MESACUP anti-Skin profile TEST

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MESACUP anti-Skin profile TEST
Cat. No.
Cat. No.
Art. Nr.
Cat. No.
Cat. N.
Cat. Nº
Aρ. Κατ.
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7115E:
7115E:
96 wells
96 puits
96 Auftragsstellen
96 pocillos
96 pozzetti
96 poços
96βυθισμάτων
FOR PROFESSIONAL USE ONLY
UNIQUEMENT À USAGE PROFESSIONNEL
NUR ZUM PROFESSIONELLEN GEBRAUCH
SOLO PARA USO PROFESIONAL
SOLO PER USO PROFESSIONALE
APENAS PARA USO PROFISSIONAL
ΜΟΝΟ ΓΙΑ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ.
MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.
KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F
4-5-3 Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi, 460-0008 Japan
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- CONTENTS - CONTENU - INHALTSVERZEICHNIS - CONTENIDO - CONTENUTI - CONTENDO - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ -
English ··················································· 1
Français ················································· 9
Deutsch ·················································· 17
Español ·················································· 25
Italiano ··················································· 33
Português ···············································
Ελληνικά ·················································
Symbols/Symboles/Symbole/Símbolos/Simboli/
Simbolos/Σύμβολα/ ··································· 41
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English
English
INTENDED USE
The MESACUP anti-Skin profile TEST is a qualitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for
the detection of IgG antibodies to Dsg1, Dsg3, BP180, BP230 and TypeVII collagen in human serum.
Five individual autoantibodies can be detected simultaneously in a single assay. The MESACUP anti-Skin
profile TEST is intended for in vitro diagnostic use, as an aid in the diagnosis of certain autoimmune
bullous diseases.
SUMMARY AND EXPLANATION
Autoimmune bullous diseases are a group of cutaneous disorders characterised by skin blistering or
erosions and classified into pemphigus and pemphigoid.
Pemphigus is an autoimmune bullous disease targeting skin and mucous membranes. It is divided into two
major subtypes: pemphigus vulgaris (PV) and pemphigus foliaceus (PF). In patients with PV,
anti-desmoglein 3 (Dsg3) antibodies are produced. Among PV patients, patients with mucosal-dominant
PV have only anti-Dsg3, and patients with mucocutaneous PV have both Dsg1 and Dsg3 antibodies,
whereas anti-Dsg1 positive but anti-Dsg3 negative patients are diagnosed as PF (1). These anti-Dsg
antibodies consist of pathogenic and non-pathogenic antibodies. A recent study has shown that the
pathogenic anti-Dsg antibodies bind to mature Dsg antigens that are unmasked by proteolytic processing
of immature Dsg (2).
Bullous pemphigoid (BP) is an autoimmune subepidermal bullous disease characterized by the presence
of IgG autoantibodies to the epidermal basement membrane zone in sera. Autoantibodies from patients
with BP target two distinct antigens, a 180 kDa transmembrane protein termed BP180 and a 230 kDa
intracellular protein termed BP230. Epitope studies for anti-BP180 antibodies have shown that
non-collagenous 16a (NC16a) domain of BP180 is the major epitope recognized by the majority of BP
sera (3-4). For anti-BP230 antibodies, its C-terminal domain (BP230-C) mainly reacts to BP patient serum,
but some BP patient sera recognize only N-terminal domain of BP230 (BP230-N) (5-6).
Epidermolysis bullosa aquisita (EBA) is an autoimmune bullous skin disease characterized by the
presence of Type VII Collagen IgG autoantibodies. Type VII Collagen is composed of three identical
α-chains. Each α-chain consists of a central collagenous (COL) domain flanked by a 145 kDa
non-collagenous amino-terminal (NC1) domain and a smaller 34 kDa carboxyl-terminal non-collagen
(NC2) domain. The major antigenic epitopes for anti-Type VII collagen autoantibodies in patients with
EBA reside within the NC1 domain. However, the recent research paper showed that NC2 domain is a
minor antigenic epitope for these autoantibodies (7).
From the above background, the recombinant antigens used by this profile kit were listed to the following
table.
Skin-specific autoantibodies
Used recombinant antigens
Anti-Dsg1
Dsg1
Anti-Dsg3
Dsg3
Anti-BP180
BP180 NC16a
Anti-BP230
BP230-C and BP230-N
Anti-TypeVII Collagen
NC1 and NC2
1
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English
PRINCIPLE
The MESACUP anti-Skin profile TEST is an ELISA that detects five anti-Skin-specific antibodies
(anti-Dsg1, anti-Dsg3, anti-BP180, anti-BP230 and anti-TypeVII collagen) in patient serum
simultaneously. Microwells (8 wells) are separately coated with 5 different recombinant antigens.
Specific antibodies in diluted serum will bind to the antigen-coated well (Sample incubation). The wells
are then washed to remove unbound antibodies and other components. A conjugate of horseradish
peroxidase-labeled anti-human IgG antibody is added to wells and incubated (Conjuate incubation). After
another washing step, the peroxidase substrate is added and incubated for an additional period of time
(Substrate incubation). Acid solution is then added to each well to terminate the enzyme reaction and to
stabilize the color development. The test result is determined photometrically by measuring the
absorbance and plotting the results.
BRIEF ASSAY PROCEDURE
<Sample incubation>
Add 100 µL of diluted sample (1:101) to designated wells of the microwell
(20-30°C) 30 min.
plate according to schema
↓
Wash
↓
<Conjugate incubation>
Add 100 µL of Conjugate reagent to each well
(20-30°C) 30 min.
↓
Wash
↓
<Substrate incubation>
Add 100 µL of Substrate to each well
(20-30°C) 15 min
↓
Add 100 µL of Stop solution to each well
↓
Read absorbance
↓
Interprete the result
REAGENTS AND STORAGE
1) Antigen Microwell strips
96 wells Microwell strips (12 x 8 wells) coated with 5 individual recombinant antigens. The strips are
packed in a strip holder and sealed in a foil envelope with desiccant.
2) Calibrator 1 (0 U/mL)
One vial containing 1.5 mL of assay diluent containing 0.09% sodium azide. Ready-to-use, make no
further dilution.
3) Calibrator 2 (100 U/mL)
One vial containing 1.5 mL of autoantibodies positive human serum in assay diluent containing 0.09%
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English
sodium azide. Ready-to-use, make no further dilution.
4) Conjugate reagent
One vial containing 15 mL of horseradish peroxidase conjugated goat anti-human IgG antibody.
Ready-to-use, make no further dilution.
5) Assay diluent
One vial containing 50 mL of Tris buffer containing 0.09% sodium azide. Ready-to-use, make no further
dilution.
6) Wash concentrate (20X)
One vial containing 50 mL of PBS with Tween 20 concentrate (20X).
7) Substrate
One vial containing 20 mL of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine dihydrochloride /hydrogen peroxide (TMB/
H2O2). Ready-to-use, make no further dilution.
8) Stop solution
One vial containing 20 mL of 0.25 mol/L sulfuric acid. Ready-to-use, make no further dilution.
Both unopened and first opened kit components are stable until the labeled expiration date at 2-8°C.
PRECAUTIONS
(1) This product is for in vitro diagnostic use only.
(2) Do not use the kit components beyond the stated expiration dates.
(3) Avoid contact of the reagents with eyes, skin and clothing. Reagents on skin must be washed away with
plenty of water. TMB is irritating and the Stop solution consists of 0.25 mol/L sulfuric acid, which is a
poison and is corrosive.
(4) Calibrator 2 is derived from human serum, in which HBs antigen, HCV antibody, HIV-1 and HIV-2
antibodies have not been detected. No test method, however, can guarantee the absence of these or any
other infectious agents. These reagents and all patient samples should be handled as if they are capable
of transmitting AIDS, hepatitis or any other infectious diseases.
(5) Calibrator 1, Calibrator 2 and Assay diluent contain sodium azide (0.09%) as a preservative and must
be handled with caution. Do not ingest or allow contact with skin or mucous membranes. Sodium azide
may react with copper or lead in plumbing system to form explosive metal azides. Therefore, always
flush with plenty of water when disposing materials containing sodium azide into a drain.
(6) Calibrator 1, Calibrator 2, Conjugate reagent and Assay diluent contain materials of animal origin,
taken from non-infected animals. These components, however, should be treated as potential
biohazards in use and for disposal.
(7) Do not mix reagents from other kits.
(8) All reagents must be brought to room temperature (20-30°C) before starting the assay.
(9) Do not expose the kit to direct sun during the test and storage.
(10) Avoid microbial and cross contamination of reagents or samples.
(11) Incubation temperatures above or below normal room temperature (20-30°C), shorter or longer
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English
incubation times and inaccurate dilutions may give erroneous results.
(12) The wells must be properly rinsed with Wash solution to avoid false positive results.
(13) Carefully pipette each sample and reagent to avoid cross contamination between microwells, avoid
foaming.
(14) All unused Microwell strips should be returned to the ziplock pouch, which must be carefully resealed
to avoid moisture absorption.
(15) Wash concentrate may become turbid at 2-8°C, this does not cause inconsistent results.
(16) Materials used for the test should be disposed or treated as shown below.
Soak in 2% final conc. glutaraldehyde solution for more than 1 hour, soak in 0.1% sodium hypochlorite
solution (available chlorine: approx. 1,000 ppm) for more than 1 hour or autoclave at 121°C for more
than 20 minutes.
(17) The antibody values obtained from this assay are aids in the diagnosis only. Each physician must
interpret these results in light of the patient’s history, physical findings, and other diagnostic procedure.
(18) In the event of damage to the protective packaging, the kit components should be treated or disposed of
in accordance with the relevant instructions and regulations of each country.
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
Microplate reader (wavelength: 450 nm, 620 nm/reference)
Multichannel micropipette (e.g. 100 µL - 300 µL)
Single channel pipette (e.g. 10 µL & 100 µL)
Autowasher or washing bottle
Deionized or distilled water
One liter graduated cylinder for preparation of Wash solution
Test tubes for patient sample dilutions (e.g. 1,000 µL)
Disposable pipette tips
Paper towels
Microplate cover
PROCEDURE

PREPARATION OF REAGENTS
1. Bring all assay materials to room temperature (20-30°C) prior to use.
2. Microwell strips: One strip must be used per one patient serum. Remove required Microwell strips
from the pouch and place them in the frame. Promptly return unused strips to the refrigerated storage.
3. Wash solution: Prepare 1:20 dilution of the Wash concentrate prior to use (ex. add 50 mL of Wash
concentrate to 950 mL of distilled water). The diluted Wash solution is stable for 2 weeks at 2-8°C.
4. Do not dilute Calibrator 1, Calibrator 2, Conjugate reagent, Assay diluent, Substrate and Stop solution.
These reagents are ready-to-use.

PREPARATION OF SAMPLES
1. Use fresh patient sera. Samples should be tested as soon as possible after collection.
If storage is needed, samples should be stored at -20°C or lower. Do not repeat freezing and thawing.
2. Dilute each patient serum 1:101 by adding 10 µL of serum to 1 mL of Assay diluent.
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English
* Diluted samples can not be stored. Dilute each patient serum for each assay.
* Assay diluent may form precipitates, which does not cause inconsistent results.

ASSAY PROCEDURE
STEP 1. (SAMPLE INCUBATION)
With a multichannel micropipette, transfer each 100 µL of Calibrator 1, Calibrator 2, diluted patient
serum and Assay diluent into each designated well of the microwell plate according to the schema below.
(Do not dilute Calibrator 1, Calibrator 2 and Assay diluent.)
Well
Added solution
Well description
A
100 µL Calibrator 1
Calibrator 1 (0 U/mL)
B
100 µL Calibrator 2
Calibrator 2 (100 U/mL)
C
100 µL diluted serum
Anti-Dsg1
D
Anti-Dsg3
E
Anti-BP180
F
Anti-BP230
G
Anti-TypeVII collagen
H
100 µL Assay diluent
Assay control
* Incubation starts on pipetting into the microwells. Pipetting should be completed as quickly as possible.
Cover the wells with a microplate cover and incubate for 30 minutes at room temperature (20-30°C).
STEP 2. (WASHING)
Aspirate or discard the well contents. Fill the well with Wash solution and then completely aspirate or
discard the contents. Wash 4 times. Tap the plate on a paper towel to remove any remaining Wash
solution. When autowasher is used, wash 4 times.
* Each laboratory is recommended to confirm its own appropriate washing times and other conditions.
* Wash solution should be used at 20-30°C.
STEP 3. (CONJUGATE INCUBATION)
Add 100 µL of the Conjugate reagent to each well with a multichannel micropipette. Cover the wells with
the microplate cover and incubate for 30 minutes at room temperature (20-30°C).
* Do not return the Conjugate reagent once taken out of vial.
STEP 4. (WASHING)
Wash the microplate as described in STEP 2.
STEP 5. (SUBSTRATE INCUBATION)
Add 100 µL of the Substrate to each well with a multichannel micropipette.
* Do not return the Substrate once taken out of vial.
Cover the wells with the microplate cover and incubate for 15 minutes at room temperature (20-30°C).
STEP 6. (STOP REACTION)
Add 100 µL of the Stop solution to each well with a multichannel micropipette.
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
English
READING
Read the absorbance of each well at 450 nm. If a dual wavelength plate reader is used, set the test
wavelength at 450 nm and the reference at 620 nm.
* Reading should be done within 20 minutes after stopping the reaction.
* Before reading the plate, ensure that the bottom of the plate is clean and dry, and that no air bubbles are
present on the surface of the liquid in the wells.

