Evaluation de deux kits ELISA pour la détermination quantitative

Transcription

Travail de diplôme
Evaluation de deux kits ELISA
pour la détermination quantitative sérologique
d’anticorps anti-spermatozoïdes
Veronica Vasquez
TAB 53ème volée
Ecole Supérieure de la Santé
Département d’immunologie
synlab Lausanne
Janvier - Mars 2014
Responsables accompagnants :
Mercedes Cipolli & Jean-Michel Druon
Travail de diplôme en Immunologie
Janvier - Mars 2014
Résumé
Les anticorps anti-spermatozoïdes (ASA) peuvent provoquer l’infertilité immunologique, qui
représente 20% des cas d’infertilité des couples. Ils peuvent être retrouvés chez l’homme ou
chez la femme et entravent les chances de conception de bien des façons. Les facteurs
déclencheurs ainsi que les processus induisant la production d’ASA chez l’homme et chez la
femme sont complexes et encore hypothétiques. Les couples souffrant d’infertilité
immunologique doivent avoir recours à des méthodes de procréation médicalement assistée
pour concevoir un enfant.
De nombreuses techniques ont été développées afin de rechercher la présence d’ASA. Ces
différentes méthodes se distinguent entre elles par leur précision et leur performance très
variables. Au bout du compte, la majorité d’entre elles manquent de fiabilité.
Au sein du département d’immunologie-sérologie du laboratoire synlab Lausanne, nous
voulons introduire dans les analyses de routine un test immuno-enzymatique ELISA pour le
dosage quantitatif sérique d’anticorps dirigés contre les antigènes de surface de
spermatozoïdes. Nous avons choisi de comparer et d’évaluer deux kits ELISA : « AntiSpermatozoen-ELISA (Serum) » d’Euroimmun et « Spermatozoa-Ab, ELISA » d’IBL. Nous
avons reçus 31 échantillons, préalablement testés avec le kit « Varelisa Sperm Antibodies »
de Phadia. Ce dernier constitue notre méthode de référence pour l’évaluation de nos kits.
Tout d’abord, j’ai procédé à une étude comparative mettant en lumière leurs différences,
avantages et inconvénients. Ensuite, j’ai testé les 31 sérums, puis j’ai comparé les résultats
obtenus à ceux de la méthode de référence. Compte tenu des résultats obtenus avec le kit
Euroimmun, son évaluation n’a pas été poursuivie. Pour l’évaluation de la méthode IBL, j’ai
vérifié les critères : sensibilité, spécificité et précision. J’ai également décrit les paramètres :
exactitude, limite de détection, limite de linéarité et contamination.
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Abstract
Anti-sperm antibodies (ASA) may cause immunological infertility, which is responsible for
20% of infertile couples. They can be found in men or women and impede chances of
conception in many ways. Processes inducing the production of ASA in men and women, as
well as the triggers, are complex and hypothetical. Couples with immunological infertility
have to use methods of assisted reproductive technology in order to conceive a child.
Many techniques have been developed to detect the presence of ASA. These diverse
methods differ from each other greatly in precision and performance. After all, most of them
are unreliable.
Within the immunology-serology Department of the laboratory synlab Lausanne, we want to
introduce into routine analyses an ELISA test for the quantitative determination of antisperm antibodies in serum. We chose to test and compare two ELISA kits : « AntiSpermatozoen-ELISA (Serum) » of Euroimmun and « Spermatozoa-Ab, ELISA » of IBL. We
received 31 samples, that had been previously tested with the kit « Varelisa Sperm
Antibodies » of Phadia. It is our reference method for the evaluation of our kits.
First, I performed a comparative study highlighting their differences, advantages and
disadvantages. Then I tested the 31 sera, and I compared the results to those of the
reference method. According to the results obtained with the Euroimmun kit, its evaluation
was stopped. For the evaluation of the IBL method, I checked the criteria : sensitivity,
specificity and precision. I also described the parameters : accuracy, limit of detection, limit
of linearity and contamination.
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Table des matières
1
Introduction ........................................................................................................................ 1
2
Infertilité d’origine immunologique ................................................................................... 2
2.1
Impacts des ASA sur la fertilité ....................................................................................2
2.2
Présentation et localisation des différents isotypes d’ASA .........................................3
2.3
Production d’ASA .........................................................................................................3
2.3.1
Chez l’homme .......................................................................................................3
2.3.2
Chez la femme ......................................................................................................4
2.4
Antigènes spermatiques responsables de la production d’ASA ..................................5
2.5
Thérapeutique ..............................................................................................................5
2.6
Techniques de détection d’ASA ...................................................................................6
2.6.1
Techniques les plus courantes ..............................................................................6
2.6.2
Conclusion sur les différents tests existants.........................................................8
3
But du travail....................................................................................................................... 8
4
Développement .................................................................................................................. 9
4.1
Matériel ........................................................................................................................9
4.1.1
Echantillons de sérum ...........................................................................................9
4.1.2
Automate « Euroimmun Analyser I » ...................................................................9
4.1.3
Kits à comparer et évaluer ..................................................................................10
4.1.3.1
IBL International GmbH : « Spermatozoa-Ab, ELISA » ..................................10
4.1.3.2 Euroimmun - Medizinische Labordiagnostika AG : « Anti-SpermatozoenELISA (Serum) » .............................................................................................................13
4.1.4
Matériel nécessaire non fourni ...........................................................................15
4.1.5
Tableaux comparatifs des kits.............................................................................16
4.1.5.1
Comparaison des réactifs..............................................................................16
4.1.5.2
Comparaison de l’utilisation .........................................................................17
4.2
Méthode .....................................................................................................................19
4.3
Résultats .....................................................................................................................21
4.3.1
Corrélation des méthodes ..................................................................................21
4.3.2
Tableau des résultats ..........................................................................................22
4.3.3
Sensibilité et spécificité ......................................................................................23
4.3.3.1
4.3.4
Méthode IBL ..................................................................................................24
Précision ..............................................................................................................26
4.3.4.1
Répétabilité de la méthode IBL.....................................................................27
4.3.4.2
Reproductibilité de la méthode IBL ..............................................................28
iv
4.3.4.3
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Conclusion sur la précision de la méthode IBL .............................................29
4.3.5
Exactitude ...........................................................................................................30
4.3.6
Domaine de mesure ............................................................................................30
4.3.6.1
Limite de détection .......................................................................................30
4.3.6.2
Limite de linéarité .........................................................................................30
4.3.7
4.4
Contamination ....................................................................................................31
Discussion ...................................................................................................................32
4.4.1
Résultats obtenus avec le kit Euroimmun ..........................................................32
4.4.1.1
Démarche ......................................................................................................32
4.4.1.2
Validation des résultats ................................................................................32
4.4.1.3
Interprétation et exploitation des résultats .................................................32
4.4.2
Résultats obtenus avec le kit IBL.........................................................................33
4.4.2.1
Démarche ......................................................................................................33
4.4.2.2
Interprétation et validation des résultats .....................................................34
4.4.2.3
Synthèse des résultats concordants/discordants .........................................34
4.4.2.4
Analyse des résultats discordants.................................................................35
5
Conclusion......................................................................................................................... 38
6
Remerciements ................................................................................................................. 40
7
Références bibliographiques ............................................................................................ 41
8
Iconographie ..................................................................................................................... 43
9
Lexique .............................................................................................................................. 44
10 Annexes............................................................................................................................. 45
v
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1 Introduction
Ce travail de diplôme a été effectué au département d’immunologie-sérologie du laboratoire
synlab Lausanne. Les laboratoires privés synlab font partie des laboratoires suisses les plus
importants. synlab possède 19 sites répartis en Suisse romande, en Suisse alémanique, au
Tessin, et s’est étendu au niveau international. Il possède actuellement 260 sites dans 20
pays différents. Il offre plus de 4000 analyses médicales différentes pour lesquelles il garantit
la qualité, la sécurité et la précision. Le site de Lausanne a été accrédité en 2004 par le
Service d’accréditation suisse (SAS) en tant que laboratoire d’analyses médicales dans les
domaines de la chimie clinique, de l’hématologie, de l’immunologie, de la sérologie, et de la
parasitologie, selon la norme ISO/CEI 17025. En 2013, il a été accrédité par le SAS comme
répondant aux exigences de la norme ISO 15189 [1].
Le laboratoire central de la Suisse romande, synlab Lausanne, reçoit des demandes
d’analyses de routine et spécialisées provenant non seulement de cliniques privées,
d’hôpitaux, de médecins généralistes et spécialistes, mais il prend aussi en charge des
analyses spécifiques d’autres laboratoires synlab. Ses prestations couvrent les domaines
suivants : l’immunologie-sérologie, l’hématologie, l’hémostase, la chimie clinique, la
microbiologie, la parasitologie, la biologie moléculaire et la génétique [1].
Au département d’immunologie-sérologie, nous voulons rapatrier dans nos analyses de
routine le dosage sérique des anticorps anti-spermatozoïdes par technique immunoenzymatique ELISA, actuellement pratiqué au laboratoire synlab Augsburg en Allemagne.
Dans ce but, nous avons choisi 2 différents kits ELISA conçus pour effectuer cette analyse. Ce
travail consiste à établir la comparaison et l’évaluation de ces kits, dans le but de nous
donner des arguments nous permettant d’effectuer notre choix.
Veronica Vasquez, 53ème TAB, EsSanté
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2 Infertilité d’origine immunologique
L’infertilité est l’incapacité d’un couple à procréer après un an de rapports sexuels réguliers
non protégés. De plus en plus de couples souffrent d’infertilité. En moyenne, jusqu’à 20%
des couples en âge de procréer se retrouvent face à ce problème. Dans environ 20% de ces
cas, on retrouve chez l’homme ou chez la femme la présence d’anticorps dirigés contre des
antigènes de spermatozoïdes [2]. Un couple souffre d’infertilité immunologique lorsque les
spermatozoïdes de l’homme n’arrivent pas à féconder l’ovule de sa partenaire à cause de la
présence, chez l’un ou l’autre, d’anticorps anti-spermatozoïdes (ASA). Le taux de grossesse
des couples infertiles est environ 38% inférieur à celui des couples fertiles [3]. Néanmoins
environ 1% des couples fertiles sont porteurs d’ASA [4].
2.1 Impacts des ASA sur la fertilité
Les ASA, qui peuvent être agglutinants, immobilisants ou cytotoxiques [5], ont un impact
négatif sur la fertilité à plusieurs niveaux. Les ASA se lient aux antigènes à la surface des
spermatozoïdes, réduisant leur mobilité et allant jusqu’à provoquer leur agglutination, ce qui
inhibe leur migration à travers les sécrétions génitales féminines [3]. Ils altèrent leur
aptitude à pénétrer et à franchir le mucus cervical.
Les ASA peuvent inhiber la capacitation des spermatozoïdes. La capacitation est le premier
processus d’une suite de modifications qui permettront aux spermatozoïdes d’acquérir une
maturation fonctionnelle. Des modifications moléculaires et physiologiques essentielles
s’effectuent, afin de rendre les spermatozoïdes capables de féconder l’ovocyte. Après avoir
été déposés dans les voies génitales féminines, les spermatozoïdes deviennent hyperactifs :
leur tête effectue de grands mouvements, leurs battements flagellaires s’intensifient, et ils
acquièrent une trajectoire typique. Cet état favorise leur ascension dans la cavité utérine
jusqu’à l’ovocyte. La membrane externe et l’acrosome des spermatozoïdes subissent une
maturation physiologique. Ces remaniements leur permettent d’effectuer la réaction
acrosomique, qui rendra possible la fécondation de l’ovocyte. Au cours de cette réaction, le
spermatozoïde fixé à l’ovocyte est stimulé par la protéine ZP3 (zona protein 3) qui constitue
la zone pellucide. La membrane plasmatique du spermatozoïde fusionne avec la sousjacente membrane extérieure de l’acrosome, ce qui provoque la libération d’enzymes
protéolytiques hyaluronidase et acrosine contenues dans l’acrosome, et provoque la
dissolution de la zone pellucide, permettant ainsi au spermatozoïde de la traverser. Si la
capacitation est inhibée par des ASA, la réaction acrosomique ne peut pas s’effectuer, et le
spermatozoïde est incapable d’interagir et de pénétrer la zone pellucide de l’ovocyte.
Non seulement les ASA inhibent la fécondation, mais ils perturbent aussi les prochaines
étapes, à savoir la fusion des gamètes, les débuts de l’embryogenèse (clivages anormaux),
ainsi que l’implantation de l’œuf dans l’endomètre de la femme [5].
L’effet cytotoxique des ASA, en particulier du type IgG, provoque la désintégration des
spermatozoïdes. Le complexe antigène-anticorps active la voie classique du complément.
Après une cascade de réactions, elle aboutit à la formation d’un complexe d’attaque
membranaire qui va lyser les spermatozoïdes [5].
Les ASA sécrétés localement, par exemple lors d’obstruction de l’épididyme, altèrent la
fonction et la maturation des spermatozoïdes [6].
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2.2 Présentation et localisation des différents isotypes d’ASA
Les deux classes principales d’ASA sont les IgG et les IgA. La classe d’ASA IgM est rare.
Comme on ne retrouve pas de taux significatifs de cet isotype dans les fluides reproductifs,
et qu’il est peu probable qu’il contribue à l’infertilité, il est rarement recherché. Les ASA sont
polyclonaux, c’est-à-dire qu’ils sont produits par plusieurs clones de lymphocytes B et sont
dirigés contre différents épitopes d’antigènes de surface du spermatozoïde.
Les ASA peuvent être retrouvés chez l’homme ou chez la femme dans la circulation sanguine
et dans les sécrétions telles que le mucus cervical, les sécrétions vaginales, les sécrétions des
trompes utérines, le fluide folliculaire, le fluide de l’épididyme, dans le liquide séminal sous
forme libre ou liés aux antigènes de surface des spermatozoïdes.
Isotypes retrouvés dans le sérum
Les IgG sont les principaux types d’ASA que l’on retrouve dans le sérum. Ces
immunoglobulines systémiques, sécrétées dans plusieurs tissus et fluides, représentent la
classe d’anticorps la plus importante de l’organisme. Etant capables de fixer le complément,
ils ont un pouvoir cytotoxique [5]. Dans le sérum, on peut également détecter des IgA, qui
sont produits en parallèle. Le taux d’ASA présent dans le sérum est différent de celui du
liquide séminal. En effet, les ASA détectés dans le tractus urogénital sont indépendants du
sérum, car ils ont en grande partie été formés localement. Cependant, un taux élevé d’ASA
dans le sérum indique généralement une production locale augmentée [7].
