Cours transcription CBPS

L’Expression génique, la transcription et sa régulation :
Approches expérimentales.
I - Généralités
I - 1 : Expression et niveaux de régulations d’un gène eucaryote
Structure de la
chromatine
ADN
Transcription
Fréquence de
transcription
Transcrit primaire
Maturation
ARN messager
Exportation de l’ARNm
ARN messager
Stabilité cytoplasmique de l’ARN
Noyau
Cytoplasme
Efficacité de la traduction
Protéine
Maturation
I - 2 : Structure générale d'un gène transcrit
A la différence des ADN polymérases dépendantes d’une
tsp
+1
matrice, les ARN polymérases n’ont pas besoin d’amorce
pour initier une polymérisation mais d’une séquence d’ADN
double brin particulière, le promoteur. Le promoteur est situé
en amont de l’unité de transcription qui est délimitée par le
t
5’
3’
3’
5’
<0
promoteur
>0
unité de transcription
5’
ARN prem
3’
site d’initiation de la transcription (tsp pour transcription start
point, numéroté +1) et le terminateur (t). Par convention on utilise une numérotation négative en amont du
tsp et positive en aval. D’autre part, on parle de brin sens pour spécifier le brin d’ADN dont la séquence est
identique à celle de l’ARN pré-messager. Inversement, le brin antisens ou brin matrice (car c’est celui qui est
copié lors de la transcription) correspondrait à un ARN prémessager antisens.
Chez les procaryotes, les ARN sont majoritairement polycistroniques (opérons), chez les eucaryotes,
monocistroniques mais on remarque dans la plupart des cas la présence d’introns, ce qui peut mener à la
synthèse de plusieurs protéines différentes grâce au mécanisme d’épissage alternatif.
1
I - 3 : Rôle du promoteur
Le rôle du promoteur est double. Il permet d’une part de positionner tous les éléments protéiques nucléaires
nécessaires à l'initiation de la transcription. D’autre part, le promoteur, du fait de sa structure asymétrique
permet d’orienter le sens de la transcription.
Le schéma en arbre de Noël ou écouvillons permet de visualiser
5’
3’
5’
5’
3’
3’
pol
le nombre d’ARN polymérases en cours de transcription
5’
à l’intérieur d’une même unité de transcription.
Les chaînes naissantes d’ARN sont d’autant plus nombreuses
transcription + faible
que l’initiation aura été efficace (dépend du promoteur).
I - 4 : Structure schématique d'un promoteur phage/procaryote/eucaryote.
Promoteur T7 : TAATACGACTCACTAT
Promoteur E. coli : -35TTGACA … -10TATAAT
Promoteur Eucaryote :
I - 5 : Les ARN polymérases :
ARN polymérase T7 :
- 1 seule chaine polypeptidique
- Taille : 99KDa
- Vitesse de synthèse : environ 200 nt/sec à 37°C
ARN polymérase E. Coli :
- 5 sous unités : deux α, une ß, une ß ', ω plus le facteur σ - uniquement pour l’initiation de la transcription.
- Taille : 447KDa (sans le facteur σ)
- Vitesse de synthèse : environ 50 nt/sec à 37°C
ARN polymérase Eucaryote :
- 3 ARN polymérases différentes :
ARN polymérase I : permet de transcrire les ARN ribosomiques (sauf le 5S)
ARN polymérase II : permet de transcrire les ARN messagers
ARN polymérase III : permet de transcrire les petits ARN comme les ARNt et l’ARNr 5S.
- 10 à 12 sous unités
- Taille : >500KDa
- Vitesse de synthèse : environ 20 à 30 nt/sec à 37°C
2
II - Comment savoir si l’expression d’un gène est régulée ?
Si l’expression d’un gène x est régulée, la protéine correspondante X est présente dans les cellules en
quantités variables. Cette régulation peut dépendre du type cellulaire, de stimuli extérieurs, du cycle
cellulaire, …
Afin d’étudier si l’expression d’un gène x est régulé, il faudra donc analyser la présence éventuelle de la
protéine X dans différentes cellules. Pour cela, le plus simple est d’utiliser un anticorps.