CALCULATION OF RESULT
(A450 of patient sample for the antigen <well C, D, E, F, G> － A450 of Calibrator 1<well A>)
x 100
Unit value (U/mL) =
(A450 of Calibrator 2<well B>) - A450 of Calibrator 1<well A>)
* A450 is abbreviation of absorbance value at 450 nm.
* An international reference material for each antibody is not available. The assay is calibrated in relative
arbitrary units.

QUALITY CONTROL
Each assay result should meet the following criteria.
A450 of the Assay control (well H):
A450 of the Calibrator 1 (well A):
A450 of the Calibrator 2 (well B):
＞ 0.5
＜ 0.1
＞ 0.5
If any of these criteria are not met, the results are invalid and the test should be repeated.
Before repeating the test, check the following points.
・ Incubation Temperature
・ Incubation Time
・ Washing
TEST INTERPRETATION AND EXPECTED VALUE
The following is intended only as a guide for interpretation. Each laboratory is recommended to establish
its own criteria for test interpretation based on the sample populations that are typically found.
Value (U/mL)
Interpretation
≥15
Positive
<15
Negative
・ The above value was established with assaying 42 normal sera, 30 pemphigus vulgaris (PV) patient
sera, 30 pemphigus Foliaceus (PF) patient sera, 60 bullous pemphigoid (BP) patient sera and 30
epidermolysis bullosa aquisita (EBA) patient sera.

LIMITATIONS
As with other diagnostic test procedures, the results obtained with the MESACUP anti-Skin profile TEST
serve only as an aid in the diagnosis and should not be interpreted as diagnostics in themselves.
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English
PERFORMANCE CHARACTERISTICS

CLINICAL SPECIFICITY AND SENSITIVITY
PV
Total
number
30
Dsg1
positive
26
Dsg3
positive
25
BP180
positive
1
BP230
positive
1
Type VII
positive
0
PF
30
30
5
0
1
0
BP (active)
30
0
0
26
29
0
BP (remission)
30
1
0
26
5
0
EBA
30
0
0
0
1
26
Normal control
42
0
0
0
1
0
Disease groups
PV: Pemphigus vulgaris
PF: Pemphigus foliaceus
BP: Bullous pemphigoid
EBA: Epidermolysis bullosa aquisita

SENSITIVITY
A450 of the Assay control (well H) shall be ＞ 0.5
A450 of the Calibrator 1 (well A) shall be ＜ 0.1
A450 of the Calibrator 2 (well B) shall be
＞ 0.5

SPECIFICITY
When testing positive samples for each of the 5 antibodies, all shall be positive.
When testing negative samples for each of the 5 antibodies, all shall be negative.

REPRODUCIBILITY
When testing positive samples for each of the 5 antibodies in sixfold, all shall be positive.
When testing negative samples for each of the 5 antibodies in sixfold, all shall be negative.

LIMITS OF DETECTION
Anti-Dsg1:
Anti-Dsg3:
Anti-BP180:
Anti-BP230:
Anti-TypeVII collagen:

2.2 U/mL
1.8 U/mL
1.2 U/mL
1.6 U/mL
1.2 U/mL
INTERFERING SUBSTANCES
Hemoglobin (up to 498 mg/dL), Bilirubin F (up to 18.7 mg/dL), Bilirubin C (up to 19.7 mg/dL), chyle (up
to 1,440 FTU) and/or Rheumatoid factor (up to 450 IU/mL) do not interfere with the result, but avoid
using highly hemolysed samples or highly lipemic samples.
REFERENCES
1. Ishii K, Amagai M, Hall RP, Hashimoto T, Takayanagi A, Gamou S, Shimizu N, Nishikawa T:
Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific enzyme-linked immunosorbent
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English
assays with baculovirus expressed recombinant desmogleins. J Immunol 159: 2010-2017, 1997
2. Yokouchi M, Saleh MA, Kuroda K, Hachiya T, Stanley JM, Amagai M, Ishii K: Pathogenic epitopes of
autoantibodies in pemphigus reside in the amino-terminal adhesive region of desmogleins which are
unmasked by proteolytic processing of prosequence. J Invest Dermatol 129: 2156-2166, 2009
3. Matsumura K, Amagai M, Nishikawa T, Hashimoto T: The majority of bullous pemphigoid and herpes
gestations serum samples react with the NC16a domain of the 180-kDa bullous pemphigoid antigen.
Arch Dermatol Res 288: 507-509, 1996
4. Kobayashi M, Amagai M, Kuroda-Kinoshita K, Hashimoto T, Shirakata Y, Hashimoto K, Nishikawa T:
BP180 ELISA using bacterial recombinant NC16a protein as a diagnostic and monitoring tool for
bullous pemphigoid. J Dermatol Sci 30: 224-232, 2002
5. Hamada T, Nagata Y, Tomita M, Salmhofer W, Hashimoto T: Bullous pemphigoid sera react
specifically with various domains of BP230, most frequently with C-terminal domain, by immunoblot
analyses using bacterial recombinant proteins covering the entire molecule. Exp Dermatol 10: 256-263,
2001
6. Yoshida M, Hamada T, Amagai M, Hashimoto K, Uehara R, Yamaguchi K, Imamura K, Okamoto E,
Yasumoto S, Hashimoto T: Enzyme-linked immunosorbent assay using bacterial recombinant proteins
of human BP230 as a diagnostic tool for bullous pemphigoid. J Dermatol Sci 41: 21-30, 2006
7. Saleh MA, Ishii K, Kim YJ, Murakami A, Ishii N, Hashimoto T, Schmidt E, Zillikens D, Shirakata Y,
Hashimoto K, Kitajima Y, Amagai M: Development of NC1 and NC2 domains of TypeVII collagen
ELISA for diagnosis and analysis of the time course of epidermolysis bullosa acquisita patinents. J
Delmatol Sci 62: 169-175, 2011
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Français
Français
BUT DU DOSAGE
Le MESACUP anti-Skin profile TEST est un dosage qualitatif d'immuno-adsorption par enzyme liée
(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay) pour la détection dans le sérum humain des IgG dirigées
contre les Dsg1, Dsg3, BP180, BP230 et le collagène de type VII. Cinq auto-anticorps différents peuvent
être détectés simultanément dans un même essai. Le MESACUP anti-Skin profile TEST est destiné au
diagnostic in vitro et est une aide au diagnostic de certaines maladies auto-immunes bulleuses.
RÉSUMÉ ET EXPLICATIONS
Les maladies auto-immunes bulleuses sont un groupe de maladies cutanées caractérisées par la formation
de bulles ou d'érosions au niveau de la peau. Elles sont classifiées en pemphigus et pemphigoïde.
Le pemphigus est une maladie bulleuse auto-immune affectant la peau et les muqueuses. Il se divise en
deux sous-types majeurs: le pemphigus vulgaire (PV) et le pemphigus foliacé (PF). Les patients atteints
de PV produisent des anticorps anti-desmogléine 3 (Dsg3). Parmi les patients PV, ceux qui sont atteints
d'un PV à composante muqueuse dominante n'ont que l'anti-Dsg3 et ceux qui sont atteints d'un PV
muco-cutané ont à la fois des anticorps anti-Dsg1 et anti-Dsg3. Les patients anti-Dsg1 positifs et
anti-Dsg3 négatifs sont diagnostiqués comme atteints de PF (1). Ces anticorps anti-Dsg sont des anticorps
pathogènes et non pathogènes. Une étude récente a montré que les anticorps anti-Dsg pathogènes se lient
aux antigènes Dsg matures qui sont démasqués par un processus protéolytique des Dsg immatures (2).
La pemphigoïde bulleuse (PB) est une maladie bulleuse subépidermique auto-immune caractérisée par la
présence dans le sérum d'auto-anticorps IgG dirigés contre la zone de la membrane basale épidermique.
Les auto-anticorps de patients atteints de PB ciblent deux antigènes: une protéine transmembranaire de
180 kDA appelée BP180 et une protéine intracellulaire de 230 kDA appelée BP230. Des études des
épitopes ont montré que le domaine non collagéneux 16a (NC16a) de la BP180 est l'épitope principal
reconnu par la majorité des anticorps PB présents dans le sérum (3-4). Le domaine C-terminal (BP230-C)
des anticorps anti-BP230 réagit principalement avec le sérum de patient PB, mais certains sérums de
patient PB ne reconnaissent que le domaine N-terminal de la BP230 (BP230-N) (5-6).
L'épidermolyse bulleuse acquise (EBA) est une maladie bulleuse auto-immune de la peau caractérisée par
la présence d'auto-anticorps IgG anti-collagène de type VII. Le collagène de type VII est composé de trois
chaines α identiques. Chacune des chaines α consiste en un domaine central collagéneux (COL) flanqué
d'un domaine amino-terminal non collagéneux de 145 kDa (NC1) et d'un domaine non collagéneux
carboxy-terminal plus petit de 34 kDa (NC2). Les principaux épitopes antigéniques pour les
auto-anticorps anti-collagène de type VII chez les patients souffrant d'EBA se trouvent dans le domaine
NC1. Une publication de recherche récente a cependant montré que le domaine NC2 est un épitope
antigénique mineur pour ces auto-anticorps (7).
S'appuyant sur le contexte décrit ci-dessus, les antigènes recombinants utilisés par cette trousse profile
sont repris dans le tableau suivant.
Auto-anticorps spécifiques de la peau
Antigènes recombinants utilisés
Anti-Dsg1
Dsg1
Anti-Dsg3
Dsg3
Anti-BP180
BP180 NC16a
Anti-BP230
BP230-C et BP230-N
Anti-collagène de type VII
NC1 et NC2
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Français
PRINCIPE DE LA MÉTHODE
Le MESACUP anti-Skin profile TEST est un test ELISA qui détecte simultanément cinq anticorps
anti-peau spécifiques (anti-Dsg1, anti-Dsg3, anti-BP180, anti-BP230 et anti-collagène de type VII) dans le
sérum du patient. Des puits de microtitration (8 puits) sont tapissés séparément avec 5 antigènes
recombinants différents. Des anticorps spécifiques dans le sérum dilué se lieront au puits tapissé
d'antigènes (incubation de l'échantillon). Les puits sont ensuite lavés pour retirer les anticorps non liés et
les autres composants. Un conjugué d'anticorps anti-IgG humaine marqué à la peroxydase de raifort est
ajouté aux puits et incubé (incubation du conjugué). Après une nouvelle étape de lavage, le substrat
peroxydase est ajouté et incubé une nouvelle fois (incubation du substrat). Une solution acide est ensuite
ajoutée pour arrêter la réaction enzymatique et stabiliser le développement de la couleur. Le résultat de
l'analyse est déterminé photométriquement en mesurant l'absorbance et en mettant les résultats en
graphique.
PROCÉDURE D'ANALYSE EN BREF
<Incubation de l'échantillon> Ajouter 100 µL d'échantillon dilué (1:101) aux puits désignés de la Micro
(20-30°C) 30 min.
plaque selon le schéma
↓
Laver
↓
< Incubation du Conjugué >
Ajouter 100 µL du Conjugué (prêt à l’emploi) à chacun des puits
(20-30°C) 30 min.
↓
Laver
↓
< Incubation du Substrat >
Ajouter 100 µL de Substrat à chacun des puits
(20-30°C) 15 min
↓
Ajouter 100 µL de la Solution d'arrêt à chacun des puits
↓
Lire l'absorbance
↓
Interpréter le résultat
RÉACTIFS ET CONSERVATION
1)
Micro plaques tapissés d'antigènes
Micro plaques à 96 (12 x 8) puits tapissés de cinq antigènes recombinants différents. Les plaques sont
emballées dans un porte-barrettes et scellées dans une pochette en aluminium contenant un
dessiccateur.
2)
Calibrateur 1 (0 U/mL)
Un flacon contenant 1,5 mL du Diluant sérum contenant 0,09% d'azoture de sodium. Prêt à l'emploi, ne
pas diluer.
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3)
Français
Un flacon contenant 1,5 mL de sérum humain positif pour les auto-anticorps dans le Diluant sérum
contenant 0,09% d'azoture de sodium. Prêt à l'emploi, ne pas diluer.
4)
Conjugué (prêt à l’emploi)
Un flacon contenant 15 mL d'anticorps de chèvre anti-IgG humaine conjugué à de la peroxydase de
raifort. Prêt à l'emploi, ne pas diluer.
5)
Diluant sérum
Un flacon contenant 50 mL de tampon Tris contenant 0,09% d'azoture de sodium. Prêt à l'emploi, ne
pas diluer.
6)
Solution de lavage (20X)
Un flacon contenant 50 mL de PBS avec du Tween 20 concentré (20X).
7)
Substrat
Un flacon contenant 20 mL de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine dihydrochloride/peroxyde d'hydrogène
(TMB/H2O2). Prêt à l'emploi, ne pas diluer.
8)
Solution d'arrêt
Un flacon contenant 20 mL à 0,25 mol/L d'acide sulfurique. Prêt à l'emploi, ne pas diluer.
Les composants aussi bien des trousses non ouvertes que des trousses ouvertes pour la première fois sont
stables entre 2 et 8°C jusqu'à la date d'expiration mentionnée sur l'étiquette.
PRÉCAUTIONS
(1) Ce produit ne peut être utilisé que pour le diagnostic in vitro.
(2) Ne pas utiliser les composants de la trousse après la date d'expiration.
(3) Éviter le contact des réactifs avec les yeux, la peau ou les vêtements. En cas de contact des réactifs avec
la peau, laver avec beaucoup d'eau. Le TMB est irritant et la Solution d'arrêt contient 0,25 mol/L
d'acide sulfurique qui est un poison et corrosif.
(4) Le Calibrateur 2 est un dérivé du sérum humain dans lequel l'antigène HBs, l'anticorps HCV, les
anticorps HIV-1 et HIV-2 n'ont pas été détectés. Aucune méthode d'analyse ne peut cependant garantir
l'absence de ceux-ci ni de tout autre agent infectieux. Ces réactifs et tous les échantillons de patients
doivent être manipulés comme s'ils étaient capables de transmettre le SIDA, l'hépatite ou n'importe
quelle autre maladie infectieuse.
(5) Le Calibrateur 1, le Calibrateur 2 et le Diluant sérum contiennent de l'azoture de sodium (0,09%)
comme agent conservateur et doivent être manipulés avec précaution. Ne pas ingérer ou mettre en
contact avec la peau ou les muqueuses. L'azoture de sodium peut réagir avec le cuivre ou le plomb des
tuyauteries et former des azotures métalliques explosifs. C'est pourquoi il faut toujours rincer
abondamment à l'eau lorsque l'on jette dans les canalisations des substances contenant de l'azoture de
sodium.
(6) Le Calibrateur 1, le Calibrateur 2, le Conjugué (prêt à l’emploi) et le Diluant sérum contiennent des
substances d'origine animale prélevées sur des animaux non infectés. Ces composants doivent
cependant être manipulés et jetés comme des dangers biologiques potentiels.
(7) Ne pas mélanger avec des réactifs d'autres trousses.
11
7115E
Français
(8) Tous les réactifs doivent être portés à température ambiante (20-30°C) avant le lancement de l'essai.
(9) Ne pas exposer la trousse aux rayons directs du soleil pendant l'analyse et lors du stockage.
(10) Éviter la contamination microbienne et la contamination croisée des réactifs et des sérums.
(11) Des températures d'incubation supérieures ou inférieures à une température ambiante normale
(20-30°C), des temps d'incubation plus longs ou plus courts et des dilutions incorrectes peuvent affecter
les résultats.
(12) Les puits doivent être correctement rincés avec la Solution de lavage pour éviter des résultats
faussement positifs.
(13) Pipeter soigneusement chacun des échantillons et chacun des réactifs pour éviter la contamination
croisée entre les puits de microtitration. Éviter la formation de mousse.
(14) Toutes les barrettes non utilisées doivent être remises dans la pochette à glissière qui, elle-même, doit
être soigneusement rescellée pour éviter l'absorption d'humidité.
(15) Le Solution de lavage (20x) peut devenir trouble entre 2 et 8°C. Cela n'affecte pas les résultats.
(16) Les substances utilisées pour l'analyse doivent être jetées et traitées comme décrit ci-dessous.
Faire tremper dans une solution de glutaraldéhyde à une concentration finale de 2% pendant plus d'une
heure, faire tremper dans une solution d'hypochlorite de sodium à 0,1% (chlore disponible:
approximativement 1.000 ppm) pendant plus d'une heure ou autoclaver à 121°C pendant plus de 20
minutes.
(17) Les valeurs d'anticorps obtenues par cet essai ne sont qu'une aide au diagnostic. Le médecin doit
interpréter ces résultats à la lumière des antécédents du patient, de l'examen physique et d'autres
procédures de diagnostic.
(18) Si l'emballage protecteur est abîmé, les composants de la trousse doivent être traités ou jetés selon les
instructions pertinentes et les règlementations de chacun des pays.
MATÉRIELS REQUIS, MAIS NON FOURNIS
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
Un lecteur de plaques de microtitration (longueur d'onde: 450 nm, 620 nm pour la référence)
Micropipette multicanaux (par ex. 100 µL - 300 µL)
Pipettes simple canal (par ex. 10 µL & 100 µL)
Automate de lavage ou bouteille de lavage
Eau distillée ou désionisée
Un cylindre gradué d'un litre pour la préparation de la solution de lavage
Tubes d'analyse pour les dilutions des échantillons de patient (par ex. 1.000 µL)
Pointes de pipettes jetables
Serviettes en papier
Couvercle de plaque de microtitration
PROCÉDURE

