Cinétique enzymatique

Travaux pratiques de chimie physique I
Fournier Coralie, Chappuis Emilie
Groupe E
08.10.2009
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
1. RÉACTION TRYPSINE - BAPNA
1.1 But
Le but de cette expérience est de déterminer la cinétique, c’est à dire la vitesse, d’une réaction enzymatique,
grâce à la spectroscopie d’absorption optique. L’enzyme étant la trypsine et le substrat de la BAPNA. A l’aide
du Lineweaver-Burk plot KM et Vmax peuvent être déterminés.
1.2 Théorie
Lors d’une réaction enzymatique, il y a deux étapes importantes. La première est la formation d’un complexe
enzyme – substrat, puis, lors de la deuxième étape, il y a formation du produit et la libération de l’enzyme.
k a ( k 'a )
kb
E + S ←⎯
⎯→ ES ⎯⎯→
E+P
On admet qu’au début, la vitesse de réaction est constante : V0 = k b [ ES ]
Cependant on ne peut connaître la concentration en complexe enzyme – substrat, il faut donc trouver une
relation avec la concentration en substrat et en enzyme qui est connue.
Si on considère que le complexe ES est formé et consommé à la même vitesse « steady state » on a :
-
pour la formation du complexe : k a [ E ][ ES ]
pour la consommation du complexe : k b [ ES ] + k ' a [ ES ]
« steady state » [ ES ](k b + k ' a ) = k a [ E ][ S ]
k a [ E ][ S ]
k 'a +kb
La concentration totale en enzyme vaut [ E ]total = [ E ] + [ ES ] , qu’on substitue dans l’équation précédente :
Au final on trouve donc : [ ES ] =
[ ES ] =
k a ([ E ]total − [ ES ])[ S ]
k 'a +kb
On regroupe les constantes en une seule et même constante KM appelée constante de Michaelis :
-1-
KM =
k 'a + kb
ka
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Alors on obtient : [ ES ]K M + [ ES ][ S ] = [ E ]total [ S ] et [ ES ] = [ E ]total
[S ]
K M + [S ]
[S ]
K M + [S ]
Substituons cette dernière équation à l’équation de la vitesse V0 : V0 = k b [ E ]total
D’après cette équation, on remarque que si la concentration en substrat est beaucoup plus grande que la
valeur de la constante de Michaelis, on peut approximer V0 par : V0 = k b [ E ]total = Vmax
Finalement on trouve l’équation de Michaelis – Menten :
V0 = Vmax
[S ]
K M + [S ]
Dans ce travail pratique, on déterminera expérimentalement la vitesse initiale d’une réaction enzymatique à
diverses concentrations de substrat afin de calculer la constante de Michaelis et la vitesse maximale de cette
réaction. En réarrangeant l’équation de Michaelis – Menten, on remarque que la vitesse initiale est reliée
linéairement à la concentration en substrat :
K
1
1
1
= M ⋅
+
V0 Vmax [ S ] Vmax
En faisant un graphique de 1/V0 en fonction de 1/[S], on aura 1/Vmax comme ordonnée à l’origine et et -1/KM
sera l’intersection de la droite avec l’axe des x, i.e., y = 0.
1.3 Partie pratique
La N -benzoyl-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) est utilisée dans cette expérience comme substrat. Sa liaison
amide sera rompue par l’hydrolyse ce qui génèrera un produit de couleur jaune, la p-nitroaniline. Le DMSO
sera utilisé comme solvant car la BAPNA n’est pas soluble dans l’eau.
L’évolution de la réaction pourra être observée grâce à l’absorption optique de la p-nitroaniline, cela est
possible car le substrat (BAPNA) et le deuxième produit de la réaction sont incolores.