Isotypes retrouvés dans le liquide séminal
A l’inverse du sérum, dans le liquide séminal, la plupart des auto-anticorps retrouvés sont
des IgA sécrétoires produits localement. Une infime quantité d’IgA est exsudé à partir du
sérum. Chez l’homme, l’isotype IgA, qui a le pouvoir d’agglutiner les spermatozoïdes, est
surtout produit au niveau de l’épididyme (principal site de sécrétion d’ASA) [5]. Dans le
liquide séminal, on retrouve aussi des IgG. Environ 1-2% des IgG circulants dans le sérum
passent dans le compartiment séminal par transsudation via la prostate, les vésicules
séminales, ou l’épididyme [8]. Dans le liquide séminal, ainsi que dans d’autres sécrétions du
tractus génital masculin, la majorité des IgG présents a été exsudé du sérum [9].
Isotypes retrouvés dans le mucus cervical
Dans le mucus cervical de la femme on décèle les deux isotypes IgG et IgA, mais c’est
l’isotype IgA qui prédomine largement [7].
2.3 Production d’ASA
2.3.1 Chez l’homme
Environ 10% des hommes infertiles sont porteurs d’ASA. Un homme devient infertile dès que
50% de ses spermatozoïdes sont sensibilisés par des ASA [7]. La prévalence des ASA chez les
hommes infertiles augmente avec l’âge. Environ 6-27% des hommes infertiles présentant
des analyses de sperme apparemment normales souffrent d’infertilité d’origine inexpliquée.
Dans 10% de ces cas, on retrouve des ASA [9]. Des taux d’ASA relativement bas ont été
détectés chez 2% des hommes fertiles [10].
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Le mécanisme anatomique et physiologique le plus connu comme étant impliqué dans le
processus de production d’ASA est la barrière hémato-testiculaire. Constituée dans les tubes
séminifères par les jonctions serrées accolant les cellules de Sertoli (ou épithéliocytes de
soutien) les unes aux autres, elle est très sélective et fait office de protection. Elle prévient la
production d’ASA, en séquestrant les antigènes spermatiques dans le compartiment central
des tubes séminifères pour les empêcher de traverser la membrane basale, de passer dans la
circulation sanguine via les microcapillaires entourant l’appareil génital, et d’entrer en
contact avec les cellules immunocompétentes. Lorsqu’il y a rupture de la barrière hématotesticulaire, les antigènes spermatiques nouvellement formés sont détectés par le système
immunitaire et considérés comme étant immunogènes [11]. Les lymphocytes B vont
s’activer et produire des ASA. La réponse immunologique humorale responsable de la
production de ces auto-anticorps provient du fait que les antigènes spermatiques ne sont
produits qu’à partir de la puberté au cours de la spermatogenèse et de la maturation des
gamètes, bien après que le système immunitaire de l’organisme ait appris à reconnaître les
antigènes de ses propres cellules [5]. Cette auto-tolérance immunitaire s’effectue vers la fin
de la vie fœtale et peu après la naissance [11].
Les causes pouvant induire cette réaction immunologique sont les traumatismes
testiculaires d’ordre accidentel ou chirurgical. Il s’agit principalement de torsions
testiculaires, de biopsies testiculaires, de vasectomies, lors d’azoospermie obstructive de
l’épididyme ou du canal déférent [12]. Les infections génitales, urinaires, ou les
inflammations chroniques du tractus génital masculin, représentent des causes probables de
production d’ASA, qui doivent encore être vérifiées par des études supplémentaires [5].
2.3.2 Chez la femme
Jusqu’à 2% des femmes infertiles sont porteuses d’ASA [10]. Chez la femme, les ASA sont
principalement produits localement au niveau du mucus cervical [13]. Les ASA du mucus
cervical, qui rendent la femme infertile, sont surtout des IgA sécrétoires [14]. Chez la femme
souffrant d’infertilité immunologique, on peut par ailleurs aussi détecter des ASA
agglutinants et immobilisants dans le sérum.
La présence d’ASA de titre élevé autant au niveau systémique que local diminue encore
d’avantage les chances de pouvoir concevoir [15]. Ainsi, une femme possédant un titre élevé
d’ASA d’isotype IgG dans le sérum, ainsi que dans le fluide folliculaire, peut rencontrer des
problèmes de fertilité importants.
Dans les cas d’infertilité féminine d’origine inexpliquée, on peut déceler dans le sérum des
patientes des ASA de titre faible. Or, on peut en retrouver au même titre chez des femmes
fertiles. La signification clinique du titre peut se révéler très contestable.
Chez la femme le processus de formation d’ASA est un phénomène plus rare et plus
mystérieux que chez l’homme. Alors que chez l’homme on parle d’auto-immunisation, il
s’agit d’une iso-immunisation anti-sperme chez la femme.
Durant les rapports sexuels, le tractus génital féminin est inséminé à plusieurs reprises avec
des antigènes spermatiques, sans que cela n’induise pour autant une immunisation antisperme. Les mécanismes exacts qui empêchent une réponse immunitaire contre les
antigènes spermatiques, tout comme les facteurs déclencheurs responsables de la formation
d’ASA n’ont pas encore été clairement définis. Ils sont soit idiopathiques, ou soit encore à
l’état d’hypothèses qui auraient besoin d’être investiguées [12]. On suppose qu’un système
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complexe de barrières permettrait d’éviter la production d’ASA. Le liquide séminal
possèderait un effet immunosuppresseur sur les lymphocytes B, T, et NK de la muqueuse
génitale féminine. La prolifération des lymphocytes, ainsi que la réponse cytotoxique de ces
cellules en seraient inhibées. Il aurait en outre aussi la capacité d’inhiber les fonctions
macrophagiques. Les propriétés physiologiques immunosuppressives du liquide séminal
auraient l’avantage de limiter la réponse immunitaire au niveau du col de l’utérus et du
vagin, afin de protéger les spermatozoïdes qui représentent des exo-antigènes pour le
tractus génital féminin [16].
Selon certaines hypothèses, les lésions inflammatoires ou mécaniques du vagin, les
infections ou inflammations à répétition du tractus génital, l’endométriose, les fausses
couches à répétition, les pratiques sexuelles et les opérations chirurgicales au niveau du col
de l’utérus pourraient entraîner une immunisation anti-sperme [10].
2.4 Antigènes spermatiques responsables de la production d’ASA
Les antigènes spermatiques se développent durant les dernières étapes de la
spermatogenèse, et/ou sont produits par les différentes cellules rencontrées par les
spermatozoïdes pendant leur transit dans l’appareil génital. Ces protéines de surface
subissent de nombreuses modifications durant leur transit des testicules jusque dans
l’appareil génital féminin. Dans l’épididyme, où les spermatozoïdes sont stockés et achèvent
leur maturation après avoir été produits dans les tubes séminifères, leur membrane de
surface subit un remaniement au cours duquel d’autres antigènes sont absorbés [9].
Plusieurs antigènes présents dans le liquide séminal, élaboré par les glandes sexuelles
annexes (vésicules séminales, prostate, et glandes bulbo-urétrales ou glandes de Cowper), se
fixent sur les spermatozoïdes. Il s’agit par exemple du « spermatozoa coating antigen » (SCA)
[17]. Les antigènes spermatiques humains qui provoquent la formation d’ASA n’ont pas
encore tous été identifiés.
2.5 Thérapeutique
Jusqu’à présent, il n’existe pas de traitement qui soit à la fois efficace et sans effets
secondaires [18]. Il y a plusieurs années, une thérapie immunosuppressive à base de
stéroïdes était administrée aux patients [19]. Actuellement, elle n’est pratiquement plus
proposée, car elle produit des effets secondaires importants. De plus, selon plusieurs études
publiées, le traitement n’a pas montré de réels effets sur les taux d’ASA, sur les paramètres
du sperme, et n’a pas non plus permis d’augmenter le taux de conception [9].
Les couples souffrant d’infertilité due à des ASA doivent avoir recours à des techniques de
Procréation Médicalement Assistée (PMA). Si le problème se trouve être chez la femme, on
procède tout d’abord à une Insémination Intra-Utérine (IIU). Une IIU est utile par exemple
dans le cas où une femme présente un utérus et des trompes utérines normalement
développés, mais qu’elle est très positive pour des ASA d’isotypes IgA et IgG dans le sérum et
dans le mucus cervical. Les paramètres du sperme de son conjoint sont normaux et il n’a pas
d’ASA. L’IIU permettra d’outrepasser la glaire cervicale contenant les ASA [13]. Le sperme du
conjoint, récolté 1-2 heures avant l’intervention, est déposé au moyen d’un cathéter souple
directement dans l’utérus de la femme en période ovulatoire [20].
Si cette technique est infructueuse, ou si les ASA se trouvent être chez le conjoint, on
recommande, selon les résultats des investigations, une Fécondation In Vitro (FIV), ou une
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Janvier - Mars 2014
Intra-Cytoplasmique Sperm Injection (ICSI) [13]. La FIV est un bon moyen pour contrecarrer
les effets négatifs des ASA dans le mucus cervical, les sécrétions utérines, les fluides ovariens
et des trompes de Fallope. Quant à l’ICSI, elle permet de diminuer l’effet inhibiteur des ASA
sur la liaison de l’acrosome du spermatozoïde à la zone pellucide de l’ovocyte [15]. L’ICSI est
une FIV avec micro-injection. Elle va au-delà de la mise en rencontre de spermatozoïdes et
d’ovocytes en éprouvette, étant donné qu’elle consiste à injecter directement les
spermatozoïdes sélectionnés dans les ovocytes. Les spermatozoïdes sont choisis en fonction
de leur mobilité et de leur morphologie : taille/forme du flagelle et de la tête, acrosome bien
constitué, et les ovocytes sont obtenus après stimulation hormonale. L’ICSI permet ainsi
d’augmenter les chances de réussite d’une FIV [21].
2.6 Techniques de détection d’ASA
Pour le suivi des couples infertiles, les laboratoires d’analyses médicales en andrologie et
biologie de la reproduction proposent un bilan de fertilité qui comprend des examens
d’andrologie, d’endocrinologie, de génétique, de bactériologie, de sérologie et de pathologie
[22]. Le spermogramme est l’examen andrologique de référence, effectué en 1ère intention
pour explorer l’infertilité masculine. Il consiste non seulement à évaluer la concentration, la
mobilité, la vitalité, et la morphologie des spermatozoïdes, mais aussi à mesurer le volume,
le pH, le taux de leucocytes du sperme, à doser certains composants, ainsi qu’à détecter la
présence d’ASA. Une infertilité d’origine immunologique est notamment suspectée lors
d’agglutination spontanée des spermatozoïdes, lors d’oligospermie, de lyse spermatique
(due à la présence d’ASA cytotoxiques), et d’une altération de la mobilité des
spermatozoïdes [5]. Dans ce cas, on effectue en seconde intention des tests
complémentaires spécifiques pour rechercher les ASA.
2.6.1 Techniques les plus courantes
Tests d’agglutination
Les deux tests les plus connus pour la détermination qualitative d’anticorps fixés sur les
spermatozoïdes sont le MAR Test (Mixed Antiglobulin Reaction Test) et le direct IBT
(Immunobead Test) [14]. Le principe général de ces deux tests est de rendre visible au
microscope les spermatozoïdes sensibilisés par des ASA à l’aide de particules enrobées
d’immunoglobulines [7].
- La technique directe du MAR Test
Appelé « réaction d’agglutination mixte », c’est un test simple, rapide et sensible, qui
requiert du sperme natif. Des billes de latex recouvertes d’IgG humaines sont mélangées au
sperme. On ajoute ensuite un antisérum anti-IgG, constitué d’immunoglobulines de lapin
dirigées contre les IgG humains. Ces dernières vont former des ponts entre les IgG des billes
et les IgG présents sur les spermatozoïdes, créant ainsi des agglutinats mixtes :
agglutinations entre les billes et les spermatozoïdes recouverts d’ASA de type IgG. La
localisation des complexes est visible au microscope [5]. Un taux entre 10-50% des
spermatozoïdes liés aux billes peut révéler une probable infertilité immunologique (résultat
qualitatif douteux). A partir d’un taux de 50%, l’infertilité immunologique peut être
envisagée (résultat qualitatif positif). L’isotype IgA peut être détecté en utilisant des billes
recouvertes d’IgA et l’antisérum adapté, ce qui rend ce test plus spécifique [23]. Afin de
rechercher des ASA dans le sérum, on peut faire un MAR Test indirect. Le test indirect
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nécessite l’utilisation de sperme d’un donneur qui sera mélangé au sérum. Les étapes se
déroulent ensuite de la même façon que pour le MAR Test direct [9].
- La technique directe IBT
Ce test nécessite un lavage préalable du sperme du patient, ce qui permet de diminuer les
faux négatifs, en éliminant en grande partie les immunoglobulines libres. Les anticorps liés
aux spermatozoïdes sont détectés grâce à des billes de polyacrylamide recouvertes
d’immunoglobulines de lapin anti-IgG ou anti-IgA humains. L’IBT est un test spécifique, car il
a l’avantage de déterminer la classe des immunoglobulines fixées sur les spermatozoïdes. De
plus, les billes indiquent la localisation des ASA sur la tête, la pièce intermédiaire ou le
flagelle des spermatozoïdes. La spécificité régionale des ASA peut constituer une information
clinique d’intérêt, dans le mesure où, les types d’agglutinations « tête à tête », par exemple,
en altérant certaines fonctions des spermatozoïdes, impactent d’avantage la fertilité [5]. A
partir de 50% de spermatozoïdes porteurs de billes, il pourrait y avoir une infertilité
immunologique (résultat qualitatif positif) [23]. L’IBT peut aussi être utilisé en test indirect
afin de rechercher des ASA dans le sérum [9].
Les techniques d’agglutination sont faciles à pratiquer, mais l’évaluation reste subjective,
elles ne permettent pas une quantification précise. Elles manquent de performance. [24]. On
trouve des variations significatives entre les résultats des différents tests d’agglutination,
dues à des différences techniques et de procédures [25]. Ces tests sont peu fiables,
notamment à cause de l’effet de prozone. En cas d’excès d’ASA dans le sperme, les sites
antigéniques sont saturés et il y a un risque de faux négatif. La présence de bactéries et
d’autres substances du sperme peuvent mener à des réactions faussement positives. Le
MAR test ne peut être réalisé que sur un échantillon de sperme frais, dont la concentration
en spermatozoïdes mobiles est suffisante. Il ne convient donc pas aux patients souffrant
d’oligospermie ou d’asthénospermie [5].
Tests de pénétration in vitro
- Le Test de Miller-Kürzrock
Il permet d’étudier la qualité de la glaire cervicale de la femme, et peut ainsi de révéler la
présence d’ASA. Il consiste à évaluer la pénétration des spermatozoïdes du conjoint et
parallèlement celle des spermatozoïdes d’un témoin [12].
- Les tests S-CMPT (Sperm-Cervical Mucus Penetration Test)
et le S-CMCT (Sperm-Cervical Mucus Contact Test)
Ils sont effectués en cas d’infertilité aussi bien chez l’homme que chez la femme. Le S-CMPT
consiste à faire traverser les spermatozoïdes à travers un capillaire rempli de mucus cervical
de la femme. Ce test permet de mesurer le degré d’inhibition de la migration des
spermatozoïdes, sensibilisés par des auto-anticorps du sperme ou des iso-anticorps de la
glaire cervicale. Le S-CMCT permet de mesurer le % des spermatozoïdes qui n’arrivent pas à
avancer à cause de leurs mouvements instables et désordonnés, notamment dus à la liaison
des ASA de type IgA aux micelles du mucus cervical [8].
