchines. L’EGCG était la catéchine majeure dans
toutes les variétés de thé représentant entre 44,6% et 53,7% des catéchines totales, ce qui est similaire
dans la plupart des variétés de thé en Chine.
2.4.2. Les acides phénoliques et les flavonols
L’acide gallique est l’acide phénolique le plus important dans le thé avec une concentration
comprise entre 0,57 et 1,37 mg/g de thé (Wu et al., 2012).
Wang et Helliwell (2001) ont analysé des contenus en flavonols compris entre 0,24 et 0,52, 1,04 et 3,03
et 1,72 et 2,31g/kg de poids sec pour la myricétine, la quercétine et la kaempférol respectivement.
2.4.3. Les alcaloïdes de purine
En ce qui concerne la caféine, les résultats d’une étude ont démontré que les feuilles de thé noir
Zhenong 25 contenait une quantité supérieure à 24 mg/g de thé alors que les feuilles de thé vert Ziya
avait un plus faible contenu en caféine avec seulement 15,66 mg/g (Wu et al., 2012).
L’équipe de Sharma (2005) a analysé l’ensemble de ces composés dans du thé noir Kangra orthodoxe.
Cinq catéchines (EGC, C, EC, EGCG, ECG), l’acide gallique et trois alcaloïdes de purine (caféine,
théobromine et théophylline) représentaient une quantité de 59,5 mg/g de poids sec.
20
©
Tableau 7 : Résultats quantitatifs des polyphénols et des alcaloïdes de purine du thé noir
catéchines
Réf.
Couplage
Yang et al., 2007
Sharma et al., 2005
UV
UV
UV
Fernandez et al., 2000
UV
Peng et al., 2008
UV
Conditions extraction
Solvant : eau
T°C : 100°C
Durée : 30 min
Solvant : méthanol aqueux
(70%)
Durée : 30 min
Solvant : eau
T°C :100°C
Durée :20 min
Thé analysé
Thé noir Kucha
Thé noir Orthodox Kangra
Thé noir Lipton
{en sachet}
Solvant : acétonitrile / eau
Thé noir Ceylon
T°C : ambiante
Durée :40 min
Thé noir Assam
Solvant : eau
T°C : 90°C
Durée : 30 min
Thé noir Kucha
Unités
EGC
C
EC
EGCG
ECG
acide phénolique
GCG
GC
% ± écart sur les 3 réplicats 2,95 ± 0,003 0,15 ± 0,003 0,38 ± 0,016 6,78 ± 0,001 0,90 ± 0,004 0,35 ± 0,005 0,95 ± 0,06
CG
TOTAL
AG
nd
12,46
nd
Cf
Tb
Tc
0,94 ± 0,02 0,45 ± 0,004 1,58 ± 0,006
Tp
nd
mg / g de poids sec
17
1
7,2
33
1
nd
nd
nd
nd
0,3
17,9
1,06
1,5
nd
mg/L
60
nd
40
12
11
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
% / poids sec
1,616
0,383
0,288
0,997
0,612
nd
nd
nd
nd
nd
2,63
nd
nd
nd
% / poids sec
1,601
0,462
ND
0,456
0,450
nd
nd
nd
nd
nd
3,28
nd
nd
nd
% / poids sec
1,29 ± 0,01
0,23 ± 0,06
nd
0,08 ± 0,01
0,20 ± 0,03 0,28 ± 0,01 7,28 ± 0,58 1,51 ± 0,15 3,69 ± 0,64 1,63 ± 0,01
nd : non déterminé
21
0,79 ± 0,02 0,80 ± 0,01 2,11 ± 0,03 0,006 ± 0,01
©
3. Analyse des polyphénols du thé par UHPLC
La méthode de séparation des polyphénols par HPLC requiert pour la plupart du temps une
durée d’analyse comprise entre 20 et 90 minutes par échantillon avec une moyenne de 20 à 40 minutes
pour séparer sept catéchines maximum. Bien que ces méthodes offrent un excellent pic de résolution,
certains inconvénients peuvent être soulignés comme la dégradation potentielle de l’échantillon dû au
temps écoulé entre l’extraction et l’analyse HPLC, la durée relativement longue de l’analyse ou encore
la consommation accrue de solvants. Pour pallier à ces inconvénients, des méthodes analytiques plus
récentes se développent. En effet, l’UHPLC est une chromatographie de séparation rapide qui possède
la particularité d’utiliser une colonne avec des particules inférieures ou égales à 2 µm. Couplée à la
spectrométrie de masse, cette technique donne de bons résultats en termes de rapidité d’analyse et de
résolution (Naldi et al., 2014)
D’après Guillarme et al. (2010), cette technologie a démontré de réels bénéfices en termes de
temps d’analyse, de pouvoir de résolution, de consommation de solvants et dans une moindre mesure,
la sensibilité.
