la transcription

LA TRANSCRIPTION
I-
Rappels
1) Procaryotes
Organelles non identifiés, pas de noyau, paroi chez bactéries. Transcription et traduction au même endroit.
ARN polycistronique (= plusieurs gènes côte-à-côte transcrit { partir d’une même transcription et régulée {
partir d’un seul régulateur), sans intron, transcription simple, ARNm instables.
2) Eucaryotes
Noyau défini, et compartiments. Dans le noyau on a la transcription. ADN  transcription  ARN immature 
épissage (enlève les introns)  ARN mature  transport dans le cytoplasme  dégradation (+/-)  Protéines.
ARN monocistronique, avec intron, maturation, transcription complexe, ARNm stables.
ADN double brin doit s’ouvrir pour laisser passer la polymérase  intervention de protéines
Polymérase : 5’  3’
Opéron : régulé et transcrit par la même chose …
II- La transcription chez les procaryotes
L’ARN polymérase est composé de 5 sous-unités qui chez les procaryotes ont chacune des caractéristique et
rôles différents :
 2 α qui se lient aux séquences de régulation (il y en a deux)
 β et β’ permettent la synthèse de l’ARN et forment des ponts Phosphodiester
 ω a un rôle dans la structuration de la sous unité β’
/!\ Il n’y a qu’une seule polymérase chez les procaryotes !
1) Initiation de la transcription
L’ARN polymérase ainsi constituée de ses 5 sous unités porte
le nom d’Enzyme core. L’enzyme adopte une structure en pince de
crabe qui va se refermer sur l’ADN. Sous cette forme, la polymérase
est capable de synthétiser de l’ARN mais ne peut pas reconnaître de
le promoteur, pour cela, il faut lui adjoindre un facteur de
transcription : σ. Ce facteur va reconnaître le promoteur et
permettre { l’ARN polymérase d’initier la transcription. Lorsqu’elle
est associée au facteur de transcription σ, elle porte le nom
d’holoenzyme.
Structure du promoteur :
En amont du site d’initiation de transcription +1, le
promoteur
fait
apparaître
2 séquences
nucléotidiques
conservées (ou consensus): une séquence riche en A et T appelée
TATA box (ou Pribnow box) placée à environ -10 pb du site +1 et
une séquence appelée « boîte -35 » à environ -35 pb du site +1.
La reconnaissance du promoteur d’un gène se fait par association
entre les boîtes TATA et -35 de l’ADN et le facteur de transcription.
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2) L’élongation
On passe ensuite à la phase d'élongation de la transcription, ou la "bulle" de transcription (17 pb, 1,6 tour
d’ADN) : le double brin d’ADN va s’ouvrir devant l’ARN polymérase et se refermer derrière elle lorsque d’ARN
est synthétisé. Cette action va créer des contraintes dans la structure du double brin. En général, chez les
procaryotes, l’ADN est circulaire et surenroulé, ce qui nécessite des topoisomérases qui contrôlent de manière
précise ces contraintes topologiques.
La vitesse de transcription est estimée à 50-90 nt/sec.
3) La terminaison rho indépendante et rho dépendante
La terminaison de la transcription va consister { dissocier de l’ADN, l’ARN et la polymérase.
2 types de terminaison:
- La terminaison "rho indépendante"
Sur la matrice d’ADN, on trouve 2 régions inversées répétées riches en GC suivie d’une succession de A. lors de
la polymérisation, les 2 régions répétées vont pouvoir s’associer par complémentarité et faire adopter { l’ADN
une structure en épingle à cheveux. Rho indépendante va interagir avec le complexe de la polymérisation et
créer une pause. Pendant cette pause, l’ARN est associé { l’ADN dans la région riche en A (association A-U). 2
éléments vont déstabiliser le complexe de transcription : d’une part l’association G-C (très stable) et d’autre
part, l’association A-U entre ADN et ARN (peu stable) qui favorise la dissociation.
