Université Montpellier I - UFR Médecine

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Thèse présentée pour obtenir le grade de :
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE MONTPELLIER I
Discipline : Biologie Moléculaire et Cellulaire
Formation doctorale : Endocrinologie Moléculaire et Cellulaire
Ecole doctorale : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
Par
Aurélie GARCIA Etablissement de modèles cellulaires de cancer du sein et de l’ovaire permettant l’étude des effets des récepteurs des œstrogènes sur la prolifération et l’activation de gènes Soutenance le 15 janvier 2010
JURY :
M. Eric BADIA, Maître de Conférences, Université de Médecine, Montpellier
M. Patrick BALAGUER, Chargé de Recherche, INSERM, Montpellier
Mme Claude CASELLAS, Professeur, Faculté de Pharmacie, Montpellier
Mme Pascale COHEN, Professeur, Faculté de Pharmacie, INSERM, Lyon
M. Marc POIROT, Directeur de Recherche INSERM, Toulouse
M. Daniel ZALKO, Chargé de Recherche INRA, Toulouse
1
Directeur de thèse
Codirecteur de thèse
Président
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Thèse présentée pour obtenir le grade de :
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE MONTPELLIER I
Discipline : Biologie Moléculaire et Cellulaire
Formation doctorale : Endocrinologie Moléculaire et Cellulaire
Ecole doctorale : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
Par
Aurélie GARCIA Thèse préparée dans
l’Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier (IRCM)
INSERM, unité 896
CRLC Val d'Aurelle - Paul Lamarque
208 rue des Apothicaires
34298 Montpellier cedex 5 FRANCE
Etablissement de modèles cellulaires de cancer du sein et de l’ovaire permettant l’étude des effets des récepteurs des œstrogènes sur la prolifération et l’activation de gènes ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Establishment of breast and ovarian cancer cell lines to study estrogen receptors effects on proliferation and genes activation Soutenance le 15 janvier 2010
JURY :
M. Eric BADIA, Maître de Conférences, Université de Médecine, Montpellier
M. Patrick BALAGUER, Chargé de Recherche, INSERM, Montpellier
Mme Claude CASELLAS, Professeur, Faculté de Pharmacie, Montpellier
Mme Pascale COHEN, Professeur, Faculté de Pharmacie, INSERM, Lyon
M. Marc POIROT, Directeur de Recherche INSERM, Toulouse
M. Daniel ZALKO, Chargé de Recherche INRA, Toulouse
2
Directeur de thèse
Codirecteur de thèse
Président
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Résumé Les récepteurs des œstrogènes α et β (REα et REβ) régissent de manière opposée lʹexpression de gènes nécessaires à la prolifération et à la différentiation cellulaire. Leur activité transcriptionnelle dépend dʹun ligand naturel et de molécules environnementales capables de perturber leur fonctionnement. Les cancers du sein et de l’ovaire peuvent être hormono‐dépendants. Les thérapies visant à contrecarrer la progression des cancers du sein exprimant le REα reposent sur son inactivation par inhibition de la production dʹœstrogènes et inhibition de son activité. L’hormonothérapie n’est pas proposée pour traiter les cancers de l’ovaire, en raison d’une résistance de novo qu’il faudrait mieux comprendre. Il est également nécessaire de mieux appréhender les mécanismes de la résistance acquise dans le cas de cancers du sein, afin de rechercher de nouvelles thérapies. L’objectif de cette thèse a été de préciser les effets des RE sur la prolifération cellulaire et l’activation des gènes. Pour cela, nous avons établi des modèles cellulaires bioluminescents de cancer du sein et de l’ovaire, dont la bioluminescence est dépendante des ligands œstrogéniques. Ces lignées nous ont permis de préciser les effets de ligands sélectifs naturels, synthétiques et environnementaux sur l’activation de gènes par les RE α et β. L’autre volet de ce travail a consisté à établir d’autres modèles bioluminescents mammaires et ovariens permettant d’étudier la prolifération cellulaire et tumorale in vitro et in vivo. Nous démontrons également l’intérêt de ces modèles pour l’étude du mécanisme d’acquisition de l’hormono‐résistance et la recherche de nouveaux traitements antitumoraux. Mots clés : cancer – ovaire – sein – prolifération – récepteur des œstrogènes – ligand – résistance. Abstract Estrogen Receptors α and β (ERα and ERβ), which are members of the nuclear receptors superfamily, impact on cell proliferation and differentiation genes expression in an opposite manner. Both transcription factors activity belong to a natural ligand, but also to many environmental molecules, efficient to bind and disrupt their mechanism. Breast and ovarian cancers can be hormono‐dependant cancers. Therapies aimed at counteract ERα positive breast cancers progression are mainly based on its invalidation. Nowadays, two strategies are applied: estrogen production inhibition using aromatase inhibitors, and ERα activity inhibition by anti‐estrogens. On the contrary, hormono‐therapy is not proposed for ovarian cancer treatment, because of a de novo resistance which remains to be better understood. It also appears essential to improve our knowledge about breast cancer resistance acquisition mechanisms, in order to research new therapies. The aim of this work was first to precise estrogen actions on cell proliferation and target genes activation. For that, we established estrogen‐responsive bioluminescent breast and ovarian cancers models. These cell lines allowed us to determine effects of natural, synthetic and environmental selective ligands on natural and synthetic genes activation through ERα and ERβ. The other part of this study consisted in establishing other breast and ovarian bioluminescent cell lines, allowing us to study cell and tumor proliferation in vitro and in vivo. We also show these bioluminescent models relevance to investigate hormono‐resistance acquirement mechanisms and new anti‐tumoral treatments. Key words: cancer – ovarian – breast – proliferation – estrogen receptor – ligand – resistance. 3
SOMMAIRE LISTE DES FIGURES............................................................................................................. 7
LISTE DES TABLEAUX ........................................................................................................ 7
LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................... 8
AVANT PROPOS .................................................................................................................. 11
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................................ 16
A. LES RECEPTEURS DES ŒSTROGENES.................................................................... 17
1. Généralités.................................................................................................................... 17
2. Classification ................................................................................................................ 17
3. Les récepteurs des œstrogènes : structure et fonction .................................................. 20
3.1. Région A/B ............................................................................................................ 21
3.2. Région C ................................................................................................................ 24
3.2.1. Structure ......................................................................................................... 24
3.2.2. L’élément de réponse aux œstrogènes (ERE) ................................................ 26
3.2.3. Dimérisation ................................................................................................... 29
a) Homodimères ................................................................................................... 30
b) Hétérodimères .................................................................................................. 31
3.3. Région D ............................................................................................................... 34
3.4. Région E ................................................................................................................ 34
3.4.1. Structure ......................................................................................................... 34
3.4.2. Liaison au ligand ............................................................................................ 35
3.4.3. Sélectivité du LBD ......................................................................................... 37
3.5. Région F ................................................................................................................ 38
B. LES LIGANDS DES RECEPTEURS DES ŒSTROGENES ......................................... 39
1. Les œstrogènes naturels ............................................................................................... 39
2. Les phyto-œstrogènes et les myco-œstrogènes ............................................................ 42
2.1. Les sources de phyto-œstrogènes .......................................................................... 43
2.1.1. Isoflavones ..................................................................................................... 44
2.1.2. Lignanes ......................................................................................................... 44
2.2. Les sources de myco-œstrogènes .......................................................................... 45
2.3. Phyto-œstrogènes et maladies ............................................................................... 46
3. Les xéno-œstrogènes : des perturbateurs endocriniens ................................................ 50
3.1. Définition et sources.............................................................................................. 50
3.2. Identification des effets ......................................................................................... 51
4. Les ligands synthétiques .............................................................................................. 53
4.1. Molécules pharmaceutiques .................................................................................. 53
4.2. Ligands sélectifs des récepteurs alpha et bêta ....................................................... 58
4
C. MECANISME D’ACTION DES RECEPTEURS DES ŒSTROGENES ...................... 60
1. Voie d’activation classique : transcription directe sur l’ERE ...................................... 61
2. Voie d’activation indirecte : indépendante des ERE .................................................... 65
2.1. Sp1 ......................................................................................................................... 65
2.2. AP-1 ...................................................................................................................... 66
2.3. NF-κB.................................................................................................................... 68
3. Effets non génomiques des œstrogènes........................................................................ 70
D. LES CO-FACTEURS TRANSCRIPTIONNELS ........................................................... 72
1. Les co-activateurs......................................................................................................... 74
2. Les co-répresseurs ........................................................................................................ 76
E. MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES ET SIGNALISATION
HORMONALE .................................................................................................................... 80
1. Phosphorylation............................................................................................................ 80
2. Ubiquitinylation ........................................................................................................... 82
3. Sumoylation ................................................................................................................. 83
4. Méthylation du REα ..................................................................................................... 84
5. Acétylation ................................................................................................................... 84
F. LES FONCTIONS PHYSIOLOGIQUES DES RECEPTEURS DES ŒSTROGENES . 86
1. Distribution tissulaire ................................................................................................... 86
2. Les phénotypes des souris knock-out ........................................................................... 87
2.1. Inactivation du REα chez les souris : REα KO .................................................... 87
2.1.1. L’utérus .......................................................................................................... 87
2.1.2. Le vagin .......................................................................................................... 87
2.1.3. Les ovaires...................................................................................................... 88
2.1.4. La glande mammaire ...................................................................................... 89
2.1.5. Les troubles de la sexualité et de la maternité chez les femelles ................... 89
2.1.6. Le développement de l’appareil reproducteur mâle et les troubles de la
sexualité .................................................................................................................... 90
2.1.7. Le métabolisme osseux .................................................................................. 91
2.1.8. Le tissu adipeux .............................................................................................. 91
2.2. Inactivation du REβ chez les souris : REβ KO ..................................................... 92
2.2.1. La reproduction femelle et mâle..................................................................... 92
2.2.2. Retentissement cardiovasculaire .................................................................... 93
2.2.3. L’os................................................................................................................. 94
2.3. Inactivation des deux RE chez les souris : double KO ......................................... 94
G. LES FONCTIONS PHYSIOPATHOLOGIQUES ASSOCIEES AUX RECEPTEURS
DES ŒSTROGENES ........................................................................................................... 99
1. Les cancers du sein et de l’ovaire................................................................................. 99
1.1. Cancers hormono-dépendants : définition............................................................. 99
1.2. Cancer du sein ....................................................................................................... 99
1.2.1. Evolution et incidence .................................................................................... 99
1.2.2. Facteurs de risque ......................................................................................... 101
5
1.2.3. REα et cancer du sein .................................................................................. 104
1.2.4. Résistance aux thérapies hormonales ........................................................... 108
a) Résistance au tamoxifène ............................................................................... 108
b) Résistance au fulvestrant................................................................................ 110
1.2.5. REβ et cancer du sein ................................................................................... 111
1.3. Cancer de l’ovaire ............................................................................................... 112
1.3.1. Evolution et incidence .................................................................................. 112
1.3.2. Facteurs de risque et facteurs protecteurs .................................................... 113
a) Les facteurs de risque du cancer de l’ovaire : ................................................ 114
b) Les facteurs protecteurs : ............................................................................... 115
1.3.3. RE et cancer de l’ovaire ............................................................................... 116
1.4. RE et cancers du sein et de l’ovaire, invasion, et motilité. ................................. 118
2. Les autres physiopathologies ..................................................................................... 120
2.1. Instabilité vasomotrice ........................................................................................ 120
2.2. L’ostéoporose ...................................................................................................... 120
2.3. Cerveau et comportement.................................................................................... 122
2.4. Le système cardio-vasculaire .............................................................................. 123
2.5. Obésité ................................................................................................................. 124
ARTICLES ET TRAVAUX DE THESE ........................................................................... 125
Caractérisation de la sélectivité et de l’activité de ligands des récepteurs des œstrogènes
alpha et bêta. ......................................................................................................................... 126
Effet différentiel des récepteurs des œstrogènes alpha et bêta sur la transactivation et
la prolifération cellulaire dans un contexte ovarien. ......................................................... 153
Etablissement de modèles cellulaires permettant l’étude de l’effet des récepteurs des
œstrogènes alpha et bêta sur la prolifération cellulaire in vivo. ....................................... 180
Modèles cellulaires mammaire et ovarien bioluminescents résistants au tamoxifène et à
ICI 182,780 ............................................................................................................................ 203
Effet d’un inhibiteur d’histone désacétylase (la TSA) sur les lignées cancéreuses
mammaire MCF-7 et ovarienne BG1 ................................................................................. 227
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................................................. 245
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................... 252
6
LISTE DES FIGURES Figure 1 : Domaines fonctionnels du RE. ................................................................................ 19
Figure 2 : Pourcentages d'homologies entre le REα et le REβ. ............................................... 21
Figure 3 : Localisation et alignement des motifs conservés dans le domaine AF-1 du REα et
du REβ...................................................................................................................................... 22
Figure 4 : Sites de phosphorylation du REα. ........................................................................... 23
Figure 5 : Représentation du domaine C des récepteurs des œstrogènes. ................................ 25
Figure 6 : Structure tridimensionnelle du LBD du REα. ......................................................... 36
Figure 7 : Structure tridimensionnelle canonique du LBD des RN. ........................................ 36
Figure 8 : Modélisation du LBD du REβ complexé avec l’œstradiol. ..................................... 37
Figure 9 : Voies de la stéroïdogénèse....................................................................................... 40
Figure 10 : Les principaux effets des œstrogènes. ................................................................... 42
Figure 11 : Structures moléculaires d’œstrogènes synthétiques et naturels. ............................ 43
Figure 12 : Métabolisation des lignanes. .................................................................................. 45
Figure 13 : Structures topologiques de la zéaralénone et de ses dérivés.................................. 46
Figure 14 : Exemples de structures de perturbateurs endocriniens. ......................................... 51
Figure 15 : Ligands synthétiques sélectifs des récepteurs des œstrogènes. ............................. 59
Figure 16 : Mécanismes d’action du RE. ................................................................................. 60
Figure 17 : Liaison directe à l’ADN (sur la séquence ERE) des homo- et hétéro-dimères du
récepteur des œstrogènes. ......................................................................................................... 63
Figure 18 : Voie d’activation classique des récepteurs des œstrogènes. .................................. 64
Figure 19 : Les différentes voies de la régulation transcriptionnelle par les récepteurs des
œstrogènes. ............................................................................................................................... 69
Figure 20 : Activation différentielle des gènes cibles via la liaison des RE à d’autres facteurs
de transcription. ........................................................................................................................ 69
Figure 21 : Les différents mécanismes de la signalisation œstrogénique. ............................... 71
Figure 22 : Modulation de la transcription via les ERE. .......................................................... 73
Figure 23 : Structure des co-activateurs de la famille p160. .................................................... 75
Figure 24 : Structure schématique des co-répresseurs SMRT et NCoR. ................................. 78
Figure 25 : Co-activateurs et co-répresseurs du REα. ............................................................. 79
Figure 26 : Phosphorylation du REα en réponse à l’œstradiol. ............................................... 81
Figure 27 : Phosphorylation du REα en réponse à l’activation des seconds messagers des
voies de signalisation. .............................................................................................................. 81
Figure 28 : Dégradation du REα. ............................................................................................. 83
Figure 29 : Répartition tissulaire du REα et du REβ dans le corps humain. ........................... 86
Figure 30 : Coupe de l’ovaire humain. ..................................................................................... 88
Figure 31 : Effet de l’invalidation des RE sur l’utérus de modèles murins. ............................ 95
Figure 32 : Evolution de la mortalité par cancers chez la femme et évolution de l’incidence et
de la mortalité des cancers du sein depuis 1950 à 2005. ........................................................ 100
Figure 33 : Evolution de l’incidence et de la mortalité pour les cancers de l’ovaire dans le
monde de 1950 à 2005. .......................................................................................................... 113
LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Récepteurs Nucléaires humains. D’après Gronemeyer et al., 2004. .................... 18
Tableau 2 : Séquences de différents éléments de réponse aux œstrogènes (ERE). ................. 27
Tableau 3 : Phénotypes des souris RE KO. .............................................................................. 97
7
LISTE DES ABREVIATIONS C-terminal(e) : carboxy-terminal(e)
CtBPs : C-terminal binding proteins
A
A : adénine
aa : acides aminés
ADN : acide désoxyribonucléique
AE : anti-œstrogènes
AEBS : antiestrogen-binding site
AF-1/AF-2 : activation function 1 / 2
AhR : aryl hydrocarbon receptor
AI : aromatase inhibitor
AIB1 : amplified in breast cancer 1
AMP : adénosine mono-phosphate
AP-1 : activator protein 1
AR : androgen receptor
ARN : acide ribonucléique
ARNm : ARN messager
ATAC : Arimidex, Tamoxifen, Alone or in
Combination
ATP : adénosine tri-phosphate
D
DBD : DNA binding domain – domaine
de liaison à l’ADN
DCC : dextran coated charcoal
DDE : 1,1-dichloro-2,2-bis(pchlorophenyl)ethylene (pesticide)
DDT : 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4chlorophényl)éthane (pesticide)
DES : diéthylstilbestrol
DFS : desease free survival
DMEM : Dulbecco’s modified eagle’s
medium
DNMT-1 : DNA methyltransferase-1
DPN : 2,3-bis(4-hydroxyphenyl)
propionitrile.
16-OH DHEA : 16-hydroxy déhydroépiandrostènedione
B
BELZ : BG1-ERE-Luc-Zéocine
BELZ-ERβ flag : BELZ surexprimant le
REβ marqué avec une séquence flag
BG1 : lignée cellulaire de carcinome
épithélial ovarien humain
BPA : bisphenol A
BRCA : breast cancer
BRET : bioluminescence resonance energy
transfer
E
E1 : œstrone
E2 : 17β-œstradiol
E3 : œstriol
EcR : ecdysone receptor
EE2 : éthynyl œstradiol
ERB-041 : 2-(3-Fluoro-4hydroxyphenyl)-7-vinyl-1,3 benzoxazol5-ol
ERE : estrogen response element élément de réponse aux œstrogènes
ERR : estrogen receptor-related receptor
C
C : cytosine
cAMP : adénosine-monophosphate cyclique
CAR : constitutive androstane receptor
CBP : CREB binding protein
CDK : cyclin-dependent kinase
CoA : co-activateur
CoR : co-répresseur
CORE : continuing outcomes relative
evaluation
CpG : paire de nucléotides C et G ;
îlots CpG : zone où l'occurrence de ces
paires est élevée
CREB : cAMP response element-binding
F
FAT : factor acetyl transferase
FCS : foetal calf serum
FDA : food and drug administration
FRET : fluorescence resonance energy
transfer
FSH : follicle stimulating hormone
8
G
M
G : guanine
GF : growth factor
GR : glucocorticoid recepteor
GRE : glucocorticoid response element
GRIP : glucocorticoid receptor interacting
protein
MAPK : mitogen-activated protein kinase
MCF-7 : Michigan Cancer Foundation 7, en référence à l'institut de Detroit où la
lignée fut établie -au septième essai-, en
1973, par Herbert Soule et collègues.
Lignée de cellules tumorales mammaires.
MELN : MCF-7 – ERE – Luc - Néo
Mg : magnésium
MORE : multiple outcomes of raloxifene
evaluation
MPP : methyl-piperidino-pyrazole
MR : mineralocorticoid receptor
H
HAT : histone acétyl transférase
HDAC : histone désacétylase
HDACi : inhibiteur de HDAC
HeLa : lignée cellulaire provenant d'un
prélèvement de métastase effectué sur une
patiente atteinte d'un cancer du col de
l'utérus et décédée en 1951, Henrietta Lacks
HELN : HeLa – ERE – Luc – Néo
HER : human epidermal growth factor
receptor
HRE : hormone response element
HRT : hormonal replacement therapy
hsp : heat shock protein
N
NAD+ : nicotinamide adénine
dinucléotide
NCoA : nuclear receptor coactivator
N-CoR : nuclear receptor corepressor
Néo : néomycine
NES : nuclear export sequence
NF-κB : nuclear factor kappa B
NLS : nuclear localisation signal
N-terminal(e) : amino-terminal(e)
I
ICI 182,780 : Faslodex®, anti-œstrogène
stéroïdien ; [(N-n-butyl-N-methyl-11[3,17β-di-hydroxyestra-1,3,5(10)-Trien-7αyl]-undecanamide
IES : intergroup exemestane study
IGF-1 : insulin-like growth factor 1
ip : intra péritonéale
iv : intra veineuse
P
pb : paires de bases
PBDE : poly bromo diphényl éthers
PBP : poly A binding protein
PBPE : N-pyrrolidino-4(phenylmethyphenoxyl)-ethanamine, HCl
PCAF : p300/CBP-associated factor
PCB : polychloro biphenyls
PKA : protéine kinase A
PPAR : peroxisome proliferator-activated
receptor
PPT : 4-propyl-1,3,5-tris(4-hydorxyphényl) pyrazole.