3.1.
Conditions chromatographiques
Naldi et al. (2014) ont mis en place une UHPLC-UV pour contrôler la qualité du vert. Cette
méthode a permis d’identifier et de quantifier six catéchines et la caféine de thés verts d’origines
géographiques différentes (Sencha, Ceylon Green et Lung Chin). L’analyse a été réalisée en 3 minutes
sur une colonne C18 Waters Acquity BEH Shield RP18 (100 mm X 2,1 mm, 1,7 à une température de
60°C. Le solvant d’élution utilisé été le phosphate triethanolamine à un débit de 0,9 mL/min. Le
détecteur UV était fixé à 230 nm (Tableau 9)
Scoparo et al. (2012) ont utilisé une UHPLC-MS. Cette méthode a permis d’analyser certains
composés bioactifs de thés verts et de thés noirs du Brésil tels que les catéchines, la kaempférol, la
quercétine, la myricétine, l’acide gallique et la caféine. L’analyse a été réalisée en moins de 12 minutes
sur une colonne C18 Acquity BEH-C18 à une température de 60°C. Deux gradients d’élution ont été
utilisés : l’acide formique et le méthanol à un débit de 0,4 mL/min. (Tableau 9)
Guillarme et al., 2010, ont réalisé une analyse qualitative de polyphénols d’échantillons de thé en
utilisant une UHPLC couplée à un détecteur UV et à un spectromètre de masse. Les catéchines et
l’acide gallique du thé noir Lipton « Tea time finest Ceylan » ont été séparés en moins de 2 minutes
(Tableau 9 et Tableau 10) par une colonne C18 Acquity BEH Shield RP18 (150 mm X 2,1 mm, 1,7
µm) qui a été sélectionnée comme étant la colonne la plus appropriée parmi les autres colonnes testées :
-
3.2.
colonne C18 (50 mm X 2,1 mm, 1,9 µm)
colonne C18 (50 mm X 2,1 mm, 1,7µm)
colonne RP18 (50,100 X 2,1 mm, 1,7µm)
colonne phenyl (50 mm X 2,1 mm, 1,7 µm)
Résultats qualitatifs et quantitatifs
L’analyse par UHPLC a été validée en termes de précision et de détection de limites de
quantification (Naldi et al., 2014). Quelles que soient les conditions chromatographiques adoptées,
22
©
l’ordre d’élution des composés phénoliques ainsi que de la caféine était similaire (Figure 5). Cependant
les temps de rétention de ces composés sont variables selon la colonne, les solvants et le débit utilisés
(Tableau 10).
Alcaloïde de purine
AG
GC
CAF
EGC
Flavonols
C
EC
EGCG
GCG
ECG
CG
K3O
glu
K3Ogal
Catéchines (flavanols)
Figure 7 : Ordre d'élution de composés bioactifs des thés analysés par UHPLC (du temps de
rétention le plus court au temps de rétention le plus long)
Au niveau quantitatif, Guillarme et al., (2010) ont démontré par leur analyse haut débit que
l’ECG était le composé majoritaire, suivi de l’EC, de l’EGCG, de l’ECG, de C, de CG et de CGC. Naldi
et al. (2014) ont déterminé que la catéchine majoritaire était l’EGCG (Tableau 7).