Dépend à la fois du ralentissement du complexe d'élongation et d'une séquence qui le déstabilise, c'est une
séquence de repliement qui va ordonner à la polymérase de se décrocher. Elle est intrinsèque au gène.
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- La terminaison "rho dépendante" :
Rho est une protéine de 46kDa qui se lie { l’ARN
nouvellement synthétisé sur une séquence riche en C et
pauvre en G. il forme un complexe hexamèrique
Hélicase/ATPase dépendant de l’ARN, migre le long de
l’ARN de 5’ vers 3’, déroule l’hybride ADN/ARN puis se
décroche de l’ARN quand il atteint la bulle de
transcription.
III- La transcription chez les eucaryotes
1) Introduction
Le mécanisme général de la transcription des eucaryotes est le même que celui décrit chez les
procaryotes. Les différences viennent de la présence de plusieurs types de gènes codant différents types d’ARN
cellulaire. La distinction entre ces différents gènes se fait au niveau des promoteurs qui possèdent des signaux
de reconnaissance spécifiques à certaines ARN polymérases.
ARN polymérase
utilisée
ARN synthétisé
Localisation
Sensibilité à l’-amanitine
ARN polymérase I
ARNr cytoplasmique (71%)
45S précurseur ARNr (4%)
Nucléole
Insensible
ARN polymérase II
ARNm
ARNnh (ARN hétérogènes)
Nucléoplasme
Très sensible
nucléoplasme
Sensible aux fortes
concentrations
petits ARNr (ARNt, ARN 5S et
autres)
95% de l’ARNm est polyadénylé.
ARN polymérase III
Autre différence importante : chez les procaryotes les ARNm ne subissent pas de maturation contrairement aux
eucaryotes où le gène est d’abord transcrit en ARN prémessager dans le noyau, puis va subir une maturation
avant d’être exporté dans le cytosol.
2) L’initiation par les polymérases I et III
a. Par la polymérase I
Les promoteurs, qui vont être reconnus par les
polymérases de types I, ont deux composant de
séquences : le « core » du promoteur qui comprend les séquences régulatrices évoquées plus haut (de -45 à +20
environ) et les éléments de contrôles (UCE) situés environ de -180 à -107. Ces éléments ne sont pas nécessaires
mais augmentent l’activité.
Deux facteurs entrent en jeu :
 UBF1 qui se fixe sur des séquences GC à la fois
dans l’UCE et sur le core
 SL1 se fixe { UBF1 { la fois dans l’UCE et sur le
core
 La polymérase peut alors se positionner sur le
core et démarrer. On ignore encore comment et
pourquoi le fait d’avoir cette configuration sur l’UCE
également augmente l’activité du la polymérase.
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Les ARN ribosomaux obtenus vont alors subir un épissage afin d’obtenir les différents types d’ARNr qui
composeront le ribosome.
Un grand ARN est transcrit, puis il est découpé, à nouveau découpé.
b. Par les polymérases III
Contrairement à la polymérase de type I, il existe 3 types de promoteurs pour cette polymérase :
 Le promoteur de type 1, compose de deux séquences en aval du point +1 : la Box A et la Box C.
 Le promoteur de type 2, compose de deux séquences en aval du point +1 : la Box A, immédiatement
après le point +1, et la Box B, quelques bases plus loin.
 Le promoteur de type 3, compose de trois séquences en amont du point +1 : Une TATA Box (qui va
jouer exactement le même rôle que la Pribnow Box des Procaryotes) juste avant le promoteur, laquelle
suffit à l'expression du gène, mais également les séquences PSE, située un peu avant, et Oct qui se
trouve très loin en arrière du +1. Ces deux dernières séquences augmentent l'activité du promoteur.