Test ELISA
- La technique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Elle permet la détermination quantitative d’anticorps anti-spermatozoïdes par un test
immuno-enzymatique. Le principe de cette technique, que j’ai utilisée dans ce travail, est
décrit sous « Méthode ». Selon les fournisseurs, cette technique est plus sensible et
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Janvier - Mars 2014
spécifique que les méthodes conventionnelles. Elle peut détecter des antigènes ou des
anticorps de faible concentration. Etant facile à pratiquer, elle permet le screening d’un
nombre important de sérums [24].
2.6.2 Conclusion sur les différents tests existants
Les différentes techniques de détection d’ASA disponibles actuellement sur le marché
diffèrent par leur performance très variable. De façon générale, leur efficacité est douteuse,
elles manquent beaucoup de fiabilité. L’absence d’un test standardisé et universellement
accepté pour la détection d’ASA, appelé « Gold Standard », ainsi que le manque de preuves,
par des études scientifiques plus approfondies, sur les mécanismes précis et l’impact réel
des ASA sur la fertilité, font que ces tests ne représentent pas un grand intérêt diagnostic
pour les médecins, et que les laboratoires scientifiques ne sont pas plus enclins à s’investir
dans la mise au point de techniques plus performantes [26].
Le résultat positif d’un test ELISA, ou d’un autre test existant sur le marché, ne doit être
considéré que comme un indice supplémentaire en faveur du diagnostic d’une infertilité
d’origine immunologique. Avant d’envisager toute intervention thérapeutique, il doit être
corrélé à d’autres tests diagnostiques et observations cliniques [24]. Le lien de cause à effet
entre la présence d’ASA et l’inhibition de la conception doit encore être considéré comme
hypothétique, jusqu’à ce que l’on puisse prouver cette relation par des essais scientifiques
valables, utilisant des tests fiables [26].
3 But du travail
Ce travail a pour objet la comparaison et l’évaluation de deux kits : « Spermatozoa-Ab,
ELISA » d’IBL International et « Anti-Spermatozoen-ELISA (Serum) » d’Euroimmun, dans le
but d’introduire un test ELISA pour la quantification sérique d’ASA dans les analyses de
routine du département d’immunologie-sérologie du laboratoire synlab Lausanne.
Pour nous permettre de faire un choix entre ces deux kits utilisant la technique immunoenzymatique ELISA, j’ai tout d’abord procédé à leur description, et à une étude comparative
mettant en lumière leurs différences, avantages et inconvénients. A notre demande, un
laboratoire du groupe synlab nous a envoyé des sérums, qui avaient auparavant été testés
pour les anticorps anti-spermatozoïdes par technique immuno-enzymatique ELISA avec le kit
« Varelisa Sperm Antibodies » de Phadia GmbH. Ce dernier constitue la méthode de
référence pour l’évaluation des kits.
Ensuite, j’ai testé les 31 sérums reçus avec chaque kit. J’ai comparé mes résultats à ceux de
la méthode de référence Varelisa qui nous ont été communiqués. J’ai vérifié les critères
d’évaluation d’une méthode : sensibilité, spécificité et précision. J’ai également décrit les
paramètres : exactitude, limite de détection, limite de linéarité et contamination.
8
Janvier - Mars 2014
4 Développement
4.1 Matériel
4.1.1 Echantillons de sérum
J’ai eu à disposition 31 sérums congelés de patients de sexe masculin et féminin. Les
informations cliniques des patients ne m’ont pas été communiquées.
4.1.2 Automate « Euroimmun Analyser I »
« Euroimmun Analyser I » est un analyseur de plaque de microtitration entièrement
automatisé qui effectue l’analyse de nombreux paramètres sériques de sérologie
infectieuse, d’allergologie et de diagnostique auto-immun. Il utilise des méthodes ELISA et
permet d’aider au diagnostic de nombreuses maladies. Cet automate effectue la dilution des
échantillons, le pipetage des réactifs, les processus de lavage, le transport des microplaques,
les incubations, la mesure photométrique des réactions colorimétriques et l’évaluation des
données.
Figure 1 : Analayer I, n° série 9163980079
Il est contrôlé par le logiciel « Windows PC Euroimmun Analyser I ». Ce logiciel permet
l’utilisation de tests pré-définis, ainsi que la programmation manuelle de tests par
l’utilisateur. Il a été fabriqué de façon à répondre aux exigences de sécurité autant
pour les mécanismes mécaniques, qu’électroniques. Il est facile d’utilisation et assure un
travail fiable et rapide pour le travail de routine.
Les maintenances journalières, hebdomadaires et mensuelles sont effectuées par les
techniciennes en analyse biomédicales (TAB) du département d’immunologie-sérologie. Une
maintenance technique annuelle est assurée par un ingénieur envoyé par Euroimmun [27].
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Janvier - Mars 2014
4.1.3 Kits à comparer et évaluer
4.1.3.1 IBL International GmbH : « Spermatozoa-Ab, ELISA »
REF (N° de commande) : RE52029
Lot du kit : ESP107
Date d’expiration du kit : 30/09/2015
Conservation : 2-8°C
Figure 2 : Boite du kit IBL International GmbH
Figure 3 : Composition du kit IBL
(Annexe 1)
Description des réactifs [24] :
 Barrettes de la microplaque
Conservées à 2-8°C dans un sachet en plastique avec dessiccateur, elles sont stables
jusqu’à 6 semaines. Le kit contient 2 types de microplaques :
o « Microtiter Plate (MTP) », Lot : V333, Date d’expiration : 02/2016
C’est une plaque de microtitration, qui contient 12 barrettes formées chacune de
8 puits sécables les uns des autres. Le fond de chaque puits est recouvert
d’antigènes de surface de spermatozoïdes. La microplaque MTP, qui contient
donc les « coated wells », sert à la détermination de réactions spécifiques.
o « Microtiter Plate NSB (MTP NSB)», Lot : V334, Date d’expiration : 02/2016
C’est une plaque de microtitration, qui contient 12 barrettes formées chacune de
8 puits sécables les uns des autres. La différence avec le MTP réside dans le fait
que le fond des puits ne contient pas d’antigènes de surface de spermatozoïdes.
Il sert à la détermination des liaisons non spécifiques. La microplaque MTP NSB,
qui contient donc les « uncoated wells », est colorée en jaune.
 « Wash Buffer », Lot : V402, Date d’expiration : 09/2015
Le tampon de lavage contient du tampon phosphate, du Tween et des stabilisateurs. Il
doit être dilué avec de l’eau distillée, car il est concentré 20x. Il sert aux étapes de
lavage, ainsi qu’à la dissolution du calibrateur lyophilisé (S5), du tampon de dilution
lyophilisé, et du contrôle de validation lyophilisé. Conservé à 2-8°C, le tampon de
lavage dilué a une stabilité de 4 semaines.
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Janvier - Mars 2014
 « Diluent Buffer », Lot : V335, Date d’expiration : 02/2016
Le tampon de dilution lyophilisé doit être dissout avec du tampon de lavage préparé
(dilué). Il sert à la reconstitution des calibrateurs (S4, S3, S2, S1, et S0), à la dilution du
conjugué enzymatique concentré, ainsi qu’à la dilution 1/51 des échantillons (10µl
sérum + 500µl tampon de dilution). Conservé à 2-8°C, il a une stabilité de 2 jours.
 « Standard », Lot : V336, Date d’expiration : 02/2016
Le calibrateur lyophilisé doit être dissout avec du tampon de lavage préparé afin de
constituer la solution calibrateur (ou standard) stock (S5). Le calibrateur S5 constitué
est stable jusqu’à 2 semaines, conservé à 2-8°C. A partir de ce dernier, on obtient par
dilutions géométriques avec du tampon de dilution préparé, les 4 autres calibrateurs
(S4, S3, S2, S1). Le calibrateur S0 contient uniquement du tampon de dilution. La
concentration de ce dernier est considérée comme nulle. Pour les calibrateurs S1, S2,
S3, S4 et S5, les concentrations respectives devraient être de 37.5, 75, 150, 300, 600
[mU/100 µl]. Une série ne peut être validée si l’absorbance du calibrateur S5 est
< 1.300. (Annexe 2)
 « Control », Lot : V337, Date d’expiration : 02/2016
Le contrôle positif lyophilisé doit être dissout avec du tampon de lavage préparé. Une
fois reconstitué, il a une stabilité de 2 semaines si stocké à 2-8°C. La valeur de la
concentration obtenue pour le contrôle positif doit se situer dans l’intervalle 143 – 297
mU/100 µl pour pouvoir valider la série. (Annexe 2)
 « Enzyme Conjugate », Lot : V338, Date d’expiration : 03/2016
Le conjugué enzymatique est concentré 601x. La quantité de solution de conjugué doit
être préparée fraîchement, avec du tampon de dilution, en fonction du nombre de
réactions de la série à exécuter. Une fois constituée, sa stabilité n’est que de 2 heures
à température ambiante (18-25°C), ainsi elle ne peut être utilisée que pour la série en
cours. Le conjugué enzymatique contient des anticorps anti-IgGAM humains, couplés à
de la peroxydase.
 « TMB Substrate Solution », Lot : V244, Date d’expiration : 07/2016
La solution substrat TMB est prête à l’emploi. Il contient du TMB, un tampon et des
stabilisateurs. Le TMB est le substrat spécifique de l’enzyme peroxydase.
 « TMB Stop Solution », Lot : V284, Date d’expiration : 07/2016
La solution stop est prête à l’emploi. Elle contient 1M d’acide sulfurique.
Stockage, stabilité et intégrité des sérums requis par le kit
Les sérums conservés à 2-8°C ont une stabilité de 24h et doivent être stockés à l’abri de la
chaleur. Il faut éviter les congeler et décongeler à plusieurs reprises car cela impacte sur
l’intégrité de leurs composants. Par ailleurs, il est déconseillé d’utiliser des échantillons
fortement hémolysés, ictériques, ou lipémiques. Les sérums d’aspect trouble (opaque)
doivent être au préalablement centrifugés afin de les débarrasser de toute particule. Une
fois dilués, ils ont une stabilité de 24h à 2-8°C [24].
Mesures de précautions particulières précédant la mise en route du test
Pour la méthode manuelle, il faut veiller à ce que les échantillons dilués, les réactifs, le
matériel et les appareils (incubateur, lecteur de microplaque) soient prêts avant de
commencer le test, car toutes les étapes doivent se suivre sans interruption. Les réactifs et
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échantillons dilués doivent être amenés à température ambiante et bien vortexés avant leur
utilisation. Pour la procédure réalisée manuellement, il est recommandé de créer un schéma
de pipetage avec le positionnement des calibrateurs, du contrôle et des échantillons sur la
plaque. Les barrettes ne doivent être sorties de leur emballage qu’après avoir atteint la
température ambiante, au risque d’être affectés par l’humidité, ce qui pourrait fausser les
résultats [24].
Procédure du test et calcul des résultats
La description détaillée de la procédure du test figure dans le fascicule en annexe. La durée
moyenne d’une série est de 2h40.
La procédure a la particularité d’utiliser des barrettes sécables coatées (MTP) et non coatées
(MTP NSB). Pour la détermination à simple, en début de procédure, chaque calibrateur,
contrôle et échantillon dilué est incubé dans 1 puits de la micropaque coaté et dans 1 puits
non coaté (microplaque jaune). Une fois le test terminé, les absorbances des réactions des
puits non coatés, qui représentent les liaisons non spécifiques, sont soustraites des
absorbances des réactions des puits coatés, qui contiennent la liaison totale (spécifique et
aspécifique). On obtient alors les DO des réactions spécifiques des échantillons, calibrateurs
et contrôle.
Pour chaque série, l’automate génère une courbe de calibration grâce aux concentrations et
absorbances obtenues pour les calibrateurs. A partir de cette dernière sont calculés les
concentrations en anticorps anti-spermatozoïdes des échantillons et du contrôle positif.
Comme nous avons dû réaliser la méthode manuellement, faute de n’avoir pu obtenir une
programmation et base de données des réactifs compatibles avec les automates Analyser I
ou BEP 2000, l’Analyser I nous a uniquement servi à la lecture des DO. Nous avons ensuite
introduit les résultats des DO dans un programme Excel, reçu d’IBL International GmbH. Ce
programme a établi la courbe de calibration et a calculé les concentrations en anticorps antispermatozoïdes des échantillons et du contrôle positif. Les résultats des concentrations pour
les échantillons et le contrôle sont exprimés en mU/100µl. Afin d’obtenir les valeurs en
U/ml, il faut les multiplier par le facteur 0.5. Les échantillons positifs présentent des valeurs
> 150 mU/100µl [24].
Performance selon le fabricant
Pour la répétabilité (= précision intra-sérielle), le fabricant indique un CV% de 2.7 - 11.9, et
pour la reproductibilité (= précision inter-sérielle), il indique un CV% de 7.9 - 15.4 [24].
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4.1.3.2 Euroimmun - Medizinische Labordiagnostika AG :
« Anti-Spermatozoen-ELISA (Serum) »
REF (N° de commande) : EA 1086-9601 P
Lot du kit et des réactifs : I140110AU
Date d’expiration du kit : 09/10/2014
Conservation : 2-8°C
Figure 5 : Composition du kit Euroimmun
Figure 4 : Boîte du kit Euroimmun
(Annexe 3)
Stabilité des réactifs :
Qu’ils soient entamés ou non, les réactifs sont stables jusqu’au 9/10/2014 s’ils sont stockés à
2-8°C et protégés de toute contamination. En revanche, le tampon de lavage une fois
préparé, ainsi que les barrettes une fois l’emballage ouvert, ont une stabilité différente,
décrite ci-dessous [28].
Description des réactifs [28] :
 « Microplate wells »
La plaque de microtitration est composée de 12 barrettes, formées chacune de 8 puits
sécables, et sont contenues dans un cadre porteur. Les puits font office de contenants
de réaction. Ils sont recouverts d’un mélange d’antigènes de surface de
spermatozoïdes humains. Les « coated wells » sont prêts à l’emploi, et doivent être
amenés à température ambiante avant d’être sortis de l’emballage de protection afin
d’éviter la formation d’humidité dans les puits. Les barrettes non utilisées doivent être
immédiatement remises dans l’emballage de protection d’origine. Après la 1ère
ouverture, les puits coatés, conservés à 2-8°C dans le sachet refermé avec
dessiccateur, ont une stabilité de 4 semaines.
 « Wash Buffer »
Le tampon de lavage est concentré 10x, et doit être dilué avec de l’eau distillée. Après
préparation, le tampon de lavage stocké à 2-8°C est stable durant 4 semaines.