On peut alors réaliser :
•
des western blot (ou un ELISA), de l’immunocytochimie
•
des puces à cellules ou à tissus (cell array ou tissue array), révélation par respectivement
immunocytochimie ou immunohistologie
•
de l’immunodétection in situ (embryon de souris par exemple), …
III - Comment savoir quel est le niveau de régulation de l’expression d’un gène
La régulation peut être :
Structure de la
chromatine
ADN
• transcriptionnelle
Transcription
(initiation ou élongation)
Fréquence de
transcription
Transcrit primaire
• post-transcriptionnelle
Maturation
(épissage, export, stabilité de l’ARN)
• traductionnelle
Noyau
• post-traductionnelle
Cytoplasme
ARN messager
Exportation de l’ARNm
ARN messager
Stabilité cytoplasmique de l’ARN
Efficacité de la traduction
Protéine
Maturation
Pour trancher entre ces diverses hypothèses :
1.
Faire un WB (par exemple) -> niveau d’expression variable de la protéine
2.
regarder si la différence de quantité de protéine X est due à une modification de la quantité
d’ARNm X
3.
si oui, regarder quelle étape de la transcription est concernée (initiation, élongation, maturation,
stabilité, export…).
Mq
C
UV
Mq
C
UV
10Kb
Protéine X
70kDa
Protéine X
5Kb
actine
actine
40kDa
2Kb
1Kb
Western Blot
Northern Blot
Mq : marqueurs de taille (protéine ou ARN suivant le gel)
C : cellules non traitées
UV : cellules traitées aux UV
Western blot :
Ac anti protéine X fabriqué chez le lapin, Ac IIaire anti lapin couplé Cy3
Ac anti actine fabriqué chez la souris, Ac IIaire anti souris couplé Cy5
3
Western blot : Après avoir préparé un extrait protéique, on fait migrer ces protéines sur un gel SDS-PAGE,
on transfère sur filtre (nitrocellulose ou nylon), puis on révèle à l’aide d’un anticorps dirigé contre la protéine
d’intérêt.
Avantage : on a accès à la taille de la protéine, on peut donc avoir, en plus des renseignements au niveau
quantitatif, des renseignements au niveau qualitatif.
Inconvénient : peu sensible.
ELISA : Il existe différents types d’ELISA. Seul
l’ELISA « sandwich » sera présenté ici. Après
avoir préparé un extrait protéique, on dépose ces
protéines au fond d’un puit au fond duquel on a
préalablement fixé des anticorps dirigés contre
la protéine d’intérêt. Après lavage, on ajoute un
anticorps, toujours dirigé contre la protéine
d’intérêt mais qui doit être différent du premier.
La présence de deuxième anticorps sera alors
révélée.
Avantage : on peut tester de très grands nombres
d’échantillons, la technique est un peu plus
sensible (et rapide) que le WB.
Inconvénient : aucun renseignement qualitatif.
Immunocytochimie : Cette technique est pratiquée sur des cellules vivantes (ou éventuellement sur des tissus
– on parle alors d’immunohistochimie). Elle consiste à détecter la présence de la protéine d’intérêt (toujours
à l’aide d’un anticorps) dans son contexte naturel. Si la protéine est à l’intérieur de la cellule (et non à la
surface comme dans l’exemple ci-dessous), il faudra au préalable à l’incubation avec l’anticorps fixer les
cellules puis les perméabiliser. Une fois l’anticorps fixé sur son antigène, il sera révélé par une des
techniques classiques.
Avantage : permet de vérifier
la localisation de la protéine
d’intérêt dans la cellule.
Inconvénient : peu sensible,
pas de données qualitatives
sur la protéine.