PR : progesterone receptor
PRMT : protein arginine Nmethyltransferase
PXR : pregnane X receptor
K
K : lysine
KO : knock-out
L
L : leucine
LBD : ligand binding domain – domaine de
liaison au ligand
LCoR : ligand-dependent corepressor
LH : luteinizing hormone
Luc : luciférase de luciole
16α-LE2 : 3,17-dihydroxy-19-nor-17αpregna-1,3,5(10)-triene-21,16α-lactone
λ : longueur d’ondes
R
R : arginine
RAC : receptor associated coactivator
RAR : retinoic acid receptor
RD : repression domain
9
SMRT : silencing mediator of retinoic and
thyroid hormone receptors
SNP : single nucleotid polymorphism
Sp1 : specificity protein 1
SRA : steroid receptor RNA activator
SRC : steroid receptor coactivator
STAR : study of tamoxifen and raloxifen
STEAR : selective tissue specific activity
regulator
RE+ : lignée cellulaire RE positive (qui
exprime le RE)
REA : repressor of estrogen receptor
activity
REα : récepteur des œstrogènes alpha
REβ : récepteur des œstrogènes bêta
RFB : retardateur de flamme bromé
RID : receptor interacting domain
RIP140 : receptor interacting protein of
140 kDa
RMN : résonance magnétique nucléaire
RN : récepteur nucléaire
RNA : ribonucleic acid
R,R-THC : R,R-tetrahydrochrysene
RT-qPCR : reverse transcription
quantitative polymerase chain reaction
RXR : retinoid X receptor
T
T : thymine
TBBPA : tétra bromo bisphénol A
TGFβ : transforming growth factor bêta
THS : traitements hormonaux de
substitution
TIF : transcriptional intermediary factor
TR : thyroid receptor
TRAM : thyroid hormone receptor
activator molecule
TSA : trichostatine A
S
S : sérine
SAHA : suberoyl analide hydroxamic acid
sc : sous cutané
SERD : selective estrogen receptor
downregulator
SERM : selective estrogen receptor
modulator
SHBG : sex hormone-binding globulin
SHP : short heterodimer partner
V
VDR : vitamin D receptor
VEGF : vascular endothelial growth factor
8β-VE2 : 8-vinylestra-1,3,5(10)-triene3,17β-diol
10
AVANT PROPOS AVANT PROPOS 11
Avant propos Le cancer est une pathologie due à une prolifération anarchique des cellules. Ces dernières se divisent sans contrôle, indéfiniment, et n’assurent plus aucune fonction utile à l’organisme. Au niveau cellulaire, le cancer correspond à une perte des fonctions de régulation de la cellule normale telles que la prolifération, la mort cellulaire et la communication intercellulaire. En effet, dans les tissus sains, la prolifération cellulaire a pour but de maintenir l’intégrité d’un tissu, en compensant les pertes naturelles et/ou accidentelles. La plupart des cancers se développent selon un processus décomposé en plusieurs étapes. La première est celle dite de l’initiation. Cette étape, responsable d’altérations permanentes de l’ADN, conduit à des mutations, et peut permettre l’émergence d’une cellule cancéreuse. La seconde étape est la promotion, au cours de laquelle les mutations ainsi que les agents promoteurs (tels que des facteurs de croissance, des hormones, etc.) induisent la modification du phénotype de la cellule, entraînant une transformation de celle‐ci. Ceci aboutit à un avantage sélectif pour la cellule, avec le plus souvent une prolifération continue, un arrêt de la différenciation et une absence d’apoptose. Cette étape de promotion est donc celle qui entraîne la formation d’une tumeur à partir de cellules ayant une altération préalable. Enfin, la progression tumorale correspond à l’acquisition des différents caractères liés à la malignité. En effet, toutes les tumeurs ne deviennent pas malignes, certaines tumeurs cessant de croître à cette étape et restant bénignes. Cependant, lorsque la tumeur devient maligne, elle acquiert la capacité à développer des métastases, et quelquefois de résister aux traitements. Le cancer du sein et le cancer de l’ovaire sont responsables de la majorité des décès prématurés par cancer chez la femme. De nombreux facteurs génétiques, hormonaux et environnementaux sont impliqués dans les processus de développement de ces deux cancers. Environ 70% des cancers du sein et la majorité des tumeurs épithéliales de l’ovaire sont hormono‐dépendants, cʹest‐à‐dire qu’ils expriment les récepteurs des œstrogènes (RE) et de la progestérone (PR). L’expression du RE dans ces cancers rend leur prolifération sensible aux œstrogènes. Il existe deux isoformes du RE, le REα et le REβ, qui se distinguent par leur distribution tissulaire et leur capacité à activer des cibles différentes. Ces deux isoformes du récepteur des œstrogènes sont exprimés dans le sein et l’ovaire, mais il existe des variations caractéristiques du niveau d’expression au cours des phénomènes d’hyperplasie. Le mécanisme d’action des RE est complexe et fait intervenir de nombreuses protéines impliquées dans diverses voies de signalisation. 12
Avant propos Le caractère hormono‐dépendant de la majorité des cancers du sein RE positifs a permis de développer une stratégie de traitement thérapeutique hormonal. Les moyens thérapeutiques hormonaux sont au nombre de quatre : l’hormono‐thérapie soustractive (suppression ovarienne chirurgicale ou radio‐thérapeutique), l’hormono‐thérapie compétitive (anti‐œstrogènes), l’hormono‐
thérapie additive (blocage de l’axe hypophyso‐ovarien par des progestatifs) et l’hormono‐thérapie inhibitrice (inhibition de la conversion des stéroïdes précurseurs en œstrogènes avec les inhibiteurs d’aromatase). L’hormono‐thérapie compétitive consiste à cibler directement le REα par l’utilisation de ligands pharmaceutiques antagonistes, tels que le tamoxifène et le fulvestran (ICI 182,780). Cependant, après une période de réponse à ces traitements dont la durée est variable, certaines tumeurs développent une résistance menant à l’insensibilité de la tumeur à la thérapie, allant parfois jusqu’à induire la prolifération tumorale. D’autre part, bien qu’une grande partie des cancers de l’ovaire exprime les RE, seulement une minorité répond au traitement hormonal contre près de 70% pour le cancer du sein. C’est pourquoi l’hormono‐thérapie n’est pas utilisée pour traiter le cancer de l’ovaire. A ce jour, plusieurs groupes de recherche ont émis l’hypothèse selon laquelle le REβ jouerait un rôle antiprolifératif dans les cellules de cancer du sein REα positives, contrairement au REα qui est connu pour entraîner la prolifération cellulaire. De récentes études suggèrent que le REβ agirait en réduisant la prolifération cellulaire induite par le REα. Cet isoforme apparaît alors comme une cible potentielle pour le développement de thérapies basées sur l’utilisation d’agonistes sélectifs du REβ. Une meilleure compréhension du rôle des œstrogènes et des mécanismes d’action de leurs récepteurs dans la progression tumorale mammaire et ovarienne est essentielle. D’importants progrès restent à faire concernant le rôle du REβ ainsi que son utilité thérapeutique. De même, l’étude des effets des molécules environnementales sur les deux isoformes du RE, décrites comme étant des perturbateurs endocriniens, constitue un intérêt majeur. Enfin, la compréhension de l’acquisition de la résistance à la thérapie anti‐hormonale et de ses mécanismes est essentielle. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail a été, à partir de nouveaux modèles cellulaires bioluminescents de cancer du sein et de l’ovaire, d’étudier les effets des récepteurs des œstrogènes sur la prolifération cellulaire et sur l’activation de gènes cibles. 13
Avant propos ¨ Dans la première partie de ce manuscrit, je présenterai une étude bibliographique concernant les acteurs de la signalisation œstrogénique, tels que les récepteurs des œstrogènes et leurs co‐
régulateurs transcriptionnels. Seront également décrits leurs ligands, naturels, environnementaux et synthétiques, ainsi que les modifications post‐traductionnelles que subissent les RE. Leurs mécanismes d’action seront définis, ainsi que leurs fonctions physiologiques. J’exposerai enfin le rôle des œstrogènes et des RE dans différentes pathologies, notamment les cancers du sein et de l’ovaire. Les chapitres suivants présentent les travaux effectués au cours de ma thèse. Mon travail a consisté à mettre au point des lignées cellulaires permettant l’étude de l’activation des récepteurs des œstrogènes alpha et bêta par des ligands naturels, synthétiques, et environnementaux in vitro et in vivo. ¨ Dans une seconde partie, un travail portant sur l’étude du rôle de la partie amino‐terminale des récepteurs des œstrogènes sera exposé. Ce travail a été effectué en utilisant des lignées cellulaires bioluminescentes, exprimant les deux isoformes du RE entiers ou délétés de leur domaine A/B. Elles ont été développées à partir d’une lignée épithéliale humaine issue de cancer du col de l’utérus (HeLa) RE négatives. Ces outils nous ont permis de mettre en évidence le rôle répresseur du domaine A/B du REβ dans le contexte cellulaire HeLa. Ces travaux vont être soumis à publication dans Biochemical Pharmacology. Escande A, Busson M, Garcia A, Grimaldi M, Bellet V, Pillon A, Cavaillès V and Balaguer P. Differential response of estrogen receptor beta and delta AB domain estrogen receptor beta to partial and full estrogen agonists. ¨ Dans la troisième partie, j’exposerai l’étude des interférences transcriptionnelles entre les deux isoformes du RE. Pour ce faire, j’ai établi dans un contexte cellulaire RE positif, un modèle qui exprime le REβ constitutivement. Les modèles cellulaires bioluminescents établis sont dérivés de la lignée épithéliale humaine issue d’un cancer ovarien, BG1, exprimant le REα de manière endogène. Dans ces lignées, et en utilisant des ligands sélectifs des REα et REβ, nous avons pu montrer que la transactivation et la prolifération cellulaire sont différemment régulées par les deux RE. Nous démontrons que les effets des ligands varient selon l’expression relative des deux isoformes, laissant penser que les RE existent dans nos modèles cellulaires sous forme 14
Avant propos d’homo‐ et/ou d’hétéro‐dimères. Cette étude a donné lieu à un article qui va être soumis prochainement dans le journal Toxicological Sciences. Garcia A, Busson M, Bellet V, Escande A, Muhn P, Cavaillès V and Balaguer P. ERα/ERβ ratio influence estrogen receptor ligands induced transactivation and proliferation of human BG1 ovarian cancer cells. ¨ Dans la quatrième partie, l’établissement d’un modèle cellulaire bioluminescent, permettant l’étude de la régulation de la prolifération tumorale in vivo par les récepteurs des œstrogènes sera décrit. Ce modèle a été réalisé à partir de la lignée BG1, et exprime la luciférase de façon constitutive. L’expression de la luciférase dans ces cellules permet de suivre la prolifération tumorale de l’animal sans sacrifice. Nous avons validé l’utilisation de ce modèle pour des études in vivo. Cette lignée cellulaire permet, par xénogreffe, d’étudier la croissance tumorale ovarienne, ainsi que la formation de métastases. Ce travail sera présenté sous forme d’article. Busson M, Garcia A, Lazennec G, Cavaillès V and Balaguer P. A novel in vivo model of estrogen responsive ovarian cancer using non‐invasive bioluminescence imaging. ¨ La cinquième partie sera consacrée à l’établissement de modèles cellulaires originaux qui permettront d’étudier la résistance à l’hormono‐thérapie. Nous avons établi, à partir des lignées cellulaires MCF‐7 et BG1 exprimant la luciférase, des clones cellulaires résistants aux conditions de culture sans œstrogènes, ou avec les anti‐œstrogènes tamoxifène ou ICI 182,780 (fulvestran). Ces modèles cellulaires ont été établis in vitro et validés in vivo. Ce travail sera décrit sous forme d’article en français. Busson M, Garcia A, Gurdak M, Balaguer P, Cavaillès V, Badia E. Cancers du sein et de l’ovaire hormono‐dépendants : Mécanismes de la résistance aux thérapies hormonales. ¨ Enfin, dans la dernière partie, un regard critique sur les résultats, les déductions, hypothèses, et perspectives de ce travail seront présentés. 15
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 16
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes A. LES RECEPTEURS DES ŒSTROGENES
1. Généralités
Les récepteurs des œstrogènes (RE) appartiennent à la superfamille des récepteurs nucléaires (RN) (Evans, 1988; Mangelsdorf et al., 1995). Les RN représentent la plus grande famille de facteurs de transcription connue chez les eucaryotes, et ont pour fonction de relayer les messages hormonaux (Escriva et al., 2000). D’un point de vue physiologique, les récepteurs nucléaires sont directement impliqués dans le contrôle de grandes fonctions comme la reproduction, la différenciation cellulaire, le métabolisme ou lʹhoméostasie (Chawla et al., 2001). Les récepteurs nucléaires sont apparus très tôt au cours de l’évolution et sont au nombre de 48 chez l’homme. Leur identification biochimique date de 1960 (Jensen, 2004) mais leur appartenance à une grande famille de facteurs de transcription est connue depuis tout juste 20 ans (Green et al., 1986b). L’étude des récepteurs nucléaires couvre de nombreux domaines depuis l’analyse des mécanismes de régulation de la transcription jusqu’au développement de drogues agonistes ou antagonistes et leurs éventuelles exploitations pour la thérapie en particulier des cancers et des pathologies métaboliques. 2. Classification
Les récepteurs nucléaires sont regroupés en plusieurs sous‐familles qui incluent les récepteurs aux hormones thyroïdiennes (TR), à l’acide rétinoïque (RAR), à la vitamine D (VDR), à l’ecdysone (EcR), les récepteurs contrôlant l’activation de la prolifération des péroxysomes (PPARs), ainsi que les récepteurs des xénobiotiques comme PXR ou CAR, les récepteurs aux rétinoïdes (RXR), les récepteurs aux hormones stéroïdiennes telles que les glucocorticoïdes (GR), les androgènes (AR), les minéralocorticoïdes (MR), les progestatifs (PR, pour Progesterone Receptor), les œstrogènes (RE), ainsi que les récepteurs orphelins comme ERR (Estrogen‐Related Receptor), SHP (Short Heterodimer Partner) (Aranda and Pascual, 2001; Escriva et al., 2000). Ces RN sont classés en six groupes selon une nomenclature phylogénique de forme NRxyz où x représente la sous‐famille, y indique le groupe et z, le gène (Gronemeyer et al., 2004) (Tableau 1). 17
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes Tableau 1 : Récepteurs Nucléaires humains. D’après Gronemeyer et al., 2004.
18
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes Par exemple, les récepteurs des œstrogènes α et β (REα et REβ), qui appartiennent respectivement à la catégorie NR3A1 et NR3A2, sont classés dans la troisième famille des RN, aux côtés des ERR, GR, MR, PR et AR. Les RE forment alors le premier groupe (A) de cette sous‐famille et sont codés par deux gènes, désignés respectivement 1 et 2 ce qui correspond aux formes REα et REβ. Le groupe B est composé par les ERR et les autres récepteurs nucléaires de cette troisième famille appartiennent au groupe C. Un grand nombre de récepteurs dont les ligands naturels ne sont pas connus, sont appelés récepteurs nucléaires orphelins. Parmi ces récepteurs, nous retrouvons les ERR présents dans la classe III des RN. Les RN dérivent probablement d’un ancêtre commun dont l’origine reste controversée. Il est probable que la molécule ancestrale ait été un facteur de transcription orphelin constitutivement actif qui aurait acquis, au cours de l’évolution, la capacité de lier un ligand et d’hétérodimériser (Gronemeyer et al., 2004). Les Récepteurs Nucléaires présentent des homologies de structure. En effet, un RN typique est une protéine qui contient une région N‐terminale variable (A/B), un domaine de liaison à l’ADN (C) (DBD pour DNA Binding Domain) conservé, une région charnière variable (D), un domaine de liaison au ligand (E) (LBD pour Ligand Binding Domain), et une région C‐terminale variable (F) (Figure 1). Ce sont ces domaines qui ont permis de classer les RN en différentes sous‐familles, en fonction de leurs propriétés de liaison au ligand, de liaison à l’ADN, et de dimérisation (Chawla et al., 2001). Figure 1 : Domaines fonctionnels du RE.
D'après Kumar et al., 1987 et Koehler et al., 2005
19
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes Notre travail portant sur l’étude des Récepteurs des Œstrogènes (RE), seules leurs structures seront présentées ici. 3. Les récepteurs des œstrogènes : structure et fonction
Une des premières études portant sur la liaison de l’œstradiol à un récepteur date des années 1960 (Jensen and DeSombre, 1973). C’est l’équipe de Jensen, en 1962, qui avait commencé ces études et avait émis l’hypothèse de l’existence du récepteur des œstrogènes (Jensen, 1962). En utilisant de l’œstradiol tritié, ils ont montré une liaison préférentielle des œstrogènes dans l’utérus et le vagin. Ces études ont été élargies par Noteboom et Gorski en 1965 qui ont montré que le RE était probablement une protéine (Noteboom and Gorski, 1963; Noteboom and Gorski, 1965). L’équipe de Gorski a également montré que les interactions entre ce récepteur et l’œstradiol sont impliquées dans la transmission des effets de cette hormone (Toft and Gorski, 1966). Leurs travaux se sont basés sur des études du système hormonal qui ont suggéré que les hormones peuvent avoir des effets dans des tissus cibles grâce à des récepteurs (Hechter and Halkerston, 1965). Il existe deux isotypes du Récepteur des Œstrogènes. Le récepteur des œstrogènes alpha (REα) a été le premier cloné, en 1986 (Green et al., 1986a; Green et al., 1986b). Il a été isolé de la lignée humaine de cancer du sein MCF‐7. On a longtemps pensé qu’il était responsable de tous les effets biologiques et pharmacologiques des œstrogènes et des anti‐œstrogènes naturels ou synthétiques. Le deuxième RE connu est le récepteur des œstrogènes bêta (REβ), qui a été identifié en 1996 dans la prostate de rat par clonage à l’aide d’amorces de PCR aléatoires (Kuiper et al., 1997; Mosselman et al., 1996). Les gènes des deux RE sont portés par des chromosomes différents. Le REα est localisé sur le chromosome 6 (Menasce et al., 1993) et le REβ sur le chromosome 14. Ils possèdent tous deux des différents variants d’épissage (Kuiper et al., 1997). Ceci suggère que les deux RE sont codés par des gènes indépendants et sont distincts (Pearce and Jordan, 2004). Bien que les domaines de liaison à l’ADN (DBD) des deux récepteurs soient très similaires (environ 96% d’homologie), le degré d’homologie de leur structure entière n’est pas très élevé (47%) (Figure 2) (Pearce and Jordan, 2004). C’est particulièrement le cas du domaine de liaison au ligand (LBD), pour lequel seulement 55% de la séquence en acides aminés (aa) est identique (Witkowska et al., 1997). Par 20
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes contre, seuls deux aa impliqués dans la liaison au ligand sont différents. Ceci explique les différences d’affinité de certains ligands pour ces deux récepteurs. En ce qui concerne la taille des protéines, les traductions in vitro du REα et du REβ ont été réalisées par l’équipe de Ogama et coll. et ont révélé des différences de taille (Ogawa et al., 1998). En effet, les produits de traduction du REα donnent deux protéines de 66k Da et de 55 kDa, alors que ceux du REβ donnent deux protéines de 60 kDA et de 57 kDA. Figure 2 : Pourcentages d'homologies entre le REα et le REβ.
D'après Saunders, 1998 et Gustafsson, 1999.
3.1. Région A/B
La région A/B est située du côté N‐terminal des RN. C’est la région la plus variable entre les différents récepteurs, tant au niveau de la taille que de la séquence, y compris lorsqu’il s’agit d’isoformes d’un même récepteur obtenus par épissage alternatif ou par l’intermédiaire de promoteurs alternatifs (Germain P., 2003). Cette région contient un domaine d’activation de la transcription ligand‐indépendante, AF‐1 (Activating Function 1) qui est dépendant du promoteur et du contexte cellulaire. Il permet la spécificité d’action des SERM (Selective Estrogen Receptor Modulator). C’est par exemple le cas pour le tamoxifène, un anti‐œstrogène utilisé dans le traitement du cancer du sein, qui peut présenter selon le type cellulaire, un effet agoniste partiel via la fonction AF‐1 du REα, ou antagoniste complet (Kumar et al., 1987; Tzukerman et al., 1994). A 21
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes l’inverse, aucune activité agoniste partielle du tamoxifène n’a été observée avec le REβ dans des cellules cancéreuses du sein ou de l’endomètre (Castro‐Rivera and Safe, 2003). Cette région N‐terminale est peu conservée entre les RE (15‐18% d’homologie) avec un domaine A/B du REβ plus court d’environ 35 acides aminés, ainsi réduit à 148 acides aminés. Cette différence pourrait expliquer que dans certains contextes cellulaires, le REβ semble avoir une transactivation N‐terminale moins active que le REα (Delaunay et al., 2000; Katzenellenbogen et al., 1997). Malgré cela, la même séquence de 6 acides aminés est présente dans les deux récepteurs (Figure 3) (Escriva et al., 2000). Dans le REα, ce motif fait partie de la boite 1, bien conservée, qui a été définie comme étant un des sous‐domaines contrôlant l’activité de AF‐1 (Tora et al., 1989a; Tora et al., 1989b). Consensus
(49)
PAVXNY
REα humain (49)
PAVYNY
REβ humain (6)
PAVMNY
Figure 3 : Localisation et alignement des motifs conservés dans le domaine
AF-1 du REα et du REβ.
D’après Escriva et al., 2000.
La position du résidu proline est indiquée entre parenthèses.
D’autres études ont montré que la région A/B, par l’intermédiaire du domaine AF‐1, recrute différents co‐facteurs tels que SRA (Steroid Receptor RNA Activator) (Lanz et al., 1999) ou la protéine p68 (Endoh et al., 1999) pour le REα, modulant ainsi son activité, comme nous le verrons plus loin dans la partie consacrée aux co‐facteurs. D’autre part, cette région A/B est la cible des phosphorylations de résidus sérine et thréonine, (Figure 4) médiées par différentes voies de signalisation qui peuvent affecter de manière significative l’activité transcriptionnelle (Shao and Lazar, 1999). L’activité ligand‐indépendante du RE peut également être modifiée par la phosphorylation d’une tyrosine conservée dans la région carboxy‐terminale (Tora et al., 1989b). Les phosphorylations du REα ont lieu sur différents sites de la protéine, et sont réalisées par différentes kinases : PKA (Protein Kinase A) (Shiau et al., 1998), MAPK (Mitogen‐Activated Protein Kinase) (Endoh et al., 1999). Le REβ peut également être phosphorylé sur plusieurs sérines par les MAPK (Tremblay et al., 1999). Ces modifications permettent de réguler différents aspects 22
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes fonctionnels du récepteur, incluant la liaison à l’ADN et la dimérisation, les interactions avec les co‐
facteurs et l’affinité de liaison avec le ligand (Shao and Lazar, 1999). Figure 4 : Sites de phosphorylation du REα.
D’après Pearce and Jordan, 2004.
Les kinases et les ligands induisent des phosphorylations à des sites spécifiques.
Une étude comparative de la région N‐terminale des deux RE a montré que le REα est capable de se lier à une TBP (TATA Box‐Binding Protein) alors que le REβ ne l’est pas (Warnmark et al., 2001b). La TBP joue un rôle central dans la machinerie de transcription basale permettant le recrutement plus efficace de la TBP à la TATA box. La différence de liaison avec la TBP de la région N‐terminale des deux RE permet d’appuyer l’hypothèse selon laquelle la région A/B du REα et celle du REβ utilisent différents ensembles de protéines cibles. Ceci est en accord avec des travaux ayant montré des différences fonctionnelles entre les régions N‐terminales des deux RE. Par exemple, des études ont mis en évidence que le domaine AF‐1 du REα pouvait fonctionner de manière autonome, alors que celui du REβ n’en était pas capable (Escriva et al., 2000; Tora et al., 1989a). Tous ces travaux laissent penser que les interactions de la région A/B avec d’autres protéines permettent la stabilisation de la structure N‐terminale des RE. Ces liaisons mettent également en jeu un mode de liaison complexe et dynamique pour les régions A/B afin de réaliser l’activation transcriptionnelle, où la région est capable de former différentes conformations dépendantes des partenaires de liaison (Warnmark et al., 2001b). 23
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes 3.2. Région C
3.2.1. Structure
La région C est la région la plus conservée dans la famille des récepteurs nucléaires. Elle contient le domaine de liaison à l’ADN ou DBD pour DNA Binding Domain, permettant aux récepteurs de reconnaître spécifiquement leurs séquences cibles HRE (Hormone Response Element) (Germain P., 2003). Le HRE des récepteurs des œstrogènes est appelé ERE (Estrogen Response Element) (Chawla et al., 2001). Cette séquence d’ADN est courte mais très spécifique, et se trouve au niveau des promoteurs des gènes cibles, afin d’activer leur transcription. Elle forme un palindrome composé de deux hexanucléotides séparés par trois paires de bases dont la séquence consensus est AGGTCAnnnTGACCT (Chawla et al., 2001; Klinge, 2001). Le récepteur se lie aux ERE sous forme de dimères. Le DBD comporte une séquence centrale de 66 à 68 aa très conservée qui contient deux structures en doigt de zinc responsables de la reconnaissance du RE avec l’ERE. Comme elle est très conservée entre le REα et le REβ (96% d’identité, ils ne diffèrent que par 3 acides aminés), elle leur permet de se lier aux mêmes cibles (Pearce and Jordan, 2004). Le DBD contient 9 cystéines, de même que d’autres résidus conservés dans la superfamille des récepteurs nucléaires et qui sont requis pour permettre une forte affinité de liaison à l’ADN (Aranda and Pascual, 2001). Dans chaque doigt de zinc, 4 des cystéines invariables sont engagées dans des liaisons tétraédriques avec l’ion zinc (Zn2+), et les deux doigts de zinc forment ensemble une structure compacte et rigide (Cheskis et al., 2007) (Figure 5 (a)). Cette organisation particulière a été initialement étudiée par résonnance magnétique nucléaire (RMN) pour le récepteur des œstrogènes et le récepteur aux glucocorticoïdes (Katzenellenbogen et al., 1995; Schwabe et al., 1990), et ultérieurement par cristallographie, sous une forme liée avec l’ADN (Schwabe et al., 1993). La spécificité de l’interaction avec les séquences consensus de l’ADN au niveau des promoteurs des gènes cibles (ERE) est définie par une séquence du premier doigt (le plus N‐terminal) dans une région appelée « P box » (Green et al., 1988). D’autre acides aminés, situés dans le second doigt de zinc, forment la « D box » et sont impliqués dans la dimérisation du récepteur (Figure 5 (a)). 24
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes Figure 5 : Représentation du domaine C des récepteurs des œstrogènes.
D’après Ruff et al., 2000 et Germain P., 2003.
(a) Représentation schématique de la région C des RN, avec structures en doigt de zinc. Les résidus
formant la « P box » et la « D box » sont représentés.
(b) Structure tri-dimensionnelle du DBD d’un dimère de RE interagissant avec l’ERE. Les hélices α
des « P box » sont représentées, elles sont logées dans le grand sillon de l’ADN. La
représentation du dimère ici montre l’engagement de la « D box » dans la dimérisation. On peut
également observer les hélices α carboxy-terminales orientées perpendiculairement à celles de la
« P box ».
Le DBD contient deux hélices α : la première commence au niveau de la troisième cystéine du premier doigt de zinc, et est appelée hélice de reconnaissance, car elle se loge directement dans le grand sillon de l’ADN et réalise un contact avec les bases qui composent l’ERE (Figure 5 (b)). La seconde hélice α commence après la « D box ». Ces deux structures hélicoïdales sont repliées perpendiculairement l’une par rapport à l’autre, protégeant ainsi leurs parties hydrophobes. Le doigt 25
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes de zinc N‐terminal, contenant plusieurs acides aminés hydrophobes, est replié vers le centre de la structure et a des contacts avec les deux hélices α, ainsi qu’avec la partie C‐terminale de la région C. Le doigt de zinc C‐terminal est orienté vers l’extérieur (Aranda and Pascual, 2001). 3.2.2. L’élément de réponse aux œstrogènes (ERE)
Pour réguler la transcription, les récepteurs se lient au niveau de séquences qu’ils reconnaissent spécifiquement sur l’ADN, appelées éléments de réponse aux hormones ou HRE, localisées dans la région 5’ des gènes cibles (Aranda and Pascual, 2001; Gruber et al., 2002b). Ainsi, une interaction génomique directe se produit entre le complexe RE‐ligand et des séquences spécifiques d’ADN appelées éléments de réponse aux œstrogènes, ERE (Klein‐Hitpass et al., 1988b; Klein‐Hitpass et al., 1986; Walker et al., 1983; Walker et al., 1984). Généralement, les REα et les REβ sont capables de former des homo‐ et des hétérodimères qui se fixent sur l’ADN (Pettersson et al., 1997). Les deux isoformes présentent des affinités différentes pour les divers ERE et entraînent donc différents effets sur la transcription au même site (Kulakosky et al., 2002). Bien que ces séquences se situent généralement dans la région promotrice, elles peuvent quelquefois se trouver à des kilobases du site d’initiation de la transcription en amont, ou parfois en aval du promoteur. A la fin des années 1980, Klein‐Hitpass et coll. ont décrit des séquences palindromiques présentant une forte affinité de liaison avec le RE et répondant aux œstrogènes (Klein‐Hitpass et al., 1988b). Ce palindrome était composé de 13 paires de bases (pb) : 5’‐GGTCA CAG TGACC‐3’. La spécificité de cette séquence pour le RE a été mise en évidence grâce à des tests de liaison du RE en comparaison avec le récepteur aux glucocortocoïdes (GR). En effet, le GR n’était pas capable de lier cette séquence d’ADN in vitro, bien que le GRE présente une séquence proche de celle de l’ERE. Les ERE sont donc des séquences palindromiques spécifiques du RE, séparées par 3 nucléotides non spécifiques : 5’‐GGTCAnnnTGACC‐3’. Ces séquences palindromiques sont appelées séquences consensus de l’ERE (Hall et al., 2001; Klinge, 2001; Nilsson and Gustafsson, 2002). De plus, il apparait que la symétrie de l’ERE facilite la liaison des homodimères du RE (Kumar and Chambon, 1988; Notides et al., 1981). Cette séquence a donc été décrite comme étant la séquence minimum présentant les qualités essentielles pour lier le RE et pour médier l’induction des gènes répondant aux œstrogènes (Klein‐Hitpass et al., 1986). 26
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes De nombreuses études se sont portées sur les séquences des ERE, et il en ressort que l’enchainement des bases des ERE diffère souvent du motif de base de cette séquence consensus. Les gènes humains contenant des ERE fonctionnels sont – pour exemple – le gène de la vitellogénine A2 (Walker et al., 1983), le gène pS2 (Jeltsch et al., 1987), le gène de l’ocytocine (Richard and Zingg, 1990), c‐fos (Weisz and Rosales, 1990), c‐myc (Weisz and Bresciani, 1988), TGF‐α (El‐Ashry et al., 1996), le gène de la lactoferrine (Teng et al., 1992), le gène de la prolactine (Berwaer et al., 1994), le gène du récepteur PR (Kraus et al., 1994), le gène de la Cathepsine D (Augereau et al., 1994), et d’autres… Tableau 2 : Séquences de différents éléments de réponse aux œstrogènes (ERE).