Tableau 8 : Résultats quantitatifs des composés phénoliques et de la caféine contenus dans des échantillons de thés verts et
de thés noirs
23
©
Tableau 9 : Conditions chromatographiques utilisées pour la séparation, l'identification et la quantification de composés phénoliques de thés verts et de thés noirs par UHPLC
UV : détecteur UV, MS : spectromètre de masse, Tr : Temps de rétention
AG : Acide gallique, GC : Gallocatéchine, CAF : Caféine, EGC : Épigallocatéchine, C : Catéchine, EC : Épicatéchine, EGCG : Épigallocatéchine gallate, GCG : Gallocatéchine gallate, ECG :
Épicatéchine gallate, CG : Catéchine gallate, K3O gal : Kaempferol-3-O galactoside, K3O glu : Kaempferol-3-O-glucoside
* : correspond au temps d’élution du dernier composé lorsque le temps de run total n’est pas précisé dans la publication
* correspond au temps d’élution du dernier composé phénolique
Tableau 10 : Identification de composés phénoliques de thés verts et de thés noirs après analyse par UHPLC.
24
©
Conclusion
L’HPLC est la méthode la plus utilisée pour l’analyse des catéchines, de l’acide gallique et des
alcaloïdes de purine du thé.
Cependant, il est important de souligner que le thé est une matrice complexe à analyser. En
effet, la comparaison des résultats est parfois difficile étant donné le manque d’uniformité dans les
conditions utilisées pour l’extraction du thé. La préparation des infusions de thé comme le ratio
feuille/eau, la durée d’extraction et la température de l’eau sont autant de paramètres variables en
fonction des études. La tendance des catéchines à se dégrader durant un temps d’extraction prolongé
est également une source importante de variation entre les résultats (Komes et al., 2010).
En termes de conditions chromatographiques optimales, il semblerait que la colonne C18 soit
la phase stationnaire privilégiée par les auteurs répertoriés. Le choix de la phase mobile s’est porté
essentiellement sur deux solvants dont l’un souvent à base d’acétonitrile. Le débit d’élution de cette
phase mobile se situait principalement aux alentour de 1,0 mL/min et la détection UV était fixée autour
de 280 nm.
D’un point de vue purement qualitatif, les catéchines, l’acide gallique et les alcaloïdes de purine
ont été élués dans des temps compris entre 13 minutes (Roman et al., 2013) et 90 minutes (Friedman
et al., 2006) dans le cas d’une HPLC classique. Des publications plus récentes ont obtenu des résultats
d’analyses efficaces et considérablement plus rapides en adoptant la technique de l’UHPLC qui utilise
une phase stationnaire à base de particules inférieures ou égales à 2µm. Guillarme et al. (2010) ont en
effet séparé les catéchines et l’acide gallique du thé en moins de deux minutes.
Les résultats quantitatifs ont démontré que le thé vert contenait des quantités de polyphénols
significativement plus élevées en comparaison avec le thé noir et le thé Oolong. Ceci peut s’expliquer
par l’inactivation des polyphénols oxydases à haute température lors du séchage des feuilles de thé
vert. Cette inactivation empêche l’oxydation des catéchines et conserve les polyphénols sous leur forme
monomérique (Namal Senanayake, 2013).
En conclusion, l’UHPLC offre des perspectives prometteuses car elle permet d’analyser de
manière simple, efficace et rapide les composés d’intérêt du thé. Les pistes d’amélioration consisteraient
à déterminer une extraction et des conditions chromatographiques optimales et spécifiques à chaque
type de thé pour les qualifier et les quantifier de manière précise.
25
©
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28

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