PRÉPARATION DES RÉACTIFS
1.
2.
3.
Amener tous le matériel de l'essai à température ambiante (20-30°C) avant utilisation.
Micro plaques: une barrette doit être utilisée par sérum de patient. Retirer le nombre de barrettes
requises de la pochette et les placer dans le porte-barrettes. Remettre rapidement les barettes non
utilisées dans le réfrigérateur.
Solution de lavage: préparer une dilution 1:20 de la Solution de lavage (20x) avant utilisation (par
ex., ajouter 50 mL de Solution de lavage (20x) à 950 mL d'eau distillée). La Solution de lavage
diluée est stable pendant 2 semaines entre 2 et 8°C.
12
7115E
4.

Français
Ne pas diluer le Calibrateur 1, le Calibrateur 2, le Conjugué (prêt à l’emploi), le Diluant sérum, le
Substrat et la Solution d'arrêt. Ces réactifs sont prêts à l'emploi.
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
1.
Utiliser des sérums de patients frais. Les échantillons doivent être testés le plus rapidement possible
après leur prélèvement.
S'il faut les conserver, les échantillons doivent être conservés à -20°C ou plus bas. Ne pas répéter la
congélation et la décongélation.
2. Diluer chacun des sérums de patient à 1:101 en ajoutant 10 µL de sérum à 1 mL de Diluant séum.
* Les échantillons dilués ne peuvent pas être conservés. Diluer chacun des échantillons de patient pour
chacun des essais.
* Le Diluant sérum peut précipiter. Cela n'affecte pas les résultats.

PROCÉDURE D'ANALYSE
ÉTAPE 1. (INCUBATION DE L'ÉCHANTILLON)
Avec une pipette multicanaux, transférer 100 µL de Calibrateur 1, de Calibrateur 2, de sérum dilué du
patient et de Diluant sérum dans chacun des puits désignés de la plaque de microtitration selon le schéma
ci-dessous. (Ne pas diluer le Calibrateur 1, le Calibrateur 2 et le Diluant sérum.)
Puits
Solution ajoutée
Description du puits
A
100 µL de Calibrateur 1
B
100 µL de Calibrateur 2
C
100 µL de sérum dilué
Anti-Dsg1
D
Anti-Dsg3
E
Anti-BP180
F
Anti-BP230
G
Anti-collagène de type VII
H
100 µL de Diluant sérum
Contrôle de l'essai
* L'incubation commence lors du pipetage dans les puits de microtitration. Le pipetage doit être achevé le
plus vite possible.
Recouvrir les puits avec un couvercle de plaque de microtitration et incuber pendant 30 minutes à
température ambiante (20-30°C).
ÉTAPE 2. (LAVAGE)
Aspirer et jeter le contenu des puits. Remplir les puits de Solution de lavage et les aspirer à fond ou jeter
le contenu. Laver 4 fois. Tapoter la plaque sur une serviette en papier pour retirer la Solution de lavage
restante. Lorsqu'un automate de lavage est utilisé, laver 4 fois.
* Il est recommandé que chaque laboratoire confirme ces propres temps de lavage appropriés et d'autres
conditions.
* La Solution de lavage doit être utilisée entre 20 et 30°C.
ÉTAPE 3. (INCUBATION DU CONJUGUÉ)
Ajouter 100 µL de Conjugué (prêt à l’emploi) à chacun des puits avec une pipette multicanaux. Recouvrir
les puits d'un couvercle de plaque de microtitration et incuber pendant 30 minutes à température ambiante
(20-30°C).
13
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Français
* Ne pas remettre le Conjugué (prêt à l’emploi) dans le flacon une fois qu'il a été prélevé.
ÉTAPE 4. (LAVAGE)
Laver la plaque de microtitration comme décrit à l'ÉTAPE 2.
ÉTAPE 5. (INCUBATION DU SUBSTRAT)
Ajouter 100 µL de Substrat à chacun des puits avec une pipette multicanaux.
* Ne pas remettre le Substrat dans le flacon une fois qu'il a été prélevé.
Recouvrir les puits d'un couvercle de plaque de microtitration et incuber pendant 15 minutes à
température ambiante (20-30°C).
ÉTAPE 6. (RÉACTION D'ARRÊT)
Ajouter 100 µL de Solution d'arrêt à chacun des puits avec une pipette multicanaux.

LECTURE
Lire l'absorbance de chacun des puits à 450 nm. Si l'on utilise un lecteur de plaques à deux longueurs
d'onde, régler la longueur d'onde du test à 450 nm et la référence à 620 nm.
* La lecture doit se faire dans les 20 minutes après la réaction d'arrêt.
* Avant de lire la plaque, s'assurer que le fond de la plaque est propre et sec et qu'il n'y a pas de bulles d'air à
la surface du liquide dans les puits.

CALCUL DES RÉSULTATS
(A450 de l'échantillon du patient pour l'antigène <puits C, D, E, F, G> － A450 du Calibrateur 1
Valeur (U/mL) =
<puits A>)
x 100
(A450 du Calibrateur 2<puits B>) - A450 du Calibrateur 1< puits A>)
* A450 est l'abréviation de la valeur de l'absorbance à 450 nm.
* Un matériel de référence interne pour chacun des anticorps n'est pas disponible. L'essai est calibré en
unités arbitraires relatives.

CONTRÔLE DE QUALITÉ
Chacun des résultats de l'essai doit rencontrer les critères suivants.
A450 du Contrôle de l'essai (puits H): ＞ 0,5
A450 du Calibrateur 1 (puits A):
＜ 0,1
A450 du Calibrateur 2 (puits B):
＞ 0,5
Si l'un de ces critères n'est pas rencontré, les résultats sont invalides et l'analyse doit être recommencée.
Avant de répéter l'analyse, vérifier les points suivants:
・ Température d'Incubation
・ Temps d'Incubation
・ Lavage
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS ET VALEURS ATTENDUES
Ce qui suit ne doit être considéré que comme un guide pour l'interprétation. Il est recommandé que chaque
laboratoire établisse ses propres critères d'interprétation du test sur base de l'échantillon de population
typique qui s'y retrouve.
14
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Valeur (U/mL)
Interprétation
≥15
Positif
<15
Négatif
・ Les valeurs ci-dessus ont été établies en analysant 42 sérums normaux, 30 sérums de patients atteints
de pemphigus vulgaire (PV), 30 sérums de patients atteints de pemphigus foliacé (PF), 60 sérums de
patients atteints de pemphigoïde bulleuse (PB) et 30 sérums de patients atteints d'épidermolyse bulleuse
acquise (EBA).

LIMITES
Comme pour d'autres procédures de tests de diagnostic, les résultats obtenus avec le MESACUP anti-Skin
profile TEST ne servent que comme aide au diagnostic et ne doivent pas être interprétés comme
diagnostics en eux-mêmes
PERFORMANCE

SPÉCIFICITÉ ET SENSIBILITÉ CLINIQUES
Groupes
maladies
de
PV
Nombre
total
30
Dsg1
positif
26
Dsg3
positif
25
BP180
positif
1
BP230
positif
1
Type VII
positif
0
PF
30
30
5
0
1
0
PB (active)
30
0
0
26
29
0
PB (rémission)
30
1
0
26
5
0
EBA
30
0
0
0
1
26
Contrôle normal
42
0
0
0
1
0
PV: Pemphigus vulgaire
PF: Pemphigus foliacé
PB: Pemphigoïde bulleuse
EBA: Épidermolyse bulleuse acquise

SENSIBILITÉ
＞ 0,5
＜ 0,1
＞ 0,5
L'A450 du Contrôle de l'essai (puits H) doit être
L'A450 du Calibrateur 1 (puits A) doit être
L'A450 du Calibrateur 2 (puits B) doit être

SPÉCIFICITÉ
Lorsque l'on analyse chacun des échantillons positifs pour les 5 anticoprs, tous les paramètres doivent être
positifs.
Lorsque l'on analyse chacun des échantillons négatifs pour les 5 anticorps, tous les paramètres doivent
être négatifs.

REPRODUCTIBILITÉ
Lorsque l'on analyse six fois chacun des échantillons positifs pour les 5 anticorps, tous les paramètres
doivent être positifs.
Lorsque l'on analyse six fois chacun des échantillons négatifs pour les 5 anticorps, tous les paramètres
15
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doivent être négatifs.