Gène
Séquence ERE
Référence
Consensus
GGTCAnnnTGACC
Klein-Hitpass et al., 1986
Vitellogénine A2
GGTCAcagTGACC
Walker et al., 1984
pS2
GGTCAcggTGGCC
Berry et al., 1989
Lactoferrine
GGTCAaggTAACC
Teng et al., 1992
Complément 3
GGTGGcccTGACC
Fan et al., 1996
Des travaux récents ont comparé les effets de la liaison des deux isoformes du RE sur différents palindromes répétés, pour lesquels l’espacement entre deux ERE est nommé n, et n est variable (0 à 4) (El Marzouk et al., 2008). Ces travaux ont rapporté que les deux isoformes se lient avec des affinités similaires aux différents tandems d’ERE, mais que cette affinité diminue graduellement avec l’augmentation du nombre de n, à l’exception du tandem pour lequel n=3 (soit 4 ERE), qui présente une affinité similaire à celui pour lequel n=0 (soit un seul ERE) (El Marzouk et al., 2008). De plus, cette étude s’est portée sur la même comparaison des affinités de liaison des deux isoformes sur les différents ERE, mais en présence d’un co‐activateur (HMGB1). Ce co‐activateur est connu pour augmenter l’affinité de liaison du REα sur les ERE (Das et al., 2004; Melvin et al., 2004; Romine et al., 1998). Effectivement, les résultats étaient en accord avec les études précédentes et ont montré que ce co‐activateur augmente l’affinité de liaison du REα avec l’ERE, et de même pour le REβ (El Marzouk et al., 2008). Ces résultats laissent penser que la présence de co‐activateurs peut contrebalancer la moins bonne affinité de liaison du RE à certains ERE, et que cette affinité de liaison entre le RE et les ERE ne représente que le premier niveau de sélectivité. D’autres niveaux tels que l’action des co‐
27
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes facteurs, la structure de la chromatine, sont essentiels pour assurer une bonne affinité de liaison et la spécificité fonctionnelle (ce point sera développé par la suite). Des études ont montré un synergisme, cʹest‐à‐dire plus qu’une induction additive, de l’activation de l’expression du gène rapporteur pour la liaison du REα à des ERE adjacents (Martinez and Wahli, 1989), et également que la distance entre les éléments de réponse était importante dans l’intensité de l’induction du gène rapporteur (Wahli and Martinez, 1991). De nombreux travaux ont décrit le synergisme transcriptionnel des multiples ERE pour le REα (de Haan et al., 2000; Klinge, 1999; Mattick et al., 1997; Sathya et al., 1997; Tyulmenkov et al., 2000). Pour les deux isoformes REα et REβ, une synergie d’activation de la transcription du gène rapporteur a été détectée pour trois copies d’ERE, mais pas pour deux copies (Sathya et al., 1997; Tyulmenkov et al., 2000). Ces observations étaient en accord avec d’autres travaux qui on montré une meilleure affinité de liaison du REα à 3 ou 4 ERE plutôt que 1 ou 2 copies de l’ERE (Klinge et al., 1992; Klinge et al., 1998; Klinge et al., 1996). Bien que le mécanisme de cette synergie reste peu clair, il apparait que le LBD et le domaine A/B soient tous deux requis (Massaad et al., 1998). Il a également été déduit que la région AF‐1 n’est pas nécessaire pour la synergie transcriptionnelle des 3 ou 4 copies de l’ERE, car le REα et le REβ présentent la même synergie, même si l’activation de la transcription par le REβ reste plus faible que celle du REα (McInerney et al., 1998b; Tyulmenkov et al., 2000). Cependant, certaines études ont rapporté que la synergie transcriptionnelle pour des tandems d’ERE semble être spécifique du type cellulaire étudié (Klinge, 2001), à savoir par exemple les facteurs cellulaires ou même les co‐
activateurs qui peuvent différer selon le type cellulaire. Enfin, des différences notables entre le REα et le REβ ont pu être décrites. Effectivement, il a été rapporté dans de nombreuses études que le REα présente une meilleure transactivation des gènes cibles via l’ERE que le REβ (Anolik et al., 1995; Hall and McDonnell, 1999; Jones et al., 1999; Kulakosky et al., 2002; Mosselman et al., 1996; Tyulmenkov et al., 2000; Vasudevan et al., 2001). Effectivement, plusieurs équipes ont montré par transfection transitoire que l’activité transcriptionnelle du REβ est 2 à 5 fois moindre que celle du REα pour divers promoteurs contenant des ERE (Bowers et al., 2000; Klinge et al., 2000; McInerney et al., 1998b), et de plus que les deux isoformes présentent des réponses différentes aux anti‐œstrogènes (McInerney et al., 1998b; Paech et al., 1997) voire même opposées (Hall and McDonnell, 1999; Pettersson et al., 2000). D’autre part, des études ont montré que la troncature de la partie N‐terminale du REα diminue la transcription induite par E2 mais pas celle du REβ (Delaunay et al., 2000). Une autre étude a mis en évidence que la 28
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes délétion de la partie N‐terminale du REβ diminuait l’interaction REβ‐ERE indépendamment de E2 (Huang et al., 2005b). De plus, à cause de leur différence de comportement lors de la délétion de la partie N‐terminale, il est également possible d’émettre l’hypothèse que les différences de transactivation observées entre le REα et le REβ pourraient être dues (au moins en partie) aux différences dans leur région N‐terminale (région structurale la moins conservée entre les deux isoformes), et que les TATA‐box‐Binding protéines interagissent avec la partie N‐terminale du REα mais pas avec celle du REβ (Cowley and Parker, 1999; Delaunay et al., 2000; Huang et al., 2005b; Warnmark et al., 2001b). Le mécanisme de transactivation du RE isoforme‐spécifique reste encore aujourd’hui peu clair. Cependant, l’hypothèse émergente serait que le domaine A/B, spécifique de chaque RE (i.e. la partie N‐terminale de la protéine), définit l’activité transcriptionnelle de chaque isoforme dans la voie de signalisation dépendante de l’ERE (Huang et al., 2006; Li et al., 2008). Cependant, la communauté scientifique émet une réserve sur cette hypothèse, puisque l’altération des interactions REβ‐ERE par le domaine A/B est un facteur qui contribue, mais qui n’est pas suffisant pour expliquer l’inefficacité transcriptionnelle du REβ (Nott et al., 2008). De même, il semblerait que la partie C‐terminale des deux RE joue un rôle dans cette différence d’activité transcriptionnelle (Safe, 2001). Et de plus, bien que les mécanismes impliqués restent encore à éclaircir, les caractéristiques distinctes des parties N‐ et C‐terminales sont supposées responsables de l’expression génique spécifique de chaque RE (Kushner et al., 2000b; Safe, 2001). Toutes ces données indiquent donc une différence fondamentale dans le comportement du REα et celui du REβ en corrélation avec leurs différences structurales ainsi que leur liaison avec l’ERE. 3.2.3. Dimérisation
Les deux isoformes du RE présentent une grande homologie dans le domaine C, associé à la liaison à l’ADN et à la dimérisation, et dans le domaine E, impliqué dans la liaison au ligand, la dimérisation, ainsi que l’interaction avec d’autres cofacteurs (Klinge, 2000; Pike et al., 1999; Webb et al., 1999). Ces deux domaines (C et E) sont nécessaires pour la dimérisation. Après la liaison au ligand, les monomères du RE subissent des changements conformationnels qui rendent accessibles les séquences requises pour la dimérisation, et ainsi se forme une interface de dimérisation hydrophobe entre les LBD des deux récepteurs engagés. De plus, ce changement conformationnel entraîne la formation d’une plateforme fonctionnelle pour la liaison à des séquences d’ADN cibles et le 29
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes recrutement des cofacteurs. Par conséquent, tout changement pouvant altérer la dimérisation des RE peut potentiellement interférer avec leur fonction proprement dite. En présence du ligand, donc, les récepteurs des œstrogènes se lient sous forme dimérique sur les ERE. La région majoritairement impliquée dans cette dimérisation est localisée dans le LBD (Figure 5) et comprend des répétitions heptamériques d’acides aminés hydrophobes. Une interface mineure existe aussi dans le DBD qui lui permet de se dimériser, et d’interagir avec l’ADN lorsqu’il est exprimé seul sous la forme d’une protéine chimère mimant le dimère. a) Homodimères
La dimérisation des RE a lieu via les régions C et E des récepteurs. Cependant, cette dimérisation pourrait être également influencée par le domaine F. Une équipe s’est particulièrement intéressée à l’importance de ce domaine depuis plusieurs années, ayant précédemment montré que la délétion du domaine F dans le REα humain augmentait de manière drastique la dimérisation du récepteur dans un système double hybride de levure (Peters and Khan, 1999). Par la suite, cette équipe a confirmé ce phénomène par d’autres travaux, en utilisant des techniques de mutagénèse dans le domaine F du REα humain (Yang et al., 2008). En effet, leurs observations ont été que tous les mutants générés augmentaient le potentiel de dimérisation avec le REα de type sauvage, ainsi qu’avec le mutant lui‐même, en comparaison à l’homodimère de type sauvage. L’augmentation de la dimérisation apparaissait être indépendante d’une possible augmentation d’affinité avec E2, car les valeurs des Kd (constantes de dissociation) pour les mutants n’étaient pas altérées de façon importante. Ceci suggère que le domaine F en lui‐même affecte directement la dimérisation. Les données présentées dans cette étude permettaient donc de conclure que le domaine F exerce une restriction interne sur la dimérisation du REα, protégeant probablement contre toute activation inappropriée en présence de différents ligands (Skafar and Koide, 2006; Yang et al., 2008). Par ailleurs, d’autres travaux se sont portés sur la stabilisation des homodimères REα/α. En effet, il semblerait que la force de l’interaction du dimère soit régulée par la liaison au ligand (Brandt and Vickery, 1997; Lee et al., 2008; Tanenbaum et al., 1998). Grâce à une technique de FRET (Transfert de Résonnance d’Energie de Fluorescence), une équipe a étudié la stabilité du domaine de liaison au ligand (LBD) de l’homodimère REα/α (en utilisant des constructions de REα‐LBD couplés à un 30
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes fluorophore) (Tamrazi et al., 2002). Les résultats obtenus ont montré que les LBD des REα apo existent sous forme de dimères très stables et dont la vitesse de dissociation est lente, et encore plus ralentie en présence de divers ligands. Il est à noter que la stabilité cinétique des dimères reflète le caractère du ligand, non son affinité pour le récepteur. La plupart des ligands stabilisent le dimère, cependant, les antagonistes présentent généralement un effet stabilisant plus efficace que les agonistes. De plus, les peptides co‐activateurs contenant le motif LXXLL stabilisent de façon sélective les dimères des REα‐LBD liés à l’agoniste. Ces données ont également permis aux auteurs de montrer que cette méthode basée sur la mesure de cinétique et de stabilité thermodynamique par fluorescence peut également permettre d’estimer la nature agoniste ou antagoniste de nouveaux ligands. b) Hétérodimères
Des études ont été menées afin d’évaluer les différences de dimérisation ainsi que d’activation des voies de signalisation des homodimères et des hétérodimères des RE (REα/α, REβ/β, REα/β). Bien que le REα et le REβ lient E2 avec des affinités similaires (Paech et al., 1997), il existe des différences d’affinité de liaison aux SERM qui semblent importantes dans la médiation tissu‐spécifique et cellulaire des SERM tels que le 4‐hydroxy‐tamoxifène (OH‐Tam) et la génistéine (Castro‐Rivera and Safe, 2003; de Haan et al., 2000). Suite à la liaison au ligand, un phénomène d’homo‐ ou d’hétérodimérisation a lieu entre le REα et/ou le REβ (Chen et al., 1999b; Cowley and Parker, 1999; Ogawa et al., 1998; Pettersson et al., 1997). Ces dimères sont capables de moduler l’expression génique via la liaison aux ERE des gènes cibles. La liaison des dimères sur l’ERE entraîne ainsi l’activation de différentes voies de signalisation œstrogéniques. En effet, il a été montré que le REα et le REβ, tous deux exprimés in vitro et in vivo, forment des hétérodimères qui se lient à l’ADN avec une affinité similaire à celle des homodimères REα/α, mais plus grande que celle des homodimères REβ/β (Cowley and Parker, 1999). D’autre part, en présence du ligand, il existe des différences dans le potentiel de transactivation des éléments de réponse d’AP‐1 (fos/jun) entre les différents homodimères (REα/α et REβ/β) (Paech et al., 1997). Des études ont été réalisées afin de mieux comprendre l’action des hétérodimères. Des cinétiques de dimérisation des REα/β ont été réalisées in vitro (Jisa and Jungbauer, 2003), et des essais de recrutement des co‐activateurs par l’hétérodimère sur des dimères de fusion transfectés dans différentes lignées cellulaires (CHO‐K1, Chinese Hamster Ovary, HeLa, human cervical carcinoma, MDA‐MB‐231, breast adenocarcinoma) (Hillisch et al., 2004). Ces 31
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes études ont montré que l’hétérodimère est capable de se fixer sur un ERE, et que de plus le REα est le partenaire dominant pour le fonctionnement de cet hétérodimère sur des rapporteurs synthétiques (Hillisch et al., 2004; Jisa and Jungbauer, 2003; Tamrazi et al., 2005). Cependant, d’autres travaux, cette fois‐ci réalisés sur des cellules exprimant les deux isotypes du RE de manière endogène (et donc toute la machinerie nécessaire à leur fonctionnement), mais dans lesquelles ont été transfectés les deux isoformes marqués avec une séquence flag afin de les détecter plus aisément, ont mis en avant que les hétérodimères sont capables de réguler de manière ligand‐dépendante l’expression génique de gènes non régulés par les homodimères (REα/α et REβ/β) (Monroe et al., 2005). Il est à noter que ces hétérodimères, dans ce contexte cellulaire, sont capables d’induire de telles voies de signalisation uniquement lorsqu’ils sont liés à E2 ou à OH‐Tam. Ces observations suggèrent que non seulement les homodimères, mais également les hétérodimères possèdent des rôles transcriptionnels distincts dans les cellules exprimant les deux isoformes du RE. De récentes études se sont également portées sur la formation des hétérodimères (Powell and Xu, 2008). Parce que les deux isoformes des RE (REα et REβ) montrent des fonctions opposées dans la prolifération cellulaire (le REα promeut, alors que le REβ inhibe la croissance cellulaire œstrogéno‐
dépendante (Jarvinen et al., 2000; Koehler et al., 2005)), la capacité des ligands à induire les dimères REα/β en comparaison à leurs homodimères respectifs est suspectée présenter d’importants impacts sur la transcription des gènes cibles ainsi que la croissance cellulaire. Une hypothèse serait que les différents ligands œstrogéniques pourraient exercer différents effets cellulaires via une induction différentielle de l’homodimérisation du REα, de celle du REβ, ou encore de l’hétérodimérisation REα/β. La régulation différente de ces isoformes du RE pourrait être influencée par divers facteurs incluant la sélectivité de liaison au ligand, les différences conformationnelles ou les préférences de partenaire de dimérisation, l’interaction avec les co‐régulateurs, ainsi que la liaison à l’ADN. Malheureusement, il réside un manque de méthodes directes permettant de suivre la formation d’hétérodimères in vivo, et de distinguer la faculté des ligands œstrogéniques à promouvoir l’homo‐ ou l’hétérodimérisation. Les auteurs de ces travaux ont utilisé la technique de BRET (pour Bioluminescence Resonance Energy Transfer, ou Transfert de Résonnance d’Energie de Bioluminescence) afin de suivre la formation d’hétérodimères et d’homodimères du RE. Cette technique avait été préalablement mise au point dans cette équipe (Kladde et al., 1996), et permet d’observer la formation d’interactions protéiques dans un système cellulaire vivant pertinent en temps réel. Le BRET est proche du FRET (précédemment évoqué dans ce même chapitre), mais présente la particularité et 32
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes l’avantage de s’affranchir des problèmes de bruit de fond et de « photobleaching » engendrés par le FRET. Cette technique de BRET avait également été développée et optimisée afin d’étudier l’homodimérisation du REα in vivo (Koterba and Rowan, 2006; Michelini et al., 2004). Ces équipes ont montré qu’il est possible d’effectuer les tests à grande échelle (plaques 96 puits) et rapidement (Michelini et al., 2004). De plus, il a été montré que le BRET représente un outil efficace afin d’étudier les interactions protéine‐protéine, et d’autre part que non seulement le REα homodimérise, mais aussi que l’interaction du REα avec le co‐activateur SRC‐1 est dose‐dépendante, induite en 30 minutes, et stable au‐delà de 12 heures (Koterba and Rowan, 2006). Récemment, l’utilisation du BRET a permis à Powel et coll. (Powell and Xu, 2008) de mettre en évidence que même si les deux isoformes sont capables d’hétérodimériser, le REα joue un rôle dominant. Ces données sont en accord avec de précédents travaux ayant utilisé d’autres techniques (Hillisch et al., 2004; Jisa and Jungbauer, 2003; Tamrazi et al., 2005). De plus, les tests de BRET ont permis de montrer que la liaison du ligand au REα est nécessaire pour l’hétérodimérisation alors que celle au REβ ne l’est pas, mais par contre que la liaison du ligand au REβ permet d’accéder au plus haut niveau d’hétérodimérisation. D’autre part, la génistéine a présenté de meilleures facultés à former des homodimères REβ/β que des homodimères REα/α ou des hétérodimères, ceci appuyant la préférence déjà établie de ce ligand pour le REβ (Escande et al., 2006). De même, plusieurs ligands environnementaux, en plus de la génistéine, ont été comparés, et présentent d’avantage d’habilité à induire la formation d’homodimères REβ/β et d’hétérodimères REα/β que d’homodimères REα/α. Ceci suggérant que les composés induisant la formation d’hétérodimères pourraient posséder une certaine valeur thérapeutique, puisque chaque dimère est susceptible d’induire des voies de signalisation différentes. Cette technique apparaît donc être un outil efficace afin de déterminer la sélectivité de dimérisation des différents ligands des RE, à des fins thérapeutiques, en complément d’autres stratégies de criblage. Au vu de tous ces résultats, il apparaît donc évident que les REα et les REβ forment des homodimères, ainsi que des hétérodimères fonctionnels in vitro et in vivo. De plus, lorsque les deux isoformes sont exprimés, les hétérodimères prédominent (Pettersson et al., 1997). Il reste toutefois à approfondir le rôle joué par les hétérodimères dans la signalisation œstrogénique, et plus spécifiquement dans la médiation des effets antagonistes du REβ sur l’activité transcriptionnelle du REα. 33
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes 3.3. Région D
La Région D, aussi appelée région « charnière », est une région hypervariable qui relie le DBD au LBD. Elle est peu conservée entre le REα et le REβ (30% d’homologie), et contient le signal de localisation nucléaire (NLS pour Nuclear Localisation Signal), qui permet l’adressage du récepteur au noyau de la cellule lors de la fixation au ligand (Guiochon‐Mantel et al., 1996). Elle confère au récepteur une capacité de rotation intramoléculaire. En effet, cette région charnière permet au DBD de pivoter jusqu’à 180° de son axe d’origine afin de diminuer les contraintes dues à la liaison sur l’ERE (Glass, 1994). Au départ, on ne lui connaissait que cette fonction, mais par la suite, des études portant sur les exigences structurelles du DBD et du LBD ont révélé que les extrémités de la région D font partie de ces domaines adjacents. Par exemple, la partie N‐terminale du domaine D contient les boites T et A qui sont impliquées dans la dimérisation et la reconnaissance des séquences d’ADN, et la partie C‐terminale possède la région responsable des interactions entre les récepteurs et les co‐
répresseurs régulées par le ligand (Heinzel et al., 1997). Il est à noter que les deux extrémités N‐ et C‐
terminales de la région D qui portent d’importantes informations fonctionnelles ont été conservées parmi les différents RN, particulièrement bien entre paralogues, alors que la région centrale non (Owen and Zelent, 2000). 3.4. Région E
3.4.1. Structure
La région E, composée d’environ 250 aa, assure la liaison avec le ligand par l’intermédiaire du domaine de liaison au ligand (LBD). Cette région est structurellement complexe et multifonctionnelle car, en plus de la liaison au ligand, elle contient un second site de dimérisation du RE, et intervient dans l’interaction avec les protéines de choc thermique (Hsp pour heat‐shock protein), et dans l’activité transcriptionnelle dépendante du ligand (AF‐2) (Wurtz et al., 1996). La première cristallisation d’un récepteur stéroïdien a été réalisée pour le REα (Brzozowski et al., 1997; Tanenbaum et al., 1998). La cristallisation du LBD de nombreux RN a montré des structures similaires, suggérant une structure canonique pour les différents membres de la superfamille 34
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes (Wurtz et al., 1996). Les cristallisations ont été réalisées en présence de ligand agoniste ou antagoniste (holorécepteur), ou bien en absence de ligand (aporécepteur) (Moras and Gronemeyer, 1998) (Figure 6). Le LBD est ainsi composé de 12 hélices α (H1 à H12) empilées en 3 couches antiparallèles, ainsi que deux feuillets β antiparallèles, formant la poche de liaison du ligand (Ligand Binding Pocket ou LBP), essentiellement hydrophobe (Shiau et al., 1998). La spécificité de cette poche pour différents ligands est liée à des acides aminés non conservés au sein de la superfamille (Bourguet et al., 1995; Brzozowski et al., 1997). Dans cette poche hydrophobe sont réalisés les contacts entre les acides aminés et le ligand spécifique. La taille même de cette LBP varie selon le récepteur considéré. 3.4.2. Liaison au ligand
La liaison à l’hormone sur la LBP engendre la réorganisation de la structure tertiaire du LBD (Brzozowski et al., 1997). Cette modification de la conformation du LBD en présence de l’agoniste se traduit par le basculement de l’hélice H12, créant par conséquent une surface d’interaction avec les co‐activateurs (Figures 6 et 7). L’hélice H12 agit alors comme un couvercle qui vient se refermer sur le ligand, le maintenant à l’intérieur de la LBP. Des antagonistes sont aussi capables de s’associer à la LBP. Dans ce cas, ils bloquent le repliement de l’hélice H12 au niveau de cette poche ne permettant pas de recruter les co‐
activateurs et d’activer les gènes cibles (Figures 6 et 7). Il est également possible de noter sur la figure 7 que sous la forme apo, les hélices H10 et H11 sont perpendiculaires. Lors de la liaison à l’agoniste, le RE adopte la conformation holo, et l’hélice H11 se positionne dans la continuité de l’hélice H10, formant ainsi la région sur laquelle se fixe le NID des co‐activateurs (NID pour Nuclear‐receptor Interacting Domain). Lorsque l’antagoniste se lie au récepteur, l’hélice H11 ne s’aligne pas avec H10, ce qui ne forme pas cette surface pouvant accueillir les co‐activateurs.
35
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes Figure 6 : Structure tridimensionnelle du LBD du REα.
D’après Ruff et al., 2000.
Superposition de la structure tridimensionnelle du LBD lié à l’œstradiol (conformation verte), au
raloxifène et au tamoxifène (conformations rouge et bleue). L’hélice H12 n’adopte pas la même
position selon la nature du ligand lié au REα (agoniste ou antagoniste).
Figure 7 : Structure tridimensionnelle canonique du LBD des RN.
D’après Bourguet et al., 2000.
Figure schématique des trois différents états conformationnels du LBD des récepteurs nucléaires. (a)
LBD sous forme apo (sans ligand) de RXR (Retinoid X Receptror). (b) LBD de RAR (Retinoid Acid
Receptor) lié à l’agoniste (conformation holo). (c) LBD de RAR lié à l’antagoniste. Les barres
représentent les hélices α H1 à H12 alors que les flèches représentent les feuillets β. Les différentes
régions du LBD sont colorées selon leur fonction : la surface de dimérisation est représentée en vert, le
site de liaison aux co-régulateurs, est coloré en orange, et représentée en rouge, l’hélice H12, qui abrite
les résidus de AF-2 ; les autres éléments sont mauves.
NB : cette figure ne représente pas le RE, cependant, elle permet de bien noter les différentes régions
du LBD, et de plus on observe les mêmes changements de conformation dans la structure du RE (Celik
et al., 2007), notamment pour l’alignement des hélices H10 et H11, ainsi que le repliement de l’hélice
H12.
36
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes 3.4.3. Sélectivité du LBD
L’homologie entre le REα et le REβ pour les 20 aa constituant la LBP est extrêmement conservée. Seulement 2 aa sont différents : la méthionine 421 du REα correspond à l’isoleucine 373 du REβ, et la leucine 384 du REα est une méthionine 336 pour le REβ. Cette différence d’acides aminés a un effet direct sur le volume de la cavité (490 Å pour le REα et 390 Å pour le REβ), et contribue également à la sélectivité des ligands pour chaque isotype (Brzozowski et al., 1997; Hillisch et al., 2004) (Figure 8).
Figure 8 : Modélisation du LBD du REβ complexé avec l’œstradiol.
D’après Hillisch et al., 2004.
Les deux acides aminés de la LBP qui diffèrent entre le REα et le REβ (REβ-M336 et REβ-I373) sont
représentés en noir.
En conclusion, les ligands du RE, connus pour produire différents effets biologiques, induisent différentes conformations des deux RE, suggérant une étroite corrélation entre l’état conformationnel du RE et son activité biologique. De plus, la capacité de certains peptides à discriminer entre les complexes du REα et du REβ liés au ligand, indique que les effets biologiques différents des agonistes et des antagonistes du RE sont également corrélés avec les différences structurelles entre le REα et le REβ (Paige et al., 1999). 37
Etude bibliographique. A. Les récepteurs des œstrogènes 3.5. Région F
Située à l’extrême partie carboxy‐terminale, la région F est formée des 45 derniers aa de la partie C‐
terminale du REα, alors que le REβ possède un domaine F plus court de 30 aa constitué de seulement 18% d’homologie avec le domaine F du REα (Ogawa et al., 1998; Pike et al., 1999). Cette région est peu conservée et sa fonction n’est pas clairement définie. Dans le cas des RE, elle contient la fonction d’activation de la transcription AF‐2 et pourrait moduler l’amplitude de l’activité transcriptionnelle en réponse aux œstrogènes et anti‐œstrogènes (Katzenellenbogen et al., 1995). Assez peu d’études se sont portées sur cette région du REα, mais cependant, certains travaux ont rapporté que la délétion du domaine F pouvait influencer la réponse aux anti‐œstrogènes dans un contexte cellulaire particulier (Montano et al., 1999). D’autres études ont montré que des mutations dans le domaine F étaient capables de conférer des activités agonistes au 4‐hydroxy‐tamoxifène (Schwartz et al., 2002). Enfin, il a été mis en évidence que des mutations ponctuelles autour et à l’intérieur d’une des hélices α dans le domaine F altéraient les réponses à E2 ainsi qu’au tamoxifène (Skafar and Koide, 2006), et de plus que les 16 derniers acides aminés de la partie C‐terminale du REα sont essentiels pour l’activité maximale en présence de E2 (Koide et al., 2007). Il a été également montré que la présence du domaine F du REα diminue la fonction de dimérisation médiée par le LBD (Hillisch et al., 2004). Le domaine F est également nécessaire pour l’interaction entre le REα et les facteurs de transcription Sp1 (Kim et al., 2004). Toutes ces données indiquent que le domaine F possède un rôle fonctionnel, qui n’a pas été complètement caractérisé à ce jour.