 « Dilution Buffer (calibrator 0) »
Le tampon de dilution est prêt à l’emploi. Il sert à la dilution 1/100 des échantillons de
sérum (5µl sérum + 495µl de tampon de dilution). Il fait aussi office de calibrateur 0.
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Janvier - Mars 2014
 « Calibrators »
o Calibrateur 1, Anti-Spermatozoa, ELISA (IgAGM, human), 31 RU/ml
Les calibrateurs sont prêts à l’emploi et contiennent une concentration en anticorps
IgG, IgA et IgM définie. Il faut bien les vortexer avant utilisation. Une courbe de
calibration est réalisée pour chaque série grâce aux concentrations et absorbances
obtenues pour les calibrateurs. A partir de cette courbe de calibration, on peut obtenir
les concentrations en ASA des échantillons de sérum. Les absorbances des calibrateurs
servent aussi de critère de validation. Une série peut être validée si les absorbances S1,
S2, S3 et S4 obtenues se situent dans l’ordre croissant « S1 < S2 < S3 < S4 », et que
l’absorbance du calibrateur S0 est < 0.15. (Annexe 4)
 « Positive Control »
Le contrôle positif est prêt à l’emploi. Il doit être bien vortexé avant utilisation. Une
série est validée si la concentration du contrôle positif se situe entre 70-120 RU/ml.
(Annexe 4)
 « Enzyme Conjugate »
Prêt à l’emploi, le conjugué enzymatique doit être bien vortexé avant utilisation. Il
contient des anticorps IgG anti-IgAGM humains, marqués à l’enzyme peroxydase.
 « Chromogen/Substrate Solution »
La solution substrat, composée de TMB/H2O2, est prête à l’emploi. Le TMB est le
substrat spécifique à l’enzyme peroxydase. La solution est sensible à la lumière. Il faut
refermer la bouteille tout de suite après utilisation, et protéger la microplaque de la
lumière lors de l’incubation avec le substrat.
 « Stop Solution »
La solution stop, composée de 0.25 M d’acide sulfurique, est prête à l’emploi.
Stockage, stabilité et intégrité des sérums requis par le kit
Les sérums stockés à 2-8°C peuvent être conservés durant 1 semaine. Il faut éviter les cycles
de congélation et décongélation répétés. Une fois dilués, ils ont une stabilité de 24h à 2-8°C.
Les sérums fortement hémolysés, lipémiques et ictériques ne devraient pas être testés [28].
Mesures de précautions particulières précédant la mise en route du test
Tous les réactifs doivent être sortis du réfrigérateur environ 30 minutes avant leur
utilisation, afin d’être amenés à température ambiante (18-25°C) [28].
Procédure du test et calcul des résultats
La description détaillée de la procédure du test figure dans le fascicule en annexe. La durée
moyenne d’une série est de 2h55.
La procédure utilise un seul type de barrette. Euroimmun nous a envoyé la programmation
de ce test pour pouvoir l’effectuer sur l’Analyser I. L’automate a effectué les analyses, lu les
DO, généré la courbe de calibration, et calculé les concentrations en ASA des échantillons
des patients et du contrôle positif. Il a rendu un rapport automatique des résultats.
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Janvier - Mars 2014
Les concentrations des échantillons, du contrôle positif et des calibrateurs sont exprimées en
RU/ml, qui veut dire « Relative Units/ml ». Les échantillons positifs présentent des valeurs
≥ 60 RU/ml. Entre 55-65 RU/ml, les résultats sont équivoques. Pour ces derniers, Euroimmun
recommande de tester un nouveau prélèvement dans les 14 jours [28].
Performance selon le fabricant
Pour la répétabilité (= précision intra-sérielle), le fabricant indique un CV% de 4.30 - 5.20, et
pour la reproductibilité (= précision inter-sérielle), il indique un CV% de 5.30 – 8.50 [28].
4.1.4 Matériel nécessaire non fourni
Pour la méthode manuelle, il est nécessaire d’être équipé d’un incubateur régulé à 37°C,
d’un lecteur de plaque de microtitration pour la lecture des absorbances à 450 nm
(l’Analyser effectue cette tâche), de pipettes automatiques, d’une chambre humide, d’un
chronomètre, de tubes à usage unique, de cylindres gradués, d’eau distillée, d’embouts de
pipette, et de papier absorbant.
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Janvier - Mars 2014
4.1.5 Tableaux comparatifs des kits
4.1.5.1 Comparaison des réactifs
Ce tableau présente les différences entre les réactifs des kits en termes de préparation et de stabilité.
Stabilité sans reconstitution
(2-8°C)
Préparation
Réactifs
IBL
Euroimmun
IBL
Euroimmun
Stabilité après reconstitution
(2-8°C)
IBL
Euroimmun
Tampon de lavage
4 semaines
4 semaines
Tampon de dilution
2 jours
--
2 semaines (S5)
--
2 semaines
--
2 heures à TA
--
Calibrateurs
Contrôle positif
Conjugué enzymatique
Solution substrat
+ ≈ 5 mois
--
--
Solution stop
+ ≈ 5 mois
--
--
--
--
Barrettes sécables (microplaque)
Réactifs prêts à l'emploi
--
--
6 semaines
Réactifs nécessitant une reconstitution
4 semaines
Date d’expiration du kit
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Janvier - Mars 2014
4.1.5.2 Comparaison de l’utilisation
Ce tableau résume les points essentiels permettant la comparaison des kits par rapport à leur utilisation. Il met en évidence leurs différences,
leurs avantages et inconvénients.
Kits
« Spermatozoa-Ab, ELISA »
« Anti-Spermatozoen-ELISA (Serum) »
IBL International GmbH
Euroimmun-Medizinische Labordiagnostika AG
Techniques
praticables
Manuelle / Automatique (possible selon le fournisseur, mais n’a pas
encore pu être testée)
Manuelle / Automatique
Performance
(fabricant)
Répétabilité (précision intra-sérielle) : CV% 2.7 - 11.9
Reproductibilité (précision inter-sérielle) : CV% 7.9 - 15.4
Répétabilité (précision intra-sérielle) : CV% 4.30 - 5.20
Reproductibilité (précision inter-sérielle) : CV% 5.30 - 8.50
Unités
mU/100 µl ( = 0.5 U/ml )
RU/ml
Evaluation des
résultats
Positif : > 150 mU/100 µl
Positif : > 60 RU/ml
Equivoque : 55-65 RU/ml
Durée approx.
pour 1 série
manuelle
3h20 au total, dont :
Préparation : 40 min
Procédure : 2h40
3h05 au total, dont :
Préparation : 10 min
Procédure : 2h55
Prix/kit
230 EUR ( ≈ 281 CHF )
96 réactions
505 CHF
96 réactions
 Stabilité des barrettes après 1ère ouverture plus longue de 2
semaines.
 Technique automatisable => Moins de risques d’erreurs.
Rendu des résultats automatique. Une fois la série lancée,
laisse l’opérateur libre pour d’autres activités.
 Prix intéressant.
Avantages
 Temps de préparation et du rendu des résultats plus courts
=> Gain de temps
 Facilité d’utilisation, plus pratique pour la routine.
 Réactifs principaux prêts à l’emploi. Mode d’utilisation du
kit plus actuel.
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Janvier - Mars 2014
 Stabilité de la plupart des réactifs ouverts ou non ouverts
commune à la stabilité du kit => conservables plus
longtemps, plus facile de s’y retrouver.
 Meilleure précision selon le fabricant.
 Intervalle des valeurs équivoques est donné
 Doute sur la possibilité d’une adaptation automatique. Tentatives
non concluantes jusqu’à présent.
 Prix environ 1.8x plus cher
 Méthode manuelle => Risque d’erreurs plus élevé lors de la
procédure, et lors de l’entrée des résultats des DO dans le
programme Excel. Monopolisation d’un opérateur.
 Reconstitution nécessaire pour la plupart des réactifs => perte de
temps, moins pratique pour la routine, risque d’erreurs plus élevé.
Inconvénients
 Quantité des réactifs à reconstituer à calculer pour chaque série,
en fonction du nombre de réactions à effectuer => préparation
longue. Mode d’utilisation obsolète.
 Sérums à diluer manuellement : erreurs possibles, temps de
préparation allongé.
 Stabilité de certains réactifs relativement courte => kit plus
rapidement terminé.
 Diversité des stabilités => suivi plus contraignant.
 Précision selon le fabricant moins bonne que celle d’Euroimmun
 Manque d’un intervalle pour les valeurs équivoques.
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Janvier - Mars 2014
4.2 Méthode
Les kits « Spermatozoa-Ab, ELISA » d’IBL et « Anti-Spermatozoen-ELISA (Serum) »
d’Euroimmun comportent un test immuno-enzymatique qui permet la quantification
d’anticorps anti-spermatozoïdes totaux (IgGAM) dans le sérum humain. La technique utilisée
est plus précisément un ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) indirect et non
compétitif.
Principe de la technique ELISA [29]
1. Fixation de l’antigène dans les puits d’une plaque de microtitration :
Selon les fabricants des kits que j’ai contactés afin de connaître les antigènes exacts
fixés dans le fond des puits des barrettes fournies dans leur kit, il s’agit d’un mélange
d’antigènes de surface de spermatozoïdes et d’autres composants purifiés, extraits du
plasma séminal par des étapes de centrifugations et de lavages. Les fabricants, gardant
profil bas par rapport aux antigènes coatés dans les puits, ne m’ont pas fourni plus de
précisions sur ces protéines.
2. Ajout des échantillons puis incubation à 37°C :
On ajoute les sérums dilués, le contrôle positif et les calibrateurs dans les puits. Durant
l’incubation, les anticorps anti-spermatozoïdes présents dans les échantillons vont se
fixer spécifiquement sur les antigènes coatés au fond des puits.
3. Lavages :
Lors des lavages, on élimine les anticorps non liés spécifiquement aux antigènes. Il ne
reste plus que les complexes antigènes-anticorps fixés au fond des puits.
4. Révélation des complexes antigène-anticorps :
On ajoute un conjugué enzymatique et on incube à 37°C. Composé d’anticorps IgG
anti-IgGAM humains couplé à l’enzyme peroxydase, le conjugué se fixe sur la partie
anticorps du complexe.
5. Lavages :
Les lavages permettront d’éliminer l’excès de conjugué non fixé.
6. Ajout du substrat chromogène incolore TMB et incubation à température ambiante :
Lors de la réaction enzymatique, le substrat est dégradé par l’enzyme en un produit
plus ou moins fortement coloré en bleu, selon la quantité d’anticorps antispermatozoïdes présente dans l’échantillon.
7. Ajout de la solution stop :
On stoppe la réaction après un temps d’incubation précis. La solution stop provoque le
virement de la coloration bleue en jaune.
8. Mesure photométrique de la densité optique (= absorbance) de chaque réaction à 450
et à 620 nm, en vue du dosage quantitatif. L’intensité de la coloration dans les puits est
directement proportionnelle à la concentration d’anticorps présente dans
l’échantillon.
19
Janvier - Mars 2014
Schéma d’une réaction positive
2
3
1
4
Antigène de surface
s de spermatozoïde
d
f
d
f
d
s
g
s
d
f
ASA dans
l’échantillon
Conjugué
enzymatique
Substrat
incolore
Produit
coloré
Figure 6 : Illustration d’une réaction ELISA positive (dosage d’ASA)
20
Janvier - Mars 2014
4.3 Résultats
En vue de l’introduction dans les analyses de routine d’un test ELISA pour la détermination
quantitative d’anticorps anti-spermatozoïdes dans le sérum humain, j’ai testé deux kits qui
pourraient effectuer cette tâche. Afin de les évaluer, j’ai tout d’abord effectué avec chaque
kit une 1ère détermination des échantillons. J’ai ensuite comparé leurs résultats à ceux de la
méthode de référence « Varelisa Sperm antibodies » de Phadia GmbH, obtenus par un
laboratoire du groupe synlab.
Concernant le kit « Anti-Spermatozoen-ELISA (Serum) » d’Euroimmun - Medizinische
Labordiagnostika AG, après discussion avec mes référents des résultats obtenus, il a été
décidé de ne pas poursuivre son évaluation (causes décrites sous « Discussion »).
Pour l’évaluation du kit « Spermatozoa-Ab, ELISA » d’IBL International, j’ai procédé à la
vérification des paramètres : sensibilité, spécificité et précision. J’ai également décrit les
facteurs de validation d’une méthode : exactitude, limite de détection, limite de linéarité et
contamination.
Pour une meilleure organisation lors des tests, j’ai attribué un numéro aux 31 sérums qui ont
servi à tester les kits et établir l’analyse des différents paramètres.
L’appellation des méthodes a été abrégée afin de faciliter la lecture :
- Méthode de référence : Varelisa
- Méthodes à évaluer : IBL et Euroimmun
4.3.1 Corrélation des méthodes
Effectuer une corrélation de méthodes, c’est comparer des résultats obtenus avec
différentes méthodes pour les mêmes échantillons. Une corrélation de méthodes requiert
un minimum de 20 échantillons couvrant l’ensemble du domaine physiologique de mesure
(valeurs basses, moyennes et hautes) [30].
Jusqu’à présent, il n’existe pas d’étalon (= sérum de référence) international ou de test de
référence « Gold Standard » pour la recherche d’anticorps anti-spermatozoïdes. De plus, les
fournisseurs produisent chacun leurs propres mélanges d’antigènes pour détecter ces
anticorps. Ces protéines, qui tapissent le fond des puits de réaction des barrettes de la
microplaque sont différentes d’un fournisseur à un autre. Ces derniers ne veulent d’ailleurs
pas les révéler ; c’est un secret de fabrication. Chaque fournisseur attribue des unités et un
seuil de positivité propres aux valeurs des résultats obtenus avec ses kits.
Par conséquent, il n’est pas possible d’effectuer une réelle corrélation de méthodes dans ce
travail. Vu que les résultats ne sont pas comparables, établir une relation linéaire entre les
différentes méthodes par la régression linéaire selon Passing-Bablok serait aberrant.
Cependant, il est possible d’établir un graphique de comparaison qui s’en inspire, mais qui
illustrerait plutôt la répartition des résultats en fonction des deux méthodes, délimitée en
catégories représentatives de la sensibilité et la spécificité (graphique sous « Sensibilité et
spécificité »).