LIMITES DE DÉTECTION
Anti-Dsg1:
Anti-Dsg3:
Anti-BP180:
Anti-BP230:
Anti-collagène de type VII:

2,2 U/mL
1,8 U/mL
1,2 U/mL
1,6 U/mL
1,2 U/mL
SUBSTANCES INTERFÉRENTES
L'hémoglobine (jusqu'à 498 mg/dL), la bilirubine F (jusqu'à 18,7 mg/dL), la bilirubine C (jusqu'à 19,7
mg/dL), le chyle (jusqu'à 1440 FTU) et/ou le facteur rhumatoïde (jusqu'à 450 IU/mL) n'interfèrent pas
avec les résultats, mais éviter d'utiliser des échantillons fortement hémolysés ou des échantillons
fortement hyperlipémiques.
BIBLIOGRAPHIE
2001
Delmatol Sci 62: 169-175, 2011
16
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Deutsch
Deutsch
VERWENDUNGSZWECK
Der MESACUP anti-Skin profile TEST ist ein qualitatives enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Testsystem zum Nachweis von IgG Antikörpern gegen Dsg1, Dsg3, BP180, BP230 und TypeVII Kollagen
im menschlichen Serum. Fünf individuelle Autoantikörper können in einem einzigen Test gleichzeitig
nachgewiesen werden. Der MESACUP anti-Skin profile TEST ist zum in vitro Gebrauch vorgesehen, als
Hilfe bei der Diagnose bestimmter blasenbildender Autoimmunerkrankungen.
ZUSAMMENFASSUNG UND KLINISCHER HINTERGRUND
Autoimmune blasenbildende Erkrankungen sind eine Gruppe von Hauterkrankungen, die durch
Blasenbildung oder Erosionen der Haut gekennzeichnet und als pemphigus und pemphigoid klassifiziert
sind.
Pemphigus ist eine autoimmune blasige Hauterkrankung, die die Haut und muköse Membranen zum Ziel
hat. Es werden zwei Hauptuntertypen unterschieden: Pemphigus vulgaris (PV) und Pemphigus foliaceus
(PF). Bei Patienten mit PV werden Anti-Desmoglein 3 (Dsg3) Antikörper gebildet. Bei PV Patienten
weist muco-dominante PV nur anti-Dsg3 und mucocutane PV sowohl Dsg1 als auch Dsg3 Antikörper auf,
wohingegen Anti –Dsg1 positive aber Anti-Dsg3 negative Patienten als PF(1) diagnostiziert werden. Diese
Anti-Dsg Antikörper bestehen aus pathogenen und nichtpathogenen Antikörpern. Eine Aktuelle Studie hat
gezeigt, dass die pathogenen Anti-Dsg Antikörper an reife Dsg-Antigene binden, die unmaskiert durch
proteolytische Prozesse unreifer Dsg(2)sind.
Blasenbildende Pemphigoid (BP) ist eine subepidermale blasige Erkrankung, die durch die Präsenz von
IgG-Autoantikörpern gegen epidermale Basismembranbereiche im Serum gekennzeichnet ist. Die
Autoantikörper von Patienten mit BP zielen auf zwei ausgeprägte Antigene, ein 180 kDa transmembranes
Protein bezeichnet als BP180 und ein 230 kDa intrazelluläres Protein bezeichnet als BP230.
Epitopstudien von Anti-BP180 Antikörpern zeigten, dass die nicht-kollagene 16a (NC16a) Domäne von
BP180 das Hauptepitop ist, welches von der der Mehrheit der BP Seren (3-4) erkannt wird. Bei Anti-BP230
Antikörpern reagiert die C-terminale Domäne (BP230-C) hauptsächlich mit BP Patientenserum, aber
einige BP Patientenseren erkennen nur die N-terminale Domäne von BP230 (BP230-N) (5-6).
Epidermolysis bullosa aquisita (EBA) ist eine blasenbildende Autoimmun-Hauterkrankung, die durch das
Vorhandensein von Typ VII Kollagen IgG-Autoantikörpern gekennzeichnet ist. Typ VII Kollagen ist aus
drei identischen α-Ketten zusammengesetzt. Jede α-Kette besteht aus einer zentralen kollagenösen
Domäne (COL), flankiert von einer 145 kDa nicht-kollagenösen Amino-terminalen Domäne (NC1) und
einer kleineren 34 kDa Carboxyl-terminalen nicht-kollagenen Domäne (NC2). Die antigenen
Hauptepitope für Anti-Typ VII kollagene Autoantikörper bei Patienten mit EBA befinden sich in der NC1
Domäne. Allerdings zeigt die aktuelle Forschungsveröffentlichung, dass die NC2 Domäne für diese
Autoantikörper ein weniger wichtiges antigenes Epitop darstellt (7).
In der folgenden Tabelle sind die, in diesem Profil-Kit verwendeten, rekombinanten Antigene aufgelistet,
die den oben besprochenen Hintergrund aufweisen.
Hautspezifische Autoantikörper
Verwendete rekombinante Antigene
Anti-Dsg1
Dsg1
Anti-Dsg3
Dsg3
Anti-BP180
BP180 NC16a
Anti-BP230
BP230-C und BP230-N
Anti-TypVII Kollagen
NC1 und NC2
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WIRKUNGSPRINZIP
Der MESACUP anti-Skin profile TEST ist ein ELISA, der fünf Anti-Haut-spezifische Antikörper
(anti-Dsg1, Anti-Dsg3, Anti-BP180, Anti-BP230 und Anti-TypVII Kollagen)
gleichzeitig im
Patientenserum entdeckt. Mikrotiterstreifen (8 Vertiefungen) sind separat mit 5 verschiedenen
rekombinanten Antigenen beschichtet. Spezifische Antikörper im verdünnten Serum binden an die
Antigen beschichtete Vertiefung (Probeninkubation). Die Vertiefungen werden dann gewaschen, um
ungebundene Antikörper und andere Komponenten zu entfernen. Ein Konjugat von Meerettich
Peroxidase markiertem Anti-human IgG Antikörper wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für eine
weitere Zeitspanne inkubiert (Substratinkubation). Säurelösung wird danach zu jaeder Vertiefung gegeben,
um die Enzymreaktion zu stoppen und die Farbentwicklung zu stabilisieren. Das Testergebnis wird
photometrisch durch Messung der Absorbtion und Aufzeichnung der Ergebnisse bestimmt.
TESTABLAUF
<Probeninkubation>
Geben Sie 100 µL verdünnter Probe (1:101) zu den im Schema
festgelegten Vertiefungen der Mikrotiterplatte
(20-30°C) 30 Min.
↓
Waschen
↓
<Konjugatinkubation>
Geben Sie 100 µL Konjugatreagenz zu jeder Vertiefung
(20-30°C) 30 Min.
↓
Waschen
↓
<Substratinkubation>
Geben Sie 100 µL Substrat zu jeder Vertiefung
(20-30°C) 15 Min.
↓
Geben Sie 100 µL Stoplösung in jede Vertiefung
↓
Lesen Sie die Absorption ab
↓
Interpretieren Sie die Ergebnisse
REAGENZIEN UND LAGERUNG
1) Antigen Mikrotiterstreifen
Mikrotiterstreifen mit 96 Vertiefungen (12 x 8 Vertiefungen) beschichtet mit 5 individuellen
rekombinanten Antigenen. Die Streifen sind in einem Streifenhalter verpackt und in einem
Folienumschlag mit Trockenmittel versiegelt.
2) Kalibrator 1 (0 U/mL)
Ein Fläschchen mit 1,5 mL Probendiluent (enthält 0.09% Natriumazid). Gebrauchsfertig, nicht weiter
verdünnen.
18
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Deutsch
3) Kalibrator 2 (100 U/mL)
Ein Fläschchen mit 1,5 mL Autoantikörper positivem Humanserum in Probendiluent (enthält 0.09%
Natriumazid). Gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen.
4) Konjugatreagenz
Ein Fläschchen mit 15 mL mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Anti-human IgG Antikörper (Ziege).
Gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen.
5) Probendiluent
Ein Fläschchen mit 50 mL Tris Puffer (enthält 0.09% Natriumazid). Gebrauchsfertig, nicht weiter
verdünnen.
6) Waschkonzentrat (20X)
Ein Fläschchen mit 50 mL PBS mit Tween 20 Konzentrat (20X).
7) Substrat
Ein Fläschchen mit 20 mL 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin Dihydrochlorid /Wasserstoffperoxid (TMB/
H2O2). Gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen.
8) Stoplösung
Ein Fläschchen mit 20 mL 0.25 mol/L Schwefelsäure. Gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen.
Sowohl ungeöffnete, als auch erstmals geöffnete Testsystem Komponenten sind bei 2-8°C bis zum
aufgedruckten Verfallsdatum stabil.
VORSICHTSMASSNAHMEN
(1) Dieses Produkt ist nur zur in-vitro Diagnostik vorgesehen.
(2) Benutzen Sie keine Testsystemkomponenten nach den festgelegten Verfallsdaten.
(3) Vermeiden Sie Kontakt der Reagenzien mit Augen, Haut und Kleidung. Reagenzien auf der Haut
müssen mit viel Wasser abgewaschen werden. TMB ist reizend und die Stoplösung besteht aus 0,25
mol/L Schwefelsäure, die giftig und korrosiv ist.
(4) Kalibrator 2 stammt aus menschlichem Serum, in dem keine HBs Antigene und Antikörper gegen HCV,
HIV-1 und HIV-2 nachgewiesen wurden. Keine Testmethode kann jedoch die Abwesenheit dieser oder
anderer infektiöser Agenzien garantieren. Diese Reagenzien und alle Patientenproben sollten behandelt
werden, als ob sie AIDS, Hepatitis oder andere infektiöse Erkrankungen übertragen könnten.
(5) Kalibrator 1, Kalibrator 2 und der Probendiluent enthalten Natriumazid (0,09%) als
Konservierungsmittel und müssen mit Vorsicht behandelt werden.Nicht verschlucken und Kontakt mit
Haut oder mukösen Membranen vermeiden. Natriumazid kann mit Kupfer oder Blei zu explosiven
Metallaziden reagieren. Spülen Sie deshalb mit viel Wasser, wenn Sie Natriumazid haltiges Material in
der Spüle entsorgen.
(6) Kalibrator 1, Kalibrator 2, Konjugatreagenz und Probendiluent enthalten Material tierischen Ursprungs,
gewonnen aus nicht-infizierten Tieren. Diese Komponenten sollten trotzdem im Gebrauch und bei der
Entsorgung als potentiell biogefährdend betrachtet werden.
(7) Mischen Sie keine Reagenzien von anderen Testsystemen.
(8) Alle Reagenzien müssen vor Testbeginn auf Raumtemperatur (20-30°C) gebracht werden.
19
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(9) Setzen Sie das Testsystem während des Tests und der Lagerung nicht direktem Sonnenlicht aus.
(10) Vermeiden Sie mikrobielle und Kreuzkontaminationen der Reagenzien und Proben.
(11) Inkubationstemperaturen ober- oder unterhalb normaler Raumtemperatur (20-30°C), kürzere oder
längere Inkubationszeiten und unkorrekte Verdünnungen können zu verkehrten Ergebnissen führen.
(12) Die Vertiefungen müssen gut mit Waschlösung gespült werden, um falsche Ergebnisse zu vermeiden.
(13) Pipettieren Sie jede Probe und Reagenz sorgfältig, um Kreuzkontaminationen zwischen den Microwells
zu vermeiden. Vermeiden Sie Schaumbildung.
(14) Alle unbenutzten Mikrotiterstreifen sollten in die Ziplock Tasche zurückgesteckt werden. Diese muss
sorgfältig versiegelt werden, um Absorption von Feuchtigkeit zu vermeiden.
(15) Waschkonzentrat kann bei 2-8°C trübe werden. Dieses beeinflußt die Ergebnisse nicht.
(16) Die für den Test benutzten Materialien sollten wie nachfolgend beschrieben entsorgt oder behandelt
werden.
Weichen Sie das Material mehr als 1 Stunde in 2% iger (Endkonzentration) Glutaraldehydlösung ein,
mehr als 1 Stunde Einweichen in 0,1%iger Natriumhypochloridlösung (verfügbares Chlor ca. 1000
ppm) oder bei 121°C für mehr als 20 Minuten Autoklavieren.
(17) Die aus diesem Test erhaltenen Antikörperwerte stellen nur eine diagnostische Hilfe dar. Jeder Arzt
muss diese Ergebnisse im Licht der Patientenhistorie, der physischen Befunde und anderer
diagnostischer Verfahren bewerten.
(18) Ist die Schutzverpackung beschädigt, sollten die Testsystemkomponenten entsprechend den geltenden
Vorschriften des entsprechenden Landes behandelt oder entsorgt werden.
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
Mikroplattenleser (Wellenlänge: 450 nm, 620 nm/Referenz)
Multikanal Mikropipette (z.B. 100 µL - 300 µL)
Einkanalpipette (z.B. 10 µL & 100 µL)
Automatischer Wascher oder Waschflasche
Deionisiertes oder distilliertes Wasser
Zylinder (1 Liter, mit Graduierung) für die Zubereitung der Waschlösung
Teströhrchen für die Verdünnung von Patientenproben (z.B. 1000 µL)
Einmal Pipettenspitzen
Papiertücher
Mikroplattenabdeckung
TESTABLAUF

VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
1.
2.
3.
Bringen Sie vor der Anwendung alle Testsystem Materialien auf Raumtemperatur (20-30°C).
Mikrotiterstreifen: Jeweils ein Streifen muss pro Patientenserum verwendet werden. Entnehmen
Sie die benötigte Anzahl Mikrotiterstreifen aus der Tasche und setzen Sie sie in den Halterahmen
ein. Die unbenutzten Streifen müssen unverzüglich wieder im Kühlschrank gelagert werden.
Waschlösung: Bereiten Sie eine 1:20 Verdünnung des Waschkonzentrats vor der Verwendung zu
(fügen Sie 50 mL Waschkonzentrat zu 950 mL destilliertem Wasser). Die verdünnte Waschlösung
bleibt bei 2-8°C 2 Wochen stabil.
20
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4.

Deutsch
Verdünnen Sie nicht Kalibrator 1, Kalibrator 2, das Konjugatreagenz, die Probendiluent, das
Substrat und die Stoplösung. Diese Reagenzien sind gebrauchsfertig.
VORBEREITUNG DER PROBEN
1.
2.
Benutzen Sie frisches Patientenserum. Die Proben sollten so bald wie möglich nach Entnahme
getestet werden.
Ist Lagerung notwendig, sollten die Proben bei -20°C oder niedriger gelagert werden. Wiederholen
Sie keine Einfrier-und Auftauvorgänge.
Verdünnen Sie jedes Patientenserum 1:101 durch hinzufügen von 10 µL Serum zu 1 mL
Probendiluent.
* Verdünnte Proben können nicht aufbewahrt werden. Verdünnen Sie jedes Patientenserum für jede
Testsystem separat.
* Die Probendiluent kann Präzipitate bilden, die die Testergebnisse nicht beeinflussen.