38
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes B. LES LIGANDS DES RECEPTEURS DES ŒSTROGENES
Différentes molécules telles que les œstrogènes, les phyto‐œstrogènes, les xéno‐œstrogènes et des composés synthétiques sont capables de lier les récepteurs des œstrogènes et induisent un changement de conformation. 1. Les œstrogènes naturels
Les œstrogènes sont des hormones stéroïdiennes. Toutes les hormones stéroïdiennes sont dérivées du cholestérol (Figure 9) et possèdent une structure basée sur un noyau phénanthrène (i.e. elles sont composées de 4 cycles carbonés). Ce sont des messagers chimiques produits par les glandes endocrines qui circulent dans le sang liés à des protéines de transport. La protéine de transport des œstrogènes est la glycoprotéine SHBG (Sex Hormone‐Binding Globulin) (Siiteri et al., 1982) produite dans le foie, qui en plus d’assurer le transport des œstrogènes, régule également l’accès de ces stéroïdes à leurs tissus cibles (Hammond et al., 2003; Rosner, 1990). Chez la femme, l’ovaire est l’organe privilégié de synthèse des œstrogènes et, plus précisément, les follicules et le corps jaune. Durant la grossesse, l’œstriol (E3) est produit dans l’unité fœto‐placentaire de biosynthèse stéroïdienne à partir du précurseur 16‐hydroxy‐déhydroépiandrostènedione (16‐OH DHEA) sous l’action de l’aromatase (Siiteri and MacDonald, 1966). La production d’œstrogènes peut également avoir lieu dans d’autres tissus que l’ovaire tels que le muscle, le cerveau et l’adipocyte (Gruber et al., 2002a). La puberté chez les filles est initiée par des variations nocturnes de faible amplitude du taux d’œstradiol (E2) (15 à 35 pg/mL) (Goji, 1993). Chez la femme, la production d’œstrogènes varie au cours du cycle menstruel avec une concentration sérique optimale au stade préovulatoire (Baird and Fraser, 1974). Chez la femme pré‐ménopausée, la réduction des follicules ovariens conduit à un déclin régulier de la production ovarienne d’œstradiol (Gruber et al., 2002a). Lors de la ménopause, la quasi‐totalité des œstrogènes a une origine extraglandulaire par aromatisation d’androstènedione en œstrone (E1) (Grodin et al., 1973), qui est alors l’œstrogène prédominant de la femme ménopausée. Leur taux augmente avec l’âge et le poids. 39
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes Chez l’homme, dans certaines circonstances, les testicules, peuvent produire des œstrogènes (Brodie and Inkster, 1993). La majeure partie provient de l’aromatisation périphérique des androgènes surrénaliens et testiculaires (Gooren and Toorians, 2003). Aromatase
17β- déshydrogénase
5α-réductase
17β- déshydrogénase
Aromatase
Figure 9 : Voies de la stéroïdogénèse.
Deux voies métaboliques conduisent de la prégnénolone à l’androstènedione : la voie des Δ4stéroïdes (
) et la voie des Δ5-stéroïdes (
).
40
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes Le plus puissant et le plus important des œstrogènes naturels dans l’espèce humaine est le 17β‐
œstradiol (E2), sécrétion majeure de l’ovaire, à côté duquel on trouve également l’œstrone (E1) et l’œstriol (E3). La position du β‐hydroxyle en position 17 est primordiale pour leur activité biologique. Ainsi, l’E2 est biologiquement puissant (3.10‐11M), tandis que l’œstradiol 17α est moins actif (3.10‐10M) (Papendorp et al., 1985). Par contre, l’insertion d’un groupement éthinyl en position 17α, conduisant à l’œstrogène synthétique éthinylœstradiol (pilule contraceptive), transforme le 17α‐E2 en un œstrogène encore plus puissant (8.10‐12M) (Escande et al., 2006), à longue rétention au niveau de son récepteur nucléaire dans les tissus cibles, et métabolisation plus lente que celle des œstrogènes naturels. Les œstrogènes influencent la croissance, la différentiation, et le fonctionnement de nombreux tissus cibles de l’organisme (Figure 10). Ils participent au maintien de l’état et de la fonction des tissus normaux incluant les tissus des systèmes reproducteurs mâle et femelle, comme les glandes mammaires, l’utérus, les ovaires, les testicules et la prostate (Barkhem et al., 2004). Les œstrogènes jouent également un rôle dans le maintien de la densité osseuse, et dans le système cardiovasculaire, où ils ont des effets cardio‐protecteurs (Kuiper et al., 1997), et exercent de plus un effet protecteur sur le système nerveux central (McDonnell et al., 2002). Ils sont également utilisés pour diminuer les symptômes de la ménopause ou pour traiter l’ostéoporose (Yaffe et al., 1998; Zumoff, 1993). Toutefois, les œstrogènes exercent un effet néfaste sur différents tissus, et sont associés à différents cancers. Il a été démontré que les œstrogènes pouvaient être associés non seulement aux cancers du sein, ceci suggérant que la production d’œstrogènes peut aggraver la maladie (Malamas et al., 2004a), mais aussi à ceux de la prostate (Bosland, 2000), de l’endomètre, de l’ovaire (Clinton and Hua, 1997), voire du poumon (Stabile et al., 2002 ; Deroo and Korach, 2006). 41
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes Figure 10 : Les principaux effets des œstrogènes.
D’après Gruber et al., 2002a.
2. Les phyto-œstrogènes et les myco-œstrogènes
Les œstrogènes environnementaux peuvent être définis comme étant des composés chimiques polyphénoliques capables de lier les récepteurs des œstrogènes (REα et/ou REβ) (Casanova et al., 1999).. Ces molécules montrent plus ou moins similarité avec les ligands traditionnels des RE (comme le 17β‐œstradiol ou le diéthylstilbestrol) (Figure 11), et ont été classées comme œstrogènes environnementaux en se basant sur leur capacité à induire des effets physiologiques qui ressemblent aux réponses œstrogéniques (Kuiper et al., 1997; Whitten and Patisaul, 2001). Cependant leur affinité avec les RE est de 100 à 1000 fois moindre que celle des hormones naturelles et des hormones de synthèse. De plus, plusieurs études ont montré que ces composés présentent des affinités différentes 42
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes pour chaque isotype du RE (Casanova et al., 1999; Mueller et al., 2004b; Escande et al., 2006; Miller et al., 2007). Une étude de Adlercreutz en 1995 a mis en évidence que les phyto‐œstrogènes pourraient ne pas contribuer aux effets néfastes observés chez l’Homme, mais plutôt jouer un rôle protecteur contre le cancer (Adlercreutz, 1995). En effet, si l’organisme produit trop dʹœstrogènes, les phyto‐
œstrogènes peuvent bloquer partiellement leur effet négatif, tandis que sʹil y a une déficience, ils peuvent combler une partie des besoins.
Figure 11 : Structures moléculaires d’œstrogènes synthétiques et naturels.
D’après Limer and Speirs, 2004.
2.1. Les sources de phyto-œstrogènes
Les sources environnementales de phyto‐œstrogènes incluent des composés endogènes des plantes (Kuiper et al., 1997; Le Bail et al., 1998). Les principaux groupes de phyto‐œstrogènes sont les isoflavones (génistéine, daidzéine, biochanine A), les lignanes (entérolactone, entérodiol), les coumestanes (coumestrol), et les stilbènes (resvératrol) (Moon et al., 2006; Sirtori et al., 2005) (Figure 43
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes 11). Les plantes à activité œstrogénique (plus de 600 recensées) suscitent beaucoup dʹintérêt, tant chez les intervenants en santé naturelle que chez les scientifiques. Parmi les plantes alimentaires, le soja (Glycine max) et les graines de lin (Linum usitatissimum) sont les principales sources de phyto‐
œstrogènes. Les deux classes de composés phyto‐œstrogéniques qui ont le plus retenu l’attention des chercheurs sont les isoflavones et les lignanes. 2.1.1. Isoflavones
Les isoflavones sont des flavonoïdes. Les concentrations les plus élevées d’isoflavones se retrouvent dans les germes de soja ou de luzerne, les choux, les haricots verts ou les épinards (Boue et al., 2003). Ces molécules présentent des activités œstrogéniques variées (Zand et al., 2000), et les isoflavones ont été proposés comme SERM naturels (Selective Estrogen Receptor Modulators). Ces composés sont des β‐
glucosides, qui sont métabolisés par la microflore intestinale en de nombreux métabolites incluant l’équol et la O‐desmethyl‐angolensine (Limer and Speirs, 2004). Les composés parentaux ainsi que les métabolites sont actifs. Certaines études suggèrent qu’une métabolisation est possible dans les cellules cancéreuses mammaires, et que le métabolite méthylé hydroxylé génistéine 7‐sulfate pourrait être la forme biologiquement active de la génistéine dans les cellules humaines de cancer du sein (T47D et MCF‐7) (Peterson et al., 1996 and 1998). De plus, plusieurs études ont montré que la génistéine possède une meilleure affinité pour le REβ que pour le REα (Casanova et al., 1999; Escande et al., 2006; Miller et al., 2007). De même, l’équol, qui a été décrit comme étant le métabolite majoritaire de la daidzéine, présentait des effets plus bénéfiques que la daidzéine lors d’essais cliniques (Atkinson et al., 2005). Les principaux axes de recherches ont porté sur la réduction des symptômes de la ménopause, la réduction du taux de cholestérol ainsi que la prévention de l’ostéoporose et du cancer. 2.1.2. Lignanes
Les lignanes sont des composés phénoliques formés de deux unités monolignols. Il existe des centaines de lignanes dans les végétaux. Ce sont les phyto‐œstrogènes dominants dans les aliments. Les graines de lin (mais pas leur huile) sont de loin la meilleure source alimentaire de lignanes : elles en contiennent environ 86 mg par portion de 30 g. On en trouve aussi, mais beaucoup moins, dans les graines (sésame, citrouille, tournesol, pavot), dans les grains entiers et leur son (seigle, avoine, orge), ainsi que dans les petits fruits. Pour que ces phyto‐œstrogènes 44
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes deviennent actifs dans l’organisme humain, ils doivent être d’abord métabolisés par les bactéries intestinales. En effet, le sécoisolaricirésinol et le matairésinol sont métabolisés par les bactéries de la flore intestinale des mammifères en entérolignanes, respectivement l’entérodiol et l’entérolactone (Lambin et al., 2008 ; Lampe et al., 2006) (Figure 12). Les études des lignanes se sont surtout portées sur les effets des graines de lin sur le taux de cholestérol, sur les symptômes de la ménopause et sur la prévention de lʹostéoporose après la ménopause, ainsi que sur le traitement de cancers.
Figure 12 : Métabolisation des lignanes.
D’après Lamblin et al., 2008.
2.2. Les sources de myco-œstrogènes
Les myco‐œstrogènes, ou fungœstrogènes (zéaralénone et ses dérivés (Figure 13)) sont des substances phénoliques produites par plusieurs espèces des champignons du genre Fusarium (Gajecki, 2002; Kuiper‐Goodman et al., 1987). Ils sont retrouvés à de fortes concentrations après récolte du maïs ou de l’orge ainsi que dans les graines de céréales et dans l’huile végétale. Ce sont des agonistes de très bonne affinité pour les RE, de l’ordre du nano molaire (Kuiper et al., 1997; Minervini et al., 2001 ; Mueller et al., 2004b; Sievernich et al., 2004). L’α‐zéaralénol présente le plus fort potentiel œstrogénique, puis vient la zéaralénone, et enfin le β‐zéaralénol (Minervini et al., 2001). 45
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes Figure 13 : Structures topologiques de la zéaralénone et de ses dérivés.
D’après le site web http://www.mycotoxins.info.
2.3. Phyto-œstrogènes et maladies
Les phyto‐œstrogènes ont différents degrés d’activité œstrogénique (Zand et al., 2000), et les isoflavones ont été proposés comme étant des SERM naturels. De même que les SERM, les phyto‐œstrogènes peuvent se lier au REα et au REβ. Cependant, les phyto‐œstrogènes ont une meilleure affinité pour le REβ (Escande et al., 2006; Kuiper et al., 1997), avec une affinité plus faible pour les RE que l’œstradiol (McCarty, 2006; van der Woude et al., 2005). De plus le potentiel œstrogénique des phyto‐œstrogènes varie entre les différents groupes de phyto‐
œstrogènes (Oseni et al., 2008). Des études ont montré que les isoflavones exercent des effets agonistes et antagonistes, bien qu’ils soient de puissants agonistes du REβ et de faibles agonistes du REα (Fitzpatrick, 2003). Ceci pourrait permettre d’expliquer comment les phyto‐œstrogènes participent à la protection contre le cancer du sein, car le REβ inhibe la croissance cellulaire mammaire de même que les effets stimulateurs du REα (Jordan, 2001a; Le Bail et al., 1998). D’autre part des études ont montré que le recrutement de molécules co‐régulatrices pourrait être important dans la détermination de la fonction des phyto‐œstrogènes. Ceci se traduisant par des activations du domaine AF‐2 du REβ par des isoflavones (Jordan, 2001a), ou par des disparités d’activation des voies de signalisation associées aux RE (Brownson et al., 2002; Gallo et al., 2008), ou encore par des différences d’activation des deux RE (Mueller et al., 2003; Waring and Harris, 2005). 46
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes Des études ont été menées sur le potentiel bénéfique des phyto‐œstrogènes in vitro et in vivo (Zacharewski, 1997). Il est possible de classer ces études dans trois catégories. La première portant sur le rôle des phyto‐œstrogènes comme agents de chémo‐prévention, dont certaines suggèrent que la prise anticipée de phyto‐œstrogènes réduit le risque de développement de cancers (Lamartiniere et al., 1995; Murrill et al., 1996; Warri et al., 2008). La seconde catégorie regroupe les études focalisées sur les phyto‐œstrogènes comme agents de traitement, les effets in vitro étant montrés comme dose‐
dépendants. A faible dose ils augmentent la croissance des cellules tumorales, mais à fortes doses ils l’inhibent (Bentrem et al., 2003; Constantinou et al., 1998; Hsu et al., 1999; Sotoca et al., 2008a). Par contre, il apparaît difficile de tirer des conclusions in vivo, puisque de nombreuses études montrent que la génistéine, bien qu’inhibant la prolifération des cellules de cancer du sein in vitro, n’inhibe pas la croissance des tumeurs chez les souris athymiques (Lamartiniere et al., 1995; Santell et al., 2000). Elle entraînerait même des effets encore plus néfastes en co‐traitement avec le tamoxifène (Jordan et al., 2001). La troisième catégorie englobe les études qui se concentrent sur les effets d’une exposition aux phyto‐œstrogènes en continu depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte. Cette approche est récente, et a montré que des rats exposés à des isoflavones dès leur naissance présentent un poids et une masse graisseuse plus importants à l’âge de 24 mois. D’autre part, l’exposition aux phyto‐œstrogènes mène à une densité osseuse plus élevée en fin de vie (Mardon et al., 2008). Cette densité est encore accrue lorsque elle est accompagnée d’activité physique (Hertrampf et al., 2007). Les études sur l’Homme sont moins répandues et peuvent être divisées en deux catégories. La première recouvre les études qui évaluent les effets des phyto‐œstrogènes sur la biosynthèse et l’excrétion d’œstrogènes. Certaines études ont montré que l’excrétion urinaire de phyto‐œstrogènes diffère selon les régions (Peeters et al., 2003). Les femmes des régions de moindre incidence de cancer du sein ont des taux urinaires plus élevés de flavonoïdes que celles vivant dans des régions à forte incidence de cancer du sein. Cependant il n’est pas possible d’affirmer qu’une consommation plus élevée d’isoflavonoïdes est protectrice contre le cancer du sein, ou si ceci représente simplement un indicateur pour un profil stéroïdien de bonne santé. Il y a donc clairement d’autres facteurs associés à l’effet protecteur ou non des phyto‐œstrogènes que la quantité contenue dans le régime alimentaire. L’effet par lequel ceci est médié reste peu clair, cependant, les phyto‐œstrogènes ont été indiqués comme inhibiteurs des enzymes impliquées dans la synthèse des œstrogènes (aromatases). Cette baisse de la conversion des androgènes en 47
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes œstrogènes entraînerait une diminution des niveaux d’œstrogènes circulant (Whitehead and Lacey, 2003) ce qui pourrait nuire au développement du cancer du sein. La seconde catégorie regroupe les études qui évaluent l’impact général des phyto‐œstrogènes alimentaires sur des points cliniques spécifiques (endpoints) comme par exemple les symptômes de la ménopause, la densité osseuse, les maladies cardio‐vasculaires (Cassidy et al., 2006; Kris‐Etherton et al., 2002) et le développement du cancer du sein (Adlercreutz et al., 1995). De nombreuses études ont été menées pour examiner l’utilisation des phyto‐œstrogènes comme agents chémo‐préventifs. Toutefois, ces études sont limitées dans le sens qu’elles sont essentiellement rétrospectives. En ce qui concerne le traitement de la ménopause, compte tenu des récentes préoccupations concernant les effets négatifs possibles de la thérapie hormonale de remplacement, dʹautres solutions pour le traitement des symptômes de la ménopause ont été explorées et les phyto‐œstrogènes ont joué un rôle important. Un examen récent des données n’a pas révélé d’évidence claire sur l’efficacité des phyto‐œstrogènes à réduire les symptômes de la ménopause (Lethaby et al., 2007). En effet, certaines études montrent un effet bénéfique (Pruthi et al., 2007; Shiau et al., 1998), alors que d’autres équipes n’ont pas pu tirer de conclusions et ont insisté sur le fait qu’il faudrait d’avantage d’études épidémiologiques pour pouvoir conclure clairement (Naftolin and Guadalupe Stanbury, 2002; Tham et al., 1998). Il en est de même concernant les effets des phyto‐œstrogènes sur la santé osseuse, avec certaines études prouvant un effet bénéfique sur l’ostéoporose (Alekel et al., 2000; Morabito et al., 2002; Potter et al., 1998) alors que d’autres non (Atkinson et al., 2004; Weaver and Cheong, 2005). Enfin, les études sur les cancers sont dominées par celles portant sur le cancer du sein. De plus, il est à noter que les études directes sur lʹefficacité des phyto‐œstrogènes dans la prévention du cancer du sein sont difficiles compte tenu de la longueur du temps requis pour les effectuer. En revanche, certains points représentatifs ont été étudiés tels que l’effet des phyto‐œstrogènes sur la prolifération cellulaire et la densité mammaire. En complément alimentaire à court terme, les phyto‐œstrogènes se révèlent stimuler la prolifération des cellules épithéliales mammaires (Helferich et al., 2008; McMichael‐Phillips et al., 1998), et plusieurs autres études vont dans le même sens, à savoir que les phyto‐œstrogènes pourraient aggraver la pathologie déjà installée (Jakes et al., 2002; Maskarinec et al., 2003; Petrakis et al., 1996). Cependant comme observé dans les études in vivo, l’âge auquel la femme est exposée aux phyto‐œstrogènes ainsi que la durée de l’exposition semblent importants pour déterminer si effectivement un effet protecteur est obtenu. En effet, des études prospectives sous forme de questionnaires menées sur des femmes atteintes du cancer du sein au Japon n’ont pas 48
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes montré de relation entre la consommation de soja et le développement du cancer du sein. Cependant, cette étude n’a été menée que sur l’alimentation au cours de la pathologie (Key et al., 1999). D’autres études similaires ont été conduites, mais cette fois‐ci les questionnaires portaient sur le régime alimentaire pendant l’adolescence sur des femmes chinoises atteintes d’un cancer du sein. Une grande consommation de soja durant l’adolescence était associée avec la diminution de l’incidence du cancer du sein une fois adulte (Shu et al., 2001). Ceci pourrait également expliquer pourquoi un tel cancer atteint davantage les femmes ayant émigré jeunes que celles ayant émigré après la puberté (Adlercreutz and Mazur, 1997; Knight and Eden, 1996; Limer and Speirs, 2004; Ziegler et al., 1993). De plus, plusieurs publications ont montré l’effet protecteur des phyto‐œstrogènes dans la prostate. Notamment une revue portant sur l’effet des phyto‐œstrogènes sur la prostate (Goetzl et al., 2007), constate que la consommation de soja pourrait avoir un effet bénéfique sur ce cancer. En effet, de même que pour le cancer du sein, il existe des disparités entre les régions géographiques en regard avec l’incidence et la mortalité des cancers de la prostate. Les pays est‐asiatiques ont des taux plus faibles de cancer de la prostate que les pays de l’ouest comme les USA ou le Canada. Ceci suggère que les différences diététiques entre les deux régions géographiques, et particulièrement le taux plus élevé de phyto‐œstrogènes consommé en Asie, serait responsable de la différence dans l’incidence de ce cancer (Kim et al., 2004; Nagata et al., 2007). Toutefois, bien que la plupart des études sur les phyto‐œstrogènes suggèrent qu’ils fournissent des effets positifs sur la santé humaine (Lissin and Cooke, 2000; Setchell and Cassidy, 1999), certaines études annoncent que la plupart des phyto‐œstrogènes agiraient également comme perturbateurs endocriniens (Kiparissis et al., 2003; Stopper et al., 2005), pouvant entraîner des effets nuisibles sur l’Homme (Arroo et al., 2008). Il apparaît alors prématuré de recommander des taux spécifiques de phyto‐œstrogènes d’un point de vue diététique pour prévenir des maladies spécifiques chroniques (Tham et al., 1998). Ainsi, il n’existe pas de certitude sur le potentiel chémo‐préventif des phyto‐
œstrogènes ou s’ils peuvent contribuer au effets néfastes des cancers du sein (Mense et al., 2008) ou de la prostate (Nagata et al., 2007; Oseni et al., 2008). La plupart des revues s’accordent donc sur le fait qu’il faudrait des études complémentaires plus poussées afin de mieux comprendre les mécanismes et de déterminer l’impact des phyto‐œstrogènes (Arroo et al., 2009; Duffy et al., 2007; Hedelin et al., 2008; Limer and Speirs, 2004; Naftolin and Guadalupe Stanbury, 2002; Velentzis et al., 2008). 49
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes 3. Les xéno-œstrogènes : des perturbateurs endocriniens
3.1. Définition et sources
Les perturbateurs endocriniens sont des molécules organiques d’origines diverses qui ont la propriété de se lier à certains récepteurs intracellulaires. Ces molécules, que l’on peut retrouver dans l’environnement ou dans la chaîne alimentaire animale ou humaine, ont donc, via cette activité de liaison aux récepteurs, un effet néfaste sur l’organisme humain, en perturbant notamment toute une série de fonctions hormonales. Le programme international pour la sécurité chimique a défini l’expression « perturbateur endocrinien » de la manière suivante : « substance qui altère une ou plusieurs fonctions du système endocrine et, en conséquence, provoque des effets délétères sur la santé d’un individu, de sa descendance, ou de populations entières ». Plus précisément, les xéno‐œstrogènes sont des molécules non naturelles qui se lient au REα et/ou au REβ, et qui régulent les réponses induites par les œstrogènes (Colborn et al., 1993; Hall and Korach, 2002). Les xéno‐œstrogènes sont nombreux, ils appartiennent à diverses familles chimiques, et sont répandus dans l’environnement. Ce sont des composés issus de l’industrie et de l’agriculture, comme des retardateurs de flamme bromés, RFB (tétrabromo bisphénol A ou TBBPA, polybromo diphényl éthers ou PBDE), des polychloro‐biphényls (PCB), (Kutz et al., 1991; McDonnell et al., 2002), des détergents tels que les alkylphénols (nonylphénol et octylphénol), des plastifiants (phtalates, bisphénol A ou BPA), ainsi que des pesticides (DDT, DDE, méthoxychlore, dicofol, lindane, vinclozoline, bénomyl) (Jobling et al., 1995; Soto et al., 2008). De plus, des études ont montré que la dioxine, un ligand du récepteur AhR, présente également des activités œstrogéniques (Boverhof et al., 2008; Boverhof et al., 2006; Ohtake et al., 2008; Ohtake et al., 2007; Ohtake et al., 2003). Ces composés ont une affinité 10 000 à 100 000 fois plus faible pour les RE que l’œstradiol (Blair et al., 2000; Lemaire et al., 2006a). Certains d’entre eux sont capables de se lier également au récepteur des androgènes (AR) (Lemaire et al., 2004; Molina‐Molina et al., 2006; Sohoni and Sumpter, 1998), ainsi qu’à celui des xénobiotiques PXR (Pregnane X Receptor) (Kretschmer and Baldwin, 2005; Lemaire et al., 2006b; van der Woude et al., 2005), et enfin à celui de la thyroïde, TR (Ghisari and Bonefeld‐Jorgensen, 2009; Kortenkamp, 2007; Zoeller, 2005). 50
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes Figure 14 : Exemples de structures de perturbateurs endocriniens.