21
Janvier - Mars 2014
4.3.2 Tableau des résultats
Ce tableau regroupe les résultats de la 1ère détermination réalisée avec les kits à évaluer,
ainsi que ceux de la méthode de référence qui nous ont été communiqués. Les démarches
mises en œuvre pour l’obtention des résultats avec les kits Euroimmun et IBL, ainsi que la
validation, l’interprétation et l’exploitation de ces résultats, figurent dans la discussion.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
1052123
1059639
1111798
1072096
1133002
1075739
1085429
1085628
1105425
1048284
1131335
1055486
1042390
1116628
1114441
1115433
1110926
1104131
1103955
1103392
1099283
1101433
1096790
1095683
1093763
1092636
1090463
1085544
1083965
1072094
1105420
[U/ml]
< 14 = 14-20 = +/> 20 = +
23,8
21,0
24,2
10,8
24,6
5,9
5,8
5,9
15,4
15,1
15,2
33,8
29,2
32,5
38,3
2,4
35,9
19,5
28,2
39,8
35,7
35,0
40,0
23,9
26,1
10,6
33,4
27,2
2,8
29,7
37,1
pos
pos
pos
neg
pos
neg
neg
neg
dtx
dtx
dtx
pos
pos
pos
pos
neg
pos
dtx
pos
pos
pos
pos
pos
pos
pos
neg
pos
pos
neg
pos
pos
[mU/100 µl]
< 150 = ≥ 150 = +
> 600
135,9
264,8
58,6
23,3
15,6
17,3
22,0
30,6
27,6
23,8
> 600
97,3
92,6
507,4
19,0
248,4
104,9
220,3
167,6
145,9
168,2
477,5
126,6
63,0
35,8
283,0
194,5
10,4
119,5
68,0
Interprétation
N° Lab.
Spermatozoa-Ab,
ELISA,
d’IBL International
Interprétation
N°Attribué
Varelisa Sperm
Antibodies,
de Phadia GmbH
MÉTHODES À ÉVALUER
pos
neg
pos
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
pos
neg
neg
pos
neg
pos
neg
pos
pos
neg
pos
pos
neg
neg
neg
pos
pos
neg
neg
neg
Anti-SpermatozoenELISA (Serum),
d'Euroimmun
[RU/ml]
< 55 = 55-65 = +/> 65 = +
40,43
36,80
26,52
34,50
29,67
18,07
21,22
27,85
32,75
22,71
40,03
33,16
27,52
22,99
44,25
34,16
39,63
26,52
34,04
58,11
39,27
45,95
22,10
33,66
55,68
18,39
21,06
23,58
19,88
23,73
35,62
Interprétation
MÉTHODE DE RÉFÉRENCE
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
dtx
neg
neg
neg
neg
dtx
neg
neg
neg
neg
neg
neg
22
Janvier - Mars 2014
4.3.3 Sensibilité et spécificité
La sensibilité et la spécificité permettent de définir la fiabilité d’une méthode à évaluer par
rapport à une méthode de référence.
Sensibilité
La sensibilité d’une méthode correspond à sa capacité à donner un test positif quand la
méthode de référence donne un test positif. En d’autres termes, c’est le % des échantillons
trouvés positifs avec la méthode à évaluer par rapport aux échantillons positifs de la
méthode de référence. (Ou % des tests positifs dans une population malade) [31].
Calcul :
Sensibilité [%] =
𝑉𝑃
∙ 100
𝑉𝑃 + 𝐹𝑁
- VP (vrais positifs) : nombre de tests qui sont positifs autant avec la méthode à évaluer
qu’avec la méthode de référence. (Ou nombre d’individus malades avec un test positif).
- FN (faux négatifs) : nombre de tests qui sortent négatifs avec la méthode à évaluer, mais
qui sont positifs avec la méthode de référence. (Ou nombre d’individus malades avec un
test négatif).
Spécificité
La spécificité d’une méthode correspond à sa capacité à donner un test négatif quand la
méthode de référence donne un test négatif. En d’autres termes, c’est le % des résultats
trouvés négatifs avec la méthode à évaluer par rapport aux échantillons négatifs de la
méthode de référence. (Ou % des tests négatifs dans une population saine) [31].
Calcul :
Spécificité [%] =
𝑉𝑁
∙ 100
𝑉𝑁 + 𝐹𝑃
- VN (vrais négatifs) : nombre de tests qui sont négatifs autant avec la méthode à évaluer
qu’avec la méthode de référence. (Ou nombre d’individus non malades avec un test
négatif).
- FP (faux positifs) : nombre de tests qui sortent positifs avec la méthode à évaluer, mais
qui sont négatifs avec la méthode de référence. (Ou nombre d’individus non malades
avec un test positif).
23
Janvier - Mars 2014
4.3.3.1 Méthode IBL
Tableau comparatif des résultats Varelisa/IBL
Il permet une comparaison entre les résultats qualitatifs de la méthode de référence Varelisa
et de la méthode à évaluer IBL.
La sensibilité et la spécificité de la méthode IBL ont été calculées sur la base des résultats
figurant dans ce tableau. La méthode de référence Varelisa donne un intervalle des valeurs
équivoques, tandis que la méthode à évaluer IBL n’en propose pas.
o Violet : échantillons dont les résultats de Varelisa sont équivoques. Pour les calculs, ces
valeurs sont considérées comme négatives, car pour Varelisa elles sont < 20 U/ml, et
pour IBL elles sont < 150 mU/100 µl.
o Vert : résultats concordant entre les deux méthodes, soit les VP et les VN.
o Orangé : résultats discordants
N°
Attrib.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
N° Lab.
1052123
1059639
1111798
1072096
1133002
1075739
1085429
1085628
1105425
1048284
1131335
1055486
1042390
1116628
1114441
1115433
1110926
1104131
1103955
1103392
1099283
1101433
1096790
1095683
1093763
1092636
1090463
1085544
1083965
1072094
1105420
Varelisa
IBL
[U/ml]
[mU/100 µl]
23,8
21,0
24,2
10,8
24,6
5,9
5,8
5,9
15,4
15,1
15,2
33,8
29,2
32,5
38,3
2,4
35,9
19,5
28,2
39,8
35,7
35,0
40,0
23,9
26,1
10,6
33,4
27,2
2,8
29,7
37,1
pos
pos
pos
neg
pos
neg
neg
neg
dtx
dtx
dtx
pos
pos
pos
pos
neg
pos
dtx
pos
pos
pos
pos
pos
pos
pos
neg
pos
pos
neg
pos
pos
> 600
135,9
264,8
58,6
23,3
15,6
17,3
22,0
30,6
27,6
23,8
> 600
97,3
92,6
507,4
19,0
248,4
104,9
220,3
167,6
145,9
168,2
477,5
126,6
63,0
35,8
283,0
194,5
10,4
119,5
68,0
pos
neg
pos
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
pos
neg
neg
pos
neg
pos
neg
pos
pos
neg
pos
pos
neg
neg
neg
pos
pos
neg
neg
neg
24
Janvier - Mars 2014
Synthèse qualitative des résultats
N = 31
Pos
Dtx
Neg
Méthode à
évaluer :
IBL
Méthode de référence :
Varelisa
Pos
Dtx
Neg
11
0
0
0
0
0
9
4
7
20
4
7
11
0
20
31
Répartition des résultats qualitatifs en catégories
Ce graphique illustre de façon plus visuelle la répartition en catégories des échantillons selon
leurs résultats obtenus avec les deux méthodes à la fois.
o Droite rouge : fixée à 150 mU/100 µl, délimite les valeurs négatives des valeurs
positives pour la méthode IBL.
o Droite jaune : fixée à 20 U/ml, délimite les valeurs négatives des valeurs positives pour
la méthode Varelisa.
o Droite traitillée jaune : fixée à 14 U/ml, délimite le seuil inférieur de l’intervalle
douteux 14-20 U/ml de la méthode Varelisa.
Les résultats répartis dans les cases VP et VN indiquent une bonne correspondance entre les
deux méthodes, tandis que les résultats dans les cases FP et FN indiquent une mauvaise
correspondance car ils sont discordants. En l’occurrence, j’ai obtenu 9 FN, mais pas de FP.
L’analyse de ces 9 résultats discordants est développée dans la discussion.
Figure 7 : Correspondance IBL / Varelisa
25
Janvier - Mars 2014
Résultats obtenus pour la méthode IBL
Sensibilité [%] =
11
∙ 100 = 𝟓𝟓 %
11 + 9
Spécificité [%] =
7
∙ 100 = 𝟏𝟎𝟎 %
7+0
Sensibilité et spécificité selon le fabricant
Dans le fascicule explicatif accompagnant le kit, IBL international n’indique pas la sensibilité,
ni la spécificité. Après les avoir contacté à ce sujet, ils m’ont confirmé que le fabricant n’avait
pas été testé ces paramètres. Cela peut s’expliquer par le manque d’un test standardisé et
accepté universellement, appelé « Gold Standard », qui puisse détecter des anticorps antispermatozoïdes par reconnaissance d’antigènes spécifiques connus.
Conclusion
La méthode IBL présente une excellente spécificité (100%), au détriment d’une sensibilité
(55%) plutôt basse. Malheureusement nous ne pouvons pas nous situer par rapport au
fabricant qui n’a pas établi ces paramètres.
4.3.4 Précision
La précision d’une série de mesures représente l’évaluation de la dispersion des résultats par
rapport à la moyenne. Elle reflète la similitude entre les mesures effectuées sur un même
échantillon. Déterminée par l’écart-type et le coefficient de variation (CV), elle permet
l’estimation des erreurs aléatoires, et par extension, de l’imprécision [32].
 L’écart-type (𝑆𝑋 ) : appelé aussi « déviation standard », il représente la dispersion
absolue des résultats autour de la moyenne. Il est exprimé en unité de mesure et sert à
calculer le CV. Calcul pour N < 30 :
𝑁
1
𝑆𝑋 = √
∑(𝑥𝑖 − 𝑥̅ )2
𝑁−1
𝑖=1
𝑁 = nombre de mesures
𝑥𝑖 = valeur mesurée
𝑥̅ = moyenne des valeurs mesurées
2
∑𝑁
𝑖=1(𝑥𝑖 − 𝑥̅ ) = somme de tous les écarts
 Le CV : exprimé en %, il représente la dispersion relative des mesures autour de la
moyenne. Il permet de définir 2 types d’imprécision :
- L’imprécision intra-sérielle, ou répétabilité
- L’imprécision inter-sérielle, ou reproductibilité
Calcul pour 3 ≤ N ≤ 29 :
𝑆𝑋
𝐶𝑉 % =
∙ 100
𝑥̅
Pour évaluer la précision d’une méthode, il faut effectuer des essais de répétabilité et de
reproductibilité avec des échantillons couvrant les 3 niveaux de concentration (haute/
moyenne/ basse). Le nombre d’échantillons à tester dépend de la disponibilité du type
d’échantillon d’intérêt (séroprévalence), du coût des réactifs et de la technique utilisée. Pour
une technique manuelle, il est recommandé de tester 5 échantillons, en effectuant 3-4
déterminations. Les CV % résultants sont ensuite comparés aux CV % donnés par le fabricant
pour la méthode de référence [30].
26
Janvier - Mars 2014
4.3.4.1 Répétabilité de la méthode IBL
Evaluation de l’imprécision intra-sérielle. Le même échantillon est testé plusieurs fois pour
un même paramètre au cours d’une même série (le même jour), dans des conditions
standardisées, c’est-à-dire, avec les mêmes réactifs (n° lot), les mêmes instruments et
automate et par le même opérateur [30].
En accord avec mes référents, j’ai testé 5 échantillons couvrant les 3 niveaux de
concentration, à raison de 5 déterminations/échantillon. (Annexe 5 : Séries 4 et 5)
- N° 9 : négatif
- N° 21 et 22 : borderline plutôt positifs
- N° 27 et 30 : positifs
N°
N° Lab.
9
22
21
30
27
1105425
1101433
1099283
1072094
1090463
Run 1
Run 2
Run 3
Run 4
Run 5
Moyenne
[mU/100 µl]
[mU/100 µl]
[mU/100 µl]
[mU/100 µl]
[mU/100 µl]
[mU/100 µl]
35,4
143,0
162,9
202,7
134,8
25,9
162,9
171,1
232,6
259,6
27,6
159,4
177,5
213,3
295,3
20,3
169,9
180,5
214,5
247,9
28,9
178,1
160,5
196,9
201,0
27,6
162,7
170,5
212,0
227,7
CV
(%)
19,6
8,08
5,13
6,45
27,2
Imprécision intra-sérielle donnée par le fabricant [24] :
Gamme [mU/100 μl]
47,0 – 151,0
CV (%)
2,7 – 11,9
Interprétation des résultats et conclusion :
Les CV obtenus pour les échantillons n° 9 et 27 sont trop élevés. Ils sont supérieurs à la
valeur haute 11,9% de l’intervalle des CV donné par le fabricant. Si on tient compte du CV
maximal de 20% toléré chez synlab pour les ELISA, le CV du n°9 se trouve être tout juste
acceptable, tandis que celui du n°27 est toujours trop élevé. Ces échantillons ont la
particularité de représenter les niveaux de concentration opposés, respectivement bas et
haut. Le fabricant assure une linéarité des réactions pour les concentrations 31.4 – 376.9
mU/100 µl. Le CV de 19.6% de l’échantillon n°9 peut s’expliquer par le fait que la moyenne
des concentrations se situe en-dessous de la limite de linéarité. Par contre, le CV de 27,2%
de l’échantillon n° 27 est particulièrement élevé, compte tenu du fait que la moyenne des
concentrations se situe bien à l’intérieur de l’intervalle de linéarité.
Les CV obtenus pour les échantillons n° 21, 22, et 30 sont bons, car ils se situent non
seulement dans l’intervalle des CV donné par le fabricant, mais ils sont également inférieurs
aux 20% admis par synlab pour les ELISA.
Pour conclure, la précision intra-sérielle est bonne pour les échantillons qui ont une
concentration moyenne bien à l’intérieur de l’intervalle de linéarité. Elle est beaucoup moins
bonne pour les échantillons dont la concentration moyenne se situe au niveau des valeurs
bordant cet intervalle.
L’intervalle des CV des essais de répétabilité effectués est de 5,13 – 27,2%, pour la gamme
des concentrations 27,6 – 227,7 mU/100 µl. Les concentrations de la gamme des
échantillons testés par le fabricant se situent bien à l’intérieur de l’intervalle de linéarité, ce
qui explique en partie que son intervalle des CV soit meilleur que le mien. De plus, le
27
Janvier - Mars 2014
fabricant a choisi de tester une gamme des concentrations d’intervalle relativement plus
étroit, ce qui contribue aussi à donner de bons CV.
L’intervalle des CV que j’ai obtenu est plus grand et moins bon que celui du fabricant,
notamment à cause de la concentration moyenne de l’échantillon n°9 qui est inférieure à la
limite de linéarité, et à cause de la concentration du Run1 de l’échantillon n°27 qui est plus
basse que celles des Run 2-5. Pour l’échantillon n°27, si l’on supprimait le Run1, on
obtiendrait un CV de 15,5%. L’intervalle des CV serait alors meilleur : 5,13 – 19,6%.
En définitive, bien que la gamme des concentrations des échantillons testés donne un
intervalle des CV moins bon que celui du fabricant, elle couvre un domaine physiologique
plus grand qui englobe bien la zone de décision.