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IV - Analyse de la quantité d’ARNm dans les cellules
Les différentes techniques décrites dans ce paragraphe permettent d’estimer le taux d’expression d’un gène
par mesure de la quantité d’ARN cytoplasmique. Les ARNm représentent de 1 à 5% des ARN totaux et
peuvent être répartis en trois classes selon leur abondance cellulaire :
Forte abondance
< 10 gènes
10 000 à 20 000 copies/cellule
>1% des ARN totaux
Abondance moyenne
500 gènes
~200 à 400 copies/cellule
0.1%
Abondance faible
>10 000 gènes
<20 copies/cellule
0.004%
Les messagers de faible abondance représentent la plus grosse partie des gènes exprimés malgré leur faible
taux d’accumulation cytoplasmique. Leur étude a donc nécessité l’utilisation de techniques de plus en plus
sensibles ainsi que la mise au point de méthodes de quantification. L’évolution des techniques disponibles
ainsi que des protocoles expérimentaux a donc cherché à répondre à ces deux contraintes.
Northern Blot
1953
RT-PCR
1980
Protection RNAse
PCR Temps Réel
1993
1986
RT-PCR Compétitive
2000
Puces à ADN
IV – 1 : Northern blot
Si on réalise un Northern blot sur deux types cellulaires (Cell 1 et Cell 2) d'un même organisme avec comme
sonde un ADNc correspondant à un gène A et que l’on obtient après révélation deux signaux d’intensités
différentes (voir figure ci-dessous – signal obtenu avec les ARN Cell1 2 à 3 fois plus intense que le signal
obtenu avec les ARN Cell2), ce résultat doit être interprété de la manière suivante : chacune de ces cellules
contient l'ARNm cytoplasmique correspondant au gène A, mais la cellule 1 en contient 2 à 3 fois plus que la
cellule 2. Cette expérience peut être utilisée pour quantifier de manière approximative et relative ce taux
d’expression.
Attention, pour que ce résultat soit interprétable, il faut normaliser avec une sonde hybridant un ARN dont
l’expression est constitutive (ARNm actine par exemple).
On peut alternativement réaliser un Dot Blot qui consiste à déposer directement sur une membrane une
préparation d’ARN totaux ou d’ARNm. Dans cette expérience, le critère de taille est perdu.
5
Dans ces deux expériences on peut évaluer approximativement par densitométrie la quantité des messagers
détectés en se rapportant au signal obtenu pour l’ARNm choisi pour la normalisation (actine par exemple).
Exemple de northern
Exemple de Dot Blot
Cell1 Cell2
Cell1 Cell2
Cell1 Cell2
Cell1 Cell2
ARNmA
ARNmA
ARNm actine
IV – 2 : Protection à la RNAse
Cette technique, plus sensible que le Northern blot, est plus lourde à mettre en œuvre mais permet de
détecter des niveaux d’expression plus faibles.
Le principe consiste à synthétiser (par transcription in vitro) un ARN anti-sens d’une partie de l’ARNm que
l’on veut étudier (ARNmX). Cet ARN anti-sens est marqué au
32
P (et donc radioactif) et présente une
extension en 3’ non présente sur l’ARNm correspondant. Il servira ainsi de sonde – voir schéma ci-dessous.
Cette sonde est hybridée avec des ARN totaux. Les complexes formés sont traités avec un mélange de
RNAse A (coupe après les pyrimidines) et de RNAse T1 (hydrolyse après G). Seul le double brin résiste à
cette dégradation. Les produits de la digestion sont analysés sur gel d’acrylamide dénaturant et leur présence
dans le gel est révélée par autoradiographie.
ARNm actine
ARNm X
Sonde A (250 nt)
Sonde X (150 nt)
RNase A
RNase A
(120 nt)
Mq
1
(100 nt)
2
3
500nt
300nt
150nt
75nt
4
5
6
7
8
Mq : Marqueurs de taille radioactifs
1 - Sonde A
2 - Sonde X
3 - ARNm cellules témoins + sonde A + RNase
4 - ARNm cellules témoins + sonde X + RNase
5 - ARNm cellules traitées UV + sonde A + RNase
6 - ARNm cellules traitées UV + sonde X + RNase
7 - Sonde A + RNase
8 - Sonde X + RNase
De ce résultat, on peut déduire :
• Que cette expérience a bien fonctionné (on ne voit pas du tout de sonde non dégradée)
• Que la normalisation était bonne (même quantité de radioactivité dans les deux essais actine
• Que l’ARN X est moins abondant dans les cellules témoins que dans les cellules traitées.