3.2. Identification des effets
Pour caractériser une molécule comme étant de la classe des xéno‐œstrogènes, l’utilisation de tests in vitro mais aussi in vivo est recommandée (Shelby et al., 1996). Les essais in vitro regroupent des techniques diverses comme l’interaction directe par compétition avec la liaison de E2, la mesure d’activité transcriptionnelle sur des cellules bioluminescentes surexprimant le RE associé avec un ERE, l’induction de gènes E2 régulés comme PS2 ou la prolifération cellulaire (Balaguer et al., 1999; Escande et al., 2006; Mnif et al., 2007; Odum et al., 1997; Soto et al., 2008; Zacharewski, 1997). In vivo, les tests sont le plus souvent effectués sur l’étude de la descendance de souris ou de rates exposées aux phyto‐œstrogènes lors de la gestation, ou également de greffe de cellules bioluminescentes répondant aux œstrogènes en prolifération et en luminescence (Escande et al., 2006; Shelby et al., 1996; Zacharewski, 1997). 51
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes L’augmentation des cancers hormono‐dépendants et des dérèglements hormonaux observés au cours des dernières décennies pourraient être en partie causés par l’exposition à ces xéno‐œstrogènes (Caserta et al., 2008; Fénichel and Brucker‐Davis, 2008). L’équipe de Skinner a montré que l’exposition de souris gestantes à la vinclozoline ou au méthoxychlore, deux pesticides, s’était traduite par des dérèglements du développement sexuel des mâles des générations F1 à F5 (Anway et al., 2005). Cependant, les effets réels sur la santé humaine sont encore sujets à controverse (Janosek et al., 2006; Waring and Harris, 2005). On rapporte chez l’homme l’altération en quantité et en qualité du spermogramme, une augmentation de la cryptorchidie, des cancers du testicule et de la prostate (Carlsen et al., 1992; Prins, 2008; Saradha and Mathur, 2006; Toppari, 2008; Toppari et al., 1996). Chez la femme apparaissent des problèmes de fertilité, une diminution de la fonction de lactation et une augmentation de la cancérogénèse mammaire (Castro‐Rivera and Safe, 2003; Gladen and Rogan, 1995; Golden et al., 1998; Reynolds et al., 2004). Les phtalates sont utilisés comme plastifiants dans des applications domestiques et industrielles nombreuses et variées. Ils sont très largement répandus dans l’environnement et ont été détectés dans les eaux de surface et les sédiments. On peut également les trouver dans des aliments, suite à leur migration à partir d’emballages. Des études sur des souris gestantes portant sur les effets des phtalates ont montré que ceux qui présentent le plus d’effets touchent particulièrement la descendance mâle. Ils entraînent l’augmentation de la mortalité embryonnaire, et des malformations de l’appareil reproducteur mâle qui suggèrent un effet anti‐androgénique de ces composés (Gray et al., 1999; Saillenfait et al., 1998). Ces phtalates présentent peu d’activité œstrogénique in vitro (Harris et al., 1997; Jobling et al., 1995; Lamartiniere et al., 1995; Takeuchi et al., 2005), et quasiment pas in vivo (Zacharewski, 1997). Ceux qui se révèlent peu délétères pour la descendance masculine ne présentent pas ou peu d’activité œstrogénique in vitro (Gray et al., 2000). Les données relatives à la toxicité humaine sont rares et il est difficile d’extrapoler les effets à l’Homme car les études sont peu nombreuses et peu documentées (Duty et al., 2005; Latini et al., 2003; Rozati et al., 2002). Certains retardateurs de flamme bromés et plastifiants, ainsi que des pesticides (PBDE, PCB) présentent des activités œstrogéniques (BPA, TBBPA) (Matthews et al., 2001; Meerts et al., 2001). Leurs effets touchent également le fonctionnement d’autres récepteurs comme AR (Androgen Réceptor) ou PR (Progesterone Receptor) par leurs effets antagonistes sur ces récepteurs (Hamers et al., 2006; Kiparissis et al., 2003). De même que les phtalates, ces composés, en plus d’exercer des activités œstrogéniques, entraînent des malformations des organes sexuels de la descendance aussi bien mâle 52
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes que femelle (Gray et al., 1999; Markey et al., 2002; Soto et al., 2008). De plus, des expérimentations in vivo ainsi que les études épidémiologiques ont renforcé l’hypothèse qu’une exposition fœtale et au cours de l’adolescence aux xéno‐œstrogènes, et notamment au BPA ainsi qu’aux PCB, pourrait être implicitement à l’origine de l’augmentation de l’incidence des cancers du sein observée ces 50 dernières années (Jacobson‐Dickman and Lee, 2009; Soto et al., 2008; Waring and Harris, 2005). Cependant, bien que l’étude des perturbateurs endocriniens soit une priorité tant aux Etats‐Unis (Endocrine Disruptor Screening Program, U.S. Environmental Protection Agency) qu’en Europe (Endocrine Disrupter Research), tous les effets décrits plus haut sont encore controversés en ce qui concerne l’espèce humaine, et le lien entre un perturbateur endocrinien particulier et l’augmentation des cas de cancers ou la diminution de la qualité du sperme n’a pas été formellement démontré dans la littérature. Il apparaît alors nécessaire de poursuivre les études épidémiologiques afin de mieux évaluer les relations entre perturbateurs endocriniens et cancers (Caserta et al., 2008; Castro‐Rivera and Safe, 2003; Hess‐Wilson and Knudsen, 2006). 4. Les ligands synthétiques
Les RE étant impliqués dans différentes pathologies comme le cancer du sein, plusieurs laboratoires pharmaceutiques ont synthétisé des anti‐œstrogènes dès le début des années 1960. Des œstrogènes de synthèse ont également été développés pour le traitement des troubles de la ménopause, ainsi que pour la contraception féminine. Dans cette partie, je me restreindrai d’une part à la description des produits pharmaceutiques tels que l’éthynylœstradiol, le diéthylstilbestrol, la tibolone et les composés utilisés pour les traitements du cancer du sein hormono‐dépendant, et d’autre part à la description des ligands synthétiques sélectifs de chaque récepteur. 4.1. Molécules pharmaceutiques
L’éthynylœstradiol (EE2) : la synthèse de ce ligand synthétique consiste en l’insertion d’un groupement éthinyl en position 17α de l’œstradiol. L’éthynylœstradiol est un composant de la pilule contraceptive, qui présente une meilleure affinité pour le REα que l’E2 (Escande et al., 2006), 53
Ethynylœstradiol (EE2).
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes une longue rétention au niveau du récepteur dans les tissus cibles, et une métabolisation plus lente que celle des œstrogènes naturels. Le diéthylstilbestrol (DES) : c’est un composé pharmaceutique synthétique possédant une forte activité œstrogénique. Dans les années 40‐60, le DES a été prescrit aux femmes enceintes pour prévenir les avortements spontanés (Shapiro and Slone, 1979). Les conséquences négatives de son utilisation ont commencé à émerger en 1971, lorsque Herbst et coll. ont décrit l’apparition précoce du cancer du vagin chez 8 jeunes femmes qui avaient été exposées au DES in utero (Herbst et al., 1971). Une telle exposition à ce composé a causé des dysfonctionnements sexuels et des cas de stérilité dans la progéniture. Le DES a augmenté l’incidence de cancers du vagin et de l’utérus pour les femmes traitées et pour leurs filles, ainsi que la mortalité infantile et fœtale (Herbst et al., 1979; Laitman, 2002). Enfin, les garçons ont présenté des anomalies de l’appareil reproducteur comme la baisse de la qualité et de la quantité du sperme (Kinch, 1982; Diéthylstilbestrol (DES).
Swan, 2000). Son utilisation a été interdite en 1977. La tibolone : au cours des vingt dernières années, on a pu observer un intérêt croissant pour la thérapie de remplacement à la ménopause (HRT ou Hormonal Replacement Therapy). Elle a été principalement employée pour améliorer la qualité de vie des femmes souffrant de symptômes vasomoteurs (bouffées de Tibolone.
chaleur), mais aussi pour la prévention de l’ostéoporose ainsi que des maladies cardiovasculaires. La tibolone est un composé de thérapie de remplacement dont les propriétés sont de réduire les symptômes de la ménopause (Albertazzi et al., 1998) et dont les effets passent majoritairement par les récepteurs des œstrogènes (Ederveen and Kloosterboer, 2001). Elle a été classée comme STEAR (Selective Tissue Specific Activity Regulator), pour la distinguer des SERM (Selective Estrogen Receptor Modulator), car ses effets ne sont pas uniquement médiés par le RE (de Gooyer et al., 2001; Smith and OʹMalley, 2004). La tibolone est un dérivé synthétique de la 19‐nor‐testostérone. Après administration orale, elle est métabolisée au niveau intestinal puis hépatique en trois principaux composés actifs (3α‐
OH‐tibolone, 3β‐OH‐tibolone, et dans une moindre mesure l’isomère Δ4 de la tibolone) (Vos et al., 2002). Ce sont ces métabolites qui sont pharmacologiquement actifs. Ils sont responsables d’effets 54
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes œstrogéniques, androgéniques, ou progestatifs (de Gooyer et al., 2003; Escande et al., 2009). Ces actions tissu‐spécifiques de la tibolone découlent de l’équipement enzymatique du tissu cible (Kloosterboer, 2001; Palacios, 2001). Les SERD et SERM : le concept d’anti‐œstrogène bloquant l’action des œstrogènes dans le tissu mammaire pour prévenir le cancer du sein a été présenté pour la première fois par le professeur Antoine Lacassagne (Lacassagne, 1937). Il ouvre ainsi la voie à lʹhormonothérapie. Depuis ce temps, les compagnies pharmaceutiques ont développé des réducteurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes (SERD pour Selective Estrogen Receptor Downregulators) et des modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes (SERM pour Selective Estrogen Receptor Modulators), qui font partie des principales thérapies utilisées pour combattre le cancer du sein. D’autre part, les SERM sont considérés comme une thérapie d’avenir pour traiter les effets non désirés de la ménopause. Il existe deux grandes familles de SERM : les dérivés triphényléthyléniques, dont le plus utilisé est le tamoxifène, et les dérivés benzothiophènes, dont le chef de file est le raloxifène (Jordan, 2001a). Le tamoxifène est un composé anti‐œstrogénique appartenant à la famille des SERM. Il constitue l’une des premières et des plus efficaces thérapies pour le traitement et la prévention des cancers du sein RE positifs (Jordan, 2003). Ce composé triphényléthylénique a été synthétisé en 1966 et fut le premier SERM pour lequel on ait pu observer, dès 1967, des effets agonistes et antagonistes (Harper and Walpole, 1966). Le tamoxifène est largement inhibiteur et fonctionne comme un antagoniste dans les cellules cancéreuses Tamoxifène.
mammaires en inhibant leur croissance (Goldstein, 2000), et il diminue grandement le risque de cancer du sein chez la femme en pré‐ et post‐ménopause (Martino et al., 2004). Cependant, il fonctionne également comme un agoniste dans certains tissus incluant l’os, l’utérus, le foie, et le système cardio‐vasculaire. Ces effets agonistes s’avèrent bénéfiques dans certains tissus, permettant l’augmentation de la densité osseuse, et réduisant le risque de problèmes coronariens (Katzenellenbogen et al., 1997). Par contre, l’effet agoniste du tamoxifène s’avère délétère dans d’autres tissus pouvant mener à des cancers de l’endomètre ainsi qu’à l’altération des fonctions hépatiques (Bai and Gust, 2009). De plus, un traitement à long terme au tamoxifène peut souvent conduire à la résistance des cellules cancéreuses à ce composé 55
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes (Katzenellenbogen et al., 1997; Riggins et al., 2007). Tous ces effets néfastes du tamoxifène ont poussé au développement de nouveaux SERM (Robertson, 2004). Plus récemment, le raloxifène a démontré des caractéristiques comparables au tamoxifène, sans toutefois en avoir ses effets négatifs. Il a été développé vers la fin des années 1980. Bien qu’il soit capable de maintenir la densité osseuse, de prévenir le cancer du sein chez le rongeur, et d’inhiber la croissance de cancer de l’endomètre stimulé par le tamoxifène, le raloxifène a été initialement élaboré pour prévenir l’ostéoporose, pour Raloxifène.
laquelle il constitue un traitement aujourd’hui approuvé (Osborne et al., 2000). Le raloxifène est un bon inhibiteur in vitro de prolifération de lignées cancéreuses mammaires, et in vivo, il possède des activités anti‐tumorales. Comme le tamoxifène, il réduit le cholestérol total, mais n’augmente pas le cholestérol lipoprotéique, caractéristique de la diminution des effets cardio‐
protecteurs (Balfour and Goa, 1998). De plus, il a été montré que le raloxifène possède un potentiel dans le traitement de l’ischémie myo‐cardiaque. Il est capable de relâcher les artères coronaires porcines in vitro, grâce à l’activation de la voie des MAPK (Mitogen‐Activated Pretein Kinase) (Moritz et al., 2006). L’activation de la MAPK P38 est responsable de la cardioprotection au cours de l’ischémie (Sanada et al., 2001). Une grande étude a été menée sur le raloxifène, MORE (Multiple Outcomes of Raloxifene Evaluation), afin d’évaluer ses effets chez la femme post‐ménopausée (Cummings et al., 1999; Ettinger et al., 1999). Cette étude s’est étendue encore sur 8 ans, sous le nom de CORE (Continuing Outcomes Relative Evaluation) (Oseni et al., 2008). Les résultats de MORE et de CORE ont démontré l’efficacité du raloxifène à prévenir de l’ostéoporose et à inhiber de 65% le développement du cancer du sein invasif (Martino et al., 2004). Une dernière étude a alors été réalisée afin de comparer le tamoxifène au raloxifène. STAR (Study of Tamoxifen And Raloxifen) fut une étude de phase III en double aveugle de randomisation chez des femmes post‐ménopausées présentant des risques élevés de développement de cancer du sein (Vogel et al., 2006). Le résultat s’est révélé très concluant quant à la capacité des deux SERM à réduire l’incidence de cancer du sein invasif. Mais bien que le raloxifène entraîne peu de cancers de l’utérus et d’hyperplasie, il s’est montré moins efficace que le tamoxifène pour prévenir le développement de cancer du sein non invasif après 2 ans. C’est pourquoi le raloxifène est aujourd’hui approuvé par la FDA (Food and Drug Administration, 56
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes USA) pour le traitement et la prévention de l’ostéoporose, ainsi que la réduction d’apparition de cancer du sein invasif chez les femmes post‐ménopausées à haut risque (Oseni et al., 2008). Les limites des SERM ont conduit au développement d’une autre classe de régulateurs : les SERD (Miller et al., 2007). Alors que les SERM stabilisent le REα et entraînent une faible augmentation du taux de RE, les SERD, au contraire entraînent une rapide dégradation du REα. Le chef de file des SERD est l’ICI 182,780 ou fulvestrant (Osborne et al., 2004). De nombreuses tumeurs qui acquièrent une résistance au tamoxifène mais qui demeurent RE positives restent sensibles au fulvestrant. Il apparait alors comme traitement alternatif dans ce genre de cas (Fan et al., 2007). En avril Fulvestrant.
2002, la FDA a donné son accord pour son utilisation pour des traitements de cancers hormono‐dépendants métastasiques chez les femmes ménopausées qui ont déjà subi des traitements anti‐œstrogéniques sans succès. Une autorisation européenne a été obtenue en 2004 pour commercialiser le fulvestrant (Vergote and Robertson, 2004). D’un point de vue clinique, le fulvestrant offre un potentiel thérapeutique intéressant. Il possède une bonne affinité pour le RE, n’a pas d’activité agoniste sur l’utérus, et est capable de bloquer des activités œstrogéniques et anti‐œstrogéniques partielles. Il se lie au REα, l’adresse aux ERE et provoque le recrutement du corépresseur N‐CoR (Webb et al., 2003a). De plus, il est impliqué dans la dégradation importante du REα par le protéasome et est aussi capable de bloquer la prolifération des cellules MCF‐7 (Pink and Jordan, 1996). Le fulvestrant semble donc être un bon traitement des cancers du seins hormono‐
dépendants, mais contrairement au tamoxifène, il n’est pas efficace pour la prévention de l’ostéoporose et ne présente pas d’effet cardio‐protecteur (Katzenellenbogen et al., 1997). Par conséquent, le fulvestrant est recommandé comme traitement des cancers du sein à un stade avancé, chez les patientes post‐ménopausées, après échec d’une thérapie au tamoxifène (Dodwell et al., 2006; McKeage et al., 2004). Pour conclure sur ces substances œstrogéniques pharmaceutiques, il est possible de dire que les données cliniques suggèrent que l’utilisation séquentielle des différentes thérapies hormonales prolonge et permet une meilleure survie. Néanmoins, d’avantage de données sont nécessaires afin de déterminer quelles séquences ou combinaisons d’hormonothérapies sont les plus efficaces en traitement adjuvant ainsi que durant la progression du cancer, car il apparaît que selon le type de 57
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes tumeur, chaque traitement agit de manière différente (Miller et al., 2007). Et de plus, il semble important de tenir compte également des effets des phyto‐œstrogènes afin de prévoir des études alliant les hormonothérapies et les phytothérapies. En effet, comme décrit plus haut, les phyto‐
œstrogènes présentent des effets bénéfiques sur les cancers hormono‐dépendants ainsi que la ménopause. C’est pourquoi, il est possible de penser que les phyto‐œstrogènes pourraient jouer un rôle de soutien dans la chémo‐prévention, comme moteur et complément pour augmenter les effets bénéfiques des hormonothérapies (Oseni et al., 2008). 4.2. Ligands sélectifs des récepteurs alpha et bêta
Différents laboratoires ont décrit un certain nombre de composés synthétiques ayant une affinité sélective pour un des deux isotypes (Koehler et al., 2005; Veeneman, 2005). Par exemple, le PPT (4‐propyl‐1,3,5‐tris (4‐hydorxyphényl) pyrazole), membre de la classe des triarylpyrazoles (Stauffer et al., 2000), l’oxathiin‐6‐ol, modulateur sélectif du REα (Petz et al., 2004), ou bien le 16α‐
LE2 qui est un dérivé synthétique d’E2 (Hillisch et al., 2004), présentent une sélectivité pour le REα. Des composés non stéroïdiens comme le DPN (diarylpropionitrile) (Sun et al., 2003; Sun et al., 2002), ERB‐041 (Malamas et al., 2004a) et WAY‐358 (Manas et al., 2004) du laboratoire pharmaceutique Wyeth, et le composé stéroïdien 8β‐VE2 (Hillisch et al., 2004) lient avec une meilleure affinité le REβ. Une étude a montré que l’agoniste 16α‐LE2 du REα, est également agoniste du REβ à forte concentration, et de même, les agonistes du REβ DPN et 8β‐VE2 sont également agonistes du REα à forte concentration (Escande et al., 2006). Un nombre réduit d’antagonistes a été décrit comme étant des antagonistes sélectifs, tels que le MPP (methyl‐piperidino‐pyrazole), qui est un antagoniste sélectif du REα (Sun et al., 2002), et le R,R‐THC (R,R‐tetrahydrochrysene), qui est un agoniste partiel du REα mais un antagoniste complet du REβ (Sun et al., 1999). Le RU486, dont la structure est similaire à la progestérone, a été initialement synthétisé pour ses propriétés anti‐glucocorticoïdes (Beck et al., 1993). Cette molécule est également un anti‐progestatif (Baulieu, 1989). Ce composant de la pilule d’avortement médicamenteux, a été montré comme étant antagoniste sélectif du REβ (Escande et al., 2006). D’autre part, le raloxifène est un antagoniste des deux isoformes, mais présente une meilleure efficacité antagoniste pour le REα (Escande et al., 2006). De plus, il est à noter que le PTT, agoniste du REα, est antagoniste du REβ (Stauffer et al., 2000). Il faut toutefois retenir que des études ont 58
Etude bibliographique. B. Les ligands des récepteurs des œstrogènes montré que ces sélectivités observées pour ces ligands découlent en fait de leur sélectivité d’affinité de liaison avec leur isotype préféré (Meyers et al., 2001; Stauffer et al., 2000). Des études pharmacologiques ont été menées chez la rate et la souris pour certains de ces composés. Le PPT accroît le poids de l’utérus chez les rates sauvages, alors qu’il prévient d’un surpoids, d’une perte osseuse, et diminue le taux de cholestérol plasmatiques chez les rates ovariectomisées (Harris et al., 2002). Ces résultats suggèrent que l’action sélective sur le REα par le PPT peut remédier aux symptômes dus à une différence des niveaux d’œstradiol. Le 16α‐LE2 présente également une activité utérotrophique, contrairement au 8β‐VE2, et chez les rates ovariectomisées, réduit l’expression de LH, FSH, et IGF‐1 (Hegele‐Hartung et al., 2004). ERB‐041 n’augmente pas le poids de l’utérus des souris et des rates ovariectomisées, ce qui suggère que le REβ n’est pas impliqué dans l’activité utérotrophique (Harris et al., 2003). La plupart de ces ligands sélectifs a été élaborée grâce à des techniques de modélisation à des fins pharmaceutiques ainsi que dans le but d’étudier le rôle physiologique des RE. Les études in vivo montrent que les effets œstrogéniques reproductifs et métaboliques passent par le REα (Hillisch et al., 2004). Figure 15 : Ligands synthétiques sélectifs des récepteurs des œstrogènes.
59
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes C. MECANISME D’ACTION DES RECEPTEURS DES ŒSTROGENES
Les RE contrôlent l’expression de gènes cibles par le biais de différentes voies de signalisation. Ils induisent la transcription en s’associant directement à l’ADN au niveau de l’élément de réponse aux œstrogènes (ERE), et ce mécanisme détermine la voie d’activation classique des récepteurs. Les RE peuvent également réguler l’expression des gènes en l’absence d’un ERE par l’intermédiaire des interactions de type protéine‐protéine avec d’autres facteurs de transcription qui vont lier l’ADN. Ces voies sont dites voies génomiques. Lʹaction du RE peut également être non‐
génomique, et fait intervenir des mécanismes autres que des transcriptions de gènes. Lʹensemble de ces voies est schématisé dans la figure 16. Figure 16 : Mécanismes d’action du RE.
D’après Heldring et al., 2007.
La voie de signalisation classique (ou directe) comprend l’activation par le ligand et la liaison directe à
l’ADN (ERE) puis l’activation de la transcription. La voie indirecte (tethered) consiste en des
interactions protéine-protéine entre le RE et des facteurs de transcription (TF) après activation par le
ligand, et l’activation des gènes a lieu par interaction indirecte avec l’ADN. Le troisième mécanisme,
aussi appelé voie non génomique, n’est pas aussi bien connu que la voie génomique mais a été observé
dans de nombreux tissus. Le ligand active le RE, et la signalisation est initiée par des seconds
messagers (SM), menant à une réponse physiologique rapide qui n’implique pas d’activation des gènes
cibles. La voie ligand-indépendante repose sur l’activation de l’ERE via d’autres voies de
signalisation, comme la signalisation des facteurs de croissance (GF pour Growth Factor). Dans ce
cas, les kinases activées phosphorylent le RE et ainsi entraînent la dimérisation, la liaison à l’ADN, et
la régulation des gènes cibles.
60
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes 1. Voie d’activation classique : transcription directe sur l’ERE
La localisation nucléaire du RE est assurée en absence du ligand par le signal NLS (Nuclear Localisation Signal), et en présence du ligand par un signal localisé dans la région E (Gronemeyer and Laudet, 1995). Bien que localisé de manière prédominante dans le noyau, il a été démontré que des protéines nucléaires telles que le RE et des hsp (pour Heat Shock Protein) effectuaient en continu la ʺnavetteʺ entre le cytoplasme et le noyau (Dauvois et al., 1993), rendant le RE extrêmement mobile en l’absence de ligand (Shang et al., 2000; Stenoien et al., 2001). Par opposition, la liaison à un pur anti‐œstrogène peut interrompre ces translocations, en séquestrant le RE dans le cytoplasme (Dauvois et al., 1993). Dans le cytoplasme, le RE forme des complexes oligomériques avec des protéines chaperonnes, les hsp (Kang et al., 1994; Maruvada et al., 2003; Pratt and Toft, 1997). La hsp90, nécessaire au bon fonctionnement des récepteurs stéroïdiens (Osborne et al., 2005a), maintiendrait le RE dans un état inactif en absence dʹhormone en empêchant la dimérisation, et en masquant le domaine de reconnaissance de la séquence dʹADN (Pratt and Toft, 1997), et elle assurerait également une conformation favorable à la liaison du ligand (Danielsen, 1991). Cependant, une étude a précisé que le RE était associé au niveau de l’élément de réponse et qu’il effectuait des cycles d’association/dissociation sur les promoteurs des gènes cibles des œstrogènes indépendamment de la présence d’hormone (Metivier et al., 2004; Reid et al., 2003). Après liaison aux œstrogènes, le RE subit un changement de conformation qui permet la libération des hsp chaperonnes, démasque les sites de dimérisation du RE et favorise la transcription des gènes cibles via la fixation à l’ERE (Klein‐Hitpass et al., 1989). Lʹinteraction du RE avec les promoteurs des gènes cibles peut être de plusieurs types (pour revue (Heldring et al., 2007)). En fonction des complexes de co‐régulateurs (co‐activateurs ou co‐
répresseurs) recrutés sur le promoteur, l’hormone pourra alors activer ou réprimer la transcription. Parmi les gènes présentant un ERE, on retrouve : c‐fos, c‐jun, PS2, la cathepsine D, et la choline acétyl‐transférase. Même si les deux isoformes du RE (REα et REβ) présentent des propriétés similaires de liaison à l’ERE (même spectre de séquences d’ADN avec des affinités similaires) (Loven et al., 2001; Yi et al., 2002b), de nombreuses études ont mis en évidence que l’induction de la transcription ERE‐dépendante du complexe E2‐REβ est moins efficace que celle du complexe E2‐REα (précédemment décrit dans la partie ERE) (Hall et al., 2001; Nilsson and Gustafsson, 61
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes 2002) (Figure 17). Cependant, le mécanisme de transactivation via l’ERE isotype‐spécifique reste aujourd’hui peu clair (Li et al., 2008). Toutefois, plusieurs études s’accordent sur plusieurs points d’une nouvelle hypothèse émergente. Le domaine A/B des RE, déjà connu pour jouer un rôle critique dans l’interaction RE‐ERE (Huang et al., 2004; Li et al., 2008), apparaît important également dans la transactivation induite par le complexe RE‐ERE (Cowley and Parker, 1999; Pettersson et al., 2000). Effectivement, le domaine A/B, dont la structure diffère entre les deux isoformes, est l’un des facteurs à l’origine, mais pas suffisant pour expliquer le manque de capacité du REβ à induire la transcription (Li et al., 2008). Effectivement, les deux isoformes contiennent la fonction AF‐2 dans la partie C‐terminale qui présente une capacité d’activation puissante et comparable d’un RE à l’autre (Delaunay et al., 2000), mais contrairement au REα, le REβ contient une fonction AF‐1 moins puissante dans la région N‐terminale, qui pourrait présenter des activités répressives (Matthews and Gustafsson, 2003). Le domaine A/B du REβ semble donc incapable d’interagir fonctionnellement avec le domaine AF‐2 pour augmenter la transcription en réponse à l’E2 (Yi et al., 2002a). Cette différence pourrait résulter de la faible homologie de séquence du domaine A/B entre le REα et le REβ et plus particulièrement au niveau de la fonction AF‐1. Le remplacement du domaine A/B du REβ par celui du REα augmente l’activité transcriptionnelle de la protéine chimérique, en réponse à l’hormone, par rapport à la protéine REβ sauvage (McInerney et al., 1998a). De plus, le REβ pourrait jouer un rôle inhibiteur sur l’activité du REα probablement par la formation d’hétérodimères REα/REβ. En effet, la co‐expression du REβ diminue l’activité du REα à des concentrations subsaturantes en œstrogènes (Pettersson et al., 2000). D’autre part, les deux RE nécessitent la présence de tandems d’ERE afin d’induire significativement la transcription, mais l’efficacité dépend de l’isoforme du RE ainsi que du contexte cellulaire (Klein‐Hitpass et al., 1988a; Tyulmenkov et al., 2000; Yi et al., 2002a). Ces observations attestent donc des différences structurales ainsi que d’activation de la voie de signalisation directe entrainées par les deux récepteurs des œstrogènes. La voie classique d’activation des gènes cibles, dépendante des ERE est représentée figure 18. 62
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes Figure 17 : Liaison directe à l’ADN (sur la séquence ERE) des homo- et
hétéro-dimères du récepteur des œstrogènes.
D’après Matthews and Gustafsson, 2003.
Représentation schématique de la régulation transcriptionnelle des différents isotypes du RE via la
liaison à l’ERE. Les monomères du REα sont représentés en bleu, ceux du REβ en blanc. Cette figure
met également en avant les différentes efficacités d’activation de la transcription par les différents
dimères. Le dimère REα/REα est celui qui entraîne la plus forte activation, puis l’hétérodimère
REα/REβ active de manière intermédiaire, et enfin l’homodimère REβ/REβ présente la plus faible
efficacité de transactivation des gènes cibles.
63
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes Figure 18 : Voie d’activation classique des récepteurs des œstrogènes.
D’après Gruber et al., 2002b.