De la même manière que chez les polymérases de type I,
toutes ces séquences servent à lier des facteurs. Il existe donc
les facteurs généraux, nécessaires au mécanisme en lui-même,
qui peuvent se fixer en amont comme en aval du site
d'initiation (+1), les facteurs ubiquitaires se fixant en amont,
mais proche du site d'initiation, augmentant l'efficacité, et les
facteurs inductibles, également en amont, mais loin du site
d'initiation, régulant l'expression des gènes.
3) L’initiation par la Polymérase II
La polymérase de type II est responsable de la synthèse des
ARNm et donc ne concerne que les gènes codant les protéines
a. Les séquences importantes d’un promoteur
Comment a-t-on mis en évidence les séquences importantes des promoteurs ?
Afin de déterminer la localisation du promoteur, on peut employer la technique du run-off assay, une
technique de transcription in-vitro :
1. On digère un fragment linéaire de l’ADN, lequel possède un promoteur de polymérase type II dont on veut
connaitre la position, avec une enzyme de restriction : le site correspondant doit se trouver dans un
emplacement connu de la région codante du gène.
2. On met au contact notre gène tronqué avec une ARN polymérase II, des facteurs « ad hoc » (tous ceux qui
sont nécessaire) ou un extrait partiellement purifié, et des XTP marqués.
3. On fait un gel dans lequel on va faire migrer le mélange. La polymérase avance et arrive { l’ endroit de la
coupure ou elle se retrouve donc éjectée dans le vide, formant des fragments incomplets.
4. On récupère le fragment d’ARN marque. Sachant l’emplacement du site dans la région codante, il suffit de
regarder la taille du transcrit obtenu pour retrouver l’emplacement du point +1.
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Promoteur des ARN PolII :
Dans beaucoup de gènes on a une séquence : la TATA box. Si on transforme en TAGA ou TAAA la
transcription marchera beaucoup moins bien.
La structure de ces promoteurs est difficilement généralisable car selon les gènes, on peut trouver des éléments
spécifiques liés à leur régulation. Mais la plupart des promoteurs PolII possèdent une TATA Box (de -25 à -35)
et un élément Inr (Initiator) à cheval sur le +1. Certains ne possèdent qu’un seul des deux et d’autres encore
carrément aucun des deux. Il existe également une autre séquence, celle-ci se trouvant en aval du site
d’initiation cette fois : c’est la séquence DPE (Downstream Promotor Element) situé à +30.
On peut trouver encore d’autres régions sur le promoteur tel que la boîte BRE ou bien la DPE. Mais aucun
promoteur ne contient tous ces éléments, beaucoup ont une combinaison de quelques-uns.
Le promoteur contient donc environ 40nt comporte 4 séquences situées en amont et en aval du site de
démarrage de la transcription. Ces éléments de séquences seront reconnus par des facteurs généraux de
transcription.
b. Les facteurs généraux de transcription
Les facteurs généraux de transcriptions sont nécessaires au mécanisme général. Ils sont ubiquitaires et se
fixent en amont du site d’initiation sur des séquences particulières (dans les régions proximales). Ils
augmentent l’efficacité d’initiation des gènes possédant ces séquences. Ce sont également des facteurs
inductibles : c'est à dire qu’ils se fixent généralement en amont (dans les régions distales) mais ayant un rôle
régulateur, ils contrôlent l’expression spatio-temporelle des gènes.
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4) Comment mesurer l’expression d’un gène ?
a. Northern Blot et cartographie à la RNase
Northern Blot On utilise la méthode du Northern Blot pour déterminer la quantité d’ARNm spécifiques produits
par un gène dans des tissus différents. On fait migrer les ARNm que l’on hybride avec des ADNc (sonde
spécifique). L’intensité du marquage permet de visualiser les ARNm correspondants.
- Migration sur gel contenant du formaldéhyde comme dénaturant d’ARN coloré au BET, par le biais
d’une électrophorèse.
- Le gel est place sur une éponge, laquelle baigne dans une solution saline. On pose une membrane de
nitrocellulose sur le gel, et du papier absorbant par-dessus.