6
IV – 3 : RT-PCR
Plus sensible que les autres techniques la RT-PCR permet de détecter facilement même de faible taux
d’ARN. La reverse transcription est généralement réalisée à partir d’un oligodT. La PCR est ensuite réalisée
avec des amorces spécifiques permettant d’obtenir un fragment amplifié d’une taille généralement comprise
en 200 et 500pb environ.
Quantité d’ADN < au seuil de détection
Quantité
d’ADN
Les amorces ont été toutes utilisées
Seuil de détection
Nombre de cycles
IV – 3 a : RT-PCR semi-quantitative
Il s’agit ici de réaliser une PCR classique, mais où le nombre de cycle réalisé ne sera pas trop important.
En effet, si on regarde l’exemple ci-dessous, en prenant un nombre de cycle habituel (40 par exemple,
représenté par la flèche noire), tous les ADN auront été amplifiés de la même façon – la quantité est limitée
par la quantité d’amorce et non de matrice.
Par contre, si on arrête la PCR quelques cycles avant, on observera une quantité d’ADN amplifiée
proportionnelle à la quantité de matrice utilisée.
La révélation se fera par coloration au Bromure d’Ethydium ou tout autre colorant de l’ADN après
Cell traitées, oligos actine
Cellules contrôles, oligos actine
Cellules trait ées, oligos actine
Cellules contrôles, oligos X
Cellules trait ées, oligos X
Cell contrôles, oligos actine
Quantité
d’ADN
Cell contrôles, oligos X
Nombre de cycles d’amplification choisi pour faire la PCR
Cell traitées, oligos X
séparation par électrophorèse sur gel d’Agarose.
Seuil de détection
Nombre de cycles
Cette technique est ni précise ni sensible. Elle nécessite donc d’une part d’avoir des quantités très différentes
de matrice et d’autre part une mise au point importante et laborieuse pour déterminer le nombre de cycles à
réaliser.
IV – 3 b : RT-PCR temps réel ou Q-PCR (Q : Quantitative)
Le principe de cette PCR consiste à détecter et quantifier un rapporteur fluorescent dont l’émission est
directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés durant la réaction de PCR, et donc à la
quantité initiale de matrice. Il s’agit ici d’une méthode quantitative qui permet d’atteindre une valeur absolue
ou relative, et non plus approximative, de la quantité initiale de matrice.
7
Pour que cette quantification puisse avoir lieu les mesures vont être réalisées à chaque cycle de la PCR, d’où
le terme « temps réel », en tout début de phase exponentielle.
L’apparition du produit d’amplification est mesurée par l’intermédiaire d’un composé fluorescent présent
dans la PCR. On détermine un cycle seuil (Ct : Treshold cycle) qui correspond au nombre de cycles PCR
nécessaire pour que le signal mesuré dépasse le bruit de fond de l’expérience. Dans le cas de deux
échantillons X et Y, si CtX< CtY alors Qo(X)>Qo(Y) (avec Qo : quantité initiale de matrice).
Fluorescence
ligne de base
(bruit de fond)
CX CY
Nombre de cycles
La quantification est ensuite effectuée grâce à une courbe étalon établie à partir d’une PCR réalisée sur une
gamme de dilution en série d’un ADN de quantité connue.
La détection des amplicons par fluorescence repose sur deux méthodes différentes : l’utilisation d’un
intercalant ou l’hybridation de sondes spécifiques. Seule l’utilisation du SyBR green sera étudiée ici.
Utilisation d’un intercalant, le SyBR green.
Le SyBR Green est un intercalant de l’ADN. Ce composé fluorescent a une énergie d’émission 250 fois plus
forte lorsqu’il est intercalé dans de l’ADN double brin (λexc : 494nm, λem : 521nm). Sa présence dans le
milieu réactionnel ne modifie pas l’efficacité de la PCR. La mesure de la fluorescence est effectuée en fin de
phase d’élongation quand la totalité de l’ADN synthétisé est sous forme double brin.
