T-Spot - Service d`immunologie et allergie

Division of Immunology and Allergy
PROGRES DANS LE
DIAGNOSTIC DE LA
TUBERCULOSE
Les tests immunologiques
(IGRAs et test de cytométrie)
Dr Alexandre Harari, PD
PROGRES DANS LE
DIAGNOSTIC DE LA
TUBERCULOSE
Les tests immunologiques
(IGRAs et test de cytométrie)
Dr Alexandre Harari, PD
Service d’immunologie et allergie
Les tests immunologiques
(IGRAs et test de cytométrie)
Principe des IGRAs, ELISA Vs. ELISpot
Tests commerciaux et test CHUV
Limites des tests et impératifs logistiques
TB-Flow
• Principe du test
• Performances du test et valeur seuil
• Améliorations en cours
• Logistique
Principe des tests TST et IGRAs
TST (Mantoux)
Mesure de la réaction
cutanée après 3 jours
IGRA (IFN-γ release assay)
Mesure de la production
d’IFN-γ après 16-24h
Lewinsohn DA. Curr Opin Pediatr 2010
TST
•
False Positives
–
–
•
vs.
IGRAs
•
People who have received the BCG
vaccine will show up positive
People exposed to bacteria in
environment will show up positive
–
–
–
False Negatives
–
–
skin reaction is a very crude measure.
Small responses not picked up
(real problem in immunosuppressed
patients)
commonly negative in active disease
(only 75-90% sensitivity. Worse in
immunosuppressed).
T-SPOT.TB is very specific:
•
Specificity 99.9%
T-SPOT.TB does not give false positive in people
with prior BCG vaccination
T-SPOT.TB does not cross-react with common
non-tuberculous (atypical) mycobacteria
T-SPOT.TB is very sensitive:
–
–
–
–
–
–
Sensitivity 97.9%
picks up infected people missed by the skin test
works even in immunosuppressed populations
picks up new infection earlier than the skin test
works well in children and infants
maintains sensitivity even in active TB, including
all types of extrapulmonary TB
Young DB.
Nat Med 2003;9:503-4
ESAT-6/CFP10
Absents chez M. bovis (BCG) mais
présents chez M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M.
marinum...
IGRAs are Extremely Specific in Discriminating Mtb
Infection from Vaccination
Tuberculose
complex
ESAT-6
CFP 10
M tuberculosis
+
+
M africanum
+
+
M bovis
+
+
BCG
-
-
M leprae
+
+
ESAT-6
CFP-10
M kansasii
+
+
M marinum
+
+
M szulgai
+
+
M abcessus, M avium,
M branderi, M celatum,
M chelonae, M fortuitum,
M gordonii, M intracellulare,
M malmoense, M oenavense,
M scrofulaceum, M smegmatis
M terrae, M vaccae, M xenopi
-
-
Environmental mycobacteria
Region of difference (RD)-1
ESAT-6: Early Secreted Antigenic Target (6kDa-95aa)
CFP-10: Culture Filtrate Protein (10kDa-100aa)
Andersen P et al. Lancet 2000;356:1099-104
Principe des différents IGRAs
Sang complet (ELISA)
ou
Antigènes
ESAT-6 et CFP-10
Lymphocytes (ELISpot)
incubation (16-20h)
ELISA
Dosage de l’IFN-γ dans le
milieu (pg/mL)
Sécrétion d’IFN-γ
ELISA
ELISPOT
Détermination du
nombre de cellules
produisant de l’IFN-γ
ELISPOT
Lalvani A. Br Med Bull 2010
IGRAs commerciaux
ELISA: QuantiFERON
ELISpot: T-Spot
Isolation des lymphocytes
Comptage des lymphocytes
Mise en plaque + antigènes
Lavage
Révélation spot
Comptage des spots
Exemples de résultats ELISpot
Neg CTRL
« Mtb »
Pos CTRL
Différences entre l’ELISpot commercial (T-Spot)
et celui du CHUV
Paramètres
T-Spot
Test CHUV
Nombre de cellules/puits
250’000
200’000
Nombre de puits/condition (réplicats)
1
3
Contrôle qualité interne
∅
oui
≥ 8 spots/ puits
de plus que le
CTRL négatif
> 55 spots/ 106
cellules
ET
> 4 fois supérieur au
CTRL négatif
Critères de positivité
Différences entre l’ELISpot commercial (T-Spot)
et celui du CHUV
Scénario 1
Scénario 2
Scénario 3
Négatif
Positif
Positif pour T-Spot
Négatif pour
CHUV
CTRL
négatif
(non
stimulé)
ESAT-6 ou CFP10
Logistique et limites des tests
IGRAs
La qualité des résultats des tests IGRAs est affectée si le sang n’est
pas isolé dans les 6 heures
Le sang doit parvenir au labo avant 14h30.
Besoin de 2 tubes de sang (EDTA) de 9ml
Les résultats sont fourni en 24-36h (sauf vendredi)
En cas d’urgence un vendredi, faire un prélèvement le lundi
suivant permet d’obtenir les résultats plus rapidement
Les tests IGRAs ne distinguent pas une TB active d’une infection
latente
Predictive value of interferon-γ release assays for incident
active tuberculosis: a systematic review and meta-analysis
Molebogeng X Rangaka, Katalin A Wilkinson, Judith R Glynn, Daphne Ling, Dick Menzies, Judith
Mwansa-Kambafwile, Katherine Fielding, Robert J Wilkinson, Madhukar Pai
Summary
Background We aimed to assess whether interferon-γ release assays (IGRAs) can predict the development of active
tuberculosis and whether the predictive ability of these tests is better than that of the tuberculin skin test (TST).