TESTPROZEDUR
SCHRITT 1. (PROBENINKUBATION)
Mit einer Multikanalpipette werden jeweils 100 µL Kalibrator 1, Kalibrator 2, verdünntes Patientenserum
und Probendiluent in jede festgelegte Vertiefung der Mikrotiterplatte entsprechend dem untenstehenden
Schema gegeben. (Verdünnen Sie nicht Kalibrator 1, Kalibrator 2 und die Probendiluent)
Beschreibung der
Vertiefung
Vertiefung
Zugefügte Lösung
A
100 µL Kalibrator 1
Kalibrator 1 (0 U/mL)
B
100 µL Kalibrator 2
Kalibrator 2 (100 U/mL)
C
100 µL verdünntes Serum
Anti-Dsg1
D
Anti-Dsg3
E
Anti-BP180
F
Anti-BP230
G
Anti-TypeVII Kollagen
H
100 µL Probendiluent
Testkontrolle
* Die Inkubation startet mit dem Pipettieren in die Vertiefungen. Das Pipettieren sollte so schnell wie
möglich vollendet werden.
Bedecken Sie die Platte mit einer Mikroplattenabdeckung und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur
(20-30°C) für 30 Min.
SCHRITT 2. (WASCHEN)
Saugen oder verwerfen Sie die Inhalte der Vertiefungen. Füllen Sie die Vertiefung mit Waschlösung und
saugen Sie sie komplett ab. Waschen Sie 4 mal. Klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch und entfernen
Sie die verbliebene Waschlösung. Wenn ein automatischer Wascher benutzt wird, waschen Sie 4 mal.
* Jedes Labor muss seine geeigneten eigenen Waschzeiten und anderen Bedingungen verifizieren.
* Die Waschlösung sollte bei 20-30°C benutzt werden.
SCHRITT 3. (KONJUGATINKUBATION)
Fügen Sie 100 µL Konjugatreagenz mit einer Multikanalpipette zu jeder Vertiefung. Bedecken Sie die
Platte mit einer Mikroplattenabdeckung und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur (20-30°C) für 30
21
7115E
Deutsch
Min.
* Das aus der Flasche entnommene Konjugatreagenz nicht wieder zurückpipettieren.
SCHRITT 4. (WASCHEN)
Waschen Sie die Mikrotiterplatte, wie in Schritt 2 beschrieben.
SCHRITT 5. (SUBSTRATINKUBATION)
Geben Sie 100 µL des Substrats mit einer Multikanalpipette in jede Vertiefung.
* Geben Sie das entnommene Substrat nicht wieder in das Fläschen zurück
Bedecken Sie die Vertiefungen mit einer Mikroplattenabdeckung und inkubieren Sie sie bei
Raumtemperatur (20-30°C) für 15 Min.
SCHRITT 6. (STOPREAKTION)
Geben Sie 100 µL der Stoplösung mit einer Multikanalpipette in jede Vertiefung.

ABLESUNG
Lesen Sie die Absorption von jeder Vertiefung bei 450 nm ab. Wird ein Plattenleser mit dualer
Wellenlänge benutzt, setzen Sie die Testwellenlänge auf 450 nm und die Referenzwellenlänge auf
620 nm.
* Die Ablesung sollte innerhalb von 20 Minuten nach dem Stoppen der Reaktion erfolgen.
* Stellen Sie vor dem Ablesen der Platte sicher, dass der Plattenboden sauber und trocken ist und dass sich
keine Luftblasen auf der Oberfläche der Flüssigkeit in den Vertiefungen befindet.

BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
(A450 der Patientenprobe für das Antigen <Vertiefung C, D, E, F, G> － A450 von Kalibrator 1
Einheitswert (U/mL) =
<Vertiefung A>)
x 100
(A450 von Kalibrator 2 <Vertiefung B>) - A450 von Kalibrator 1 <Vertiefung A>)
* A450 ist die Abkürzung für den Absorptionswert bei 450 nm.
* Ein internationales Referenzmaterial für jeden Antikörper steht nicht zur Verfügung. Das Testsystem ist in
relativen Durchschnittswerten kalibriert.

QUALITÄTSKONTROLLE
Jedes Testergebnis sollte die folgenden Kriterien erfüllen:
A450 der Testkontrolle (well H):
A450 des Kalibrators 1 (well A):
A450 des Kalibrators 2 (well B):
＞ 0,5
＜ 0,1
＞ 0,5
Werden irgendwelche dieser Kriterien nicht erfüllt, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte
wiederholt werden.
Ehe Sie den Test wiederholen, überprüfen Sie die folgenden Punkte.
・ Inkubationstemperatur
・ Inkubationszeit
・ Waschen
22
7115E
Deutsch
TESTINTERPRETATION UND ERWARTETE ERGEBNISSE
Das Folgende sollte nur als eine Anleitung zur Interpretation benutzt werden. Jedes Labor muss seine
eigenen Kriterien für die Testinterpretation etablieren, basierend auf den Proben-Populationen wie sie
typischerweise gefunden werden.
Wert (U/mL)
Interpretation
≥15
Positiv
<15
Negativ
・ Die oben genannten Werte wurden durch Testung von 42 normalen Seren, 30 Pemphigus vulgaris (PV)
Patientenseren, 30 Pemphigus Foliaceus (PF) Patientenseren, 60 Bullous pemphigoid (BP) Patientenseren
und 30 Epidermolysis bullosa aquisita (EBA) Patientenseren begründet.

GRENZEN DES VERFAHRENS
Wie bei anderen diagnostischenTestprozeduren sollten die, mit dem MESACUP anti-Skin profile TEST
erhaltenen Ergebnisse ausschließlich als Hilfe bei der Diagnose dienen und nicht selbst als Diagnostika
interpretiert werden.
LEISTUNGSMERKMALE

KLINISCHE SPEZIFITÄT UND SENSITIVITÄT
PV
30
Dsg1
positiv
26
PF
30
30
5
0
1
0
BP (aktiv)
30
0
0
26
29
0
BP (remission)
30
1
0
26
5
0
EBA
30
0
0
0
1
26
Normale Kontrolle
42
0
0
0
1
0
Krankheitsgruppe
Gesamtzahl
Dsg3
positiv
25
BP180
positiv
1
BP230
positiv
1
Typ VII
positiv
0
PV: Pemphigus vulgaris
PF: Pemphigus foliaceus
BP: Bullous pemphigoid
EBA: Epidermolysis bullosa aquisita

SENSITIVITÄT
A450 der Testkontrolle (Vertiefung H) sollte sein ＞ 0,5
A450 des Kalibrators 1 (Vertiefung A) sollte sein ＜ 0,1
A450 des Kalibrators 2 (Vertiefung B) sollte sein ＞ 0,5

SPEZIFITÄT
Wenn jede positive Probe auf 5 Antikörper geprüft wird, sollten alle Parameter positiv sein.
Wenn jede negative Probe auf 5 Antikörper geprüft wird, sollten alle Parameter negativ sein.
23
7115E

Deutsch
REPRODUZIERBARKEIT
Wenn jede positive Probe auf 5 Antikörper sechsfach geprüft wird, sollten alle Parameter positiv sein.
Wenn jede negative Probe auf 5 Antikörper sechsfach geprüft wird, sollten alle Parameter negativ sein.

NACHWEISGRENZEN
Anti-Dsg1:
Anti-Dsg3:
Anti-BP180:
Anti-BP230:
Anti-TypVII Kollagen:

2,2 U/mL
1,8 U/mL
1,2 U/mL
1,6 U/mL
1,2 U/mL
INTERFERIERENDE SUBSTANZEN
Hämoglobin (bis zu 498 mg/dL), Bilirubin F (bis zu 18,7 mg/dL), Bilirubin C (bis zu 19,7 mg/dL), chyle
(bis zu 1440 FTU) und/oder Rheumafaktor (bis zu 450 IU/mL) interferieren nicht mit dem Ergebnis,
vermeiden Sie aber den Gebrauch von stark hämolysierten oder hoch lipämischen Proben.
LITERATURVERZEICHNIS
2001
Delmatol Sci 62: 169-175, 2011
24
Espaňol
7115E
Español
USO PREVISTO
El MESACUP anti-Skin profile TEST es un ensayo inmunoenzimático (ELISA) para detectar anticuerpos
IgG anti Dsg1, Dsg3, BP180, BP230 y colágeno tipoVII en suero humano. Se pueden detectar cinco
anticuerpos individuales simultáneamente en un ensayo. El MESACUP anti-Skin profile TEST está
diseñado para diagnóstico in vitro y como ayuda para el diagnóstico de ciertas enfermedades ampollosas
autoinmunes.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
Las enfermedades ampollosas autoinmunes son un grupo de trastornos de la piel, que se caracterizan por
la aparición de ampollas o erosiones y se clasifican como pénfigo y penfigoide.
El pénfigo es una enfermedad ampollosa autoimmune que se manifiesta en la piel y en las membranas
mucosas. Se divide en dos subclases principales: pénfigo vulgar (PV) y pénfigo foliáceo (PF). En los
pacientes con PV, se producen anticuerpos anti desmogleia 3 (Dsg3). Entre los pacientes PV, los
pacientes con el PV mucosal dominante solo tienen anti Dsg3 y los pacientes el PV mucocutáneo tienen
tanto anticuerpos Dsg1 como Dsg3, en cambio los pacientes anti Dsg1 positivos pero anti Dsg3 negativos
se diagnostican como PF(1). Estos anticuerpos anti Dsg consisten de anticuerpos patogénicos y no
patogénicos. Un estudio reciente demostró que los anticuerpos patogénicos anti Dsg se unen a antígenos
Dsg más maduros que son descubiertos a través del procesamiento proteolítico de Dsg inmaduro (2).
El penfigoide ampolloso (BP) es una enfermedad ampollosa subepidérmica autoinmune que se caracteriza
por la presencia de autoanticuerpos IgG en el suero contra la zona basal de la membrana. Los
autoanticuerpos de pacientes con BP están dirigidos a dos antígenos distintos, una proteína
transmembrana de 180 kDa llamada BP180 y una proteína intracelular de 230 kDa llamada BP230. En
estudios de epítopes para anticuerpos anti BP180 se ha demostrado que el dominio 16a (NC16a) no
colagenoso del BP 180 es el epítope principal reconocido por la mayoría de los sueros BP(3-4). Para los
anticuerpos anti BP230 el dominio C terminal (BP230-C) reacciona principalmente con el suero de
pacientes BP, pero el suero de algunos pacientes BP solo reconoce el dominio N terminal de BP230
(BP230-N) (5-6).
La epidermólisis ampollosa adquirida (EBA) es una enfermedad ampollosa autoinmune de la piel que se
caracteriza por la presencia de autoanticuerpos IgG contra el colágeno tipo VII. El colágeno tipo VII
consiste de tres cadenas α idénticas. Cada cadena α consiste de un dominio central colagenoso (COL)
flanqueado por un dominio amino terminal (NC1) no colagenoso de 145 kDa y un dominio más pequeño
no colagenoso, carboxilo terminal (NC2) de 34 kDa. Los epítopes antigénicos más importantes para los
autoanticuerpos anti colágeno tipo VII en pacientes con EBA residen dentro del dominio NC1. Sin
embargo, un estudio de investigación reciente demostró que el dominio NC2 es un epítope antigénico
menor para estos autoanticuerpos(7).
De los antecedentes anteriores, los antígenos recombinantes utilizados en el perfil de este kit se enumeran
en la siguiente tabla.
Autoanticuerpos específicos de la piel
Antígenos recombinantes utilizados
Anti-Dsg1
Dsg1
Anti-Dsg3
Dsg3
Anti-BP180
BP180 NC16a
Anti-BP230
BP230-C y BP230-N
Anti colágeno tipoVII
NC1 y NC2
25
Espaňol
7115E
PRINCIPIO
El MESACUP anti-Skin profile TEST es un ELISA que detecta simultáneamente cinco anticuerpos
específicos anti piel (anti Dsg1, anti Dsg3, anti BP180, anti BP230 y anti colágeno tipoVII) en el suero
del paciente. Se recubren individualmente ocho pocillos de una microplaca con cinco antígenos
recombinantes diferentes. Los anticuerpos específicos diluidos en el suero se unirán al pocillo recubierto
con antígenos (incubación de la muestra). A continuación los pocillos se lavan para eliminar anticuerpos
libres y otros componentes. Se añade un conjugado de un anticuerpo IgG anti humano marcado con
peroxidasa de rábano picante a los pocillos y se incuba (incubación del conjugado). Después de otro paso
de lavado, se añade el substrato de peroxidasa y se incuba durante un periodo de tiempo adicional
(incubación del substrato). A continuación se añade la solución de ácido a cada pocillo para detener la
reacción enzimática y para estabilizar el desarrollo del color. El resultado de la prueba se determina de
forma fotométrica midiendo la absorbancia y graficando los resultados.
BREVE PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
<Incubación de la muestra>
Añadir 100 µl de muestra diluida (1:101) en pocillos designados de la
(20-30°C) 30 min.
microplaca según el esquema
↓
Lavado
↓
<Incubación del Conjugado> Añadir 100 µl de Reactivo conjugado en cada pocillo
(20-30°C) 30 min.
↓
Lavado
↓
<Incubación del Substrato>
Añadir 100 µl de Substrato en cada pocillo
(20-30°C) 15 min.
↓
Añadir 100 µl de Solución de parada en cada pocillo
↓
Leer la absorbancia
↓
Interpretar los resultados
REACTIVOS Y CONSERVACIÓN
1) Tiras de pocillos con antígenos
96 pocillos en Tiras de pocillos (12 x 8 pocillos) recubiertos con cinco antígenos recombinantes. Las
tiras están contenidas en un porta tiras y selladas en una bolsa de aluminio con desecante.
2) Calibrador 1 (0 U/ml)
Un vial de 1,5 ml de Diluyente del ensayo con 0,09% de azida de sodio. Listo para usar, no diluir.
26
Espaňol
7115E
3) Calibrador 2 (100 U/ml)
Un vial de 1,5 ml de suero humano positivo para autoanticuerpos, en Diluyente del ensayo 0,09% de
azida de sodio. Listo para usar, no diluir.
4) Reactivo conjugado
Un vial de 15 ml de anticuerpo de cabra anti IgG humano conjugado con peroxidasa de rábano picante.
Listo para usar, no diluir.
5) Diluyente del ensayo
Un vial de 50 ml de tampón Tris con 0,09% de azida de sodio. Listo para usar, no diluir.
6) Solución de lavado concentrada (X20)
Un vial de 50 ml de PBS con Tween 20 concentrado (X20).
7) Substrato
Un vial de 20 ml de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina dihidroclorhidra /peróxido de hidrógeno (TMB/ H2O2).
Listo para usar, no diluir.
8) Solución de parada
Un vial de 20 ml de 0,25 mol/l de ácido sulfurico. Listo para usar, no diluir.
Tanto los componentes del kit sellados como los recién abiertos son estables hasta la fecha de caducidad
impresa en la etiqueta y conservados a 2-8°C.
PRECAUCIONES
(1)
Este producto es solo para diagnóstico in vitro.
(2)
No utilizar después de la fecha de caducidad.
(3)
Evitar el contacto de los reactivos con los ojos, la piel y la ropa. Los reactivos en la piel deben lavarse
con abundante agua. TMB es irritante y la Solución de parada consiste de 0,25 mol/l de ácido
sulfúrico que es un veneno y es corrosivo.
(4)
Calibrador 2 proviene de suero humano en el que no se ha detectado el antígeno HBs, el anticuerpo
anti VHC, anticuerpos anti VIH-1 y anti VIH-2. Sin embargo, ninguna prueba puede garantizar la
ausencia de estos u otros agentes infecciosos. Estos reactivos y todas las muestras de los pacientes
deben manipularse como si pudieran transmitir SIDA, hepatitis o cualquier otra enfermedad
infecciosa.
(5)
Calibrador 1, Calibrador 2 y Diluyente del ensayo contienen azida de sodio (0,09%) como
conservante y deben manipularse con precaución. No ingerir o permitir que tome contacto con la piel
o membranas mucosas. La azida de sodio puede reaccionar con el cobre o el plomo en el sistema de
cañerías para formar azidas metálicas explosivas. Por lo tanto, siempre se debe enjuagar con copiosa
cantidad de agua al eliminar material que contiene azida de sodio en el desagüe.
(6)
Calibrador 1, Calibrador 2, Reactivo conjugado y Diluyente del ensayo contienen material de origen
animal, de animales no infectados. Sin embargo estos componentes deben tratarse como
potencialmente biopeligrosos al utilizarlos y eliminarlos.
(7)
No mezclar reactivos de otros kits.
(8)
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-30°C) antes de iniciar el ensayo.
27
Espaňol
7115E
(9)
No exponer el kit a la luz solar directa durante la prueba y la conservación.
(10) Evitar la contaminación microbiana y cruzada de los reactivos o muestras.
(11) La temperatura de incubación por sobre o por debajo la temperatura ambiente normal (20-30°C),
tiempos de incubación más largos o más cortos y diluciones inexactas pueden dar resultados erróneos.
(12) Los pocillos deben ser enjuagados debidamente con Solución de lavado para evitar resultados falsos
positivos.
(13) Pipetear cuidadosamente cada muestra y reactivo para evitar contaminación cruzada entre los pocillos,
evitar la formación de espuma.
(14) Todas las Tiras de pocillos no utilizadas deben devolverse e la bolsa sellable, que debe sellarse
cuidadosamente para evitar la absorción de humedad.
(15) La Solución de lavado concentrada puede volverse turbia a 2-8°C, esto no produce resultados
inconsistentes.
(16) Los materiales utilizados para la prueba deben eliminarse o tratarse como se describe a continuación.
Remojar en una solución de concentración final de 2% de glutaraldehído por más de una hora,
remojar en solución de hipoclorito de sodio al 0,1% (cloro disponible alrededor de 1000 ppm) por
más de una hora o autoclave a 121°C por más de 20 minutos.
(17) Los valores de anticuerpos obtenidos en este ensayo solo ayudan con el diagnóstico. Cada médico
debe interpretar estos resultados considerando los antecedentes del paciente, los hallazgos físicos y
otros procedimientos diagnósticos.
(18) En caso que el envase protector este dañado, los componentes del kit deben tratarse o eliminarse
según las instrucciones pertinentes y normativas de cada país.
MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
Lector de microplacas (longitud de onda: 450 nm, 620 nm/referencia)
Micropipeta multicanal (p. ej. 100 µl - 300 µl)
Pipeta monocanal (p. ej. 10 µl y 100 µl)
Lavador automático o botella de lavado
Agua desionizada o destilada
Cilindro graduado de un litro para preparar la solución de lavado
Tubos de ensayo para diluir las muestras de los pacientes (p. ej. 1000 µl)
Puntas de pipetas desechables
Toallas de papel
Cubierta de microplaca
PROCEDIMIENTO
■ PREPARACIÓN DE REACTIVOS
1.
2.
3.
Dejar que todos los materiales del ensayo alcancen temperatura ambiente (20-30°C) antes de
utilizar.
Tiras de pocillos: Se debe utilizar una tira por cada suero de paciente. Sacar las Tiras de pocillos
necesarias de la bolsa y colocarlas en el porta tiras. Devolver inmediatamente las Tiras no utilizadas
al frigorífico.
Solución de lavado: Preparar una dilución 1:20 de la Solución de lavado concentrada antes de
28
Espaňol
7115E
4.
utilizar (p. ej. añada 50 ml de concentrado a 950 ml de agua destilada). La Solución de lavado
diluida es estable por dos semanas a 2-8°C.
No diluir el Calibrador 1, Calibrador 2, Reactivo conjugado, Diluyente del ensayo, Substrato y
Solución de parada. Estos reactivos están listos para ser utilizados.
■ PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
1.
2.
Utilizar suero fresco de los pacientes. Las muestras deben analizarse lo antes posible después de ser
tomadas.
Si es necesario almacenarlas, las muestras deben conservarse a -20°C o menos. No volver a repetir
congelamiento y descongelamiento.
Diluir cada suero de paciente 1:101 añadiendo 10 µl de suero a 1 ml de Diluyente del ensayo.
* Las muestras diluidas no se pueden conservar. Diluir el suero de cada paciente para cada ensayo.
* El Diluyente del ensayo puede formar precipitados, lo que no produce resultados inconsistentes.
■ PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
PASO 1. (INCUBACIÓN DE LA MUESTRA)
Con una micropipeta multicanal, transferir 100 µl de Calibrador 1, Calibrador 2, suero diluido del
paciente y Diluyente del ensayo en cada uno de los pocillos designados de la microplaca según el
siguiente esquema. (No diluir el Calibrador 1, Calibrador 2 ni el Diluyente del ensayo.)
Pocillo
Solución añadida
Descripción del pocillo
A
100 µl Calibrador 1
Calibrador 1 (0 U/ml)
B
100 µl Calibrador 2
Calibrador 2 (100 U/ml)
C
100 µl suero diluido
Anti-Dsg1
D
Anti-Dsg3
E
Anti-BP180
F
Anti-BP230
G
Anti colágeno tipo VII
H
100 µl Diluyente del ensayo
Control del ensayo
* La incubación se inicia al momento de dispensar con la pipeta en los pocillos. El pipeteo se debe completar
lo más rápido posible.
Cubrir los pocillos con una cubierta de microplaca e incubar por 30 minutos a temperatura ambiente
(20-30°C).
PASO 2. (LAVADO)
Aspirar o eliminar el contenido del pocillo. Llenar el pocillo con la Solución de lavado y aspirar
completamente o eliminar el contenido. Lavar cuatro veces. Golpear la placa sobre una toalla de papel
absorbente para eliminar totalmente la Solución de lavado. Si utiliza una lavadora automática, lavar
cuatro veces.
* Se recomienda que cada laboratorio confirme sus propios tiempos de lavado y otras condiciones
* La Solución de lavado debe utilizarse entre 20-30°C.
PASO 3. (INCUBACIÓN DEL CONJUGADO)
Añadir 100 µl del Reactivo conjugado a cada pocillo con una micropipeta multicanal. Cubrir los pocillos
con la cubierta e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-30°C).
29
Espaňol
7115E
* No devolver el Reactivo conjugado una vez que ha sido sacado del vial.
PASO 4. (LAVADO)
Lavar la microplaca como se describe en el PASO 2.
PASO 5. (INCUBACIÓN DEL SUBSTRATO)
Añadir 100 µl de Substrato en cada pocillo con una micropipeta multicanal.
* No devolver il Subtrato una vez que ha sido sacada del vial.
Cubrir los pocillos con la cubierta de la microplaca e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente
(20-30°C).
PASO 6. (REACCIÓN DE PARADA)
Añadir 100 µl de Solución de parada en cada pocillo con una pipeta multicanal.
■ LECTURA
Leer la absorbancia de cada pocillo a 450 nm. Si se utiliza un lector de microplacas con doble longitud de
onda, fijar la longitud de onda de las muestras a 450 nm y la de referencia a 620 nm.
* La lectura se debe realizar dentro de los 20 minutos después de detener la reacción.
* Antes de leer la placa, asegurar que el fondo de la placa esté limpio y seco y que no hay burbujas de aire en
la superficie del líquido en los pocillos.
■ CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
(A450 de la muestra del paciente para el antígeno <pocillo C, D, E, F, G> － A450 del Calibrador 1<pocillo A>)
x 100
Valor de la Unidad (U/ml) =
(A450 del Calibrador 2<pocillo B>) – (A450 del Calibrador 1<pocillo A>)
* A450 es la abreviación del valor de la absorbancia a 450 nm.
* No hay un material de referencia internacional disponible para cada anticuerpo. El ensayo se calibra en
unidades arbitrarias relativas.
■ CONTROL DE CALIDAD
Cada resultado de la prueba debe cumplir con los siguientes criterios.
＞ 0,5
＜ 0,1
＞ 0,5
A450 del Control del ensayo (pocillo H):
A450 del Calibrador 1 (pocillo A):
A450 del Calibrador 2 (pocillo B):
Si no se cumplen cualquiera de estos criterios, los resultados son inválidos y la prueba debe repetirse.
Antes de repetir la prueba, compruebe los siguientes puntos.
・ Temperatura de Incubación
・ Tiempo de Incubación
・ Lavado
INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA Y VALOR ESPERADO
Lo siguiente tiene por objeto ser una guia para la interpretación. Se recomienda que cada laboratorio
establezca su propio criterio para interpretar la prueba en base a la población de muestras en que se
encuentran normalmente.
30
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Valor (U/ml)
Interpretación
≥15
Positivo
<15
Negativo
・ El valor anterior se estableció analizando 42 sueros normales, 30 sueros de pacientes con pénfigo
vulgar (PV), 30 sueros de pacientes con pénfigo foliáceo (PF), 60 sueros de pacientes con penfigoide
ampolloso (BP) y 30 sueros de paciente con epidermólisis ampollosa adquirida (EBA).
■ LIMITACIONES
Como en otras pruebas de procedimientos diagnósticos, los resultados obtenidos conel MESACUP
anti-Skin profile TEST sirve solo como ayuda en el diagnóstico y no debe interpretarse como un
diagnostico en sí mismo.
CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO
■ ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD CLÍNICA
Grupo de
enfermedades
Número
total
Dsg1
positivo
Dsg3
positivo
BP180
positivo
BP230
positivo
Tipo VII
positivo
PV
30
26
25
1
1
0
PF
30
30
5
0
1
0
BP (activo)
30
0
0
26
29
0
BP (en remisión)
30
1
0
26
5
0
EBA
30
0
0
0
1
26
Control Normal
42
0
0
0
1
0
PV: Pénfigo vulgar
PF: Pénfigo foliáceo
BP: Penfigoide ampolloso
EBA: Epidermólisis ampollosa adquirida
■ SENSIBILIDAD
A450 del Control del ensayo (pocillo H) debe ser ＞ 0,5
A450 del Calibrador 1 (pocillo A) debe ser
＜ 0,1
A450 del Calibrador 2 (pocillo B) debe ser ＞ 0,5
■ ESPECIFICIDAD
Al analizar cada muestra positiva para cinco anticuerpos, todos deben ser positivos.
Al analizar cada muestra negativa para cinco anticuerpos, todos deben ser negativos.
■ REPRODUCIBILIDAD
Al analizar seis veces cada muestra positiva para cinco anticuerpos, todos deben resultar positivos.
Al analizar seis veces cada muestra negativa para cinco anticuerpos, todos deben resultar negativos.
31
Espaňol
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■ LÍMITES DE DETECCIÓN
Anti-Dsg1:
2,2 U/ml
Anti-Dsg3:
1,8 U/ml
Anti-BP180:
1,2 U/ml
Anti-BP230:
1,6 U/ml
Anti colágeno tipoVII:
1,2 U/ml
■ SUBSTANCIAS QUE INTERFIEREN
Hemoglobina (hasta 498 mg/dl), Bilirrubina F (hasta 18,7 mg/dl), Bilirrubina C (hasta 19,7 mg/dl), grasa
(hasta 1440 FTU) y/o factor reumatoide (hasta 450 IU/ml) no interfieren con el resultado, pero evite
utilizar muestras muy hemolizadas o muy lipémicas.
REFERENCIAS
2001
Delmatol Sci 62: 169-175, 2011
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7115E
Italiano
Italiano
USO PREVISTO
Il MESACUP anti-Skin profile TEST è un saggio immunoassorbente legato a enzima (ELISA) di tipo
qualitativo per la rilevazione di anticorpi IgG diretti contro Dsg1, Dsg3, BP180, BP230 e collagene di
Tipo VII nel siero umano. In un unico saggio si possono rilevare contemporaneamente cinque
autoanticorpi. Il MESACUP anti-Skin profile TEST è inteso per uso diagnostico in vitro, quale supporto
alla diagnosi di alcune patologie bollose autoimmuni.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE
Le patologie bollose autoimmuni sono un gruppo di disturbi cutanei caratterizzati dalla formazione di
bolle o erosioni cutanee che vengono classificate in pemfigo e pemfigoide.
Il pemfigo è una patologia bollosa autoimmune che colpisce l’epidermide e le membrane mucose. Si
suddivide in due sottotipi principali: pemfigo volgare (PV) e pemfigo foliaceo (PF). I pazienti con PV,
producono anticorpi anti-desmogleina 3 (Dsg3). Tra i pazienti affetti da PV, quelli con interessamento
prevalentemente a carico delle mucose producono solo anticorpi anti-Dsg3, quelli con PV mucocutaneo
producono sia anticorpi anti-Dsg1 che anti-Dsg3, mentre i pazienti con positività per gli anti-Dsg1 ma
negatività per gli anti-Dsg3 ricevono diagnosi di PF.(1) Tali anticorpi anti-Dsg sono costituiti da anticorpi
patogeni e non patogeni. Uno studio recente ha dimostrato che gli anti-Dsg patogeni si legano agli
antigeni Dsg maturi smascherati dalla scissione proteolitica degli antigeni Dsg immaturi.(2)
Il pemfigoide bolloso (PB) è una patologia bollosa autoimmune subepidermica (BP) caratterizzata dalla
presenza nel siero di autoanticorpi IgG contro la membrana basale. Gli autoanticorpi prelevati da pazienti
con PB sono mirati a due antigeni distinti: una proteina transmembrana di 180 kDa, chiamata BP180, e
una proteina intracellulare di 230 kDa, chiamata BP230. Studi sugli epitopi degli anticorpi anti-BP180
hanno dimostrato che il dominio non-collagenico 16a (NC16a) di BP180 è il principale epitopo
riconosciuto dalla maggioranza dei sieri di persone con PB.(3-4) Nel caso degli anticorpi anti-BP230, il loro
dominio C-terminale (BP230-C) reagisce prevalentemente al siero di pazienti con PB, tuttavia i sieri di
alcuni pazienti con PB riconoscono solo il dominio N-terminale di BP230 (BP230-N). (5-6)
L’epidermolisi bollosa acquisita (EBA) è una patologia cutanea bollosa autoimmune caratterizzata dalla
presenza di autoanticorpi IgG anti-collagene di Tipo VII. Il collagene di Tipo VII è costituito da tre catene
α identiche. Ogni catena α è composta da un dominio centrale collagenico (COL) affiancato da un
dominio amino-terminale non collagenico (NC1) di 145 kDa e da un dominio più piccolo
carbossi-terminale non collagenico (NC2) di 34 kDa. I principali epitopi antigenici degli autoanticorpi
anti-collagene di Tipo VII nei pazienti con EBA risiedono all’interno del dominio NC1. Tuttavia, un
articolo comparso di recente in letteratura ha dimostrato che il dominio NC2 è un epitopo antigenico
minore per questi autoanticorpi.(7)
In base a quanto sopra è stato stilato un elenco degli antigeni ricombinanti utilizzati in questo kit per la
determinazione del profilo dei pazienti, come riportato nella tabella seguente.
Autoanticorpi specifici anti-antigeni epidermici
Antigeni ricombinanti utilizzati
Anti-Dsg1
Dsg1
Anti-Dsg3
Dsg3
Anti-BP180
BP180 NC16a
Anti-BP230
BP230-C e BP230-N
Anti-collagene di Tipo VII
NC1 e NC2
33
7115E
Italiano
PRINCIPIO
Il MESACUP anti-Skin profile TEST è un test ELISA in grado di rilevare nel siero dei pazienti cinque
anticorpi specifici anti-antigeni epidermici (anti-Dsg1, anti-Dsg3, anti-BP180, anti-BP230 e
anti-collagene di Tipo VII) contemporaneamente. Micropozzetti (8 pozzetti) vengono rivestiti
separatamente con 5 diversi antigeni ricombinanti. Gli anticorpi specifici nel siero diluito si legheranno al
pozzetto rivestito con l’antigene (incubazione del Campione). I pozzetti vengono poi lavati per rimuovere
gli anticorpi che non si sono legati e gli altri composti. Quindi si aggiunge un coniugato costituito da
anticorpi IgG anti-uomo legati a perossidasi di rafano e si incuba (incubazione del Coniugato). Dopo un
altro lavaggio, si aggiunge il substrato della perossidasi e si incuba per un altro intervallo di tempo
(incubazione del Substrato). Infine, a ogni pozzetto si aggiunge una soluzione acida per terminare la
reazione enzimatica e stabilizzare lo sviluppo del colore. Il risultato del test si stabilisce fotometricamente
misurando l’assorbanza e riportando i risultati in grafico.
PROCEDURA DEL TEST IN BREVE
<Incubazione del Campione> Aggiungere 100 µL del campione diluito (1:101) ai pozzetti designati della
(20-30°C) 30 min.
piastra per microtitolo secondo lo schema previsto
↓
Lavare
↓
< Incubazione del Coniugato> Aggiungere a ogni pozzetto 100 µL del Coniugato
(20-30°C) 30 min.
↓
Lavare
↓
< Incubazione del Substrato> Aggiungere a ogni pozzetto 100 µL di Substrato
(20-30°C) 15 min.
↓
Aggiungere a ogni pozzetto 100 µL di Soluzione bloccante
↓
Leggere l’assorbanza
↓
Interpretare il risultato
REAGENTI E CONSERVAZIONE
1) Strip di micropozzetti rivestiti con l’antigene
Strip di micropozzetti per piastre da 96 pozzetti (12 x 8 pozzetti) rivestiti con 5 singoli antigeni
ricombinanti. Gli strip sono confezionati in un supporto per strip e sigillati all’interno di una busta di
alluminio contenente una sostanza essiccante.
2) Calibratore 1 (0 U/mL)
Un flaconcino con 1,5 mL di Diluente del test contenente azoturo di sodio allo 0,09%. Il diluente è
34
7115E
Italiano
pronto per l’uso e non necessita ulteriore diluizione.
3) Calibratore 2 (100 U/mL)
Un flaconcino con 1,5 mL di siero umano positivo per autoanticorpi in Diluente del test contenente
azoturo di sodio allo 0,09%. La soluzione è pronta per l’uso e non necessita ulteriore diluizione.
4) Coniugato
Un flacone contenente 15 mL di anticorpi IgG di capra anti-uomo legati a perossidasi di rafano. La
soluzione è pronta per l’uso e non necessita ulteriore diluizione.
5) Diluente del test
Un flacone con 50 mL di tampone Tris contenente azoturo di sodio allo 0,09%. Il tampone è pronto per
l’uso e non necessita ulteriore diluizione.
6) Soluzione di lavaggio concentrata (20X)
Un flacone contenente 50 mL di PBS concentrato e Tween 20 (20X).
7) Substrato
Un flacone contenente 20 mL di diidrocloruro di 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina / perossido di idrogeno
(TMB / H2O2). Il substrato è pronto per l’uso e non necessita ulteriore diluizione.
8) Soluzione bloccante
Un flacone contenente 20 mL di acido solforico 0,25 mol/L. La soluzione è pronta per l’uso e non
necessita ulteriore diluizione.
I componenti del kit non aperti e aperti per la prima volta sono stabili fino alla data di scadenza se conservati
a 2-8°C.
PRECAUZIONI
(1) Questo prodotto è solo per uso diagnostico in vitro.
(2) Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza indicata.
(3) Evitare il contatto dei reagenti con occhi, cute e abiti. Se i reagenti entrano in contatto con la cute,
lavare immediatamente con abbondante acqua. Il TMB è un agente irritante e la Soluzione bloccante
contiene acido solforico 0,25 mol/L, che è un veleno ed è corrosivo.
(4) Il Calibratore 2 è derivato da siero umano in cui non sono stati identificati antigeni dell’epatite B o
anticorpi anti-HCV, HIV-1 e HIV-2. Tuttavia nessun metodo di analisi può garantire l’assenza di questi
o di altri agenti infettivi. Pertanto, questi reagenti e tutti i campioni dei pazienti devono essere
manipolati come potenzialmente in grado di trasmettere patologie come AIDS, epatite o qualsiasi altra
malattia infettiva.
(5) Il Calibratore 1, il Calibratore 2 e il Diluente del test contengono azoturo di sodio (0,09%) come
conservante e quindi devono essere maneggiati con cautela. Non ingerire o entrare in contatto con cute
o membrane mucose. L’azoturo di sodio può reagire con il rame o il piombo presenti nelle condutture
di scarico formando azoturi di metalli esplosivi. Quando si smaltiscono materiali contenenti azoturo di
sodio in una conduttura di scarico è quindi necessario far fluire abbondante acqua.
(6) Il Calibratore 1, il Calibratore 2, il Coniugato e il Diluente del test contengono materiali di origine
animale, prelevati da animali non infetti. Tuttavia devono essere considerati come potenziali portatori
35
7115E
Italiano
di rischio biologico, sia durante il loro utilizzo sia durante il loro smaltimento.
(7) Non miscelare reagenti di kit diversi.
(8) Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente (20-30°C) prima di iniziare l’analisi.
(9) Non esporre il kit alla luce diretta del sole, né durante l’esecuzione del test né durante la conservazione.
(10) Evitare la contaminazione batterica e la contaminazione incrociata dei reagenti o dei campioni.
(11) Temperature di incubazione superiori o inferiori alla normale temperatura ambiente (20-30°C), tempi di
incubazione più brevi o più lunghi e diluizioni inaccurate possono fornire risultati non attendibili.
(12) I pozzetti devono essere appropriatamente risciacquati con la Soluzione di lavaggio per evitare risultati
falsi positivi.
(13) Pipettare con attenzione ogni campione e reagente per evitare la contaminazione incrociata tra i
micropozzetti ed evitare la formazione di schiuma.
(14) Tutti gli Strip di micropozzetti non utilizzati vanno riposti nella busta di alluminio, che va
accuratamente richiusa con l’apposito sistema a zip per evitare l’assorbimento di umidità.
(15) Il Soluzione di lavaggio concentrata può diventare torbido a 2-8°C, ciò non compromette i risultati del
test.
(16) I materiali utilizzati per il test vanno smaltiti e trattati come indicato di seguito.
Immergere in una soluzione di glutaraldeide alla concentrazione finale del 2% per più di 1 ora,
immergere in una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,1% (cloro disponibile: circa 1.000 ppm) per più
di 1 ora o autoclavare a 121°C per più di 20 minuti.
(17) I valori di anticorpi ottenuti da questa analisi servono esclusivamente quale supporto alla formulazione
della diagnosi. Ogni medico deve interpretare tali risultati alla luce dell’anamnesi del paziente, dei
reperti all’esame obiettivo e di altre procedure diagnostiche.
(18) In caso di danno alla confezione protettiva, i componenti del kit devono essere trattati o smaltiti in
conformità con le istruzioni e le normative in merito vigenti in ogni paese.
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
Lettore per micropiastre (lunghezza d’onda: 450 nm, 620 nm/riferimento)
Micropipetta multicanale (per es. 100 µL - 300 µL)
Pipetta monocanale (per es. 10 µL & 100 µL)
Sistema di autolavaggio o bottiglia di lavaggio
Acqua deionizzata o distillata
Cilindro graduato da 1 litro per la preparazione della soluzione di Lavaggio
Provette d’analisi per le diluizioni dei campioni dei pazienti (per es. 1.000 µL)
Puntali per pipette monouso
Carta assorbente
Coperchio per micropiastre
PROCEDURA