64
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes 2. Voie d’activation indirecte : indépendante des ERE
En plus du mécanisme d’activation classique de la transcription, il est maintenant connu que les RE sont capables de moduler l’expression des gènes cibles sans s’associer directement à l’ADN. En effet, environ 1/3 des séquences des gènes humains régulés par les œstrogènes ne contiennent pas d’éléments de réponse consensus (OʹLone et al., 2004). Effectivement, les RE lient et modulent l’activité de facteurs de transcription tels que AP‐1 (Activator Protein 1), Sp1 (Specificity protein 1) et NF‐κB (Nuclear Factor‐κB) par des interactions protéine‐protéine (Ascenzi et al., 2006). Dans ce cas, l’action des RE peut être opposée à celle observée sur un ERE, et dépend du contexte cellulaire. L’interaction des RE avec les facteurs AP‐1 ou Sp1 pourrait relayer les effets de l’hormone sur la prolifération cellulaire (Gronemeyer et al., 2004). Dans de nombreux cas, le REα et le REβ induisent des actions opposées dans la régulation de divers promoteurs et éléments de réponse spécifiques. 2.1. Sp1
La protéine Sp1 est un facteur de transcription de la famille Sp/KLF (kruppel like factor). Ces protéines contiennent, entre autres, des motifs à doigts de zinc qui sont nécessaires pour la liaison à l’ADN. Les facteurs Sp reconnaissent les séquences oligonucléotidiques de type GC et GT retrouvées dans divers promoteurs de gènes viraux et cellulaires (Safe and Kim, 2004). Le RE peut donc activer lʹexpression de gènes via une région promotrice riche en séquence GC par des complexes REα‐Sp1 (Hall et al., 2001). Cʹest le cas pour le LDLr (Li et al., 2001a). Certains gènes qui répondent aux œstrogènes contiennent un site Sp1 adjacent à un site ERE imparfait ou à un demi‐
site ERE (Porter et al., 1997), comme c‐myc (Dubik and Shiu, 1992), la cathepsine D (Krishnan et al., 1994) tandis que d’autres contiennent deux sites Sp1 seuls comme PR (Petz et al., 2004; Schultz et al., 2003). Les deux isoformes REα et REβ interagissent spécifiquement avec le facteur Sp1. Les effets des œstrogènes sur l’activité Sp1 dépendent du type cellulaire et du type de RE exprimé (Schultz et al., 2005). En effet, les œstrogènes et anti‐œstrogènes (ICI 182,780 et 4‐OH‐Tam) augmentent la transactivation d’un gène rapporteur contenant des motifs Sp1 par le REα dans les lignées MCF‐7 et MDA‐MB‐231 mais pas dans les cellules HeLa (RE négatives). A l’opposé, l’hormone ne module pas l’activité du complexe REβ‐Sp1 et l’effet des anti‐œstrogènes est minime dans les divers types cellulaires testés (Saville et al., 2000). En utilisant des protéines chimériques, il a été montré que le domaine A/B (et plus précisément la fonction AF‐1) du REα était nécessaire pour la transactivation 65
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes de Sp1 par les ligands (Saville et al., 2000). De plus, la co‐expression du REα, avec des concentrations croissantes de REβ, résulte dans la répression de l’activité REα‐Sp1, appuyant l’hypothèse d’un antagonisme fonctionnel entre le REβ et le REα. Cependant, le mécanisme de l’interaction entre les RE et Sp1 reste mal compris. 2.2. AP-1
Le RE régule également la transcription des gènes de la collagénase, de lʹIGF‐1 (Insulin Growth Factor‐1), et de la cycline D1, qui sont essentiellement impliqués dans la prolifération cellulaire (Kushner et al., 2000b). Cette régulation pourrait faire intervenir les séquences AP‐1. Le complexe AP‐1 est un facteur de transcription composé des protéines des familles Fos (c‐Fos, Fra‐1, Fra‐2, FosB) et Jun (c‐Jun, JunB, JunD). Ces facteurs comprennent une région de liaison à l’ADN, un domaine de dimérisation, des domaines de transactivation et des sites de phosphorylation (Glover and Harrison, 1995). Le facteur AP‐1 est classiquement un homodimère (Jun/Jun) ou un hétérodimère (Jun/Fos) (Gaub et al., 1990; Teyssier et al., 2001). Ces complexes régulent la transcription génique en se fixant sur des séquences consensus palindromiques appelées sites AP‐1 (TGA(C/G)TCA) (Glover and Harrison, 1995; Karin, 1995; Pfahl, 1993). Les récepteurs nucléaires et les membres du complexe AP‐1 interagissent entre eux de façon directe via les domaines C et D des récepteurs nucléaires et le domaine ʺleucine‐zipperʺ des facteurs AP‐
1 (Doucas et al., 1991; Wagner and Green, 1994; Yang‐Yen et al., 1990). Ainsi, le domaine de liaison à l’ADN des facteurs transcriptionnels ne constitue pas seulement une zone de reconnaissance spécifique d’une séquence nucléotidique, mais également un domaine d’interaction protéine‐protéine (Wagner and Green, 1994). De fait, tous les récepteurs nucléaires semblent capables d’interagir avec AP‐1. Le complexe AP‐1 a été relié par de nombreux travaux à la prolifération cellulaire. Effectivement, AP‐1 est capable d’activer des gènes impliqués dans la prolifération. Des travaux ont montré que le blocage de l’activité AP‐1 inhibe la prolifération des cellules mammaires MCF‐7 in vitro et chez l’animal (Liu et al., 2002b). Les promoteurs contenant des éléments de réponse au facteur AP‐1 sont régulés par les œstrogènes, mais aussi par des facteurs de croissance, des cytokines, des oncogènes ou des promoteurs tumoraux (Pfahl, 1993). 66
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes En général, les œstrogènes modulent positivement lʹactivité de AP‐1, mais la régulation peut également être négative dans les cellules de cancer du sein exprimant fortement un autre facteur transcriptionnel de la famille AP‐1, Fra‐1 (Paech et al., 1997; Philips et al., 1998). L’action des ligands sur les sites AP‐1 est différente de celle observée sur un ERE et dépend du type cellulaire. En effet, le tamoxifène augmente l’activité AP‐1 dans les cellules cancéreuses de l’utérus mais pas dans les lignées cancéreuses mammaires (Webb et al., 1995). Ce phénomène spécifique de lignée est étroitement corrélé à l’effet du tamoxifène sur la prolifération cellulaire, une inhibition dans le tissu mammaire et au contraire, une augmentation dans les cellules de l’utérus. Cet effet dépend probablement du niveau d’expression des protéines Jun/Fos dans la cellule (Philips et al., 1998). Lorsque le RE stimule la transcription des gènes cibles des facteurs AP‐1, la prolifération cellulaire est induite. A l’inverse, la répression de la transcription est associée à l’inhibition de la prolifération cellulaire (Kushner et al., 2000b). Par ailleurs, les deux formes de RE semblent réguler de manière différentielle l’expression des gènes cibles AP‐1. En présence d’œstrogènes, le REα induit la transcription au niveau des sites AP‐
1 alors que le REβ exerce un effet répressif voire pas d’effet (Paech et al., 1997). De plus, les anti‐
œstrogènes (par exemple le raloxifène) exercent une puissante activité agoniste en présence du REβ, alors que la liaison du REα sur AP‐1 n’entraîne qu’une activation minimale dans les mêmes conditions (Paech et al., 1997). Kushner et coll. ont identifié deux voies d’activation des facteurs AP‐1 par les RE, dépendante ou indépendante des fonctions activatrices de la transcription. Deux classes de ligands induisent de manière distincte la transcription des gènes cibles AP‐1 les œstrogènes au travers des fonctions AF‐1 et AF‐2, et les anti‐œstrogènes selon un mécanisme indépendant des fonctions activatrices de la transcription. La dernière voie serait d’autant plus évidente en présence du REβ et de mutants de délétion de la région amino‐terminale du REα (Kushner et al., 2000a; Kushner et al., 2000b). Concernant l’activation des facteurs AP‐1 par les œstrogènes, le REα serait recruté indirectement sur les sites AP‐1, par l’intermédiaire des co‐activateurs de la famille p160 (Webb et al., 1999). Toutefois, une interaction directe entre les facteurs Jun et la région charnière du REα a pu être observée en absence de ligand (Teyssier et al., 2001). Un modèle de titration des co‐répresseurs par les RE a été proposé pour expliquer les mécanismes d’induction des gènes cibles des facteurs AP‐1 par les anti‐œstrogènes. Le RE complexé aux antagonistes serait éloigné du site de transcription et permettrait le recrutement ainsi que la séquestration des corépresseurs. La 67
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes transcription serait donc localement activée au niveau de promoteurs de gènes cibles de AP‐1 (Webb et al., 1999). L’importance du DBD des récepteurs dans la régulation de l’activité AP‐1 a été démontrée par l’utilisation de mutants sur une lysine conservée du premier motif à doigt de zinc des RE (K206 pour REα et K170 pour REβ). Le DBD jouerait un rôle régulateur en dictant le profil d’activation de la transcription sur les sites AP‐1 en réponse au ligand et permettrait la discrimination entre les voies dépendantes ou indépendantes des fonctions activatrices de la transcription (Uht et al., 2004). 2.3. NF-κB
Les RE peuvent également interagir avec le facteur de transcription NF‐κB et notamment réguler l’expression du gène cible IL‐6 (Interleukine‐6) (Galien and Garcia, 1997). Dans ce cas, le REα complexé à l’hormone fonctionne comme un répresseur de l’activité transcriptionnelle de NF‐κB. NF‐κB est une protéine hétérodimérique, dont lʹune des sous‐unités, la protéine p65 interagit avec le REα et réprime la transcription régulée par le récepteur (Galien et al., 1996; Galien and Garcia, 1997; Stein and Yang, 1995). Inversement, dans certains types cellulaires, le REα est capable dʹinhiber lʹactivité transcriptionnelle de NF‐κB sans se lier à lʹADN (Cerillo et al., 1998; McKay and Cidlowski, 1998; Valentine et al., 2000). Cette activité inhibitrice pourrait, en partie, expliquer les actions anti‐inflammatoires des œstrogènes dans le cerveau et le système cardio‐
vasculaire, ainsi que leurs effets bénéfiques sur l’os. Le REβ est également capable dʹune telle inhibition dans la voie NF‐κB (Gougelet et al., 2007). La voie d’activation transcriptionnelle indirecte, impliquant les facteurs de transcription AP‐1, Sp1 et NF‐κB est représentée figure 19. Il convient également de noter que, de même que pour la transactivation directe passant par les ERE, cette activation via d’autres facteurs de transcription présente des efficacités différentes selon l’isotype du RE engagé dans la liaison. Effectivement, il apparait que le REα entraîne la plus forte activation, la présence des deux isoformes montre une activité moins forte, et le REβ n’entraîne pas du tout d’activation des gènes cibles via la liaison à d’autres facteurs de transcription (Matthews and Gustafsson, 2003). Ces différences d’activité transcriptionnelle sont représentées dans la figure 20. 68
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes Figure 19 : Les différentes voies de la régulation transcriptionnelle par
les récepteurs des œstrogènes.
D’après Ascenzi et al., 2006.
De gauche à droite : classiquement, les RE interagissent avec les ERE sur l’ADN. Le RE est dimérisé et
complexé à l’hormone (E2) avec l’élément de réponse. Les RE sont également capables de lier
indirectement l’ADN par l’intermédiaire d’interactions protéine-protéine avec SP1, AP-1 et NF-κB. Les
RE modulent l’expression des gènes régulés par ces trois facteurs et régulent notamment, de manière
négative, la transcription des gènes cibles de NF-κB. L’activité de la protéine N-κB est inhibée par
l’intermédiaire de son partenaire IκB (Inhibitor of kappa-B). La dégradation par le protéasome de IκB et
l’activation conséquente de NF-κB est déclenchée, entre autre, par l’IL (interleukine).
Figure 20 : Activation différentielle des gènes cibles via la liaison des RE
à d’autres facteurs de transcription.
D’après Matthews and Gustafsson, 2003.
Représentation de la régulation transcriptionnelle par les RE via la liaison à d’autres facteurs de
transcription, comme AP-1 ou Sp1. Les REα et les REβ sont représentés en bleu et en blanc
respectivement.
69
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes 3. Effets non génomiques des œstrogènes
Les œstrogènes peuvent également exercer des actions rapides, dites non génomiques, qui sont indépendantes de la synthèse d’ARNm et de protéine. Dans ce processus, différents seconds messagers sont activés après un temps relativement court de traitement par l’hormone, de l’ordre de la seconde à la minute (Zhang and Trudeau, 2006). Des effets rapides de lʹœstradiol peuvent être observés au niveau du sein, des vaisseaux, des os, et du système nerveux central (Pietras and Szego, 1977). Lʹœstradiol peut notamment augmenter de manière transitoire la concentration de calcium intracellulaire, stimuler lʹadénylate cyclase ou activer la phospholipase C. Lʹobservation dʹeffets très rapides des œstrogènes ne pouvant pas provenir de la transcription et de la formation de protéines suggère des effets non‐génomiques. A la fin des années 1970 a été découverte lʹexistence dʹune fraction de RE membranaire (Pietras and Szego, 1977), qui semblerait impliquée dans la régulation rapide de voie de signalisation impliquant des kinases (entre autres PI3K et Akt/PKB) ainsi que dʹautres messagers (Levin, 2005; Simoncini et al., 2000; Song and Santen, 2006). Par conséquent, la régulation de l’expression des gènes est un processus impliquant à la fois des effets génomiques et non génomiques qui convergent sur certains éléments de réponse de promoteurs de gènes régulés par les RE (la synthèse de ces voies de signalisation est représentée figure 21). La réponse finale dépend d’un grand nombre de conditions, telles que la combinaison des facteurs de transcription associés à l’ADN, la localisation cellulaire des RE, le niveau d’expression des co‐régulateurs et des composants des voies de signalisation, ainsi que la nature du stimulus extracellulaire (Bjornstrom and Sjoberg, 2005). 70
Etude bibliographique. C. Mécanisme d’action des récepteurs des œstrogènes Figure 21 : Les différents mécanismes de la signalisation œstrogénique.
D’après Bjornstrom and Sjoberg, 2005.
1. Mécanisme d’action classique des RE. Le complexe E2-RE nucléaire lie directement les ERE des
promoteurs des gènes cibles. 2. Actions génomiques ERE indépendantes. Le complexe E2-RE
nucléaire est lié via des interactions protéine-protéine au facteur transcriptionnel (TF) qui se fixe sur le
promoteur des gènes cibles pour moduler la transcription. 3. Actions non génomiques indépendantes
du ligand. Les facteurs de croissance (GF pour Growth Factor) activent la cascade des protéines
kinases, conduisant à la phosphorylation et à l’activation du complexe nucléaire RE-ERE phosphorylé.
4. Actions non génomiques. Le complexe E2-RE membranaire active la voie des protéines kinases.
Les différentes voies de transcription déclenchées par les récepteurs des œstrogènes ont lieu en présence d’autres protéines qui interagissent avec les RE. Ces complexes multiprotéiques sont ainsi composés de protéines appelées co‐facteurs de transcription, ou également co‐régulateurs. 71
Etude bibliographique. D. Les cofacteurs transcriptionnels D. LES CO-FACTEURS TRANSCRIPTIONNELS
L’interaction des récepteurs nucléaires activés par le ligand avec d’autres protéines que les facteurs généraux de la transcription a été décrite à partir des années 1990 (Meyer et al., 1989). Des travaux ont montré qu’il existe des mécanismes qui modulent la transactivation d’un récepteur activé, par la surexpression d’un autre type de récepteur nucléaire. Les récepteurs entrent en compétition pour un pool intracellulaire limité de protéines capables de réguler leur activité transcriptionnelle qui sont appelées co‐régulateurs. Des études biochimiques ou des expériences de double hybride ont permis l’identification de ces protéines. Aujourd’hui, la liste des co‐régulateurs est longue et leurs fonctions sont multiples (Lonard and OʹMalley, 2005). L’interaction des récepteurs nucléaires avec les co‐régulateurs permet le contrôle positif ou négatif de l’expression des gènes cibles. En présence d’hormones, l’interaction entre le RE dimérisé et les ERE est favorisée (Klein‐Hitpass et al., 1989), et la machinerie transcriptionnelle est recrutée directement ou par l’intermédiaire de co‐activateurs (Ali and Coombes, 2002). Par définition, les co‐activateurs sont associés à l’activation de la transcription alors que les co‐
répresseurs inhibent l’expression des gènes cibles des récepteurs nucléaires. Cependant, des études actuelles indiquent que cette définition peut être modifiée pour chaque co‐régulateur selon le gène, le contexte cellulaire, ainsi que selon la voie de signalisation (Margueron et al., 2005; OʹMalley, 2007; Rosenfeld et al., 2006; Spiegelman and Heinrich, 2004). Parmi les co‐activateurs, nous retrouvons des protéines « cointégratrices » telles que p300/CBP (CREB‐binding Protein), les co‐activateurs de la famille SRC (Steroid Receptor Coactivator) qui participent à de nombreuses voies de signalisation cellulaires via leurs interactions avec différents types de facteurs de transcription. Afin de débuter la transcription, il faut que la machinerie transcriptionnelle de base s’assemble. Les facteurs généraux de la transcription doivent s’assembler pour que l’ARN polymérase II soit recrutée au niveau du promoteur. Puis l’initiation de la transcription est amorcée et la cascade d’activation débute par la liaison du facteur TFIID pour ensuite recruter d’autres facteurs de transcription (comme TFIIB, TFIIF, ARN polymérase II) et enfin entraîner l’élongation de la transcription (cette cascade de recrutement de facteurs transcriptionnels est décrite dans plusieurs articles (Fondell et al., 1996; Sabbah et al., 1998; Verrijzer and Tjian, 1996)). 72
Etude bibliographique. D. Les cofacteurs transcriptionnels Les récepteurs nucléaires peuvent interagir directement avec les facteurs généraux de la transcription ou faciliter leur recrutement sur l’ADN via les co‐régulateurs (McKenna et al., 1999). Ces complexes protéiques jouent donc un rôle important dans le recrutement de la machinerie transcriptionnelle, dans la modulation de la structure de la chromatine, et au final dans la régulation de lʹexpression des gènes cibles. Il existe un grand nombre de protéines interagissant avec le RE (McDonnell and Norris, 2002) et beaucoup sont communes à tous les récepteurs nucléaires. La transcription faisant intervenir les co‐régulateurs, ainsi que la liaison au ligand et aux ERE est représentée en figure 22. groupement
acétyl
chromatine condensée
et
transcription réprimée
phosphorylation
chromatine décondensée
et
transcription autorisée
Co-R: co-répresseurs; CoA: co-activateurs; HDAC: histones désacétylases; HAT: histones acétyl transférases.
Figure 22 : Modulation de la transcription via les ERE.
D’après Ali and Coombes, 2002.
Le RE possède 3 domaines engagés dans ce mécanisme d’activation des gènes cibles : AF-1, le
domaine phosphorylé, AF-2, qui est régulé par la liaison au ligand, et le DBD.
Dans l’état inactivé, le RE est lié aux co-répresseurs (CoR). Ce complexe recrute les histones
désacétylases (HDAC). Les HDAC maintiennent les histones dans un état désacétylé, favorisant la
condensation de la chromatine. La transcription est réprimée.
La liaison d’E2 résulte en un changement conformationnel d’AF-2 (hélice H12) qui facilite
l’interaction avec les co-activateurs (CoA). Les CoA recrutent les histones acétyl transférases (HAT).
L’acétylation des histones par les HAT conduit à la décondensation de la chromatine, facilitant
l’activation transcriptionnelle.
La régulation de l’activité du RE par les SERM est réalisée par la balance entre les CoA et les CoR
complexés avec le domaine AF-2, en fonction de la conformation induite par le SERM, ainsi que de la
disponibilité des CoA et des CoR tissu-spécifiques.
D’autres facteurs, comme la cycline D1 ou des facteurs de croissance, induisent la phosphorylation du
domaine AF-1, et peuvent faciliter le recrutement des co-activateurs indépendamment du ligand.
73
Etude bibliographique. D. Les cofacteurs transcriptionnels 1. Les co-activateurs
La plupart des co‐activateurs possèdent un ou plusieurs motifs consensus LxxLL, où L est un résidu leucine et x, un acide aminé quelconque, permettant leurs interactions avec l’hélice H12 du domaine AF‐2 (fonction hormono‐dépendante) des récepteurs nucléaires (Heery et al., 1997) (Figure 23). C’est le cas des co‐activateurs de la famille p160/SRC, CBP/p300, TRAP/DRIP (Thyroid Hormone Receptor‐Associated Protein/VDR Interacting Proteins) qui interagissent avec les RE via ce motif en présence d’hormone (Hall and McDonnell, 2005). De nombreuses études sur le domaine AF‐2, en présence dʹun agoniste, ont souligné lʹimportance du changement de conformation du LBD, et en particulier de lʹhélice H12, créant une seconde enclave hydrophobe (la première correspondant au ligand), idéale pour interagir avec des co‐facteurs (McDonnell and Norris, 2002). A l’opposé des co‐régulateurs qui lient le domaine AF‐2, le co‐activateur p68 RNA hélicase interagit avec le domaine A/B du REα et induit la transcription par l’intermédiaire de la fonction AF‐1 fonction constitutive, activé par phosphorylation (Endoh et al., 1999). De même, le co‐
activateur SRA (Steroid Receptor RNA Activator) exerce également son action via le domaine AF‐1 des récepteurs stéroïdiens. La particularité de ce co‐régulateur réside dans le fait qu’il fonctionne, au moins en partie, comme une molécule d’ARN (Lanz et al., 1999). Ainsi, AF‐1 et AF‐2 ne lient pas préférentiellement les mêmes protéines (McKenna et al., 1999). Cependant, il est important de noter que les co‐activateurs qui reconnaissent la fonction AF‐2 peuvent, dans certains cas, lier également la fonction AF‐1. Par exemple, p300/CBP et les co‐
activateurs de la famille p160 interagissent aussi avec le domaine A/B des RE. Par le biais de ces co‐
activateurs, la collaboration des fonctions AF‐1 et AF‐2 pourrait également expliquer la synergie d’activation de la transcription des ERE (Benecke et al., 2000; Kobayashi et al., 2000). La famille des p160 qui se lie au domaine AF‐2 comprend les co‐activateurs les plus connus tels que les NCoA (Nuclear Receptor CoActivator). Cette nomenclature est relativement récente et a été mise en place pour simplifier les désignations d’une même protéine qui porte plusieurs noms. Ces divers co‐activateurs sont : ‐ NCoA1, également appelé SRC1, KAT13A (Onate et al., 1995; Torchia et al., 1998). ‐ NCoA2, ou SRC2, KAT13C, TIF2, GRIP1 (Hong et al., 1996; Torchia et al., 1998; Tzelepi et al., 2009; Voegel et al., 1998). ‐ NCoA3, ou SRC3, KAT13B, AIB1, pCIP, RAC3, TRAM1 (Anzick et al., 1997; Chen et al., 1997; Li et al., 1997; Takeshita et al., 1997). 74
Etude bibliographique. D. Les cofacteurs transcriptionnels (SRC : Steroid Receptor Coactivator ; TIF : Transcriptional Intermediary Factor ; AIB : Amplified In Breast cancer; GRIP : Glutamate Receptor Interacting Protein; RAC : Receptor Associated Coactivator; TRAM : Thyroid hormone Receptor Activator Molecule). Figure 23 : Structure des co-activateurs de la famille p160.
D’après Aranda and Pascual, 2001.
Les co-activateurs p160 contiennent un motif bHLH (basic Helix-Loop-Helix) et une région homologue
PAS (Per-Arnt-Sim) dans la partie N-terminale. Le domaine d’interaction avec les récepteurs nucléaires
(RID) contient 3 motifs LxxLL indiqués par des astérisques. Deux domaines d’activation (AD1 et AD2) et
une région riche en Q sont localisés en partie C-terminale. Sous la séquence, les crochets réfèrent à une
région possédant une activité acétyltransférase vis à vis des histones (HAT) et aux régions interagissant
avec le co-intégrateur CBP/p300 : HAT PCAF, ou l’arginine méthyltransférase CARM1.