8
Pour vérifier que la mesure de fluorescence effectuée correspond bien à la détection de l’amplicon recherché,
à la fin de la PCR une courbe de fusion est réalisée. Dans le cas d’une contamination, plusieurs pics seront
détectés. La surface des pics obtenus en représentant dF/dT en fonction de T permet d’estimer la part de la
fluorescence due à la quantité de l’amplicon recherché.
Seul l’amplicon recherché est présent
Une seconde amplification non spécifique est détectée
dF/dT
Fluorescence
T° fusion
(contaminant)
Température
T° fusion
(amplicon)
Température
IV – 4 : Puces à ADN
Les puces à ADN permettent l’analyse simultanée de l’expression d’un ensemble de gènes (plusieurs
milliers voire le transcriptome entier).
Quelle que soit la technologie utilisée pour fabriquer les puces, le principe général est le même. Les sondes
(oligonucléotides ou ADNc) sont immobilisées sur un petit support : la puce. Les acides nucléiques à étudier
sont marqués (fluorochrome ou radioactivité pour les macroarrays) puis hybridés avec la puce. Après lavage,
les régions où l'hybridation s'est produite sont repérées et quantifiées au moyen d’un système d’acquisition
d’image ce qui permet de déterminer avec quelle(s) sonde(s) le produit d'amplification s'est hybridé. Les
résultats sont ensuite analysés et validés grâce à des logiciels informatiques dédiés à cette analyse et
interprétés d’un point de vue biologique.
Les cibles (acides nucléiques à tester) sont des ADNc reverse transcrits à partir d’une population d’ARNm.
Au cours de cette reverse transcription on marque les ADNc soit avec un précurseur
32
P, soit avec un
fluorochrome. Dans le cas des microarrays, on peut directement comparer deux conditions expérimentales en
marquant les ADNc avec deux fluorochromes différents.
On distingue trois types de Bio-puces : macroarray (ou filtre à haute densité), microarray et puce à
oligonucléotides. Sur ces puces sont réparties les unités d’hybridation (« plot »). Chaque plot correspond à
une séquence d’ADN (oligonucléotides, cDNA, produit PCR) en plusieurs milliers d’exemplaires. Ces
séquences sont fixées soit par dépôt soit par synthèse in situ.
Macroarray
Microarray
Puce à oligonucléotides
Support
nylon
Verre, silicium, Or/platine
Quartz couvert de silane
Taille de la puce
12cm x 8cm
5.4cm x 0.9cm
1.28cm x 1.28cm
Marquage des cibles
Radioactif
Fluorescent
Fluorescent
9
Nature des sondes
cDNA ou PCR
cDNA ou PCR
Oligonucléotides
Fixation des sondes
Dépôt direct
Dépôt direct
Photolithographie
Nombre de spot (sondes différentes)
2400
10 000 à 12 000
300 000 à 400 000
Nombre de conditions expérimentales
1
2
1
Autoradiographie
Microscopie confocale
Microscopie confocale
pouvant être testées simultanément
Analyse
Exemple du microarray :
Détection : chaque spot
Culture cellulaire
Condition A
est excité par un laser et
Condition B
Extraction des ARN
Surexpression
dans la
condition A
on
récupère
la
fluorescence émise via un
photo-multiplicateur
RT
Cy3-dUTP
couplé à un microscope
Cy5-dUTP
confocal. On obtient en
Sur-expression dans la
condition B
superposant les images en
Même
expression dans
les 2 conditions
fausses couleurs des spots
allant du vert au rouge en
passant par le jaune (de
l'ADN
des
conditions
Dépôt des sondes
Hybridation
Détection
fixé
deux
en
quantité égale).
L’ensemble de ces méthodes permettent de voir si la quantité d’ARNm X varie d’une cellule à une
autre. Si c’est le cas, plusieurs hypothèses peuvent être posées :
Il y a régulation au niveau de l’initiation de la transcription (régulation transcriptionnelle)
Il y a régulation au niveau de l’élongation de la transcription (régulation transcriptionnelle)
Il y a régulation au niveau de la maturation, de la stabilité, de l’export de l’ARNm (régulation posttranscriptionnelles).