- Récupération de la membrane sur laquelle l’ARN a filtré et a été transféré. Hybridation dans un sac
spécifique avec une sonde.
- Lavage de la membrane pour éliminer l’excès de sonde.
- Autoradiographie et obtention d’un autoradiogramme sur lequel la sonde s’est liée de façon
complémentaire aux ARN étudiés. L’intensité du marquage permet de visualiser les ARNm
correspondants.
Cartographie a la RNAse (permet de quantifier les ARNs ou analyser leur structure, technique plus sensible que
le NB) :
Cela nécessite d’avoir déj{ un morceau de l’ADN correspondant. La RNase A est spécifique de l’ARN simple brin.
- Insertion dans un vecteur que l’on va ensuite faire exprimer avec une RNA Polymérase sp6 et des rNTP
marqués, pour obtenir de l’ARN marqué qui nous servira de ribosonde.
- Hybridations de nos fragments d’ARN avec les ribosondes obtenue
- Digestion par RNAse A, enzyme qui dégrade spécifiquement l’ARN simple brin, pour conserver
uniquement le fragment accroché à la sonde.
- Analyse sur gel en condition dénaturante suivie d’une autoradiographie. Le fragment digéré par RNAse
va plus loin que le fragment non digéré.
b. R
T
–
P
c. C
R
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b. RT-PCR
Technique de la RT-PCR (permet d’amplifier un fragment d’ARN sous forme d’ADNc en combinant une
transcription inverse et une PCR)
- Etape de transcription inverse : utilisation d’un reverse transcriptase pour passer de l’ARNm a un
hybride ARNm/ADNc, puis d’une RNAse H pour couper le brin d’ARN, et d’une ADN Polymérase pour
détruire ce brin et synthétiser un brin d’ADNc.
- PCR : Amplification du brin d’ADNc (plus stable que l’ARN) avec des amorces, une Taq polymérase
(résistante a la chaleur) et des dNTP, selon les 3 étapes classiques d’une PCR sur n cycles –
dénaturation des brins par portage à 94°C, hybridation des amorces aux brins isoles (possible
uniquement si la température est baissée a 55°C), puis polymérisation (a 72°C, température optimale
de la polymérase).
- On obtient alors, après n cycles de PCR, 2n x la quantité d’ADNc de départ. Cette version d’analyse de
PCR est dite « PCR en point final » du fait que l’on obtient les données { la fin des n cycles.
On démarre { une certaine quantité d’ADN, puis il y aura une augmentation. En fonction de la quantité de la
matrice par rapport { la quantité d’amorce, on arrive { un plateau. Plus on met une grande quantité d’ADN plus
vite on arrive au plateau.
Sur les 2 gels, on prend 2mg d’ARN  reverse transcription dans 20µL. On met 1µL qui reconnaissent le primer
du gène X et 1µL qui reconnaissent le primer du gène Y.
A 35 cycles, on le dépose sur gel. (Attention on ne peut pas savoir où on en est dans notre « plateau ») on doit
être dans la partie linéaire car la quantité d’ADN amplifié correspond { la quantité de matrice de départ. Donc
pour pouvoir les comparer, on doit faire différents cycles, soit différentes quantité d’ADN.
Analyse en point final sur gel d’agarose
N = N0 x 2n
N : nombre final de molécules
N0: Nombre initial de molécules
n : nombre de cycles
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c. PCR quantitative
La PCR en temps réel permet la détection et la quantification d’un
« reporter » fluorescent. On peut suivre la quantité de fluorescence
émise { chaque cycle. L’augmentation du signal fluorescent est
directement proportionnelle { la quantité d’amplicons générés et la
quantité d‘amplicons est directement proportionnelle { la quantité
initiale de la matrice.
Analyse dynamique de la PCR quantitative
- haute précision pendant la phase exponentielle
- variabilité importante à la phase plateau
Le Sybr Green est un agent se liant { l’ADN double brin. Sa fluorescence augmente
quand il est lié.
