Cinétique enzymatique - Associations d`Étudiantes

Travaux Pratiques
Chimie Physique I
Semestre d’automne 2007
Cinétique enzymatique
ABEGG Daniel
SURRIABRE Pedro
Université de Genève
Science II, Laboratoire 110
11 octobre 2007
Table des matières
1 Cinétique enzymatique
1.1 But de l’expérience . . . . . . . .
1.2 Partie théorique . . . . . . . . . .
1.2.1 Mécanisme de la réaction .
1.3 Partie pratique . . . . . . . . . .
1.3.1 Manipulations . . . . . . .
1.4 Résultats . . . . . . . . . . . . . .
1.5 Calculs d’erreurs . . . . . . . . .
1.6 Discussion et conclusion . . . . .
1.7 Sources bibliographiques . . . . .
1.8 Exercice . . . . . . . . . . . . . .
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2
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3
3
3
4
4
5
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8
9
9
9
Chapitre 1
Cinétique enzymatique
1.1
But de l’expérience
L’objectif de cette expérience est d’étudier la cinétique de la réaction de décomposition
du N-benzoyl-aginine-p-nitroaniline en mesurant la variation de l’absorbance du produit
de la réaction (p-nitroaniline) en fonction du temps et à différentes concentrations du
réactif.
Finalement on veut déterminer la vitesse initiale, la vitesse maximale et la constante de
Michaelisi-Menten correspondantes à cette réaction.
1.2
Partie théorique
Pour la réaction de décomposition que nous allons étudier pendant ce TP, on suit le
mécanisme de Michaelis-Menten qui propose l’équation suivante :
V0 = Vmax
[S]
KM + [S]
Où :
V0 = vitesse initial de la réaction
Vmax = vitesse maximal de la réaction
[S] = concentration du substrat
KM = constante de Michaelis-Menten
Cependant, nous allons utiliser une forme différente de cette équation qui va nous permettre de déterminer les différentes constantes de la réaction :
KM
1
1
=
+
V0
Vmax [S] Vmax
Néanmoins, pendant cette expérience, ce qu’on va calculer directement est la variation
3
de l’absorbance par rapport au temps et non la vitesse de la réaction. On va avoir besoin
d’une relation entre cette variation de l’absorbance en fonction du temps et la vitesse de
réaction :
A = clǫ
dA
dc
=
l ǫ = V0 l ǫ
dt
dt
dA/dt est la variation de l’absorbance en fonction du temps
V0 est la vitesse de la réaction
l est la longueur de la cuvette = 1 cm
ǫ est le coefficient d’extinction molaire de la p-nitroaniline = 104 M-1 cm-1
Ainsi on trouve une relation entre la variation de l’absorbance et la vitesse de réaction.
1.2.1
Mécanisme de la réaction
O
H
O
H
N
NO 2
N
N
OH
Trypsin
( CH 2) 3
O
H
( CH 2) 3
O
+
H 2O
NH
NH
NH 2
H 2N
NH
H 2N
N−benzoyl−arginine−p−nitroanilide
(BAPNA)
1.3
NH
p−nitroaniline
(jaune)
Partie pratique
Solution mère de BAPNA
mBAP N A dans 40 ml de DMSO = c V MM = 0.06 mol/Lt · 0.04 Lt · 439.89 g/mol
= 1.0437 g
4
Prépartion des solutions
Les solutions suivantes sont préparées à partir de la solution mère
Solutions Concentration [M]
A
0.003
B
0.006
C
0.009
D
0.012
E
0.015
F
0.021
G
0.042
H
0.060
1.3.1
VBAP N A [ml]
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.75
3.50
5.00
VDM SO [ml]
4.75
4.50
4.25
4.00
3.75
3.25
1.50
0.00
Manipulations
La solution mère de BAPNA, de l’enzyme, du DMSO et du tampon (pH=8) ont été
préparé par l’assistante.
Nous avons 2 séries de 8 cuvettes qui seront pour la première, de blanc et la deuxième,
la solution à mesurer (absobance).
Dans les cuvettes à blanc, il y a 2.5 ml du Tampon et 0.5 ml d’une des 8 solutions cidessus.
Dans les autres 8 cuvettes il y a 2.5 ml d’enzyme et 0.5 ml d’une des 8 solutions.
Les cuvettes sont secouées une à une au fur et à mesure avec du parafilm car une fois
la solution ajoutée dans l’enzyme la réaction commence. L’absorbance est mesurée par
ordre croissant de concentration.
Pour mesurer l’absorbance (400 nm) il faut d’abord calibrer le spectromètre avec une
solution à blanc puis insérer la solution à mesurer, qui possède la même concentration.
Les mesures se font sur une période de 5 minutes.