10
V - Analyse du taux d’initiation de transcription d’un gène
Deux techniques seront présentées ici. Ces méthodologies nécessitent la connaissance précise de la position
du point d’initiation de la transcription. Nous commencerons donc par étudier comment déterminer cette
position.
V – 1 : Détermination du site d'initiation de la transcription
Le site d’initiation de la transcription (tsp-transcription start point noté +1) correspond au premier nucléotide
situé à l'extrémité 5' de l'ARN et ne peut être déterminé qu’expérimentalement. La molécule permettant de
déterminer ce tsp est donc l'ARN et non pas le gène lui-même.
Il est nécessaire pour déterminer le tsp de disposer du gène cloné ou au moins d'un clone contenant la
jonction entre le promoteur et le 1er exon.
V – 1 a : Cartographie à la nucléase S1
Le principe de cette technique consiste à hybrider un fragment d’ADNg marqué, que l’on suppose recouvrir
le point +1, avec une population de messagers. L’ARNm correspondant au gène dont est issue la sonde, va
protéger une partie de cette sonde contre la digestion à la nucléase S1. Les résultats sont ensuite analysés sur
gel et on mesure la diminution de taille de la sonde au nucléotide près. On fait donc migrer en parallèle une
réaction de séquence selon Sanger qui sert de marqueur de taille.
11
V – 1 b : Extension d'amorce.
Dans cette expérience on choisit d’allonger la sonde plutôt que de la dégrader comme dans l’expérience
précédente. On réalise une réverse-transcription avec une amorce spécifique issue de l’ADNg. Cette amorce
correspond à une région située en aval du point +1. On mesure ensuite sur gel polyacrylamide dénaturant
l’augmentation de la taille de l’amorce par comparaison avec une réaction de séquençage selon Sanger
réalisée avec la même amorce sur l’ADNg.
Population d’ARN
Clone Génomique
dénaturation
hybridation avec l’amorce
polymérisation
R ev erse t ranscrip ti on
Réa cti on d e sé quen ce
Exemple de résultat
V – 1 c : Transcription in vitro de type run off
On utilise un clone d’ADNg linéarisé qui est transcrit en présence d’un extrait protéique nucléaire et de
CTPα32P. Les résultats sont analysés sur gel dénaturant sur lequel on détermine la taille de l’ARN obtenu et
ainsi la position du tsp.
+1
Eco RI
Eco RI
300pb
+EN
ARN : 300nt
Préparation des extraits protéiques nucléaires : on part d’une suspension cellulaire. Après avoir sédimenté les
cellules par centrifugation, on les remet en suspension dans un tampon hypotonique en présence d’une faible
quantité de détergents. La membrane plasmique va être lysée et la membrane nucléaire va rester intacte. Les
noyaux seront sédimentés par centrifugation. Après un lavage des noyaux, les protéines nucléaires seront
extraites du noyau par un choc hypertonique.
12
V – 2 : Analyse du taux d’initiation de transcription d’un gène par run-off
La technique utilisée en « IV-1-c » est utilisée ici.
Le run-off sera réalisé en présence d’extraits nucléaires de cellules traitées un non (par les UV par exemple
si on garde l’exemple du début).
On quantifiera alors la quantité d’ARN transcrit après migration sur gel.
Promoteur gèneX
Prom actine+EN cell UV
150nt
Prom X+EN cell UV
Promoteur actine
Prom X+EN cell témoin
normalisation.
Prom actine+EN cell témoin
En parallèle, un autre run off sera réalisé à partir d’un promoteur constitutif, il nous servira pour la
350nt
Cependant il est difficile de mettre en évidence une régulation transcriptionnelle par cette méthode. Cette
absence de résultat est souvent liée à la perte ou la modification de facteurs transcriptionnels lors de la
préparation des extraits nucléaires ainsi qu’à la conformation de l’ADN in vitro (pas de chromatine).