Plus il y a de lumière, plus on a incorporé cette molécule, et plus on aura de quantité
d’amplicons.
Détermination du Ct (cycle seuil) :
La valeur de Ct est déterminée dans la phase
exponentielle, { l’intersection de la ligne de
bruit de fond avec la courbe de fluorescence.
C’est donc une PCR quantitative relative.
Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct :
Le nombre de cycles nécessaire pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est
fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents. Le Ct est directement lié { la quantité de cible présente
dans l’échantillon au début de la PCR.
Ici, Le Ct est très base quand on a 106 molécules.
Plus il y a de matrices à amplifier au départ, moins il y aura de cycle pour atteindre le Ct.
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Stratégie de quantification relative des ARNm :
 pas besoin de courbe de standard
 calcul des résultats pas comparaison des Ct
 nécessité de définir :
o un gène domestique (ex GAPDH) servant de contrôle endogène
o un calibrateur servant de standard
Cellules traitées à
x
GAPDH


-
T0
20
16
2µg d’ARN
RT :
T24
T48
22
24
16
16
le contrôle endogène permet de normaliser:
le dosage de l’ARN
la qualité de l’ARN
l’efficacité de la réverse transcription
le calibrateur :
représente l’état normal en terme physiologique
exemples: culture cellulaire non traitée; organe non atteint par une pathologie; lignée sauvage
d. les puces à ADN
La technique des puces { ADN se fonde sur la complémentarité entre les deux brins de l’ADN A/T et
G/C. Schématiquement, les puces à ADN sont des supports sur lesquels sont régulièrement répartis des bouts
d’ADN simple brin, les sondes, dont l’enchaînement des bases est connu.
La cible est l’ADN simple brin qui doit être analysé car l’enchaînement de ses bases est inconnu. Avant d’être
déposé sur la puce, il est marqué à la fluorescence.
Lorsque la cible est mise en contact avec la sonde, seuls les bouts d’ADNc vont s’hybrider. On procède { un
lavage pour qu'il ne reste sur la lame que les brins qui se seront parfaitement appariés. A l’endroit où les deux
brins d’ADN s’apparient, il apparaît un spot lumineux.
Applications pour :
- Recherche Fondamentale: expression génique (différentielle, spécifique…), génotypage
- Recherche Appliquée: établissement de pronostics et diagnostiques, suivi thérapeutique, détection de
microorganismes, contrôle agro-alimentaire et industriel, etc.
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5) Comment s'effectue la régulation?
a. Transcription sur noyaux isolés et comparaison avec Northern
Soit l’expression du gène MCH dans les cellules PC12 traitées par le NGF pendant des temps différents.
MCH : Augmentation de l’expression jusqu’{ 24h qui est due { l’augmentation.
A quoi peut être due l’activation de l’expression du gène?
 augmentation de la transcription
 augmentation de la stabilité
 les deux
Méthode de transcription sur noyaux isolés (Run-on) : sert à « doser » l’état de la transcription permet de
déterminer le type de régulation d’un gène étudié.
-
-
Lyse ménagée de cellules afin de récupérer
les noyaux isolés.
Incubation des noyaux 5 minutes à 30 °C
avec des XTP marqués.
Ajout d’héparine, qui stoppe l’initiation de
transcription. Subsiste alors les ARN dont
la transcription a débuté in vivo avant la
lyse. Ceux-ci vont donc continuer leur
élongation de façon in vitro.
Purification et récupération des ARN
marqués qui vont servir de sonde
Hybridation avec les ADN correspondants
aux gènes étudiés fixes sur membrane.
Selon le résultat du run-on et d’un
Northern complémentaire, on peut alors déterminer le type de régulation :
o
o
o
o
Si le run-on ne nous montre aucune décroissance de la transcription, tout comme le Northern,
c’est qu’il n’y a pas de régulation.