4.3.4.2 Reproductibilité de la méthode IBL
Evaluation de l’imprécision inter-sérielle. Elle exprime l’imprécision des mesures d’un même
échantillon testé pour le même paramètre. Ces mesures sont obtenues au cours de séries
distinctes, dans des conditions de dosage différentes, par exemple : instruments et
automate différents (si possible), des réactifs d’un n° lot différent, sur différents jours, et par
différents opérateurs. Ces conditions sont sources de plus d’erreurs possibles [30].
En accord avec mes référents, j’ai testé 6 échantillons couvrant les 3 niveaux de
concentrations. J’ai effectué en tout 5 déterminations/échantillon, réparties sur 5 jours
différents, pour lesquelles j’ai utilisé les mêmes de réactifs (même kit/n° lot), les mêmes
instruments et automate. (Annexe 5 : Séries 1-5)
-
N° 6 et 7 : forts négatifs
N° 2 : borderline plutôt négatif
N° 20 : borderline plutôt positif
N° 15 et 23 : forts positifs
N°
N° Lab.
7
6
2
20
15
23
1085429
1075739
1059639
1103392
1114441
1096790
Run 1
Run 2
Run 3
Run 4
Run 5
Moyenne
CV
[mU/100 µl]
[mU/100 µl]
[mU/100 µl]
[mU/100 µl]
[mU/100 µl]
[mU/100 µl]
(%)
17,3
15,6
135,9
167,6
507,4
477,5
19,9
15,2
116,6
171,1
474,6
526,2
16
27,6
123
134,2
563,7
> 600
19
19
137,7
153,5
> 600
509,8
14,5
15,8
112,5
130,7
328,1
378,5
17,4
18,6
125,1
151,4
468,4
473,0
12,6
28,1
9,03
12,3
21,4
13,9
Remarque : Les échantillons n° 15 et 23 ont chacun donné une concentration « > 600
mU/100 µl » (en rouge). Ces concentrations, dépassant celle du calibrateur S5, sont
automatiquement plafonnées à 600 par le programme Excel d’IBL. Pour le calcul des CV, ces
valeurs ont été ignorées.
Imprécision inter-sérielle donnée par le fabricant [24] :
Gamme [mU/100 μl]
42,0 – 130,0
CV (%)
7,9 – 15,4
28
Janvier - Mars 2014
Interprétation des résultats et conclusion :
Les CV des échantillons n° 7, 2, 20 et 23 sont dans l’intervalle des CV donné par le fabricant,
et ils sont inférieurs au CV maximal de 20% toléré au laboratoire de synlab pour les ELISA,
c’est pourquoi ils peuvent être considérés comme bons.
Les CV des échantillons n° 6 et 15 sont supérieurs à la valeur haute 15,4% de l’intervalle des
CV donné par le fabricant, et dépassent aussi les 20% admis par synlab pour les ELISA. Ils
peuvent être considérés comme mauvais, car trop élevés.
Pour conclure, on constate que si l’on utilise des échantillons dont la concentration moyenne
se situe bien à l’intervalle de linéarité 31.4 – 376.9 mU/100 µl donné par le fabricant (n°2 et
20), on obtient une bonne précision inter-sérielle.
Pour les échantillons dont la concentration moyenne est en dehors de l’intervalle de
linéarité, il y a plus de risques d’obtenir un mauvais CV. Pour les échantillons concernés par
cette constatation (n°7, 6, 15 et 23), ce risque est évalué à 50%. Les échantillons n°7 et 6 ont
chacun une concentration moyenne < intervalle de linéarité, tandis que les échantillons n°15
et 23 ont chacun une concentration moyenne > intervalle de linéarité. Dans les deux cas
(< ou > intervalle linéarité), un échantillon sur deux présente un mauvais CV.
L’intervalle des CV des essais de réproductibilité effectués est de 9,03 – 28,1%, pour la
gamme des concentrations 17,4 – 473 mU/100 µl. Les concentrations de la gamme des
échantillons testés par le fabricant se situent bien à l’intérieur de l’intervalle de linéarité, ce
qui explique pourquoi son intervalle des CV soit meilleur que le mien. De plus, le fabricant a
choisi de tester une gamme des concentrations d’intervalle beaucoup plus étroit, ce qui
contribue aussi à donner de bons CV. Toutefois, son intervalle n’inclut pas la zone de
décision. Il aurait au moins dû comporter le seuil de positivité 150 mU/100 µl.
4.3.4.3 Conclusion sur la précision de la méthode IBL
La répétabilité et la reproductibilité de la méthode IBL sont généralement bonnes pour les
échantillons dont les concentrations se trouvent bien à l’intérieur de l’intervalle de linéarité
donné par le fabricant. La précision pour les échantillons dont les concentrations se situent
hors de l’intervalle de linéarité ou au niveau des valeurs bordant cet intervalle, a tendance à
bien se dégrader.
Pour une évaluation plus correcte de la précision, il faudrait choisir des échantillons de
concentration située dans l’intervalle de linéarité. Afin de permettre une comparaison plus
adéquate de nos intervalles de CV à ceux du fabricant, on pourrait utiliser les mêmes
gammes de concentration restreintes que le fabriquant. Cependant, les gammes utilisées
doivent au moins inclure le seuil de positivité, car ce qui importe dans le dosage des ASA
c’est surtout d’obtenir un résultat qualitatif précis.
Le fabricant n’indique pas s’il a utilisé la méthode manuelle ou automatique, le nombre
d’échantillons testés et le nombre de déterminations effectuées. Ainsi, une comparaison
beaucoup plus optimale par rapport au fabricant n’est pas possible.
Compte tenu des résultats obtenus par technique manuelle, la précision de la méthode IBL
peut être évaluée comme bonne. La précision serait meilleure si les tests étaient effectués
par technique automatique. La précision est la 1ère performance d’une méthode à vérifier. Le
processus d’évaluation de la méthode IBL peut être poursuivi.
29
Janvier - Mars 2014
4.3.5 Exactitude
L’exactitude est la différence entre la moyenne des résultats d’une série de mesures et la
valeur vraie. Cette différence, qualifiée plus précisément d’« inexactitude », est exprimée en
% et peut être positive ou négative. L’inexactitude permet d’estimer les erreurs
systématiques, appelées également « erreurs d’inexactitude » [33].
Calcul :
𝐼𝑛𝑒𝑥𝑎𝑐𝑡𝑖𝑡𝑢𝑑𝑒 [%] =
𝑋𝑚 − 𝜇
∙ 100
𝜇
𝑋𝑚 = moyenne des mesures
𝜇 = valeur vraie
Comme il n’existe pas d’étalon international pour les anticorps anti-spermatozoïdes, il n’y a
pas de valeur vraie, et par conséquent il n’est pas possible de calculer l’inexactitude.
Dans notre cas, il s’agit de comparer une méthode à évaluer à une méthode de référence. La
notion de « biais » serait plus appropriée car il s’agit de comparer la moyenne des mesures à
la valeur obtenue par la méthode de référence. La formule de calcul est identique à celle de
l’inexactitude, sauf qu’au lieu de la valeur vraie il s’agit de la valeur cible (𝑋𝑐 ). Cependant, les
unités de mesures utilisées dans les deux méthodes étant différentes, les valeurs ne sont pas
comparables et il n’est donc pas possible de calculer le biais [33].
L’évaluation de l’exactitude par le graphique de Passing-Bablock, qui est la méthode
statistique pour évaluer l’exactitude, et qui permet d’établir une corrélation entre 2
méthodes, ne peut pas être effectuée dans ce cas-ci [34].
4.3.6 Domaine de mesure
4.3.6.1 Limite de détection
La limite de détection correspond au plus petit signal, ou à la quantité minimale, détectable
par la méthode, qui peut être distingué d’un blanc réactif. Elle est exprimée en quantité ou
en concentration, et peut être calculée sur la mesure de 5 blancs (ex : diluent) [30].
Calcul :
𝐿𝐷 = 𝑚𝑜𝑦𝑒𝑛𝑛𝑒𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐 + 𝐾 ∙ 𝑆𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐
𝑆𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐 = Ecart-type calculé sur les mesures
du blanc
𝐾 = coefficient dépendant du nombre de
mesures et des risques α et β. K = 3, pour
un risque de 99%.
La limite de détection annoncée par le fabricant est de 0.14 mU/100 µl [24]. La vérification
de la quantité minimale pouvant être distinguée du blanc réactif ne représente aucun intérêt
dans le dosage sérique d’anticorps anti-spermatozoïdes. Les concentrations < 10 mU/100 µl
sont automatiquement plafonnées à 10 par le programme Excel d’IBL. Après discussion avec
mes référents, il n’a pas été jugé utile de vérifier ce paramètre.
4.3.6.2 Limite de linéarité
La limite de linéarité est la zone de validité de la relation linéaire entre les valeurs théoriques
et les valeurs mesurées. Un minimum de 6 dilutions de concentrations échelonnées d’un
étalon ou d’un échantillon très concentré, couvrant la gamme des concentrations du
domaine de mesures souhaité, sont testées afin de déterminer la linéarité. Chaque dilution
est dosée à triple durant 3 jours consécutifs. A partir des résultats obtenus pour chaque
dilution, on calcule la moyenne et l’écart-type et on reporte sur un graphique la moyenne
30
Janvier - Mars 2014
des valeurs mesurées (en Y), associées à +/- 2 écart-types, en fonction des valeurs
théoriques des dilutions successives (en X). On trace la droite idéale (bissectrice) et la droite
obtenue (moyenne +/- 2 écart-types). La courbe de calibration ainsi établie définit la
linéarité de la méthode qui correspond à la zone où les intervalles de confiance +/- 2 écarttypes coupent la bissectrice. Les limites analytiques inférieures et supérieures ainsi
déterminées peuvent être comparées à celles données par le fabricant [31] [34].
Ce qui importe dans le dosage des ASA c’est surtout le résultat qualitatif positif ou négatif. La
limite de linéarité de la méthode IBL est donnée par le fabricant. En accord avec mes
référents, il n’a pas été jugé nécessaire de vérifier ce paramètre.
4.3.7 Contamination
La contamination est un paramètre à vérifier lors de l’évaluation d’une méthode
automatisée.
Afin de vérifier la contamination inter-échantillons, on mesure l’influence des échantillons à
forte concentration sur les échantillons à faible concentration.
La contamination dans un automate peut être déterminée en vérifiant si les rinçages qu’il
effectue sont efficaces. Après le rinçage, on passe tout d’abord un échantillon fortement
positif, suivi d’un échantillon négatif. Ensuite, on calcule les CV des échantillons négatifs et
on les compare à ceux de la reproductibilité [30].
Les automates Analyser I et BEP 2000 changeant d’embout à chaque pipetage d’échantillon
et de réactif, les risques de contamination inter-échantillons et inter-réactifs sont quasi nuls.
La seule contamination éventuelle provient du peigne qui aspire les différents liquides.
Toutefois, la vérification de ce paramètre pour ces automates n’est pas nécessaire car ces
automates subissent des maintenances quotidiennes et hebdomadaires qui assurent la
bonne fonctionnalité des peignes (lavages/ volumes pipetés/ efficacité d’aspiration). Tous les
matins, un check visuel est pratiqué sur une plaque de microtitration de 12 colonnes. Elle est
insérée vide dans l’automate. Tout d’abord, il distribue un volume d’eau déminéralisée
précis dans tous les puits, puis il aspire l’eau des puits des 6 dernières colonnes. La
vérification du niveau de l’eau, qui doit être identique dans les 6 premières colonnes, assure
une bonne distribution, tandis que la vérification des 6 dernières colonnes, qui doivent être
complètement vides, assure une bonne aspiration des peignes.
N’ayant pas pu adapter le kit IBL aux automates Analyser I ou BEP 2000 comme souhaité,
c’est la technique manuelle qui a été réalisée pour les dosages. Bien que les embouts soient
changés à chaque pipetage d’échantillon et de réactif, il y a tout de même des risques de
contamination dus à des projections de gouttelettes lors des lavages et du pipetage des
échantillons.
31
Janvier - Mars 2014
4.4 Discussion
4.4.1 Résultats obtenus avec le kit Euroimmun
4.4.1.1 Démarche
Les résultats des 31 échantillons figurant dans le tableau sont issus d’une 1 ère détermination.
Les sérums ayant été livrés en deux fois, j’ai tout d’abord testé les 18 premiers échantillons
reçus, n° 14-31, par technique automatique sur l’Analyser I. Comme nous venions d’installer
la programmation pour les anticorps anti-spermatozoïdes totaux (IgGAM) reçu par
Euroimmun, après discussion avec mes référents il a été convenu d’effectuer tout d’abord
une série test de 10 échantillons. Ensuite, nous avons testé les 8 derniers échantillons.
4.4.1.2 Validation des résultats
Les résultats des échantillons 14-31 peuvent être validés (Annexe 6), car dans les deux séries
la concentration obtenue pour le contrôle positif se situe dans l’intervalle d’acceptabilité
70 - 120 RU/ml, les absorbances résultantes des calibrateurs S1, S2, S3, et S4 se situent dans
l’ordre croissant S1 < S2 < S3 < S4, et l’absorbance du calibrateur S0 < 0.15. Sur chaque
rapport rendu par l’automate figure tout en haut à droite la mention « Passed » si la série
est validée, et « Failed » si elle a échoué. Sur le rapport des 10 échantillons (n°25, 21, 22, 20,
19, 18, 31, 17, 15 et 16) l’Analyser I a affiché « Failed », mais la série a bel et bien été validée.
Ces échantillons font partie de la toute première série qui a été testée juste après avoir
installé le programme. L’automate a rendu « Failed », car il lui manquait les valeurs pour le
« PC_LL » et le « PC_UL ». Nous n’avions pas tout de suite compris qu’il s’agissait de la valeur
basse et de la valeur haute de l’intervalle de validité du contrôle positif. Après introduction
de ces valeurs et réimpression, l’Analyser I n’a tout simplement pas corrigé sa mention.
Une fois la suite des échantillons arrivée, n° 1-13, ces derniers ont également été testés par
technique automatique sur l’Analyser I (Annexe 7). La série a pu être validée de la même
façon que pour les échantillons n° 14-31.
4.4.1.3 Interprétation et exploitation des résultats
Tout comme la méthode de référence Varelisa, la méthode Euroimmun donne un intervalle
des résultats douteux.
Malheureusement, les résultats des 31 échantillons obtenus avec le kit Euroimmun sont
sortis négatifs (excepté n° 20 et 25 qui sont douteux), alors que la méthode de référence
Varelisa indique environ 64.5% de sérums positifs. Avec mes référents, nous avons discuté
des causes possibles de cette négativité. Tout d’abord, afin de vérifier l’hypothèse d’un
éventuel problème au niveau de la programmation de la procédure automatique, j’ai choisi
de retester par technique manuelle les échantillons n° 1-13. L’Analyser I a effectué la lecture
des absorbances et a généré les résultats qu’il a rendus sous forme de rapport (Annexe 8).
Les résultats de cette série manuelle sont proches des résultats générés par technique
automatique. Ils sont donc toujours négatifs.