α
Réaction du substrat (BAPNA) dans la solution d’enzyme (Trypsine) :
H
N
O (H2C)3
HN
HN
NO2
O
N
H
H
N
Trypsin
H20
O
O
OH
O (H2C)3
HN
HN
NH2
BAPNA
+
-
O
N+
NH2
NH2
p-nitroaniline
Huit solutions, de concentrations différentes, de substrat (BAPNA+DMSO) sont préparées. Le volume de
chaque solution est de 5 mL. La trypsine (solution d’enzyme) est placée dans une petite cuvette à raison de
2.5 mL auxquels sont ajouté 0.5 mL de solution de substrat. La cuvette est recouverte avec de la paraffine,
-2-
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pour pouvoir mélanger correctement la solution et le tout est placé dans le spectromètre d’absorption. Ce
dernier est préalablement réglé à 400nm (zéro d’absorbance) grâce à une solution tampon de trypsine à pH 8.
L’absorbance et fonction du temps (durant 4 minutes) est alors mesurée pour chaque solution. Cela nous
permettra d’obtenir la vitesse de notre réaction.
1.4 Résultats
Tableau n°1 : Calcul des masses théoriques et des concentrations expérimentales
Solutions
A
B
C
D
E
F
G
H
Concentration
[S]
théorique
[mol/L]
0.0030
0.0050
0.0080
0.0120
0.0160
0.0200
0.0400
0.0500
Masse
théorique [g]
Masse
expérimentale
[g] ±0.0001 g
0.0435
0.0870
0.1087
0.0425
0.0889
0.1077
Concentration
Concentration
[S]
[S] dans la
expérimentale
cuvette [mol/L]
[mol/L]
0.0029
0.0005
0.0050
0.0008
0.0082
0.0014
0.0117
0.0020
0.0164
0.0027
0.0195
0.0033
0.0409
0.0068
0.0495
0.0083
Calcul utilisé pour la masse théorique :
Masse théorique = Concentration théorique ⋅ Volume ⋅ Masse Molaire
Calcul utilisé pour la concentration expérimentale :
Concentration expérimentale =
Masse expérimentale
Volume ⋅ Masse Molaire
Avec : Volume = 0.005 L et Masse molaire(BAPNA) = 434.89 g/mol
Tableau n°2 : Calcul de la vitesse de formation des produits
Pente [Absorbance/min]
V0 [M/min]
1/[S] [M-1]
1/V0 [min/M]
0.025922
0.033230
0.054104
0.055370
0.075154
0.068026
0.089729
0.087651
2.59E-06
3.32E-06
5.41E-06
5.54E-06
7.52E-06
6.80E-06
8.97E-06
8.77E-06
2046.5412
1211.3928
733.7852
511.6353
366.8926
306.9812
146.7570
121.1393
3.86E+05
3.01E+05
1.85E+05
1.81E+05
1.33E+05
1.47E+05
1.11E+05
1.14E+05
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Calcul utilisé pour déterminer V0 :
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L' équation de l' absorbance est donnée par la loi de Beer - Lambert :
A = ε ⋅l ⋅c
Avec : ε = 10 - 4 M -1cm -1
l = 1 cm
c = concentration M
Etant donnée que la pente est donnée par :
dA
dt
avec t = temps min
dA dc
Nous avons :
= ⋅ ε ⋅ l = v0 ⋅ ε ⋅ l
dt dt
Ainsi nous obtenons notre vitesse en M/min
Graphique n°1 :
Lineweaver - Burk plot
y = 147.91x + 94042
4.5E+05
4.0E+05
3.5E+05
3.0E+05
1/ V0
2.5E+05
2.0E+05
1.5E+05
1.0E+05
5.0E+04
0.0E+00
-1.0E+03
-5.0E+02
0.0E+00
-5.0E+04
5.0E+02
1.0E+03
1.5E+03
1/ [S]
Tableau n°3 : Détermination des constantes de Michaelis-Menten KM et Vmax :
Ordonnée [min/M]
Pente
Vmax [M/min]