Si le run-on ne nous montre aucune décroissance de la transcription, mais que le Northern
montre qu’il y a de moins en moins d’expression, c’est que la régulation du gène est posttranscriptionnelle.
Si le run-on nous présente une décroissance au cours du temps, et que le Northern nous montre
que le gène est de moins en moins exprime, c’est que la régulation est transcriptionnelle.
Si le run-on nous présente une décroissance au cours du temps, et que le Northern nous montre
un arrêt de l’expression brutal et rapide, c’est que la régulation est { la fois transcriptionnelle et
post-transcriptionnelle.
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Exemple :
Résultats
Autres méthodes :
- Comparaison de l’expression génique dans le noyau et dans le cytoplasme
- Etude de la stabilité des ARNms
b. Les éléments importants d'une régulation transcriptionnelle
La régulation de l’expression génique se fait grâce { :
 des éléments d’ADN cis-régulateurs agissant comme:
o activateurs (enhancers)
o inhibiteurs (silencers)
 des éléments transrégulateurs (proteines) se fixant sur les séquences cis régulatrices.
Les régions de régulations peuvent être localisées à différents endroits du gène. Cependant, il est
important que les éléments transrégulateurs (protéines) puissent interagir avec le complexe d’initiation de la
transcription (ARN Pol + facteurs de transcription). Cela semble évident pour la région de régulation en amont
qui est proche du promoteur alors que ça l’est moins pour les régions éloignées telles que les enhancer et les
silencer.
Caractéristiques des séquences «enhancers» ou «silencers» :
- Séquences d’ADN pouvant activer ou réprimer l’activité d’un promoteur.
- Sont situées en 5, en 3’ ou { l’intérieur d’un gène.
- Peuvent être situées très loin du promoteur (50 Kb).
- Peuvent réguler l’expression du gène de façon spécifique:
o dans un tissu, dans une cellule
o au cours du développement
o après un traitement………
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Agissent dans les deux sens.
Sont capables de moduler l’activité temporelle et spatiale de n’importe quel gène si elles sont
fusionnées en amont ou en aval de ce gène.
Activation { distance d’un promoteur eucaryote par les enhancer et silencer :
Ces séquences sont en majorité en 5’ du début de transcription mais peuvent se trouver n’importe où dans le
gène. Ils peuvent interagir dans son expression en tant qu’ « amplificateur » ou « silenceur » de la transcription.
-
Mode d’action :
Les séquences (mise en évidence, effet sur l'expression, caractéristiques…)
Comment mettre en évidence les séquences régulatrices ?
Localiser le début de la transcription
Digestion a la nucléase S1 (permet de trouver le 5’ d’un transcrit)
- Marquage d’un brin d’ADN en 5’.
- Hybridation du brin avec l’ARN correspondant.
- Digestion du surplus avec une nucléase S1, enzyme
digérant tout ce qui est simple brin (ADN et ARN).
- Dénaturation et autoradiographie du brin d’ADN.
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Extension d’amorce (permet de trouver le 5’ d’un transcrit)
- Marquage d’un oligonucléotide en 5’.
- Hybridation de l’oligonucléotide avec notre ARN.
- Reverse Transcription (avec Reverse Transcriptase + dNTPs).
- Dénaturation et autoradiographie du brin d’ADN.
Race-PCR (permet de trouver le 5’ ou le 3’ d’un transcrit)
- A l’aide d’une ligase, lier un adaptateur en 5’ sur l’ARNm.
- Réaliser une Reverse Transcription pour obtenir un hybride ARNm/ADNc
Digérer l’ARN a la RNAse.
- Lier un autre adaptateur en 5’ de l’ADNc.
- 1er tour de PCR avec un OligodT en 5’.
- 2ème tour de PCR avec un OligodT spécifique en 5’ sur l’autre brin
- N tours de PCR, puis recommencer avec deux autres oligos (un sur chaque brin) décalés par rapport aux
premiers.