V – 3 : Analyse du taux d’initiation de transcription en système cellulaire
On se place ici dans un système cellulaire qui permet de faire les expériences dans un système proche d’un
contexte in vivo. Les cellules étant en culture et donc hors de l’organisme dont elles sont issues, on parle de
système ex vivo.
Le principe de ces expériences est de faire pénétrer dans le noyau de cellules en culture une construction
chimérique qui permet de tester l’efficacité de l’initiation de la transcription.
V – 3 a : Choix du type cellulaire
On utilise soit des lignées cellulaires (cellules immortalisées) soit des cultures primaires. Ces dernières
conservent des caractéristiques de différenciation parfois indispensables, permettant par exemple de
répondre à différents effecteurs hormonaux.
V – 3 b : Constructions
Le promoteur du gène X (ou une partie de ce dernier) est sous cloné dans un plasmide en amont d’un gène
rapporteur.
Le plasmide utilisé pour ces expériences est un vecteur d’expression eucaryote qui permet de réaliser le
clonage en système bactérien puis de pouvoir dans certains cas être sélectionné en système eucaryote.
13
Dans ce système la présence de la
séquence
polyA
block
(séquence
normalement issue d’une modification
post-trancriptionnelle) permet d’avoir un
messager
dont
la
stabilité
et
la
traductibilité est invariable.
Il est en effet indispensable qu’il n’y ait
aucune régulation post transcriptionnelle
ni traductionnelle si l’on veut avoir un
reflet direct de l’activité transcriptionnelle
du promoteur testé.
Gènes rapporteurs
Les gènes rapporteurs sont des ADNc qui codent pour des protéines qui doivent remplir deux conditions :
- être facilement détectables
- ne pas être confondues avec une protéine endogène
On utilise en général une enzyme dont on détecte l’activité après avoir lysé les cellules. Cette enzyme peut
être d’origine Procaryote (CAT : Chloramphenicol Acetyl Transferase, β Galactosidase) ou Eucaryote
(Luciférase, GFP : Green Fluorescent Protein, SAP : Secreted human Alkaline Phosphatase). L’activité est
détectée soit par chimiluminescence, fluorescence, radioactivité ou colorimétrie.
V – 3 c : Transfection
Il existe différentes techniques qui permettent de faire pénétrer de l’ADN dans une cellule eucaryote. Dans
tous les cas le but est de traverser la membrane cytoplasmique. Une fois dans le cytoplasme de la cellule,
l’ADN sera transporté dans le noyau par un mécanisme non contrôlable.
Parmi les différentes techniques utilisées on peut distinguer les approches chimiques (Co-précipitation au
phosphate de calcium, DEAE Dextran), physiques (Electroporation ou Electroperméabilisation, liposomes)
et biologiques (virus).
Le choix de l’une ou l’autre de ces techniques est essentiellement fonction de la sensibilité des cellules, de
l’efficacité de transfection recherchée et de l’objectif exact de l’expérience.
La transfection est en général effectuée de manière transitoire, c’est à dire que le plasmide reste sous forme
d'épisome dans le noyau.
V – 3 d : Utilisation de la technique :
Le promoteur du gène X est introduit dans le plasmide en amont du gène rapporteur (luciférase firefly par
exemple – luciférase de la luciole).
14
14000
Relative Luciferase Unit
12000
Ce plasmide est transfecté dans les cellules à tester. Deux
10000
lots sont réalisés. Un lot sera traité (UV dans notre
8000
6000
exemple), l’autre lot sera le contrôle. Les cellules sont
4000
ensuite lysées (entre 12 et 72 heures après transfection)
2000
et l’activité luciférase firefly est détectée par ajout de la
0
Contrôle
Traité UV
luciférine.
Pour la normalisation, on cotransfecte avec un autre plasmide portant une autre luciférase (luciférase rénilla
– luciférase de l’anémone de mer) sous la dépendance d’un promoteur constitutif. L’activité luciférase
rénilla sera testée en parallèle. Les résultats seront présentés sous la forme du rapport luciférase firefly /
luciférase rénilla.