Ces protéines co‐activatrices interagissent avec les REα et les REβ de manière dépendante de la région AF‐2 et du ligand (McKenna et al., 1999). Bien que possédant la même affinité pour AF‐2, lʹabondance relative de chacun de ces co‐activateurs varie selon le tissu, et détermine avec quel isoforme le RE se complexe. La fonction première des co‐activateurs est de recruter dʹautres co‐
activateurs et histones acetyltransférases, telles que p300, CBP (pour cAMP response element‐
Binding Protein) et pCAF. Le complexe ainsi formé autour des promoteurs de gènes cibles participe à la décondensation locale de la chromatine et à la dissociation du nucléosome, qui permet la transcription de lʹADN (Giamarchi et al., 2000). De plus, dʹautres protéines sont capables dʹinteragir avec le RE en même temps que les p160, telles que les protéines TRAP220 (Thyroid Receptor‐Associated Protein 220), un composant du complexe médiateur, qui sert de liaison entre le RE et l’ARN polymérase II. TRAP220 interagit avec le REα et le REβ, mais présente une affinité sélective pour le REβ (Kang et al., 2002). Cette affinité sélective pour un isoforme semble influencée par les parties C‐terminales respectives (domaines F) (Warnmark et al., 2001a). Ce dernier complexe semble donc avoir un rôle différent dans lʹactivation de la transcription, et probablement un rôle dans la liaison du RE et de lʹARN polymérase II. Les co‐activateurs interagissant avec AF‐1 sont différents de ceux connus pour AF‐2 et présentent un grand intérêt, puisque AF‐1 est le domaine nécessaire pour lʹaction agoniste du 75
Etude bibliographique. D. Les cofacteurs transcriptionnels tamoxifène. Les SRA et les hélicases dʹARN p68 et p72 sont des régulateurs connus de AF‐1 (McKenna et al., 1999). Cependant, comme lʹactivité dʹAF‐1 varie dʹun type cellulaire à lʹautre, il semblerait que ce ne soient pas les seuls. Les principaux co‐activateurs pouvant se complexer au RE et réguler son activité transcriptionnelle sont synthétisés en figure 25. 2. Les co-répresseurs
A l’opposé des différents types de co‐activateurs qui facilitent la transcription, l’expression des gènes est réprimée en présence de complexes co‐répresseurs. En 1992, Baniahamad et collaborateurs démontraient pour la première fois, l’existence d’un domaine inhibiteur de TR qui réprimait la transcription lorsqu’il était fusionné à un DBD hétérologue en l’absence d’hormones thyroïdiennes (Baniahmad et al., 1992). Par la suite, SMRT (Silencing Mediator of Retinoic and Thyroid hormone receptors) et N‐CoR (Nuclear Receptor Corepressor) ont été les premiers co‐répresseurs des récepteurs nucléaires identifiés lors d’études biochimiques ou d’expériences de double hybride (Chen and Evans, 1995; Horlein et al., 1995; Privalsky, 2004). Les co‐régulateurs SMRT/N‐CoR interagissent avec un second groupe de co‐répresseurs : les HDAC (histones désacétylases), qui exercent une activité enzymatique désacétylase, et forment de larges complexes multi‐protéiques pour la répression optimale de la transcription (Alland et al., 1997; Heinzel et al., 1997; Nagy et al., 1997). En absence d’hormone, une étude a précisé que le REα effectuait des cycles d’association/dissociation sur les promoteurs de gènes cibles des œstrogènes (Metivier et al., 2004; Reid et al., 2003; Zhuang et al., 1995). Mais, le changement de conformation du LBD en présence dʹhormone apparaît nécessaire pour la formation du complexe transcriptionnel. Ainsi, le RE non‐lié à lʹhormone et lié à lʹADN est souvent complexé avec des co‐répresseurs. Cependant les co‐répresseurs agissent généralement en coopération avec les antagonistes. Le REβ peut être considéré comme un co‐répresseur du REα. En effet, même sʹil active les mêmes gènes que le REα, lʹinduction est en général plus faible pour le REβ (Huang et al., 2005b; Li et al., 2008; Weihua et al., 2000) et il peut même diminuer l’activité du REα (Hall and McDonnell, 1999; Li et al., 2008). Le PR (isoforme A) est également connu pour un être un régulateur négatif du REα (Wen et al., 1994). Les autres co‐répresseurs connus pour agir en absence du ligand sont N‐CoR et SMRT (précédemment cités) (Lavinsky et al., 1998; Smith et al., 1997). 76
Etude bibliographique. D. Les cofacteurs transcriptionnels En présence de l’hormone, les co‐répresseurs recrutés sont qualifiés de « répresseurs atypiques », car ils répriment l’expression des gènes cibles des récepteurs nucléaires en présence d’agoniste, jouant ainsi le rôle « d’anti co‐activateurs ». L’un de ces co‐régulateurs à avoir été identifié en premier est TIF1α (Transcriptional Iintermediary protein 1α). La fusion de TIF1α au DBD du facteur GAL4 génère une forte répression de l’activité transcriptionnelle. De plus, TIF1α via la région AF‐2 des RN réprime la transactivation réalisée par RXRα, RARα et le REα en transfection transitoire dans des cellules de mammifères (Le Douarin et al., 1995; Thenot et al., 1997). Le co‐régulateur RIP140 (Receptor Interacting Protein of 140 kDa ou également appelé NRIP1), initialement considéré comme co‐activateur, mais aujourd’hui considéré comme anti co‐activateur (Castet et al., 2004), contient neuf motifs LxxLL et interagit directement avec le domaine d’activation de la transcription AF‐2 du REα en présence d’œstradiol (Cavaillès et al., 1995). RIP140, par cette interaction avec la fonction AF‐2, empêche la liaison des RE aux co‐activateurs. De multiples domaines de la protéine RIP140 sont responsables de la répression transcriptionnelle. Des études montrent que les HDAC de classe I et II ainsi que les co‐
répresseurs CtBPs (C‐terminal Binding Proteins) interagissent avec RIP140 et participent à son activité inhibitrice de régulation de l’expression basale des gènes cibles des RE (Castet et al., 2004; Wei et al., 2000). De la même manière que RIP140, LCoR (Ligand‐dependent Corepressor) réprime la transactivation de nombreux récepteurs nucléaires en présence d’hormone et interagit directement avec les HDAC (Fernandes et al., 2003). Enfin, le co‐répresseur REA (Repressor of Estrogen receptor Activity) inhibe l’activité dépendante du ligand des REα et REβ, mais ne module pas la transactivation des autres récepteurs nucléaires. La répression de la transcription exercée par REA semble s’expliquer par un phénomène de compétition avec le co‐activateur SRC‐1 (Montano et al., 1999). De manière intéressante, ce co‐régulateur sélectif des RE interagit avec le domaine E des récepteurs à la fois en présence d’agoniste ou d’antagoniste (Delage‐Mourroux et al., 2000). Plus récemment, une étude a montré la participation des HDAC dans les fonctions répressives de la transcription engendrées par REA (Kurtev et al., 2004). Des analyses comparatives du REβ et du REα ont été menées en utilisant des variants du REβ ainsi que du REα délétés ou non du domaine A/B (Δ A/B) (contenant la fonction AF‐1) et/ou de la partie C‐terminale (contenant la fonction AF‐2) (Huang et al., 2005b). Ces travaux ont suggéré que même si la partie N‐terminale du REβ est une région déterminante qui affecte l’interaction RE‐ERE, les bases structurales responsables de l’effet différent d’E2 sur les interactions REα‐ERE et REβ‐ERE résident également dans les parties C‐terminales des deux RE. Il semblerait que la condition 77
Etude bibliographique. D. Les cofacteurs transcriptionnels requise pour augmenter l’interaction REβ‐ERE médiée par E2 lorsque la fonction AF‐2 est abolie, implique la liaison de co‐facteurs qui rendent l’interaction du REβ avec l’ERE indépendante d’E2. Ces co‐facteurs pourraient affecter les évènements (ayant lieu avant et/ou après la liaison REβ‐ERE) qui contribuent à l’efficacité de transactivation du récepteur. Ces co‐facteurs ainsi responsables de ces effets sont SMRT et N‐CoR. Des études ont montré que SMRT et N‐Cor constituent une partie du complexe co‐répresseur des holorécepteurs (ce complexe comprenant d’autres composés co‐
répresseurs) (Jepsen and Rosenfeld, 2002; Perissi et al., 2004; Perissi and Rosenfeld, 2005; Rosenfeld et al., 2006). Il a été montré qu’une région de la partie C‐terminale comprenant la fonction AF‐2 de l’aporécepteur REα interagit in vitro et in situ avec une séquence de la partie C‐terminale de N‐CoR ressemblant au motif consensus LxxLL des co‐activateurs (Lavinsky et al., 1998; Metivier et al., 2004; Smith et al., 1997; Webb et al., 2003a) (Figure 24). De plus, la liaison de l’E2 au REα libère les co‐
répresseurs du récepteur. Au contraire, la liaison de l’E2 n’entraîne pas la dissociation des co‐
répresseurs du REβ (Webb et al., 2003a). Certaines études menées in vitro indiquent également que de même que pour le REα, une région dans la partie C‐terminale du REβ qui comprend la fonction AF‐2 interagit avec N‐CoR (Webb et al., 2003b). Cependant, contrairement au REα, la liaison d’E2 n’entraîne pas la dissociation des co‐répresseurs du REβ. Il est établi que l’E2 entraîne la transactivation des gènes cibles. Toutefois, il devrait également convertir le REβ inactif lié à l’ERE en un REβ dans un état transcriptionnellement actif. Cependant, la présence des co‐activateurs et des co‐répresseurs pourrait contribuer, en plus des différences structurales des deux isoformes, à la faible activité du complexe REβ‐E2 dans la voie de signalisation ERE dépendante (Li et al., 2008). Figure 24 : Structure schématique des co-répresseurs SMRT et NCoR.
D’après Aranda and Pascual, 2001.
Les co-répresseurs SMRT et NCoR contiennent 3 domaines de répression (RD1, RD2, RD3) et 2
domaines d’interaction au récepteur (RID). Les RID, situés dans la partie C-terminale contiennent le
motif LxxI/HIxxxI/L indiqué par des astérisques. Le RD1 interagit avec mSin3A, qui recrute à son
tour les désacétylases de classe 1 et 2 (HDAC1/2). Les désacétylases de classe 3 lient RD2 sans
médiateur mSin3. Il a été montré que les HDAC3 interagissent directement avec RD2. De même, les
HDAC4/5, 7 lient le RD3.
78
Etude bibliographique. D. Les cofacteurs transcriptionnels Les principaux co‐répresseurs pouvant se complexer au RE et réguler son activité transcriptionnelle sont synthétisés en figure 25. Figure 25 : Co-activateurs et co-répresseurs du REα.
D’après McDonnell and Norris, 2002 et Hall and McDonnell, 2005.
Le REα interagit avec un grand nombre de protéines qui sont capables de réguler positivement ou
négativement la transcription des gènes cibles. La plupart des cofacteurs connus du REα interagissent
avec différentes protéines cibles raccordant le récepteur à d’autres voies de signalisation. Ces protéines
ont la capacité de moduler la signalisation du RE par des interactions directes ou indirectes. Cette
figure montre une partie des interactions clés qui régulent positivement ou négativement l’activité
transcriptionnelle du REα. Les co-activateurs sont représentés en vert et les co-répresseurs en rouge.
79
Etude bibliographique. E. Modifications post‐traductionnelles et signalisation hormonale E. MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES ET
SIGNALISATION HORMONALE
Les récepteurs des œstrogènes subissent de nombreuses modifications post‐traductionnelles, parmi lesquelles la phosphorylation, l’ubiquitinylation, la méthylation, la sumoylation, et l’acétylation. Ces modifications agissent à différents niveaux pour moduler leur activité transcriptionnelle et réguler l’expression des gènes cibles. 1. Phosphorylation
La phosphorylation des récepteurs nucléaires est étudiée depuis plus longtemps que les autres modifications post‐traductionnelles. Comme la plupart des facteurs de transcription, les RE sont des phosphoprotéines qui sont modifiées constitutivement ou en présence d’œstradiol par de nombreuses kinases, en particulier les CDK (cyclin‐dependent kinase). Plusieurs acides aminés du RE sont sujets à phosphorylations (Lannigan, 2003). En effet pour le REα par exemple, les sérines 118, 104, 106 sont modifiées après la liaison d’œstradiol, et les sérines 118, 167 sont phosphorylées par la voie des MAP kinases et/ou par la CDK7 (Cyclin‐Dependent Kinase 7) et par AKT respectivement (Ito et al., 2004 ; Chen et al., 2002 ; Lannigan, 2003). Comme présenté dans la partie précédente, les phosphorylations du RE sont importantes pour réguler la transcription ligand‐indépendante via les domaines AF‐1 et AF‐2 (Ali et al., 1993). Dans le DBD, la phosphorylation de la sérine 236 peut également avoir un effet inhibiteur sur la dimérisation du récepteur en absence du ligand et diminue la liaison à lʹADN (Chen et al., 1999b). De plus, la phosphorylation de la sérine 305 (Rayala et al., 2006) s’accompagne d’une augmentation du niveau d’expression de la cycline D1 et pourrait donc jouer un rôle important dans la prolifération des cellules cancéreuses mammaires (Balasenthil et al., 2004). La phosphorylation du REα conduit généralement à l’augmentation de l’activité transcriptionnelle, et lors de la phosphorylation de la sérine 118 cette augmentation est liée au recrutement de l’ARN hélicase p68 (Endoh et al., 1999). Un autre co‐facteur (SPBP pour Stromelysin‐1 Platelet‐derived growth factor‐responsive element‐Binding Protein) est recruté après phosphorylation de la sérine 118, ce qui entraîne la répression de la fonction du REα, et l’inhibition de la prolifération basale et de la prolifération induite par E2 des cellules MCF‐7 (Gburcik et al., 2005). Il est également intéressant de noter que la phosphorylation du REα via différentes voies de kinases a différents effets sur la stabilité 80
Etude bibliographique. E. Modifications post‐traductionnelles et signalisation hormonale du récepteur, qui dépendent de la liaison d’agonistes ou d’antagonistes (Marsaud et al., 2003). Ainsi la phosphorylation pourrait conduire à la prolifération indépendante de lʹhormone et contribuer à lʹapparition et la progression des cancers du sein et/ou à lʹapparition de résistance à lʹhormonothérapie (Osborne et al., 2005a). En effet, les phosphorylations des sérines 118 et 305 semblent inhiber lʹaction du tamoxifène (Murphy et al., 2004).
Figure 26 : Phosphorylation du REα en réponse à l’œstradiol.
D’après (Lannigan, 2003).
Figure 27 : Phosphorylation du REα en réponse à l’activation des
seconds messagers des voies de signalisation.
D’après Lannigan, 2003.
En ce qui concerne le REβ, il a été mis en évidence que deux résidus de sérine phosphorylés par la voie des MAP kinases induisent l’augmentation de l’interaction avec le co‐activateur NCoA1 (SRC1) en absence d’œstrogène, et de fait, l’augmentation de l’activité transcriptionnelle des gènes cibles (Rowan et al., 2000; Tremblay et al., 1999). Ces sérines sont les S60, S106, et S124 (Tremblay et al., 1999). 81
Etude bibliographique. E. Modifications post‐traductionnelles et signalisation hormonale La phosphorylation joue donc un rôle primordial dans le contrôle de la transcription des gènes hormono‐dépendants en ciblant les récepteurs des œstrogènes et leurs co‐régulateurs. Nous verrons par la suite que cette modification est connectée à d’autres modifications post‐
traductionnelles telles que l’acétylation et l’ubiquitinylation, qui participent également à la régulation de la transactivation des RE. 2. Ubiquitinylation
La régulation des RE passe également par la voie du protéasome (El Khissiin and Leclercq, 1999) impliquant l’ubiquitinylation des récepteurs (Lonard et al., 2000). L’ubiquitine est un polypeptide de 76 aa conjugué à divers substrats. L’ubiquitinylation des protéines est un processus composé de trois étapes, impliquant l’action séquentielle d’une enzyme d’activation (E1), d’une enzyme de conjugaison (E2), et d’une ligase (E3) (Ciechanover, 2006). Les protéines liées par des chaînes de poly‐
ubiquitine sont ainsi marquées pour être dégradées par le protéasome dans le cytoplasme (Nawaz et al., 1999). Ce processus peut être inversé par une enzyme de dé‐ubiquitinylation (Nijman et al., 2005). La stabilité du RE est modulée par son ligand : en absence du ligand, la demi‐vie du RE est d’environ 5 heures, alors qu’en présence du ligand, sa demi‐vie n’est plus que de 3 heures (Eckert et al., 1984; Nardulli and Katzenellenbogen, 1986). En présence de l’anti‐œstrogène ICI, la demi‐vie du REα est très fortement réduite. Au contraire, en présence de tamoxifène, le récepteur est stabilisé (Wijayaratne and McDonnell, 2001). L’ensemble de ces résultats permet de supposer que la stabilité du REα joue un rôle important dans la réponse œstrogénique. L’inhibition de l’exportine CRM‐1 par la leptomycine B bloque la dégradation induite par E2, mais pas par ICI. Cela démontre que la protéolyse du REα s’effectue dans des compartiments cellulaires différents, en fonction du ligand. En présence d’œstradiol, le REα est dégradé par une fraction cytoplasmique du protéasome, alors qu’en présence d’ICI il est dégradé dans le noyau (Callige et al., 2005; Callige and Richard‐Foy, 2006). Enfin, l’ubiquitine ligase, SUG1, peut interagir avec les REα et β liés en stimulant leur ubiquitinylation et donc leur dégradation, empêchant ainsi les transactivations des deux récepteurs (Faus and Haendler, 2006; Masuyama and Hiramatsu, 2004). Dans un modèle cellulaire de muscles lisses vasculaires, le REα est dégradé par le protéasome, mais pas le REβ (Liang and Nilsson, 2004). Il apparait donc que la terminaison de la transcription ERE‐dépendante est tributaire, pour le REβ comme pour le REα, de l’ubiquitinylation et de l’adressage des deux isoformes menant à la voie de dégradation par le protéasome (Tateishi et al., 2004; Tateishi et al., 2006). 82
Etude bibliographique. E. Modifications post‐traductionnelles et signalisation hormonale La figure 23 montre l’implication de l’ubiquitinylation ainsi que du protéasome dans les phénomènes d’activation de la transcription et de dégradation du REα. Figure 28 : Dégradation du REα.
D’après Callige and Richard-Foy, 2006.
Modèle résumant les différentes étapes probablement impliquées dans la dégradation du REα
induite par l’œstradiol, ainsi que les relations possibles avec l’activation de la transcription.
3. Sumoylation
Récemment découverte, la sumoylation est une modification post‐traductionnelle qui consiste en lʹattachement covalent dʹune petite protéine, appelée SUMO (Small Ubiquitin‐Like Modifier) et proche de lʹubiquitine. Cependant, à lʹinverse de lʹubiquitinylation, cette modification nʹest pas responsable que de la dégradation de la protéine, et possède diverses fonctions biologiques, dont la régulation de la transcription. De même que pour l’ubiquitinylation, la sumoylation est un processus présentant trois étapes, qui implique une enzyme d’activation (E1, Aos/Uba2), une enzyme de conjugaison (E2, Ubc9), ainsi qu’une ligase (E3) (Hay, 2006). La sumoylation sʹeffectue sur des lysines phosphorylées de la région charnière (notamment K266 et 268) et la mutation de ces résidus a pour effet de diminuer lʹactivité transcriptionnelle et la liaison à lʹADN du REα (Sentis et al., 2005). Il semblerait donc que la sumoylation régule positivement la transcription du REα, à lʹinverse des acétylations sur les lysines 266 et 268 qui répriment lʹactivité transcriptionnelle (Kim et al., 2006). Sumoylation et acétylations pourraient alors entrer en compétition pour la régulation de lʹactivité du REα. 83
Etude bibliographique. E. Modifications post‐traductionnelles et signalisation hormonale 4. Méthylation du REα
Il a été montré récemment que le REα pouvait également être méthylé (Le Romancer et al., 2008). Cette méthylation a lieu sur l’arginine 260 de la protéine, dans le domaine de liaison à l’ADN. La méthylation des résidus arginine est catalysée par la famille des PRMT (protein arginine N‐
methyltransferase), qui sont impliquées dans de nombreux processus, incluant la régulation transcriptionnelle, la réparation de l’ADN, le métabolisme de l’ARN et la transduction du signal (Bedford and Clarke, 2009). Ceci suggère que la méthylation de l’arginine 260 du REα par PRMT1 pourrait jouer un rôle dans la transduction du signal (Le Romancer et al., 2010). Cette modification du REα a lieu rapidement après traitement à l’E2 et la forme méthylée de la protéine n’est détectable que dans le cytoplasme (Le Romancer et al., 2008), suggérant que la méthylation a lieu dans ce compartiment cellulaire. Les auteurs ont également mis en évidence que la méthylation du REα est nécessaire pour le recrutement des partenaires extranucléaires du RE impliqués dans la signalisation non génomique. Lors de cette étude il a également été montré que cette méthylation du REα a lieu dans le cytoplasme de cellules épithéliales mammaires saines, mais également dans les tissus mammaires cancéreux. Suite à ces observations, une récente revue souligne alors l’importance de l’étude du rôle de cette modification du REα dans les tissus cibles des œstrogènes comme le sein, l’ovaire et l’utérus (Teyssier et al., 2010). 5. Acétylation
L’acétylation est un processus réversible qui cible les lysines des histones et des facteurs de transcription. Elle consiste à l’attachement d’un groupement acétyl provenant du donneur acétylcoenzyme A, soit sur un acide aminé N‐terminal, soit sur un résidu lysine situé à n’importe quel endroit de la chaîne peptidique (Polevoda and Sherman, 2002). L’acétylation sur une lysine est assurée par les co‐activateurs à activité FAT (Factor Acetyl Transferase), essentiellement CBP/p300 et PCAF, capables d’acétyler non seulement les histones, mais aussi les récepteurs nucléaires, les co‐
régulateurs et les facteurs généraux de transcription. L’acétylation des facteurs de transcription, comme les récepteurs des œstrogènes, régule leur activité en agissant sur la liaison à l’ADN, les interactions avec les co‐régulateurs, la stabilité et la localisation subcellulaire. Cette modification post‐traductionnelle a été mise en évidence vers la fin des années 1990, par des tests d’acétylation in vitro et des études de spectrométrie de masse (Fu et al., 2003; Wang et al., 84
Etude bibliographique. E. Modifications post‐traductionnelles et signalisation hormonale 2001a). Ces études ont montré l’acétylation des lysines 302 et 303 dans la région charnière du REα sur le motif RSKK conservé entre les espèces. Le co‐activateur p300 serait responsable de cette modification in vitro. Cette acétylation du REα a également été étudiée dans les cellules MCF‐7, et a permis aux auteurs de montrer que l’acétylation joue un rôle atténuateur ou inhibiteur sur l’activité transcriptionnelle du REα (Wang et al., 2001a). De manière intéressante, l’acétylation du REα sur plusieurs résidus (par CBP/p300) détermine sa sensibilité à l’hormone. Ainsi, la mutation du résidu 303 qui transforme la Lys en Arg (K303R) interdit l’acétylation, et confère une hypersensibilité des cellules (Fu et al., 2004). Cette mutation est retrouvée dans 34% des lésions du sein hyperplasique (Fu et al., 2004) et pourrait avoir un rôle biologique déterminant dans l’apparition du cancer du sein (Conway et al., 2005; Fuqua et al., 2000). D’autre part, la phosphorylation de la sérine adjacente, en position 305, par la PKA conduit à l’hypo‐acétylation de la lysine 303 et reproduit le phénotype d’hypersensibilité hormonale obtenue avec la mutation K303R (Cui et al., 2004). Par la suite, une équipe a montré que le REα était acétylé au niveau des résidus lysine 266 et 268 situés dans le DBD (Kim et al., 2006). Cette modification a été montrée in vitro et dans la cellule, sous l’effet du co‐activateur p300. L’acétylation de ces lysines 266 et 268 augmente la liaison à l’ADN du REα ainsi que son activité transcriptionnelle. Il apparaît alors surprenant que selon le site acétylé, l’action sur l’activité transcriptionnelle soit inversée (l’acétylation K266 et K268 stimule alors que l’acétylation K302 et K303 inhibe la réponse) (Faus and Haendler, 2006). Ceci souligne d’autant plus la finesse et la complexité de la régulation de l’activité transcriptionnelle des récepteurs des œstrogènes. Quant aux co‐régulateurs, l’acétylation semble jouer un rôle négatif sur leur activité. Cette modification diminue les interactions avec les partenaires se liant au niveau de sites proches du motif d’acétylation. C’est le cas de l’acétylation dépendante de l’hormone du co‐activateur NCoA3 (SRC3) par CBP qui diminue l’interaction avec le REα (Chen et al., 1999a). De la même manière, l’acétylation du cofacteur RIP140 (NRIP1) diminue sa liaison aux protéines co‐répressives CtBP (Vo et al., 2001). Ces modifications post‐traductionnelles des RE semblent critiques et affectent la stabilité et l’activité des récepteurs (Nott et al., 2008). Ces modifications suggèrent également un mécanisme probable dans la régulation cellule‐ et gène‐spécifique des fonctions des deux isoformes du RE. Des modifications post‐traductionnelles aberrantes pourraient affecter défavorablement la signalisation des RE en absence et en présence de l’hormone, par conséquent contribuant à l’initiation et/ou au développement d’affections des tissus cibles des œstrogènes. 85
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE F. LES FONCTIONS PHYSIOLOGIQUES DES RECEPTEURS DES
ŒSTROGENES
Les modèles de souris transgéniques « RE KO » (knock out du RE), dans lesquelles REα et/ou REβ sont inactivés, ont permis de montrer le rôle des RE dans les tissus d’un organisme, et ce rôle est parfois majeur dans des tissus qui ne sont pas des cibles classiquement reconnues des œstrogènes (Couse and Korach, 1999; Curtis and Korach, 2000). 1. Distribution tissulaire
Les invalidations des gènes codant pour les récepteurs des œstrogènes, ainsi que des études de quantification d’ARNm chez les souris de type sauvage et KO ont permis d’évaluer la présence des deux isotypes dans les différents tissus (Couse et al., 1997). Cerveau
REα, REβ
Poumon
REβ, REα
Système cardio-vasculaire
REα, REβ
Sein
REα,
ERα, REβ
ERβ
Tractus gastro-intestinal
REβ
Foie
REα
Tractus urogénital
REα, REβ
Utérus : REα dominant
Prostate : REβ dominant
Os
REα, REβ
Figure 29 : Répartition tissulaire du REα et du REβ dans le corps humain.
Adapté de Gustafsson, 1999, pour revue Pearce and Jordan, 2004,
et d’après Couse et al., 1997.
Les études portant sur la distribution tissulaire des récepteurs et sur leur mode d’expression indiquent que le REα a une expression générale, alors que le REβ possède une distribution plus spécifique avec de hauts niveaux dans les ovaires, la prostate, l’épididyme, les poumons, et l’hypothalamus (Couse et al., 1997; Kuiper et al., 1997). 86
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE 2. Les phénotypes des souris knock-out
2.1. Inactivation du REα chez les souris : REα KO
L’inactivation du REα chez les souris a permis de mettre en évidence l’importance de ce récepteur dans certains tissus et son rôle dans l’action des facteurs de croissance. Les mâles et les femelles survivent jusqu’à l’âge adulte avec des phénotypes externes apparemment normaux (Lubahn et al., 1993). Chez les souris homozygotes pour l’inactivation du REα (REα KO), les mâles présentent une diminution de la fertilité avec l’âge et les femelles sont stériles (Couse et al., 1999; Dupont et al., 2000; Lubahn et al., 1993). Ces souris présentent des troubles de la sexualité (Ogawa et al., 1996b), et chez les femelles on observe des anomalies du développement mammaire (Hewitt and Korach, 2000; Korach et al., 1996). 2.1.1. L’utérus
Chez les femelles, l’invalidation du REα n’entraîne pas d’altération de l’utérus aux stades néonatal et prépubère. Par contre, cette invalidation du REα conduit au stade adulte à une hypoplasie de l’utérus (Lubahn et al., 1993). Sous traitement à l’œstradiol pendant une durée de 3 jours, l’utérus des souris sauvages grossit et son poids est augmenté de 3 à 4 fois, alors que celui des femelles REα KO ne répond pas (Lubahn et al., 1993). Le tissu utérin des souris REα KO est capable de survivre à une réaction déciduale en réponse à des traitements hormonaux et intraluminaux qui miment l’implantation fœtale ; cependant, contrairement aux utérus normaux des souris sauvages, cette réponse était œstrogéno‐indépendante pour les souris REα KO (Hewitt and Korach, 2000). Ceci montre bien que le REα est le principal RE présent dans l’utérus. De plus, le tamoxifène n’entraînait pas de réponse non plus dans l’utérus des femelles REα KO (Korach, 1994), montrant que l’hyperémie observée dans l’utérus en réponse aux œstrogènes nécessite la présence du REα. Le REα apparait donc nécessaire pour maintenir le bon fonctionnement de l’utérus (Korach, 1994; Lindberg et al., 2002b). 2.1.2. Le vagin
Le REα est présent dans le stroma et l’épithélium du vagin (Stumpf W, 1976). Les effets induits par l’œstradiol (stratification et cornification de l’épithélium) sont abolis chez les souris REα 87
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE KO (Korach et al., 1996). Les effets des œstrogènes sont donc principalement médiés par le REα dans le vagin. 2.1.3. Les ovaires
Les ovaires des femelles REα KO, durant la période néonatale et prépubère, ne présentent pas de différence notable avec ceux des femelles de type sauvage (Schomberg et al., 1999). Au début de leur maturité sexuelle, les femelles invalidées pour le gène du REα sont anovulatoires et ont des ovaires hyperémiques avec un corps jaune non détectable (Couse and Korach, 1999; Lubahn et al., 1993). Les ovaires des souris REα KO présentent de gros follicules qui s’arrêtent au stade follicule moyen et donnent un phénotype polykystique et hémorragique qui ne possédaient pas de corps jaunes et peu de cellules granulosa (Couse and Korach, 1999; Korach, 1994; Lubahn et al., 1993). Ceci montre que le REα n’est pas nécessaire pour le recrutement des follicules primordiaux ni pour les étapes initiales de la folliculogénèse (Couse and Korach, 1999), mais essentiel pour la maturation des follicules et le développement normal des ovaires. Figure 30 : Coupe de l’ovaire humain.