X lorsque y=0
9.4042E+04
147.9116
KM
1.5728E-03
-4-
1.06E-05
-635.8010
2.0E+03
2.5E+03
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Calcul pour Vmax :
Vmax =
Calcul pour x :
x=
€
Calcul pour KM :
Graphique n°2 :
1
Ordonnée à l'origine
− Ordonnée à l'origine
pente
KM =
€
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−1
x
€
Cinétique de Michaelis - Menten
1.2E-05
Données
1/2Vmax
1.0E-05
Vmax
Logarithmique (Données)
V0 [M/min]
8.0E-06
6.0E-06
4.0E-06
2.0E-06
0.0E+00
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
[S] mol/L
1.5 Discussion des résultats
Calculs d’erreur :
Tableau n°4 : Erreurs sur le matériel
Matériel
Pipette de 1mL
Pipette de 2mL
Pipette de 5mL
Ballon de 5mL
Seringue de 0.5 mL
-5-
Erreur
±0.01
±0.02
±0.1
±0.08
±0.005
0.10
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Tableau n°5 : Erreurs sur les concentrations
Solutions
A
B
C
D
E
F
G
H
Erreur sur la
concentration
de nos
solutions
0.0001
0.0001
0.0002
0.0003
0.0004
0.0003
0.0007
0.0008
Erreur sur la
concentration dans la
cuvette
1.38E-05
2.63E-05
3.64E-05
5.24E-05
7.28E-05
6.19E-05
1.29E-04
1.56E-04
Calcul de l’erreur sur la concentration pour les solutions F à H :
2
σ c _ sol
2
⎛ σ ⎞ ⎛ σ ⎞
= ⎜ m ⎟ + ⎜ V ⎟ ⋅ c _ sol
⎝ m ⎠ ⎝ V ⎠
Avec : _m= ±0.0001 g
_V= ±0.08 mL
m= masse expérimentale pesée (voir tableau) en gramme
V= 5 mL
c_sol= concentration expérimentale de la solution en mol/L
Calcul de l’erreur sur la concentration pour les solutions A à E :
2
σ c _ sol
2
⎛ σ c _ mère ⎞ ⎛ σ V ⎞ ⎛ σ V _ pipette ⎞
⎟⎟ + ⎜
⎟⎟ ⋅ c _ sol
= ⎜⎜
⎟ + ⎜⎜
⎝ c _ mère ⎠ ⎝ V ⎠ ⎝ V _ pipette ⎠
Avec : _c_mère= erreur de la solution (F à H) utilisée
_V= ±0.08 mL
_V_pipettel= l’erreur de la pipette utilisée
c_mère = concentration de la solution utilisée (F à H) en mol/L
V= 5 mL
c_sol= concentration expérimentale de la solution en mol/L
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Diluée à partir de F
Diluée à partir de H
Diluée à partir de G
Diluée à partir de F
Diluée à partir de G
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Calcul de l’erreur sur la concentration dans la cuvette :
2
σ c _ cuv
2
⎛ σ c _ sol ⎞ ⎛ σ V ⎞
⎟⎟ + ⎜
= ⎜⎜
⎟ ⋅ c _ cuv
⎝ c _ sol ⎠ ⎝ V ⎠
Avec : _c_sol= erreur de la solution (A à H)
_V= ±0.005
c_sol = concentration de la solution utilisée (A à H) en mol/L
V= 0.5 mL
c_cuv = concentration expérimentale de la solution dans la cuvette
Il n’y a pas de grandes sources d’erreur puisque la mesure de l’absorbance est effectuée par un spectromètre
d’absorption et que son erreur est négligeable. Les principales erreurs proviennent des nombreuses
manipulations des substances (pesées, dilutions, etc.). La variation entre le KM expérimental et théorique sera
donc due principalement à une erreur humaine.
D’après la littérature [2], la constante de Michaelis est égal à 2.20 mM. La valeur déterminée graphiquement
est 1.57 mM, ce qui donne une erreur relative de 28.6 %.