5
1.4
Résultats
Solutions [BAP NA] [mol/L]
A
0.003
B
0.006
C
0.009
D
0.012
E
0.015
F
0.021
G
0.042
H
0.060
[S] [mol/L]
5.0 10−4
1.0 10−3
1.5 10−3
2.0 10−3
2.5 10−3
3.5 10−3
7.0 10−3
1.0 10−2
1/[S]
2.00 103
1.00 103
6.67 102
5.00 102
4.00 102
2.86 102
1.43 102
1.00 102
Pente [Abs/min]
0.0451
0.0807
0.1185
0.1423
0.1731
0.2232
0.3970
0.5611
V0 (exp) 10−6 [mol/min]
4.510
8.070
11.85
14.23
17.31
22.32
39.70
56.11
1/V0 (exp)
221729
123916
84388
70274
57770
44803
25189
17822
Lineweaver - Burk plot
1/V0 [min/mol]
200000
150000
f (x) = 106.085 x + 13170.6
R2 = 0.9966
100000
50000
−1/KM
1/Vmax
0
0
500
1000
1500
1/[S] [L/mol]
Vmax = 7.593 10−5 [mol/min]
KM = 8.055 10−3 [mol/L]
∆KM = 2 10−4 [mol/L]
6
2000
2500
Solutions [S] [mol/L]
A
5.00 10−4
B
1.00 10−3
C
1.50 10−3
D
2.00 10−3
E
2.50 10−3
F
3.50 10−3
G
7.00 10−3
H
1.00 10−2
8e−05
V0 (exp) 10−6 [mol/min]
4.510
8.070
11.85
14.23
17.31
22.32
39.70
56.11
V0 (th) 10−6 [mol/min]
4.438
8.385
11.92
15.10
17.98
23.00
35.30
42.05
Vmax
V0 (th) [mol/min]
7e−05
Vmax /2
6e−05
5e−05
f (x) = 1.295 10−5 ln(x) + 9.821 10−5
R2 = 0.9517
4e−05
3e−05
2e−05
KM
1e−05
0
0
0.01
0.02
0.03
[S] [mol/L]
Vmax = 7.00 10−5 [mol/min]
KM = 7.60 10−3 [mol/L]
∆KM = 5.16 10−4 [mol/L]
7
0.04
0.05
1.5
Calculs d’erreurs
Objet
Seringue
Pipette
Pipette
Pipette
Pipette
Fiole
Volume [ml]
0.5
1.0
2.0
2.5
5.0
5.0
erreur [ml]
0.01
0.02
0.02
0.02
0.02
0.08
Concentrations des solutions
Ci Vi = Csol Vsol
Csol =
C i Vi
Vsol
ln(Csol ) = ln
C i Vi
Vsol
= ln(Ci ) + ln(Vi ) − ln(Vsol )
dCi dVi dVsol
dCsol
=
+
−
Csol
Ci
Vi
Vsol
Vsol = Vi + VDMSO
∆Csol
∆Ci ∆Vi ∆Vi + ∆VDMSO
=
+
−
Csol
Ci
Vi
Vi + VDMSO
Concentrations des solutions dans les cuvettes
∆Csol ∆Vsol ∆Vsol + ∆Vajouté
∆Ccuv
=
+
−
Ccuv
Csol
Vsol
Vsol + Vajouté
Erreurs
Solutions
A
B
C
D
E
F
G
H
∆Csol [mol/L]
2 10−4
2 10−4
3 10−4
3 10−4
5 10−4
7 10−4
1 10−3
1 10−3
8
∆Ccuv [mol/L]
4 10−5
7 10−5
9 10−4
1 10−4
2 10−4
2 10−4
4 10−4
5 10−4
∆KM = moyenne(∆Ccuv ) = 2 10−4 [mol/L]
Pour l’erreur de KM du log plot, il faut multipiler l’erreur des ∆Ccuv par leurs propres
[S], faire la moyenne et multiplier par le KM trouvé.
Donc :
∆KMlog = 5.16 10−4 [mol/L]
1.6
Discussion et conclusion
Nous observons comme attendu que plus la solution est concentrée en BAPNA plus la
couleur devient jaune et donc la pente de l’absorbance augmente.
Les valeurs de constantes Vmax et KM ne sont pas trop différentes entre les 2 graphiques
mais les valeurs du lineweaver plot sont probablement plus correcte car pour la rérgésion
logarithmique, la courbe n’est pas très bien superposée aux erreurs calculées.
1.7
Sources bibliographiques
Protocole des travaux pratiques de chimie physique I
1.8
Exercice
Dans une cocotte-minute, la pression peut monter jusqu’à 2 bar. Sous cette pression, l’au
bout à 121˚C. Si l’on observe que les pommes de terre sont cuites deux fois plus rapidement qu’à pression normale (1 bar), estimer l’énergie d’activation pour la réaction de la
cuisson des pommes de terre.
On pose d’abord l’équation d’Arrhenius :
Ea 1
1
k′
− ′
ln( ) =
k
R
T
T
Où :
k’ et k sont des constantes de vitesse à une température donnée
Ea est l’énergie d ?activation
R est la constante universelle des gaz
T et T’ sont les températures correspondantes aux constantes de vitesse.
9
Dans le problème on nous dit que la vitesse de cuisson est 2 fois plus vite à 121˚C qu’à
100˚C, donc on va considérer que le rapport des constantes de vitesse est égal à 2 :
k′
ln( ) = ln(2)
k
T = 100˚C = 373 K
T ′ = 121˚C = 394 K
Ea =
R ln(2)
= 40.33 kJ/mol
1
− T1′
T
On obtient bien une valeur positive qui indique qu’il faut fournir de la chaleur au système
pour pouvoir cuire les pommes de terre.
10