Après avoir écarté cette hypothèse, nous avons pensé à un problème avec le kit Euroimmun,
ou au fait que les kits Euroimmun et Varelisa n’utilisent très probablement pas les mêmes
protéines pour détecter les ASA. Cette dernière hypothèse nous paraît plus plausible. J’ai
donc pris contact avec Euroimmun AG à Lübeck en Allemagne, et leur ai expliqué notre souci
32
Janvier - Mars 2014
avec leur kit. Avec leur accord, je leur ai envoyé mes sérums (sauf n° 3, 4, 7, 11 et 13 =>
quantité insuffisante) pour qu’ils puissent les tester eux-mêmes.
Dans l’attente d’une réponse d’Euroimmun, en accord avec mes référents, l’évaluation de ce
kit n’a pas été poursuivie. Je me suis plutôt investie dans l’évaluation du kit IBL.
Une semaine plus tard, j’ai reçu une réponse d’un « responsable produit » d’Euroimmun
avec qui j’étais entrée en contact pour l’envoi des sérums. Il a confirmé les résultats négatifs
que nous avions obtenus (Annexe 9). Il a contacté le fabricant pour lui exposer le problème.
Jusqu’à présent, il n’a toujours pas obtenu de réponse. A sa demande, je lui ai envoyé le
tableau regroupant les résultats de Varelisa, d’IBL et d’Euroimmun, afin qu’il puisse en
discuter avec le fabricant. Personnellement, le « responsable produit » pense qu’il s’agit d’un
lot non fonctionnel.
En raison de la non fonctionnalité de ce kit démontrée par leurs propres tests, Euroimmun
nous recommande de ne pas l’utiliser, et assure mettre tout en œuvre pour identifier les
problèmes et y remédier.
4.4.2 Résultats obtenus avec le kit IBL
4.4.2.1 Démarche
Initialement, nous avions prévu de tester ce kit sur les automates Analyser I ou BEP 2000. J’ai
demandé au « responsable produit » d’IBL International GmbH établi à Hambourg en
Allemagne de nous envoyer la programmation et le « Reagenzdatenbank Spermatozoa-Ab »
(= base de données des réactifs pour ce kit) afin d’adapter leur kit à un des deux automates,
de préférence à l’Analyser I. Ne possédant pas l’adaptation pour l’Analyser I, il m’a envoyé
celle pour le BEP 2000. Lors du paramétrage, un problème de compatibilité est survenu, un
message d’erreur s’est affiché. J’ai soumis le problème au « responsable produit ». Il m’a
répondu ne pas avoir d’autre « Reagenzdatenbank » qui soit compatible avec le BEP 2000 à
nous fournir, et que chez eux l’adaptation de ce test sur cet automate est fonctionnelle.
En raison de l’importance des préparations nécessaires (exemple : reconstitution des
réactifs), des stabilités très variables des différents réactifs reconstitués auxquelles il faut
être attentif, ce kit n’est pas pratique pour une utilisation sur automate. De plus, à l’inverse
du fascicule explicatif du kit Euroimmun, celui du kit IBL ne contient aucune indication sur
une procédure automatique. Selon ces constatations, il paraît difficile d’adapter ce kit sur un
automate.
Nous avons contacté une spécialiste de l’application sur le terrain de Siemens Healthcare
Diagnostics AG pour le paramétrage du fichier « Reagenzdatenbank », en vue d’une
adaptation sur le BEP 2000. N’obtenant pas de résultats concluants, nous avons confié cette
tâche à un spécialiste d’Euroimmun pour l’adaptation sur l’Analyser I. En attendant, j’ai
procédé à l’évaluation du kit par technique manuelle.
Les résultats des 31 échantillons figurant dans ce tableau proviennent de deux séries
réalisées manuellement. J’ai tout d’abord testé les échantillons n° 1-13, puis les échantillons
n° 14-31. En fin de procédure, les réactions ont été lues par l’Analyser I. Cet automate a
rendu un rapport des résultats d’absorbance. J’ai obtenu les résultats des concentrations en
introduisant les valeurs des DO dans le programme Excel reçu par IBL International.
33
Janvier - Mars 2014
4.4.2.2 Interprétation et validation des résultats
Les deux séries de tests effectuées avec le kit IBL ont donné plusieurs résultats positifs.
La série des échantillons n°14-31 a pu être validée (Annexe 4 : Série 1). Dans cette série, la
concentration du contrôle positif se situe bien dans l’intervalle d’acceptabilité 143 – 297
mU/100 µl, et l’absorbance du calibrateur S5 est bel et bien > 1.300.
Par contre, la série des échantillons n°1-13 (Annexe 10) n’a pas pu être validée. Le contrôle
positif se situe bien dans l’intervalle d’acceptabilité 143 – 297 mU/100 µl, mais l’absorbance
du calibrateur S5 est < 1.300, et de façon générale, les absorbances des calibrateurs sont
trop basses. Cette série a été refaite et a cette fois-ci pu être validée. (Annexe 4 : Série 5)
4.4.2.3 Synthèse des résultats concordants/discordants
Contrairement à la méthode de référence Varelisa, la méthode IBL ne propose pas
d’intervalle pour les valeurs équivoques.
La comparaison des résultats qualitatifs obtenus à la 1ère détermination des échantillons
entre la méthode à évaluer IBL et la méthode de référence Varelisa (sans tenir compte de
son intervalle douteux), donne les résultats suivants :
IBL vs Varelisa
29%
22 résultats concordants
sur 31 échantillons
71%
9 résultats discordants
sur 31 échantillons
Figure 8 : Concordance / discordance IBL vs Varelisa
34
Janvier - Mars 2014
4.4.2.4 Analyse des résultats discordants
Les 9 résultats discordants représentés dans le graphique « Correspondance IBL/Varelisa »
sont de faux négatifs (FN). Chaque échantillon discordant a été retesté au minimum une fois
afin de vérifier le résultat de la 1ère détermination. J’ai saisi l’occasion de revérifier certains
échantillons discordants, en les utilisant pour établir la répétabilité ou la reproductibilité,
c’est pourquoi certains d’entre eux comportent plusieurs résultats.
Afin d’obtenir une vérification externe des résultats discordants, j’ai contacté le biologiste
responsable du laboratoire d'analyses de médecine reproductive d’Unilabs Genève. Je lui ai
envoyé tous les échantillons discordants, sauf les n°2 et 21 (quantité insuffisante). Les
échantillons ont été testés par technique indirecte Immunobead-test (IBT). Pour réaliser les
tests, le biologiste a utilisé du sperme frais récolté dans la journée, MAR Test négatif et dont
les spermatozoïdes présentent une très bonne mobilité. Les résultats sont rendus en % des
anticorps anti-spermatozoïdes de classes IgG et IgA (Annexe 11). En fonction des intervalles,
ils peuvent être catégorisés en résultats qualitatif positifs, négatifs ou douteux. Selon le
fournisseur Irvine Scientific, les caractéristiques analytiques et les performances de ce test
n’ont pas été établies.
N°Attribué
Synthèse et interprétation
2
5
13
14
Varelisa
N° Lab.
[U/ml]
< 14 = 14-20 = +/> 20 = +
1ère dét.
IBL
IBT
[mU/100 µl]
< 150 = ≥ 150 = +
[%]
0–10 = 11–50 = +/51–100 = +
2ème dét.
3ème dét.
1-13 : 07.03.2014
27.02.2014 03.03.2014
14-31 : 17.02.2014
1059639
1133002
1042390
1116628
21,0
24,6
29,2
32,5
135,9
23,3
97,3
92,6
116,6
21 1099283
35,7
145,9
179,3
24 1095683
25 1093763
23,9
26,1
126,6
63,0
164,1
30 1072094
29,7
119,5
31 1105420
37,1
68,0
123,0
46,9
111,3
81,4
4ème dét.
5ème dét.
04.03.2014
07.03.2014
137,7
162.9/171.1/
144,1 177.5/180.5/
160.5
183,4
72,1
202.7/232.6/
177,0 213.3/214.5/
196.9
120,7
IgG IgA
112,5
9
8
12
2
4
8
20
12
6
6
13
6
14
4
Légende : pos / neg / dtx
 Echantillon n°2
Pour cet échantillon, la méthode de référence donne un résultat tout juste positif. Avec la
méthode IBL, cet échantillon a donné un premier résultat négatif mais proche du seuil de
positivité. Les 4 déterminations suivantes ont plus ou moins confirmé ce résultat de départ.
Cet échantillon peut être qualifié de borderline plutôt positif pour la méthode de référence
et de borderline plutôt négatif pour la méthode à évaluer IBL.
35
Janvier - Mars 2014
 Echantillons n°5, 13, 14, 25 et 31
Pour ces échantillons, la méthode de référence donne des résultats faiblement à fortement
positifs, tandis que la méthode IBL donne des résultats (à raison de 2 dét./éch.)
moyennement à très négatifs. Ces échantillons sont véritablement discordants.
Au test IBT, les échantillons n°5 et 13 sont sortis négatifs. Les échantillons n°14, 25 et 31 sont
sortis tout juste douteux, car juste au-dessus de l’intervalle négatif. Globalement, les
résultats des tests IBT pour ces 5 échantillons peuvent être considérés comme négatifs. Ils
concordent avec les résultats négatifs obtenus avec la méthode IBL.
 Echantillon n°21
Pour cet échantillon, la méthode de référence donne un résultat fortement positif, tandis
que la méthode IBL donne une 1ère détermination borderline négatif, tout juste en dessous
du seuil de positivité. Cet échantillon a été retesté en tout 7 fois : 6 résultats confirment la
positivité obtenue par la méthode de référence, tandis qu’1 résultat est pratiquement
identique à celui de la 1ère détermination d’IBL.
En conclusion, en considérant la totalité des déterminations effectuées avec la méthode IBL,
cet échantillon doit plutôt être considéré comme positif, car la moyenne des résultats est
d’environ 165,2 mU/100 µl. Par conséquent, cet échantillon n’est pas véritablement
discordant, mais il est borderline plutôt positif.
 Echantillons n°24 et 30
Pour l’échantillon n°24, la méthode de référence donne un résultat borderline positif, et
pour le n°30 un résultat positif. A la 1ère détermination de ces échantillons, la méthode IBL a
donné des résultats négatifs. Au premier abord ils ont été qualifiés de discordants.
Cependant, les deux déterminations suivantes de l’échantillon n°24, et les 6 déterminations
suivantes de l’échantillon n°30 ont donné des résultats positifs.
Ces deux échantillons sortant négatifs à la 1ère détermination, mais positifs aux deux
déterminations suivantes, ne sont pas véritablement discordants.
Au test IBT, l’échantillon n°24 a donné un résultat douteux, tandis que le n°30 a donné un
résultat tout juste douteux, tout proche du seuil de négativité. Pour l’échantillon n°24, le
résultat douteux du test IBT peut concorder avec les résultats borderline positifs des
méthodes Varelisa et IBL. Concernant le n°30, le résultat tout juste douteux du test IBT ne
concorde ni avec le résultat positif de la méthode de référence, ni avec la moyenne des
résultats positive, d’environ 193,7 mU/100 µl, de la méthode IBL.
Conclusion sur les résultats discordants
Pour les deux échantillons discordants non testés par IBT, n°2 et 21, on peut déduire deux
éléments à partir des différentes déterminations effectuées avec la méthode IBL. L’analyse
de l’échantillon n°2 démontre qu’en fonction de la méthode utilisée, un échantillon
borderline sort plutôt positif ou plutôt négatif. L’analyse de l’échantillon n°21 démontre
qu’en cas d’échantillon borderline, plusieurs déterminations d’un même échantillon
effectuées avec la même méthode peuvent donner des résultats qualitatifs différents.
Les résultats des tests IBT des 5 échantillons qualifiés de vrais discordants (n°5, 13, 14, 25 et
31) concordent avec les résultats obtenus avec le kit IBL. Ainsi, parmi les 7 échantillons
envoyés à Unilabs Genève, les résultats de 5 d’entre eux suggèrent que la méthode à évaluer
IBL serait plus juste que la méthode de référence Varelisa. Cependant, les deux derniers
36
Janvier - Mars 2014
échantillons, n°24 et 30, présentent aux tests IBT des résultats douteux alors que ces
échantillons sont finalement considérés comme de faux discordants, car positifs tant avec la
méthode Varelisa qu’avec la méthode IBL.
La technique IBT est un test d’agglutination dont l’évaluation reste subjective et qui peut
donner de faux positifs ou faux négatifs. Cette technique est approximative, ce qui coïncide
notamment avec son intervalle des résultats douteux assez large. Etant qualifiée de peu
fiable, il ne faut pas donner trop de poids à ses résultats.
Si l’on considère que les 5 échantillons (n°5, 13, 14, 25 et 31) ne sont plus de faux négatifs,
mais de vrais négatifs, et que les 2 derniers échantillons (n°24 et 30) donnent en fin de
compte des résultats concordants entre les méthodes IBL et Varelisa, soit de vrais positifs, la
nouvelle sensibilité de la méthode IBL s’élève à 86,7%. Cette sensibilité est bonne, et la
spécificité recalculée à partir des nouvelles valeurs est toujours aussi excellente.
N = 31
Méthode à
évaluer :
IBL
Pos
Dtx
Neg
Méthode de référence :
Varelisa
Pos
Dtx
Neg
13
0
0
0
0
0
2
4
12
15
4
12
13
0
18
31
13
∙ 100 = 𝟖𝟔, 𝟕 %
13 + 2
12
Spécificité [%] =
∙ 100 = 𝟏𝟎𝟎 %
12 + 0
Sensibilité [%] =
Etant donné que les tests IBL ont été réalisés par procédure manuelle, cela expliquerait
certains cas trouvés discordants à la 1ère détermination, ainsi que les résultats qualitatifs
fluctuants obtenus lors des déterminations successives. On obtiendrait certainement de
meilleurs résultats par procédure automatique. C’est d’ailleurs cette procédure que l’on
envisage d’utiliser en routine pour la détermination sérique des ASA. Les démarches ont été
entreprises avec Euroimmun afin d’adapter ce kit sur l’automate Analyser I. Une fois la
programmation installée, le kit sera testé par technique automatique.
37
Janvier - Mars 2014
5 Conclusion
L’objet de ce travail est la comparaison et l’évaluation de deux kits permettant le dosage
quantitatif sérique d’anticorps anti-spermatozoïdes par technique immuno-enzymatique
ELISA. Nous voulons rapatrier ce test, actuellement effectué à synlab Augsbourg, dans nos
analyses de routine au département d’immunologie-sérologie de synlab Lausanne. Les deux
kits choisis, « Anti-Spermatozoen-ELISA (Serum) » d’Euroimmun, et « Spermatozoa-Ab,
ELISA » d’IBL, ont été évalués grâce à 31 échantillons de sérum qui ont été préalablement
testés par un laboratoire du groupe synlab avec le kit ELISA « Varelisa Sperm Antibodies » de
Phadia GmbH. Ce dernier constitue notre méthode de référence.