2. EXERCICES
2.1 Exercice du protocole
Dans une cocotte-minute, la pression peut monter jusqu’à 2 bar. Sous cette pression, l’eau bout à 121 °C. Si
l’on observe que les pommes de terre sont cuites deux fois plus rapidement qu’à pression normale (1 bar),
estimer l’énergie d’activation pour la réaction de la cuisson des pommes de terre.
Tout d’abord nous devons poser la loi d’Arrhenius :
Avec :
A = constante d’Arrhenius
Ea = énergie d’activation [J/mol]
R = constante des gaz = 8.3145 [J/molK]
T = température K
k = constante de décomposition
⎛ −Ea ⎞
⎛ k' ⎞ Ea ⎛ 1 1 ⎞
k = A ⋅ exp⎜
⋅ ⎜ − ⎟
⎟ ou ln⎜ ⎟ =
⎝ R ⋅ T ⎠
⎝ k ⎠ R ⎝ T T' ⎠
€
On nous dit que les pommes de terres cuisent deux fois plus vite à 121 °C (2 bar) qu’à 100°C (1 bar), nous
⎛ k' ⎞
pouvons alors poser que ln⎜ ⎟ = ln(2) .
⎝ k ⎠
Par conséquent l’énergie d’activation Ea équivaut à :
€
€
Ea =
R ⋅ ln(2)
8.3145 ⋅ ln(2)
=
= 40.36 kJ/mol
⎛ 1 1 ⎞ ⎛ 1
1 ⎞
−
⎜ − ⎟ ⎜
⎟
⎝ T T' ⎠ ⎝ 373.15 394.15 ⎠
-7-
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2.2 Exercice 1
Une substance A a une constante de décomposition égale à 2.80.10-3 M/s à 30°C et égale à 1.38.10-2 M/s à
50°C. Déterminez les paramètres d’Arrhenius de cette réaction.
⎛ −Ea ⎞
⎛ k' ⎞ Ea ⎛ 1 1 ⎞
k = A ⋅ exp⎜
⋅ ⎜ − ⎟
⎟ ou ln⎜ ⎟ =
⎝ R ⋅ T ⎠
⎝ k ⎠ R ⎝ T T' ⎠
Avec :
A = constante d’Arrhenius
€
Ea = énergie d’activation [J/mol]
R = constante des gaz = 8.3145 [J/molK]
T = température K
k = constante de décomposition
Nous devons donc déterminer l’énergie d’activation Ea étant donné que tous les autres paramètres sont
connus.
⎛ 2.80 ⋅10−3 ⎞
⎛ k' ⎞
R ⋅ ln⎜ ⎟ 8.3145 ⋅ ln⎜
−2 ⎟
⎝ k ⎠
⎝ 1.38 ⋅10 ⎠
Ea =
=
= 64.96 kJ/mol
⎛ 1 1 ⎞
⎛ 1
1 ⎞
−
⎜ − ⎟
⎜
⎟
⎝ T T' ⎠
⎝ 323.15 303.15 ⎠
2.3 Exercice 2
€
Equation de Michaelis - Menton : V0 = Vmax
[S ]
K M + [S ]
1
Posons V0 = Vmax
2
1
[S ]
Vmax = Vmax
2
K M + [S ]
1
(K M + [ S ]) = [ S ]
2
1
1
K M = [S ] − [S ]
2
2
K M = [S ]
Il faut donc que la concentration en substrat soit égale à la constante de Michaelis.
3. SOURCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] Polycopié
des travaux pratiques de chimie physique I
[2] Measuring
trypsin inhibitor in soy meal: suggested improvements in the standard method.
Stauffer, Clyde E. Tech. Foods Consult., Cincinnati, OH, USA. Cereal Chemistry (1990), 67(3), 296302. CODEN: CECHAF ISSN: 0009-0352. Journal written in English. CAN 113:229773 AN
1990:629773 CAPLUS
-8-