Interactions bifonctionnelles ou comment augmenter l`affinité et la

Interactions bifonctionnelles ou comment augmenter l'affinité et
la spécificité de ligands ARN pour des ARN structurés du VIH-1.
David Boucard, Jean-Jacques Toulmé & Carmelo Di Primo
INSERM U386, Université V. Segalen, 33607 Bordeaux cedex & Institut Européen de
Chimie et Biologie, 2 rue Escarpit, 33607 Pessac cedex.
Le motif de reconnaissance boucle-boucle régule l'expression des gènes aussi bien chez les
organismes procaryotes que chez les eucaryotes (1). Dans la majorité des cas, ces complexes
résultent de l'interaction entre deux tige-boucles. Il existe cependant des exemples où le
mécanisme de régulation fait intervenir des "kissing" complexes multiples résultant de
l'interaction de plusieurs tige-boucles en tandem. Mimer ces interactions multiples permettrait
de moduler l'expression du génome d'agents pathogènes. Par rapport à une approche visant
une cible unique, une approche constitant à viser simultanément plusieurs cibles présenterait
l'avantage d'augmenter la stabilité et la spécificité des complexes donc leur efficacité à
inhiber.
La région 5' terminale non traduite (5'UTR) du génome du VIH-1 est riche en signaux
régulateurs du cycle viral. Ces signaux, constitués par le repliement de l'ARN génomique,
contrôlent des étapes clefs comme par exemple la trans-activation de la transcription,
l'initiation de la transcription inverse, la dimérisation et l'encapsidation de l'ARN viral (2).
Inspirés par les "kissing" complexes naturels multiples nous avons envisagé une stratégie
visant à générer un complexe bifonctionnel résultant de l'interaction entre deux tige-boucles
adjacentes du 5'UTR du VIH-1 et un ligand artificiel constitué de deux sites d'interaction. Un
modèle d'interaction, constitué d'un double "kissing" complexe dérivé d'un complexe boucleboucle identifié par sélection in vitro (SELEX) contre l'élément TAR du VIH-1 (3-4) a
d'abord été analysé pour démontrer les avantages thermodynamiques d'une interaction
bifonctionnelle. Les résultats issus d'expériences de dénaturation thermique suivie par
spectroscopie UV, de mobilité électrophorétique retardée et de résonance plasmonique de
surface ont montré une nette stabilisation du complexe bifonctionnel due à une diminution de
sa vitesse de dissociation par rapport aux complexes monofonctionnels.
Nous avons ensuite utilisée cette stratégie pour cibler simultanément deux tige-boucles du
5'UTR du VIH-1. Un ligand artificiel constitué d'un aptamère ARN anti-TAR lié par un lien
chimique à l'élément DIS a permis de viser les tige-boucles TAR et DIS. Un autre ligand
constitué de l'aptamère ARN anti-TAR lié à un oligonucléotide antisens a été dirigé contre les
éléments TAR et polyA. Dans les deux cas, les complexes bifonctionnels sont plus stables que
les complexes monofonctionnels. Cependant la spécificité de l'interaction est diminuée avec le
ligand constitué de l'aptamère lié à l'oligonucléotide antisens. Ces résultats démontrent que les
interactions tertiaires favorisent la spécificité des ligands articifiels structurés contre des cibles
ARN virales elles-mêmes non linéaires.
Références :
1) Brunel, C., Marquet, R., Romby, P. & Erhesmann, C. (2002) Biochimie, 84, 925-944.
2) Berkhout, B. (2000) Adv Pharmacol, 48, 29-73.
3) Ducongé, F. & Toulmé, J-J (1999) RNA, 5, 1605-1614.
4) Toulmé, JJ, Di Primo, C. & Boucard, D. (2004) FEBS Lett, 567, 55-62.