On va prendre un ARN, on cherche à savoir le début de cet ARN. On prend un oligo qui repère l’ARN pis on
met la transcriptase inverse qui fait un morceau d’ADN { partir de l’ARN. Le nombre d’oligo nous permet de
localiser le début de l’ARN.
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Mesurer l’effet de la transcription de l’ajout ou de la délétion d’une séquence.
Technique du gène rapporteur (permet de déterminer les séquences régulatrices importantes en 5’UTR d’un
promoteur) :
- Introduction d’un « gène rapporteur » dans la séquence génétique, en aval de la région 5’ étudiée, via
transfection, introduction par vecteur viral ou transgénèse. Selon le type de détection, on emploiera :
o Enzymatique : β-galactosidase, luciférase, CAT
o Immunologique : TSV40, β-globine
o Fluorescente : GFP
- Mesure de l’activité de transcription du gène rapporteur lorsque l’on supprime différentes parties du
5’UTR étudié. Les parties qui, lorsqu’elles sont supprimées, détruisent ou faiblissent sévèrement
l’activité transcriptionnelle sont les parties essentielles.
Comment localiser la séquence de fixation de la (les) protéine(s) régulatrice(s) ?
Comment identifier la (les) protéine(s) ?
Protection à la DNase I (footprint) (permet de localiser et identifier les sites de liaisons Protéines/ADN)
- Marquage de fragment d’ADN (amplifié par PCR par exemple)
- Constitution de deux pools : un avec de l’ADN marque, l’autre avec de l’ADN marque mis au contact de
protéines de liaisons
- Digestion partielle à la DNAse I des deux pools
- Electrophorèse/Autoradiographie. Les fragments manquants { l’image sur le pool mis au contact avec
les protéines sont les résultantes du fait que les protéines étaient liées à ces endroits la, protégeant ainsi
l’ADN de la digestion. Ce qui permet de connaitre l’emplacement de la séquence de liaison.
Méthode de retard sur gel (EMSA) (permet de vérifier l’interaction entre une protéine et l’ADN)
- Marquage d’ADN
- Incubation de cet ADN à la fois sans protéine mais aussi avec la protéine susceptible de se lier dessus, si
connue, ou une mixture de protéine.
- Electrophorèse : dans le puits ADN + Protéine, on droit retrouver une bande au même niveau que dans
l’autre puits, mais également, si la protéine s’est effectivement bien liée, elle a « retardé » l’ADN et donc
créer une bande « Complexe ADN/Protéine » se trouvant plus haut.
Si cette technique est utilisée avec de l’ADN froid en plus pour faire compétition, c’est une « Compétition de
Retard sur Gel ».
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Méthode de Super-retard sur gel (permet de connaitre avec précision la protéine spécifique de la région)
- Marquage d’ADN
- Incubation de cet ADN à la fois avec les protéines dans un puits, mais aussi dans l’autre puits le mélange
ADN + Protéine + Anticorps spécifique à cette protéine.
- Electrophorèse : dans le puits ADN + Protéine, on retrouve deux bandes – une pour l’ADN libre, une pour le
complexe. Dans le puits ADN + Protéine + Anticorps, on doit retrouver une bande pour l’ADN libre, et une
bande « super retardée» encore plus haute que le simple complexe ADN/Protéine, due à l’interaction avec
l’anticorps. Si c’est le cas, alors c’est bien cette protéine qui interagit.
6) Les différents facteurs de transcription
a. Les différents motifs existants
Les facteurs de transcriptions (autres que généraux qu’on a déj{ étudiés) sont composes de plusieurs
domaines: un domaine de liaison { l’ADN, séparé d’un domaine d’activation par un domaine de connexion.