PREPARAZIONE DEI REAGENTI
1. Prima dell’uso, portare tutti i materiali necessari per l’analisi a temperatura ambiente (20-30°C).
2. Strips di micropozzetti: usare uno strip per ogni siero dei pazienti. Rimuovere dall’astuccio gli Strip
di micropozzetti necessari e sistemarli sul supporto. Riporre subito gli strip inutilizzati nel comparto
36
7115E
Italiano
frigorifero.
3. Soluzione di lavaggio: preparare una diluizione 1:20 del Soluzione di lavaggio concentrata prima
dell’uso (per es. aggiungere 50 mL di Soluzione di lavaggio concentrata a 950 mL di acqua
distillata). La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 2 settimane a 2-8°C.
4. Non diluire: Calibratore 1, Calibratore 2, Coniugato, Diluente del test, Substrato e Soluzione
bloccante. Questi reagenti sono pronti per l’uso.

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
1. Usare siero appena prelevato dai pazienti. Dopo il prelievo, i campioni vanno analizzati il prima
possibile.
Se vanno analizzati in un secondo momento, i campioni vanno conservati a una temperatura uguale
o inferiore a -20°C. Non ripetere cicli di congelamento-scongelamento.
2. Diluire 1:101 ogni siero dei pazienti aggiungendo 10 µL di siero a 1 mL di Diluente del test.
* I campioni diluiti non possono essere conservati. Diluire solo il siero di ogni paziente necessario per
ciascuna analisi.
* Il Diluente del test può formare precipitati, ciò non compromette i risultati.

PROCEDURA DI ANALISI
FASE 1. (INCUBAZIONE DEI CAMPIONI)
Con una micropipetta multicanale, trasferire 100 µL ognuno di Calibratore 1, Calibratore 2, siero diluito
del paziente e Diluente del test nei rispettivi pozzetti della piastra per microtitolo, seguendo lo schema
sotto indicato. (Non diluire: Calibratore 1, Calibratore 2 e Diluente del test.)
Pozz.
Soluzione aggiunta
Descrizione del pozzetto
A
100 µL di Calibratore 1
Calibratore 1 (0 U/mL)
B
100 µL di Calibratore 2
Calibratore 2 (100 U/mL)
C
100 µL di siero diluito
Anti-Dsg1
D
Anti-Dsg3
E
Anti-BP180
F
Anti-BP230
G
Anti-collagene di TipoVII
H
100 µL di dil. di analisi
Controllo di analisi
* L’incubazione inizia nel momento in cui si pipetta nei micropozzetti, quindi tale operazione va completata il
più rapidamente possibile.
Coprire i pozzetti con un coperchio per micropiastre e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente
(20-30°C).
FASE 2. (LAVAGGIO)
Aspirare o scartare il contenuto dei pozzetti. Riempire i pozzetti con la Soluzione di lavaggio, quindi
aspirare o scartare tutto il contenuto. Lavare 4 volte. Picchiettare la piastra su carta assorbente per
rimuovere l’eventuale Soluzione di lavaggio rimasta. Quando si usa un sistema di autolavaggio, lavare 4
volte.
* Si raccomanda che ogni laboratorio confermi i propri tempi di lavaggio e le altre condizioni.
* La Soluzione di lavaggio deve essere a 20-30°C.
37
7115E
Italiano
FASE 3. (INCUBAZIONE DEL CONIUGATO)
Con una micropipetta multicanale, aggiungere a ogni pozzetto 100 µL del Coniugato. Coprire i pozzetti
con il coperchio per micropiastre e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (20-30°C).
* Non rimettere nel flaconcino l’eventuale rimanenza del Coniugato già prelevato.
FASE 4. (LAVAGGIO)
Lavare la micropiastra come indicato nella FASE 2.
FASE 5. (INCUBAZIONE DEL SUBSTRATO)
Con una micropipetta multicanale, aggiungere a ogni pozzetto 100 µL di Substrato.
* Non rimettere nel flaconcino l’eventuale rimanenza di Substrato già prelevato.
Coprire i pozzetti con il coperchio per micropiastre e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente
(20-30°C).
FASE 6. (REAZIONE DI BLOCCO)
Con una micropipetta multicanale, aggiungere a ogni pozzetto 100 µL di Soluzione bloccante.

LETTURA
Leggere l’assorbanza dei pozzetti a 450 nm. Se si usa un lettore di piastre a duplice lunghezza d’onda,
impostare la lunghezza d’onda del test a 450 nm e quella di riferimento a 620 nm.
* La lettura va eseguita entro 20 minuti dal blocco della reazione.
* Prima di leggere la piastra, controllare che la sua parte inferiore sua pulita e asciutta e che non ci siano bolle
d’aria sulla superficie del liquido nei pozzetti.

CALCOLO DEI RISULTATI
(A450 campione paziente per l’antigene <pozz. C, D, E, F, G> － A450 Calibratore 1 <pozz. A>)
x 100
Valore unità (U/mL)=
(A450 Calibratore 2< pozz. B>) - A450 del Calibratore 1< pozz. A>)
* A450 è l’abbreviazione del valore dell’assorbanza a 450 nm.
* Non è disponibile materiale di riferimento internazionale per ogni anticorpo. L’analisi è calibrata in unità
arbitrarie relative.

CONTROLLO DI QUALITÀ
Ogni risultato dell’analisi deve soddisfare i seguenti criteri.
A450 del Controllo del test (pozzetto H):
A450 del Calibratore 1 (pozzetto A):
A450 del Calibratore 2 (pozzetto B):
＞ 0,5
＜ 0,1
＞ 0,5
Se uno qualsiasi di questi criteri non risulta soddisfatto, il risultati non sono da considerarsi validi e il test
va ripetuto.
Prima di ripetere il test, controllare i seguenti parametri.
・ Temperatura di Incubazione
・ Tempo di Incubazione
・ Lavaggio
38
7115E
Italiano
INTERPRETAZIONE DEL TEST E VALORI ATTESI
Quanto segue ha l’unico intento di fornire una guida per l’interpretazione. Si raccomanda a ogni
laboratorio di stabilire i propri criteri per l’interpretazione del test in base alle popolazioni campione
tipicamente riscontrate.
Valore (U/mL)
Interpretazione
≥15
Positivo
<15
Negativo
・ Il valore indicato è stato stabilito analizzando 42 sieri di pazienti sani, 30 sieri di pazienti affetti da
pemfigo volgare (PV), 30 sieri di pazienti affetti da pemfigo foliaceo (PF), 60 sieri di pazienti affetti da
pemfigoide bolloso (PB) e 30 sieri di pazienti affetti da epidermolisi bollosa acquisita (EBA).

LIMITI
Come per tutte le procedure dei test diagnostici, i risultati ottenuti con MESACUP anti-Skin profile TEST
servono solo come supporto alla formulazione della diagnosi e non vanno considerati diagnostici di per
sé.
CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI

SPECIFICITÀ E SENSIBILITÀ CLINICHE
PV
Numero
totale
30
Dsg1
positivo
26
Dsg3
positivo
25
BP180
positivo
1
BP230
positivo
1
Tipo VII
positivo
0
PF
30
30
5
0
1
0
PB (attivo)
30
0
0
26
29
0
PB (remissione)
30
1
0
26
5
0
EBA
30
0
0
0
1
26
Controllo normale
42
0
0
0
1
0
Gruppi di malattie
PV: Pemfigo volgare
PF: Pemfigo foliaceo
PB: Pemfigoide bolloso
EBA: Epidermolisi bollosa acquisita

SENSIBILITÀ
La A450 del Controllo del test (pozzetto H) deve essere ＞ 0,5

La A450 del Calibratore 1 (pozzetto A) deve essere
＜ 0,1
La A450 del Calibratore 2 (pozzetto B) deve essere
＞ 0,5
SPECIFICITÀ
Quando si analizza ogni campione positivo per i 5 anticorpi, tutti devono risultare positivi.
Quando si analizza ogni campione negativo per i 5 anticorpi, tutti devono risultare negativi.
39
7115E

Italiano
RIPRODUCIBILITÀ
Quando si analizza per 6 volte ogni campione positivo per i 5 anticorpi, tutti i parametri devono risultare
positivi.
Quando si analizza per 6 volte ogni campione negativo per i 5 anticorpi, tutti i parametri devono risultare
negativi.

LIMITI DI RILEVAZIONE
Anti-Dsg1:
2,2 U/mL
Anti-Dsg3:
1,8 U/mL
Anti-BP180:
1,2 U/mL
Anti-BP230:
1,6 U/mL
Anti-collagene tipo VII: 1,2 U/mL

SOSTANZE INTERFERENTI
L’emoglobina (fino a 498 mg/dL), la bilirubina F (fino a 18,7 mg/dL), la bilirubina C (fino a 19,7 mg/dL),
il chilo (fino a 1440 FTU) e/o il fattore reumatoide (fino a 450 UI/mL) non interferiscono con il risultato,
tuttavia si raccomanda di evitare campioni altamente emolizzati o lipemici.
BIBLIOGRAFIA
2001
Delmatol Sci 62: 169-175, 2011
40
**The following symbols are used on the label.
**Les symboles suivants ont été utilisés sur l’étiquette.
**Die folgenden Symbole finden Sie auf dem Etikett.
**En las etiquetas se usan los siguientes símbolos
**I seguenti simboli sono usati sulle etichette.
**Os simbolos seguintes são usados no rótulo.
**Τα κάτωθι σύμβολα χρησιμοποιούνται στην ετικέτα
For in vitro diagnostic use
Dispositif médical de diagnostic in vitro
Für in-vitro Diagnostik
Para uso diagnóstico in vitro
Per uso diagnostico in vitro
Para diagnóstico in vitro
Για in vitro διαγνωστική χρήση
Catalogue number
Référence du catalogue
Artikelnummer
Número de catálogo
Numero di catalogo
Número de catálogo
Αριθμός Καταλόγου
Lot
Code du lot
Charge
Lote
Lotto
Lote
Παρτίδα
96 tests
Contenu suffisant pour 96 tests
96 Bestimmungen
96 test
96 tests
96 testes
96 εξετάσεις
See instructions for use
Consulter les instructions d’utilisation
Siehe Packungsbeilage
Ver instrucciones de uso
Vedi Istruzioni per l’uso
Ver instruções de utilização
Δείτε τις οδηγίες χρήσης
Use by
Utiliser jusque
Haltbarkeit
Temperatura de uso
Uso da
Utilizar até
Να χρησιμοποιηθεί έως
41
Store at 2 – 8°C
Limites de température : 2 à 8°C
Lagerung bei 2 – 8ºC
Conservar a 2 – 8°C
Conservare a 2 – 8°C
Armazenar a 2 – 8ºC
Φύλαξη στους 2-8ºC
Manufactured by
Fabricant
Hersteller
Fabricado por
Prodotto da
Produzido por
Παρασκευάστηκε από
Authorized Representative
Mandataire dans la Communauté européenne
Bevollmächtigter
Representane Autorizado
Rappresentante Autorizzato
Representante Autorizado
Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος
<ELISA Components>
Microwell strips
Micro plaque
Mikrotiterstreifen
Tiras de pocillos
Strips di micropozzetti
Microplacas
Ταινίες βυθισμάτων
Calibrator 1
Calibrateur 1
Kalibrator 1
Calibrador 1
Calibratore 1
Calibrador 1
Αντιδραστήριο βαθμονόμησης 1
Calibrator 2
Calibrateur 2
Kalibrator 2
Calibrador 2
Calibratore 2
Calibrador 2
Αντιδραστήριο βαθμονόμησης 2
Positive control
Contrôle positif
Positivkontrolle
Control positivo
Controllo positivo
Controlo positivo
Θετικό πρότυπο ελέγχου
42
Negative control
Contrôle négatif
Negativkontrolle
Control negativo
Controllo negativo
Controlo negativo
Αρνητικό πρότυπο ελέγχου
Standard Sera
Sérum Calibrateur 1
Standardserum
Suero Patrón
Sieri standard
Soro Padrão
Πρότυποι Οροί Καμπύλης
Conjugate reagent
Conjugué (prêt à l’emploi)
Konjugatreagenz
Reactivo conjugado
Coniugato
Reagente conjugado
Αντιδραστήριο συζεύγματος
Conjugate Reagent (101x)
Conjugué (101x)
Konjugatreagenz (101x)
Reactivo Conjugado (101x)
Coniugato (101x)
Reagente Conjugado (101x)
Αντιδραστήριο Συζεύγματος 101x
Conjugate Diluent
Diluant conjugué
Konjugatdiluent
Diluyente del conjugado
Diluente del Coniugato
Diluente do Conjugado
Διαλύτης Αντιδραστηρίου Συζεύγματος
Assay diluent
Diluant sérum
Probendiluent
Diluyente de ensayo
Diluente del test
Diluente
Διαλύτης ανάλυσης
Wash concentrate (10x)
Solution de lavage (10x)
Waschkonzentrat (10x)
Solución de lavado concentrada (10x)
Soluzione di lavaggio concentrata (10x)
Solução de lavagem concentrada (10x)
Συμπυκνωμένο πλυστικό 10 x
Substrate
Substrat
Substrat
Substrato
Substrato
Substrato
Υπόστρωμα
43
Substrate A
Substrat A
Substrat A
Substrato A
Substrato A
Substrato A
Υπόστρωμα Α
Substrate B
Substrat B
Substrat B
Substrato B
Substrato B
Substrato B
Υπόστρωμα Β
Stop solution
Solution d’arrêt
Stopplösung
Solución de parada
Soluzione bloccante
Solução de paragem
Διάλυμα διακοπής αντίδρασης
44
Manufactured by:
Fabriqué par:
Hersteller:
Fabricado por:
Prodotto da:
Produzido por:
Παρασκευάστηκε από:
MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.
KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F
4-5-3 Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi, 460-0008 JAPAN
Tel: +81 52-238-1901
Fax: +81 52-238-1440
Authorized Representative in the EU:
Mandataire dans la Communauté européenne:
Bevollmächtigter in der EU:
Representante autorizado en EU:
Rappresentante Autorizzato per l’Unione Europea:
Representante Autorizado na UE:
Εξουσιοδοτημένος Αντιπρόσωπος στην ΕΕ:
QARAD b.v.b.a.
Cipalstraat 3, B-2440 Geel, BELGIUM
Rev. December 12, 2013
12/12/2013
No. 7115E-0
Printing date: 12/17/2013
45

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