Methods Longitudinal studies of the predictive value for active tuberculosis of in-house or commercial IGRAs were
identified through searches of PubMed, Embase, Biosis, and Web of Science and complementary manual searches up to
June 30, 2011. Eligible studies included adults or children, with or without HIV, who were free of active tuberculosis at
study baseline. We summarised incidence rates in forest plots and pooled data with random-effects models when
appropriate. We calculated incidence rate ratios (IRR) for rates of disease progression in IGRA-positive versus IGRAnegative individuals.
Findings 15 studies had a combined sample size of 26 680 participants. Incidence of tuberculosis during a median
follow-up of 4 years (IQR 2–6), even in IGRA-positive individuals, was 4–48 cases per 1000 person-years. Seven studies
with no possibility of incorporation bias and reporting baseline stratification on the basis of IGRA results showed a
moderate association between positive results and subsequent tuberculosis (pooled unadjusted IRR 2・
・10, 95% CI 1・
・
42–3・
・08). Compared with test-negative results, IGRA-positive and TST-positive results were much the same with regard
to the risk of tuberculosis (pooled IRR in the five studies that used both was 2・
・11 [95% CI 1・
・29–3・
・46] for IGRA vs 1・
60 [0・94–2・72] for TST at the 10 mm cutoff ). However, the proportion of IGRA-positive individuals in seven of 11
studies that assessed both IGRAs and TST was generally lower than TST-positive individuals.
Interpretation Neither IGRAs nor the TST have high accuracy for the prediction of active tuberculosis, although use of
IGRAs in some populations might reduce the number of people considered for preventive treatment. Until more
predictive biomarkers are identified, existing tests for latent tuberculosis infection should be chosen on the basis of
relative specificity in different populations, logistics, cost, and patients’ preferences rather than on predictive ability
alone.
Funding Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases (WHO), Wellcome Trust, Canadian
Institutes of Health Research, UK Medical Research Council, and the European and Developing Countries Clinical Trials
Partnership.
www.thelancet.com/infection Vol 12 January 2012
Analyse du profile fonctionnel des lymphocytes
T CD4 spécifiques à Mtb (ESAT-6 ou CFP-10)
+ BFA
Les cytokines sont produites mais restent
intracellulaires
L’analyse par cytométrie permet de distinguer les lymphocytes T CD4
et CD8
et
de mesurer, en plus de l’ IFN-γ, la production du TNF-α et de l’IL-2
Analyse du profile fonctionnel des
lymphocytes T CD4 spécifiques à Mtb
TNF-α
IFN-γ
IL-2
Analyse du profile fonctionnel des lymphocytes T
CD4 spécifiques à Mtb
Cas Clinique N° 2
•
•
•
•
•
Patiente d’origine camerounaise
Etat fébrile avec T° à 40
Perte de 20 kg de poids
Insuffisance rénal chronique terminale
Insuffisance hépatocellulaire sur Hépatite C
chronique
• Thrombopénie
• Syndrome hémophagocitaire
Dr Jesica Mazza Stalder
Pattern miliaire
Dr Jesica Mazza Stalder
Dr Jesica Mazza Stalder
Dr Jesica Mazza Stalder
Analyse du profile fonctionnel des lymphocytes T
CD4 spécifiques à Mtb
Analyse du profile fonctionnel des
lymphocytes T CD4 spécifiques à Mtb
Schematic Overview
Stimulations with Mtb antigens
Analysis of the functional profile of Mtb-specific CD4 T cells
TNF-α
TNF-α
Latent Mtb
Infection
Polyfunctional profile
(simultaneous production of
TNF-α, IL-2 and IFN-γ)
LTBI
IL-2
IFN-γ
LT4
IL-2
IFN-γ
TNF-α
TNF-α
Dominant single TNF-α
production
TB disease
Active TB
disease
LT4
IFN-γ
IL-2
Rozot V. et al, Med Sci, 2011
Analyse Statistique
Détermination du seuil de % des Mtb-specific single-TNF-α CD4 T cells
Pourcentage de Mtb-specific single-TNF-α CD4 T cells
< 37.4% infection latente
≥ 37.4% TB active
Validation du test avec une nouvelle cohorte
Comparison avec la Clinique
Comparison avec la clinique
Sensitivity: 67%
Specificity: 92%
Positive predictive value: 80%
Negative predictive value: 92.4%
Logistique pour le test TB-Flow
Le sang doit être isolé dans les 6 heures
Le sang doit parvenir au labo avant 14h30.
Besoin de 2 tubes de sang (EDTA) de 9ml
Les résultats sont fourni en 48-72h (sauf vendredi)
En cas d’urgence un vendredi, faire un prélèvement le
lundi suivant permet d’obtenir les résultats plus
rapidement
Remerciements
Service d’immunologie et allergie
Virginie Rozot
Gonzalo Tapia
Matthieu Perreau
Vincent Aubert
Giuseppe Pantaleo
Service des maladies infectieuses
Matthias Cavassini
Thierry Calandra
Center d’Epidémiologie
Mohamed Faouzi
Service de pneumologie
Jesica Mazza Stalder
Laurent Nicod
Institute de microbiologie
Katia Jaton
Service de médecine du personnel
Michael Currat
Catherine Lazor Blanchet
Université de Cape Town
Cheryl L. Day
Willem A. Hanekom