V – 4 : Poursuite de l’étude
Si une régulation au niveau de l’initiation de la transcription est ainsi démontrée, une recherche des sites de
régulations sur le promoteur pourra alors être envisagée :
Délétions du promoteur et analyse de l’effet de ces délétions sur l’activité du promoteur
Recherche des sites de liaison de facteurs de transcription (bioinformatique, gel retard, footprint ou
immunoprécipitation de la chromatine)
Ces techniques seront étudiées dans le chapitre « interactions acides nucléiques/protéines ».
VI - Analyse du taux d’élongation de la transcription d’un gène
Si on a observé une différence dans la quantité d’ARN X présents dans la cellule traitée et pas de différence
au niveau de l’initiation de la transcription, deux hypothèses peuvent être proposées :
Régulation de l’élongation de la transcription
Régulation post-transcriptionnelle (stabilité du messager, régulation de l’export de l’ARN, …).
15
Pour étudier l’élongation de la transcription, il faut non pas s’intéresser aux ARNm cytoplasmiques mais aux
ARNm en cours de transcription c’est à dire nucléaires. Une manière d’obtenir cette information est de
réaliser un Run On.
Expérience de Run on (Elongation in vitro de transcrits initiés in vivo)
On purifie des noyaux sur coussin de sucrose à 70%. Cette forte molarité en sucre empêche les petits
facteurs de sortir des noyaux et sépare ces derniers du reste du lysat cellulaire. Le culot de noyaux est
récupéré et incubé en présence d’UTPα32P pendant 30min. Ce précurseur radioactif va permettre le
marquage des ARNm en cours de transcription et ces derniers vont subir une élongation d’environ 200 à
500nt. Dans cette élongation réalisée in vitro, la vitesse de l’ARN Pol II ne dépasse pas à 10 ou 20 nt/min.
Les rares initiations qui auront lieu au cours de cette expérience donneront des ARN beaucoup trop courts et
trop peu nombreux pour être détectés par la suite. Cette technique permet donc d’avoir un instantané de l’état
transcriptionnel d’un type cellulaire au moment de la préparation des noyaux. Une fois l’élongation
terminée, les noyaux sont lysés et les ARNm marqués sont extraits.
La ou les sondes utilisées sont en général des ADNc correspondant aux gènes dont on désire analyser la
La membrane est ensuite incubée avec les tous ARNm radioactifs, lavée et
autoradiographiée. Par cette expérience, on ne détermine pas une valeur
absolue de la transcription d’un gène mais une valeur relative entre
cell traitées
« taches »).
cell témoin
transcription. Ces ADNc sont déposés sur une membrane en quantité identique (technique du dot blot :
ADNcX
l’expression de différents gènes ou d’un même gène dans des conditions
différentes.
ADNc actine
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Quelques exemples :
Cas 1 :
gène B en WB
cellules contrôle
cellules traitées drogue x
1 bande 54 kDa
1 bande 85 kDa (même intensité pour les deux)
Régulation post traductionnelle
Cas 2 :
gène B’ en WB
cellules contrôle
cellules traitées drogue x
1 bande +++
pas de bande
Régulation en amont de traduction (ou dégradation de la protéine)
Northern blot
1 bande +++
pas de bande
Régulation en amont de la transcription (ou dégradation de l’ARN)
Run off
1 bande +++
pas de bande
Régulation de l’initiation de la tn
Cas 3 :
gène B’ en WB
cellules contrôle
cellules traitées drogue x
1 bande +++
pas de bande
Régulation en amont de traduction (ou dégradation de la protéine)
Northern blot
1 bande +++
pas de bande
Régulation en amont de la transcription (ou dégradation de l’ARN)
Run off
1 bande +++
1 bande +++
Régulation en aval de l’initiation de la transcription
Run on
1 bande +++
pas de bande
Régulation de l’élongation de la tn
Cas 4 :
gène B’ en WB
cellules contrôle
cellules traitées drogue x
1 bande +++
pas de bande
Régulation en amont de traduction (ou dégradation de la protéine)
Northern blot
1 bande +++
1 bande +++
Régulation traductionnelle
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