Il existe plusieurs types de domaines de liaison :
- Le motif Zinc Finger (doigt de Zinc), une boucle de 23 acides aminés dotée d’un site de liaison au Zinc formé
par des Histidines et des Cystéines. Il y en a plusieurs par protéines et concerne par exemple les récepteurs
aux stéroïdes ou les récepteurs nucléaires.
- Le motif Helix-Loop-Helix (HLH), motifs de 40 { 50 acides aminés qui comprennent deux hélices α de 15-16
résidus séparés par une boucle. Les hélices sont responsables de la formation de dimères et peuvent se lier
{ l’ADN à l’aide de leur partie basique.
- Les motifs Leucine Zipper (Motif a Leucine) sont des répétitions de leucines tous les 7 résidus qui se
trouvent positionnés du même côté d’une hélice α longue d’au moins 6 tours. Elles aussi se dimérisent, en
général en homodimères, l’hétérodimérisation pouvant altérer leur spécificité.
Autres facteurs de transcriptions :
Facteur
Fonction
CREB
Liaison { l’élément de réponse { l’AMP Cyclique
AP1
Protéine Activatrice
GR
Récepteur aux glucocorticoïdes se liant { l’élément GRE
MTF
Facteur de transcription répondant aux métaux
TR
Récepteur { l’hormone thyroïdienne se liant { l’élément TRE
HSTF
Facteur de transcription répondant à un choc thermique
b. Modulation de leur activité
L’activité de ces facteurs est souvent modulable rapidement, par fixation d’un ligand, phosphorylation
en réponse { un stress, expression d’une protéine régulatrice, ou dégradation.
Il faut également garder { l’esprit que l’ADN est condensé sous forme chromatine avec des histones. On parle
d’hétérochromatine condensée lorsque les histones sont déacetylés par une histone déacetylase et
d’euchromatine relâchée s’ils sont acétyles par une histone acétylase, ce qui est nécessaire pour avoir action
des facteurs.
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7) Elongation et terminaison de la traduction
Dès que l’ARN commence { sortir de l’ARN Polymérase, il est immédiatement pris en charge par les
facteurs de coiffe, d’épissage, et de polyadénylation. Ce dernier suit le mouvement jusqu’{ la séquence signal de
polyadénylation qui se trouve sur l’ADN, et, en s’y liant, permet { la terminaison d’être plus favorable que
l’élongation.
Le transcrit primaire peut donc subir les modifications suivantes, dans le noyau.
a. Addition de la coiffe
Se fait en 5’ par action de 4 enzymes différentes : Phosphatase, Guanylyl-transférase, Guanine 7-méthyltransférase et 2’-Ométhyl-transférase. Sa structure est en grande partie commune pour tous les eucaryotes,
mais les eucaryotes unicellulaires ont un ribonucléotide en plus, alors que les vertébrés en ont carrément deux
en plus.
b. Clivage et polyadénylation
Lorsque CPSF, le facteur de polyadénylation, se lie { la séquence signal, d’autres protéines le rejoignent,
induisant la courbure de l’ARN, ce qui permet à la Poly-A Polymérase de venir se loger et générer, en
consommant de l’ATP et en libérant tous les facteurs associent sauf le CPSF, digérant ainsi l’ARN courbe, une
queue poly-A devenant la fin de la séquence. Cette polyadénylation est dite « polyadénylation lente ».
Lorsqu’elle est suffisamment avancée, la Poly-A Binding Protein II se fixe sur la queue, déclenchant la
«polyadénylation rapide ».
c. ARN editing
Il s’agit de tout procédé autre que l’épissage et conduisant a un changement de la séquence de l’ARN par
rapport à la séquence de l’ADN de base. Il s’agit par exemple d’insertion, délétion, ou modification de
nucléotides. L’apolipoproteine B, par exemple, est éditée dans l’intestin pour donner lieu { une forme courte
qui n’est pas endocytosée comme dans le foie.
d. Epissage
C’est l’élimination des introns.
Biologie Moléculaire – Mme Presse
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