L’étude comparative des kits portant sur les réactifs et l’utilisation, mettant en lumière leurs
différences, avantages et inconvénients, a démontré que le kit Euroimmun présentait, à ce
stade de l’évaluation, bien plus d’avantages que le kit IBL.
En effet, la plupart des réactifs du kit IBL se trouvent sous forme lyophilisée ou concentrée et
nécessitent une reconstitution. La stabilité des réactifs reconstitués est variable d’un réactif
à un autre et peut être relativement courte. Le conjugué et les calibrateurs, par exemple,
présentent plusieurs désavantages. Le conjugué doit être préparé en fonction du nombre de
réactions de la série à effectuer. Une fois dilué, sa stabilité n’étant que de 2h, il doit être
préparé juste avant utilisation en cours de procédure. La reconstitution de la plupart des
réactifs, tels que les calibrateurs, allonge le temps de préparation, requiert la
monopolisation d’une personne et augmente les sources d’erreurs. Le suivi de la stabilité des
réactifs Euroimmun est moins contraignant, car ouverts ou non, ils sont stables jusqu’à la
date de péremption du kit.
La plupart des réactifs du kit Euroimmun sont prêts à l’emploi, offrant un gain de temps non
négligeable, une réduction du risque d’erreurs, et permet de libérer l’opérateur plus
rapidement, et ce jusqu’à la fin de la série. Le kit Euroimmun est bien plus pratique
d’utilisation que le kit IBL. Il est plus adapté à une utilisation quotidienne en laboratoire de
routine. Son mode d’utilisation est plus actuel, contrairement à celui du kit IBL pouvant être
qualifié d’obsolète ou orienté pour la recherche. Le seul inconvénient du kit Euroimmun est
son coût, environ 1,8 x plus cher que celui d’un kit IBL.
Au premier abord, la préférence est donnée au kit Euroimmun, meilleur à l’étude
comparative, et car au département d’immunologie-sérologie nous avons l’habitude de
travailler avec des kits et automates Euroimmun.
Cependant, les tests effectués avec le kit Euroimmun ont été très décevants, car ils ont
révélé sa non fonctionnalité. Sur les 31 échantillons, aucun résultat n’est sorti positif, alors
que la méthode de référence Varelisa détecte 64.5% de positifs. Après vérifications, il s’est
avéré que le kit n’est pas fonctionnel, ce qui a été confirmé par Euroimmun. L’évaluation de
ce kit n’a pas été poursuivie.
Le kit IBL est fonctionnel. À la 1ère détermination, il a obtenu 71% de résultats concordants et
29% de résultats discordants avec la méthode de référence.
La fiabilité de la méthode IBL, établie à partir des résultats de la 1ère détermination, a donné
une spécificité excellente et une sensibilité plutôt basse. Parmi les échantillons discordants,
7 d’entre eux ont pu être exclus grâce aux déterminations suivantes et aux résultats obtenus
par technique IBT. La nouvelle sensibilité calculée est bien meilleure. Elle est considérée
comme bonne. La spécificité recalculée est toujours aussi excellente.
38
Janvier - Mars 2014
Les précisions intra- et inter-sérielles sont bonnes. La corrélation des méthodes selon
Passing-Bablok et l’exactitude n’ont pas pu être établis, car les résultats entre les différentes
méthodes ne sont pas comparables, ce qui est notamment dû au fait qu’il n’existe pas de
« Gold Standard » pour le dosage des ASA. Après discussion avec mes référents, il n’a pas été
jugé utile de vérifier le domaine de mesure déjà établit par le fabricant. Il n’a pas non plus
été jugé nécessaire de vérifier la contamination.
La méthode Varelisa a été utilisée comme méthode de référence par défaut, car il n’existe
pas de méthode de référence reconnue et acceptée universellement pour le dosage des
ASA. Elle n’est pas plus fiable qu’une autre méthode ELISA disponible sur le marché. Depuis
peu, sa production a été arrêtée. Les raisons de cette décision ne sont pas connues.
La méthode IBT, qui a servi à vérifier des résultats discordants, est une technique
d’agglutination considérée comme peu fiable. Ses résultats ne peuvent pas réellement
permettre de trancher le juste du faux entre les résultats obtenus avec la méthode à évaluer
et avec la méthode de référence.
Actuellement, il n’existe pas de méthode totalement fiable pour le dosage des ASA. Les
résultats de ces méthodes doivent impérativement être corrélés aux résultats d’autres
techniques et d’un ensemble de données tels que les symptômes cliniques du patient. Le
plus important dans le résultat d’un dosage d’ASA est sa détermination qualitative. Un
résultat quantitatif précis est inutile dans ce type de dosage.
Bien que l’étude comparative ne soit pas en faveur du kit IBL, l’évaluation de la précision, de
la sensibilité et de la spécificité a donné de bons résultats pour une méthode manuelle. Si
l’évaluation était refaite par procédure automatique, les résultats seraient sûrement
meilleurs. Au vu des bons résultats, ce kit peut être utilisé en routine. Il sera donc utilisé au
laboratoire. Aux dernières nouvelles, l’adaptation du kit à l’Analyser I vient d’être réalisée.
Les premiers tests par technique automatique peuvent commencer.
Les difficultés de ce travail se sont portées sur le retard considérable de livraison des kits, la
disponibilité des automates, ainsi que le temps consacré aux tentatives d’adaptation des kits
aux automates. Pour le kit IBL, étant donné que les tests par procédure automatique n’ont
pas été possibles au cours de ce travail, ils ont dû être réalisés manuellement. De plus, il n’a
pas été possible d’obtenir des informations cliniques sur les patients, dans le but de vérifier
si nos résultats sont plausibles.
39
Janvier - Mars 2014
6 Remerciements
Je tiens tout particulièrement à remercier Mercedes Cipolli, chef TAB en immunologiesérologie, et Jean-Michel Druon, biologiste, chef responsable du département
d’immunologie-sérologie, tous deux responsables accompagnants de ce travail de diplôme,
pour leur investissement, leurs conseils avisés, leur soutien et leur bonne humeur qui m’ont
accompagnée durant la réalisation de ce travail.
Je tiens à remercier chaleureusement les techniciennes en analyses biomédicales, Bénédicte
Burgener, Véronique Monti, Corinne Liniger, et Virginia De Marco, pour leur soutien, leurs
conseils et leur bonne humeur.
Je voudrais également remercier ma professeure Sandrine Ansermet, pour son optimisme et
ses conseils.
Un grand merci à mes proches pour leurs encouragements.
40
Janvier - Mars 2014
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8 Iconographie
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[Page Web]. Accès : http://www.sante-tn.com/dici-etdailleurs/dailleurs/item/1539 (page consultée le 25 mars 2014)
Figure 1 :
Analayer I, n° série 9163980079
synlab Lausanne [Photo personnelle]
Figure 2 :
Boite du kit IBL International GmbH
Figure 3 :
Composition du kit IBL
Figure 4 :
Boîte du kit Euroimmun
Figure 5 :
Composition du kit Euroimmun
Figure 6 :
Illustration d’une réaction ELISA positive (dosage d’ASA)
[Schéma personnel]
Figure 7 :
Correspondance IBL / Varelisa
[Schéma personnel]
Figure 8 :
Concordance / discordance IBL vs Varelisa
[Schéma personnel]
43
Janvier - Mars 2014
9 Lexique
- Acrosome : structure du spermatozoïde coiffant son noyau et contenant des enzymes
hydrolytiques permettant au gamète mâle de pénétrer dans l’ovule
- Andrologie : spécialisation médicale qui s’occupe des diverses pathologies de l’appareil
génital masculin
- Asthénospermie : diminution de la mobilité des spermatozoïdes
- Azoospermie : absence totale de spermatozoïdes dans le sperme
- Biopsie testiculaires : prélèvement d’un petit échantillon de testicule dans le but
d’effectuer des examens pour confirmer une pathologie soupçonnée.
- Borderline : dans le contexte de ce travail, ce mot anglais signifie qu’un résultat se situe
autour du seuil de positivité, il est à la frontière entre deux résultats qualitatifs différents.
- Embryogenèse : développement embryonnaire en 5 grandes phases au cours duquel la
cellule œuf évolue jusqu’à former un organisme pluricellulaire.
- Endocrinologie : science médicale qui étudie la physiologie et la pathologie des glandes
endocrines, dont les produits de sécrétion dans le sang sont les hormones.
- Endomètre : Muqueuse qui tapisse la cavité interne de l’utérus
- Endométriose : Trouble inflammatoire dans lequel du tissu endométrial subit une
croissance atypique et apparaît ailleurs que dans l’endomètre, par exemple dans les
trompes, sur l’ovaire ou sur le rectum. Elle provoque notamment des saignements utérins
et rectaux anormaux, des douleurs, et peut entraîner la stérilité.
- Epididyme : Petit organe du système reproducteur masculin où les spermatozoïdes sont
conservés et achèvent leur maturation.
- Epitope : partie d’un antigène reconnu spécifiquement par le paratope (= zone des
régions hypervariables reconnaissant l’épitope) de l’anticorps correspondant.
- Fluide folliculaire : fluide présent dans les follicules, qui sont des structures ovariennes
composées d’un ovocyte en voie de développement entouré d’une ou de plusieurs
couches de cellules folliculaires.
- Gamète : cellule sexuelle (spermatozoïde ou ovule)
- Idiopathique : se dit d’un symptôme ou d’une maladie dont on ne connaît pas la cause.
- Iso-immunisation/iso-anticorps : immunisation d’un organisme contre un antigène
provenant d’un individu de la de même espèce, qui aboutit à la formation d’iso-anticorps.
- Isotype : Classification des immunoglobulines en fonction de la structure de la partie
constante de leur chaîne lourde. Chaque classe peut être subdivisée en sous-classes. Pour
l’espèce humaine, par exemple, on dénombre 5 classes : IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.
- Oligospermie : diminution du nombre de spermatozoïdes dans le sperme
- Tractus urogénital : ensemble d’organes de l’appareil urinaire et de l’appareil génital
- Vasectomie : méthode de stérilisation masculine,
chirurgicalement les canaux déférents des testicules.
qui
consiste
à
ligaturer
44
Janvier - Mars 2014
10 Annexes
Annexe 1 :
Fascicule du kit « Spermatozoa-Ab, ELISA » d’IBL International ........................... I
Annexe 2 :
Quality Control Certificate, IBL International ...................................................... IX
Annexe 3 :
Fascicule du kit « Anti-Spermatozoen - ELISA (Serum) », d’Euroimmun ............. X
Annexe 4 :
Quality Control Certificate, Euroimmun ......................................................... XVIII
Annexe 5 :
Rapports des séries 1, 2, 3, 4 et 5. (IBL, technique manuelle) ..........................XIX
Annexe 6 :
Rapport des résultats pour les échantillons n°14-31, obtenus en 2 séries
(Euroimmun, technique automatique)........................................................... XXVI
Annexe 7 :
Rapport des résultats pour les échantillons n°1-13. (Euroimmun, technique
automatique) ....................................................................................................XXX
Annexe 8 :
Rapport des résultats pour les échantillons n°1-13. (Euroimmun, technique
manuelle) ........................................................................................................XXXII
Annexe 9 :
Résultats des tests effectués par Euroimmun sur nos échantillons............. XXXIV
Annexe 10 : Rapport des résultats pour les échantillons n°1-13, série non validée du
23.02.2014. (Programme Excel, IBL, technique manuelle) ........................... XXXV
Annexe 11 : Rapports des résultats des tests IBT d’Unilabs Genève ............................... XXXVI
45
Janvier - Mars 2014
Annexe 1 : Fascicule du kit « Spermatozoa-Ab, ELISA » d’IBL International
I
Janvier - Mars 2014
II
Janvier - Mars 2014
III
Janvier - Mars 2014
IV
Janvier - Mars 2014
V
Janvier - Mars 2014
VI
Janvier - Mars 2014
VII
Janvier - Mars 2014
VIII
Janvier - Mars 2014
Annexe 2 : Quality Control Certificate, IBL International
IX
Janvier - Mars 2014
Annexe 3 : Fascicule du kit « Anti-Spermatozoen - ELISA (Serum) », d’Euroimmun
X
Janvier - Mars 2014
XI
Janvier - Mars 2014
XII
Janvier - Mars 2014
XIII
Janvier - Mars 2014
XIV
Janvier - Mars 2014
XV
Janvier - Mars 2014
XVI
Janvier - Mars 2014
XVII
Janvier - Mars 2014
Annexe 4 : Quality Control Certificate, Euroimmun
XVIII
Janvier - Mars 2014
Annexe 5 : Rapports des séries 1, 2, 3, 4 et 5. (IBL, technique manuelle)
XIX
Janvier - Mars 2014
XX
Janvier - Mars 2014
XXI
Janvier - Mars 2014
XXII
Janvier - Mars 2014
XXIII
Janvier - Mars 2014
XXIV
Janvier - Mars 2014
XXV
Janvier - Mars 2014
Annexe 6 : Rapport des résultats pour les échantillons n°14-31, obtenus en 2 séries
(Euroimmun, technique automatique)
XXVI
Janvier - Mars 2014
XXVII
Janvier - Mars 2014
XXVIII
Janvier - Mars 2014
XXIX
Janvier - Mars 2014
Annexe 7 : Rapport des résultats pour les échantillons n°1-13. (Euroimmun, technique
automatique)
XXX
Janvier - Mars 2014
XXXI
Janvier - Mars 2014
Annexe 8 : Rapport des résultats pour les échantillons n°1-13. (Euroimmun, technique
manuelle)
XXXII
Janvier - Mars 2014
XXXIII
Janvier - Mars 2014
Annexe 9 : Résultats des tests effectués par Euroimmun sur nos échantillons
#
1
2
5
6
8
9
10
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
30
31
reference number
1052133
1059639
1133002
1075739
1085628
1105425
1048284
1055486
1116628
1114441
1115433
1110926
1104131
1103955
1103392
1099283
1101433
1096790
1095683
1093763
1092636
1090463
1085544
1072094
1105420
XXXIV
concentration [rU/ml]
36
32
26
12
25
24
16
28
18
21
10
21
13
18
28
18
22
19
37
28
26
22
17
16
21
Janvier - Mars 2014
Annexe 10 : Rapport des résultats pour les échantillons n°1-13, série non validée du
23.02.2014. (Programme Excel, IBL, technique manuelle)
XXXV
Janvier - Mars 2014
Annexe 11 : Rapports des résultats des tests IBT d’Unilabs Genève
XXXVI
Janvier - Mars 2014
XXXVII
Janvier - Mars 2014
XXXVIII
Janvier - Mars 2014
XXXIX
Janvier - Mars 2014
XL
Janvier - Mars 2014
XLI
Janvier - Mars 2014
XLII

Evaluation de deux kits ELISA pour la détermination quantitative

Transcription

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