D’après le site web de Cornell University (http://www.biog11051106.org/demos/105/unit8/ovaryplacenta.html).
Ce schéma représente une coupe de l’ovaire et les différents états du développement de l’ovule.
D’autre part, il est établi que la plupart des tumeurs ovariennes chez la femme dérivent de la surface épithéliale (Clinton and Hua, 1997), tissu de l’ovaire connu pour exprimer fortement le REα. Les cellules de la granulosa, au contraire, induisent rarement de cancer. De manière 88
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE intéressante, environ 40% des femelles invalidées pour le gène du REα présentent des tumeurs de l’ovaire dérivant de cellules thécales et de la granulosa à l’âge de 20 mois (Couse and Korach, 1999). Ceci souligne donc l’intérêt d’étudier l’effet des récepteurs des œstrogènes dans le cancer de l’ovaire. 2.1.4. La glande mammaire
Le développement de la glande mammaire chez les souris REα KO est normal lors de la période néonatale et prépubère, mais affecté par la suite, i.e. celle‐ci ne se forme pas complètement et à l’âge adulte le sein demeure au stade prépubère. Les souris REα KO développent seulement un épithélium rudimentaire (Hewitt and Korach, 2000). Ceci montre que le REα est nécessaire pour la maturation de la glande mammaire. Cependant, d’autres études ont montré que les souris REα KO ne présentent pas de développement mammaire du tout (Korach et al., 1996). D’autre part, ces femelles REα KO ne développent pas de tumeur de la glande mammaire. Cependant, la descendance femelle de souris REα KO croisées avec un modèle de souris développant spontanément des tumeurs (MMTV), présente une hyperplasie et des tumeurs de la glande mammaire (Bocchinfuso and Korach, 1997). Les tumeurs apparaissent plus tardivement chez ces femelles REα KO croisées MMTV que chez les femelles MMTV, suggérant que le REα joue un rôle dans le développement de tumeurs mammaires (Bocchinfuso et al., 1999). 2.1.5. Les troubles de la sexualité et de la maternité chez les femelles
La déficience de la fonction du gène du RE peut mener à des changements dans le comportement sexuel et maternel des souris REα KO (Lubahn et al., 1993; Ogawa et al., 1996b). Elles ne s’engagent pas dans le comportement normal de reproduction (Lubahn et al., 1993). Le comportement maternel de ces femelles, qui a été mesuré par observation et récupération des portées, était réduit. Dans certains cas, les petits avaient été tués par les femelles REα KO, alors que ceci nʹa pas été observé chez les animaux de type sauvage. L’agressivité envers les autres femelles était augmentée. De plus, le comportement typique des femelles (lordose pré‐accouplement) était réduit pour au moins deux raisons : une réponse aux stimuli somatosensoriels de l’arrière‐train diminuée, de même que le fait que les femelles REα KO étaient immédiatement traitées comme intruses par les 89
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE mâles résidents qui les attaquaient. En résumé, l’absence d’expression du REα semble mener à des changements hormonaux et neuraux entraînant chez les femelles la perte de leur comportement maternel et sexuel typique, voire même ces femelles se comportaient et étaient traitées comme des mâles (Ogawa et al., 1996b). 2.1.6. Le développement de l’appareil reproducteur mâle et les troubles de la
sexualité
Le système reproducteur des souris mâles REα KO apparaît normal d’un point de vue anatomique. Toutefois, ces mâles présentent une atrophie testiculaire et sont stériles (Eddy et al., 1996; Korach, 1994). Ceci indique que les processus médiés par le REα sont essentiels pour la régulation de la reproduction chez le mâle. Les mâles REα KO et les sauvages présentent des différences dans la spermatogénèse. Après 10 semaines, des perturbations de la spermatogénèse ainsi que la dégénération des canaux séminifères apparaissent dans le pôle caudal des testicules et progressent dans le pôle crânial jusqu’à 6 mois. Cependant, les vésicules séminales, les glandes coagulatrices, la prostate, ainsi que l’épididyme n’apparaissent pas altérés morphologiquement chez ces mâles REα KO. Les spermatozoïdes des souris âgées de 8 à 16 semaines ont une mobilité réduite, sont présents en nombre moins important et ne sont pas capables de féconder d’ovule in vitro. De plus, les mâles REα KO placés en présence de femelles hormonalement prêtes pour l’accouplement produisaient significativement moins d’actes copulatoires que les mâles sauvages ou hétérozygotes (moins d’intromission, et pas d’éjaculation) (Eddy et al., 1996; Ogawa et al., 2000). Ceci suggère que l’action des œstrogènes est requise pour la fertilité des souris mâles et que la mutation du REα conduit à une fréquence d’accouplement réduite, à la diminution du nombre de spermatozoïdes, et à un fonctionnement défectueux du sperme (Eddy et al., 1996). Il est également possible de penser, grâce à ces observations, que l’aromatisation des œstrogènes joue un rôle important dans la régulation des gonadotrophines chez le mâle. D’autre part, le comportement sexuel apparaît affecté par l’inactivation du gène du REα. En effet, plusieurs observations du comportement des mâles REα KO ont montré l’importance du gène du REα dans le développement normal du comportement sexuel (Ogawa et al., 1996a). Le comportement copulatoire était affecté : les mâles KO présentaient les mêmes motivations sexuelles et s’accouplaient avec les femelles appâts, mais avec des fréquences d’intromission moindres (Ogawa et al., 1996a). 90
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE 2.1.7. Le métabolisme osseux
Peu d’études ont été menées sur l’impact des œstrogènes dans l’os. Néanmoins, l’analyse des fémurs montre que le diamètre et la longueur des fémurs étaient diminués chez les souris REα KO, et ceci de façon plus importante chez les femelles que chez les mâles (Korach, 1997). Ces appréciations ont été confirmées par les mesures de la densité osseuse et du contenu minéral. En effet, les deux sexes invalidés pour le REα présentent une diminution de la densité osseuse (Korach, 1994; Korach et al., 1996), permettant de supporter un rôle direct de l’action du REα dans l’os. Les études sur les souris KO indiquent que le REα joue un rôle dans le développement et la maturation osseuse chez les femelles et chez les mâles. 2.1.8. Le tissu adipeux
Le rôle du REα dans le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun ont été étudiés chez des souris mâles et femelles sauvages et REα KO (Heine et al., 2000). Le poids du tissu adipeux brun des mâles était similaire à tout âge chez les souris sauvages et les REα KO. Le tissu adipeux blanc et le nombre et la taille des adipocytes étaient augmentés chez les mâles REα KO, par rapport aux mâles sauvages. De même, les femelles REα KO présentaient des adipocytes plus grands et plus nombreux que les femelles sauvages. Les souris REα KO mâles et femelles présentaient une résistance à l’insuline ainsi qu’une tolérance au glucose diminuée. L’absorption d’énergie était équivalente chez les mâles REα KO et sauvages, laissant supposer que l’obésité n’était pas induite par une hyperphagie. Par contre, la dépense d’énergie des mâles REα KO était plus faible de 11% que pour les mâles sauvages, indiquant que l’altération de la dépense d’énergie pourrait jouer un rôle dans l’obésité observée chez les souris REα KO. L’absence du REα entraîne une hyperplasie ainsi qu’une hypertrophie adipocytaire, une résistance à l’insuline, et une intolérance au glucose pour les deux sexes. Ces résultats montrent l’évidence que le REα joue un rôle critique dans la formation du tissu adipeux blanc chez les mâles et les femelles. L’obésité des mâles REα KO implique un mécanisme de réduction de dépense d’énergie plutôt que d’augmentation d’absorption d’énergie (Heine et al., 2000). Le surpoids des souris REα KO (Heine et al., 2000), et plus particulièrement des mâles après maturation sexuelle (Ohlsson et al., 2000), souligne l’importance du rôle du REα et des œstrogènes dans l’adipogénèse chez la femelle et chez le mâle. Les résultats observés après invalidation du REα chez les souris ainsi que les mutations chez l’humain montrent que l’absence de ce récepteur n’est pas létale (Korach et al., 1996). La mutation 91
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE du REα est présente dans la population humaine. D’autres études sur la caractérisation des souris KO et sur les patients seraient requises afin de mieux comprendre les conséquences des mutations du REα. Enfin, il est possible d’affirmer que le modèle des souris invalidées pour le gène codant le REα permet de montrer que celui‐ci joue un rôle majeur dans l’activité œstrogénique présente dans les tissus cibles. 2.2. Inactivation du REβ chez les souris : REβ KO
Les souris invalidées pour le gène codant pour le REβ se développent normalement (Krege et al., 1998). A l’âge adulte, leur apparence morphologique et histologique apparaît être la même que celle de leurs congénères de type sauvage. 2.2.1. La reproduction femelle et mâle
Les études de reproduction menées sur les souris femelles REβ KO et sur les souris REα KO montrent que les phénotypes des souris REβ KO diffèrent de ceux des REα KO (Krege et al., 1998). Effectivement, les souris REβ KO sont fertiles et ne présentent pas de trouble du comportement d’accouplement (Ogawa et al., 1999), mais donnent moins de portées que les souris sauvages, avec un nombre de petits réduit (Dupont et al., 2000; Krege et al., 1998). Des études sur l’ovulation de ces souris montrent que cette baisse de fertilité résulte de la réduction de l’efficacité ovarienne, sans doute le reflet du faible nombre de corps jaunes et l’augmentation du nombre de follicules (Dupont et al., 2000; Krege et al., 1998; Mueller et al., 2004a). Cependant, ces femelles présentent un développement mammaire et une lactation normaux. Enfin, les œstrogènes causent une augmentation comparable du poids de l’utérus pour les souris de type sauvage et pour les souris REβ KO, alors que pour les souris REα KO le poids de l’utérus après traitement est augmenté, suggérant que le REβ joue un rôle mineur dans la physiologie de l’utérus (Hewitt et al., 2003), et que le REα est nécessaire et suffisant pour le maintien de la physiologie de l’utérus (Harris, 2007). De même, des études ont montré que le REβ n’est pas nécessaire pour le développement normal ou le fonctionnement de la glande mammaire (Hewitt et al., 2005; Tekmal et al., 2005), et d’autre part que le REβ joue un rôle dans la folliculogénèse ovarienne (Hegele‐Hartung et al., 2004). 92
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE Les jeunes mâles REβ KO sexuellement matures ne montrent pas d’anormalités évidentes et se reproduisent normalement (Krege et al., 1998; Ogawa et al., 1999; Ogawa et al., 2000). Les mâles plus âgés présentent des signes d’hyperplasie de la prostate et de la vessie. D’autres études montrent que l’inactivation du REβ chez ces mâles, contrairement aux males REα KO, entraînait un comportement plus agressif que les mâles de type sauvage (Nomura et al., 2002). Les différences de génotype agressif étaient plus prononcées lors de la puberté et chez le jeune adulte, mais aucune différence apparente n’était observée pour le groupe REβ KO adulte en comparaison avec le groupe sauvage. Les taux de testostérone du sérum des souris REβ KO étaient significativement plus élevés que ceux des souris sauvages seulement pour le groupe en période de puberté, mais pas pour les groupes jeunes adultes ni adultes. Ceci a permis aux auteurs d’émettre l’hypothèse que les œstrogènes pourraient faciliter l’agressivité via le REα, alors qu’ils pourraient inhiber cette agressivité via le REβ. Et de plus, que les actions des stéroïdes médiées par le REβ pourraient être plus précisément impliquées dans la régulation inhibitrice du comportement d’agressivité des souris pubères et jeunes adultes (Nomura et al., 2002). Les résultats indiquent que le REβ est indispensable pour l’efficacité ovulatoire mais pas essentiel pour la différentiation sexuelle mâle et femelle, la fertilité, le développement mammaire, ou encore la lactation (Hewitt et al., 2005; Krege et al., 1998; Tekmal et al., 2005). D’autres expérimentations permettraient de mieux déterminer le rôle du REβ dans le maintien osseux ainsi que dans l’homéostasie cardio‐vasculaire. 2.2.2. Retentissement cardiovasculaire
Les vaisseaux sanguins expriment les récepteurs des œstrogènes, mais leur rôle dans la physiologie cardiovasculaire n’est pas bien compris. Une étude de la vascularisation des souris REβ KO (Zhu et al., 2002) a montré que les cellules des muscles lisses et les vaisseaux sanguins de ces animaux présentent de nombreuses anomalies. Chez les souris de type sauvage, les œstrogènes atténuent la vasoconstriction (le REβ est le médiateur de ce phénomène car en réponse des œstrogènes, il induit l’augmentation de l’expression de l’oxyde nitrique synthase). Au contraire, les œstrogènes augmentent la vasoconstriction des souris dont le gène du REβ est inactif. De plus, ces souris présentent de multiples altérations dans la fonction des canaux ioniques des cellules musculaires lisses. D’autre part, elles développent au cours du vieillissement de l’hypertension systolique et 93
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE diastolique. Ces résultats appuient l’importance du rôle du REβ dans la régulation de la fonction cardiovasculaire ainsi que la tension artérielle (Zhu et al., 2002). 2.2.3. L’os
Peu d’études ont été menées sur l’engagement du REβ dans le développement, la maturation, et le maintien de la densité osseuse. Cependant, ces études ont montré que le REβ est probablement impliqué dans la régulation de la masse osseuse lors de la période adulte chez les souris femelles, suggérant que celui‐ci agirait en tant qu’inhibiteur, sans doute en contrebalançant l’action stimulatrice du REα dans le développement osseux (Lindberg et al., 2001; Windahl et al., 2002). Cependant, les études de l’activité des agonistes sélectifs du REβ permettent d’affirmer que cet isotype ne joue pas un rôle majeur dans la maintenance œstrogénique de la densité osseuse chez l’adulte (Harris et al., 2002; Hillisch et al., 2004; Malamas et al., 2004b; Smith et al., 1994). 2.3. Inactivation des deux RE chez les souris : double KO
De même que pour les souris REα KO et REβ KO, les double KO survivent jusqu’à l’âge adulte et ne présentent pas de phénotype externe anormal, mais cependant les deux sexes sont infertiles (Couse et al., 1999). Les jeunes femelles double KO montrent une différentiation correcte de l’utérus et du vagin. Cependant, vers 2,5 à 7 mois, une hypoplasie de l’utérus est observée. Parce que ce phénomène est également observé pour les femelles invalidées pour le gène du REα, ce phénotype est caractéristique de la perte du REα dans l’utérus. Les poids mouillé et sec de l’utérus en réponse aux œstrogènes étaient réduits chez les souris REα KO et double KO (Korach, 1994; Lindberg et al., 2002b), mais pas chez les souris REβ KO (Figure 31), confirmant l’importance du REα dans la réponse utérine (Lindberg et al., 2002b). 94
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE A
Figure 31 : Effet de l’invalidation des RE sur l’utérus de modèles murins.
D’après Lindberg et al., 2002b.
Augmentation du poids utérin (A) et clichés macroscopiques des utérus (B) de souris ovariectomisées
après traitement de 3 semaines à l’œstradiol (+E) ou au contrôle (-E). Echelle : barres = 5mm.
Dans l’ovaire, il apparaît clair que les deux isotypes, le REα et le REβ, coopèrent afin de maintenir l’état de différentiation des cellules granulosa (Couse et al., 1999; Couse and Korach, 1999; Drummond et al., 2002; Harris et al., 2003; Krege et al., 1998; Mueller et al., 2004a; Schomberg et al., 1999). Les femelles double KO présentent des phénotypes ovariens distincts des phénotypes sauvage ainsi que REα KO et REβ KO (Couse et al., 1999). Ceci indique que les deux récepteurs sont requis pour la maintenance des cellules germinales et somatiques dans l’ovaire. Le phénotype le plus intéressant apparaît dans l’ovaire de l’adulte double KO, dans lequel ont été observées des structures ressemblant aux tubes séminifères des testicules des mâles, conduisant à une réduction de l’efficacité ovarienne (Couse et al., 1999). Ces structures n’étaient pas présentes chez les femelles pré‐pubères. C’est le premier exemple d’inversion de sexe de gonades d’adulte, car les cellules ovariennes femelles sont capables de se redifférencier en des cellules de sertoli mâles. Une équipe ayant étudié les caractéristiques de l’os chez les souris femelles KO a montré que le phénotype REα KO correspondait à une diminution de la longueur du fémur, au contraire à une augmentation chez les souris REβ KO, et une longueur intermédiaire proche de celle des fémurs des femelles sauvages pour les double KO (Lindberg et al., 2001; Vidal et al., 1999). Ces données indiquent que le REα promeut, alors que le REβ réprime la croissance osseuse chez la femelle. Et de plus, cette équipe a montré que les œstrogènes augmentaient de manière identique les dimensions de l’os compact chez les souris ovariectomisées de type sauvage et double KO. Ces observations suggèrent que ce phénomène est indépendant du REα et du REβ (Lindberg et al., 2002b). En effet, l’utilisation de puces à ADN a permis aux auteurs de mettre en évidence que les gènes responsables de cette observation sont régulés chez les souris 95
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE sauvages et chez les souris double KO, montrant que cette régulation sous l’effet des œstrogènes est RE‐indépendante (Lindberg et al., 2002b). Les mâles invalidés pour les gènes des deux RE sont infertiles et présentent une réduction de 80% du nombre de spermatozoïdes et 5% de réduction de mobilité du sperme (Couse et al., 1999). De plus, des études ont été menées sur le comportement copulatoire des mâles invalidés pour les gènes des deux RE. Les souris double KO ne présentaient aucun composant du comportement sexuel, et ce incluant même le mouvement de saillie (Ogawa et al., 2000). Ceci montrant qu’un seul des deux RE est suffisant pour garder l’acte de saillie chez le mâle, indiquant une redondance de la fonction. Par ailleurs, le comportement moins agressif des mâles double KO était comparable à celui des mâles REα KO (Ogawa et al., 2000). Ils présentaient des niveaux d’agression par bond et par morsure réduits, mais montraient rarement d’attaques offensives. Le comportement d’agressivité semble donc dépendre spécifiquement du REα. D’autre part, une étude sur l’obésité des souris double KO a été menée et a montré que de même que les mâles REα KO, les males invalidés pour les deux gènes présentent un surpoids après maturation sexuelle, accompagné d’une augmentation du taux de cholestérol (Ohlsson et al., 2000), alors que les mâles REβ KO ne présentaient ni de surpoids ni d’augmentation du cholestérol après maturation sexuelle. Ces observations suggèrent que le REα est impliqué dans le maintien de la masse corporelle mais pas le REβ. Les souris femelles double KO ont conduit aux mêmes observations (Lindberg et al., 2001) (comme présenté plus haut). De même, des travaux réalisés sur des souris mâles sauvages, REα KO, REβ KO et double KO ont révélé que Le REα est le médiateur des effets des œstrogènes dans le squelette chez la souris mâle au cours de la croissance et de la maturation (Vidal et al., 2000). Effectivement, l’invalidation du REα (chez les mâles REα KO et double KO) était associée avec une réduction significative de la croissance osseuse, ainsi qu’une ostéopénie corticale prononcée, alors que le phénotype osseux des souris REβ KO était proche de celui des males de type sauvage. Le REβ n’est donc pas engagé dans la médiation des effets des œstrogènes sur l’os ni sur le poids corporel. 96
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE Tableau 3 : Phénotypes des souris RE KO.
D’après Pearce et Jordan, 2004.
REα KO
Tractus
reproducteur
Glandes
mammaires
REβ KO
Double KO
Femelle
Male
Femelle
Male
Femelle
Male
Infertile
Utérus hypoplastique ;
follicules
kystiques et
hémorragiques ; pas
de corps
jaune ; peu
de cellules
granulosa
dans l’ovaire
Fertilité
réduite
Peu de
spermatozoïdes ;
faible
mobilité du
sperme ;
faible poids
testiculaire
Fertilité
réduite
Utérus
normal ;
nombreux
follicules ;
peu de corps
jaunes dans
l’ovaire
Fertile
Hyperplasie
épithéliale
dans la
prostate et la
paroi de la
vessie
Infertile
Utérus hypoplastique ;
développement de
structures
similaires aux
tubes
séminifères
males
(inversement
sexuel) dans
l’ovaire
Infertile
Faible nombre
de spermatozoïdes ;
mobilité de
sperme réduite
Développement jusqu’à
une structure
prépubère ;
pas de
développement
à la puberté
Normale
Compor-
Absence
Saillies
tement
lordose ; pas
normales ;
Normal
Normal
Absence de
saillie,
sexuel
de réceptivité
intromissions
d’intromissions
réduites ;
et d’éjaculation
éjaculations
rares
Os
Densité
Densité
osseuse,
osseuse,
diamètre et
diamètre et
longueur
longueur
réduits
réduits
Normal
Normal
Pour l’instant, le phénotype osseux de l’homme REα KO diffère de celui des souris mâles équivalentes invalidées pour le REα. A ce jour, un seul homme à REα non fonctionnel a été examiné. Il est possible de penser que des analyses complémentaires sur d’autres mutants des deux genres et pour les deux isotypes pourraient apporter des indications sur la pertinence de l’utilisation de souris mutantes comme outil pour la compréhension des mécanismes d’action des œstrogènes chez l’humain (Smith et al., 1994; Windahl et al., 2002). Une autre question intrigante est pourquoi mâles et femelles répondent aux œstrogènes de manière différente. Il est possible d’émettre l’hypothèse que le REβ n’est pas essentiel pour les mâles alors qu’il l’est pour les femelles, ceci parce que les mâles REβ KO présentent une densité osseuse et des niveaux 97
Etude bibliographique. F. Les fonctions physiologiques des RE d’hormones normaux. Effectivement il semble que chez la femelle, les deux RE jouent des rôles opposés sur le maintien de la densité osseuse (Lindberg et al., 2001). Il serait nécessaire de mener d’autres études sur les modèles murins afin de déterminer pourquoi le REβ module les effets du REα dans le squelette chez la femelle mais pas chez le mâle (Ohlsson and Vandenput, 2009), ainsi que sur l’homme, afin de mieux déterminer le rôle des deux isotypes du récepteur des œstrogènes dans tous les phénomènes précédemment abordés. Dans l’ensemble, ces études sur les souris transgéniques apportent un aperçu du rôle des récepteurs des œstrogènes dans le développement et la fonction des structures reproductrices. Dans le cas des mâles, les RE ne sont pas nécessaires pour le développement des organes sexuels. Toutefois, le REα est essentiel pour la fertilité masculine, parce que la perte du REα entraine une diminution du nombre de spermatozoïdes et de mobilité du sperme. Comme il aurait pu être envisagé, la perte du RE présente un impact bien plus important chez la femelle. De manière surprenante, le développement et la différentiation précoces des organes reproducteurs ont lieu normalement en l’absence des deux récepteurs. Plus tard, les deux RE se révèlent nécessaires pour un fonctionnement correct des ovaires, et le REα est critique pour la physiologie de l’utérus. Le REα est requis pour le développement de la glande mammaire de même que pour la maintenance de la densité osseuse alors que le REβ ne l’est pas. De plus, les RE α et β jouent un rôle redondant dans la cardio‐protection médiée par l’œstradiol. 98
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE G. LES FONCTIONS PHYSIOPATHOLOGIQUES ASSOCIEES AUX
RECEPTEURS DES ŒSTROGENES
Les œstrogènes influencent de nombreux processus physiologiques chez les mammifères tels que la reproduction, le système cardiovasculaire, l’intégrité osseuse, le système nerveux. Les œstrogènes sont également impliqués dans le développement et/ou la progression de nombreuses maladies, qui incluent certains types de cancer (sein, ovaire, colorectal, prostate, endomètre), mais également l’ostéoporose, les maladies neuro‐dégénératives, les pathologies cardiovasculaires, et l’obésité. 1. Les cancers du sein et de l’ovaire
1.1. Cancers hormono-dépendants : définition
Le caractère hormono‐dépendant d’un cancer est déterminé par sa capacité de croître en réponse aux hormones. Les cancers hormono‐dépendants sont situés dans les tissus cibles des hormones sexuelles naturelles ; ce sont les cancers du sein, de l’endomètre et de l’ovaire chez la femme, et le cancer de la prostate chez l’homme, car les hormones sexuelles pourraient augmenter leur incidence ou favoriser leur développement. Cependant, les cancers touchant ces tissus ne sont pas toujours caractérisés de cancers hormono‐dépendants. Seuls ceux qui présentent les récepteurs des hormones sexuelles le sont. Les cancers hormono‐dépendants font de nos jours l’objet de nombreuses études, car le cancer de la prostate chez l’homme et celui du sein chez la femme sont les cancers qui présentent la plus forte incidence (Jemal et al., 2008 ; INVS, 2009).
1.2. Cancer du sein
1.2.1. Evolution et incidence
Le cancer du sein a un processus dʹévolution lent puisque la formation dʹune tumeur au site primaire dure plusieurs années. Lʹévolution de ce cancer est dominée par le risque dʹapparition des métastases, qui représentent la principale cause de mortalité dans cette pathologie. Le cancer 99
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE du sein constitue aujourd’hui, aussi bien dans les pays industrialisés que dans les pays en voie de développement, un problème de santé publique. Chez la femme, le cancer du sein est de très loin le plus fréquent, et son incidence augmente de façon régulière depuis les années 80 (+2,1% par an depuis 2000) (Belot et al., 2008). Cependant, malgré l’augmentation de son incidence, la mortalité par cancer du sein diminue depuis 2000 de 1,3% par an grâce aux progrès réalisés dans le dépistage et dans les traitements de ce cancer (Belot et al., 2008 ; Hery et al., 2008). Dans le monde, en 2004, le nombre de décès par cancer du sein dans le monde est évalué à près de 519 000 décès (site web World Health Organization, 2009). Figure 32 : Evolution de la mortalité par cancers chez la femme et évolution de
l’incidence et de la mortalité des cancers du sein depuis 1950 à 2005.
À gauche : évolution de la mortalité pour principaux cancers touchant les femmes en Europe de 1950 à
2005. Le cancer du sein représente le principal cas de décès pour cette population.
À droite : évolution de l’incidence et de la mortalité pour les cancers du sein dans le monde de 1950 à
2005. L’incidence augmente et la mortalité diminue.
Données de l’Institut de Veille Sanitaire (INVS, 2009).
En France, en moyenne, une femme sur huit sera confrontée au cours de sa vie à un cancer du sein (Remontet et al., 2003). Aujourdʹhui encore, en lʹabsence de moyens de prévention adaptés, un dépistage précoce et un traitement adapté représentent des moyens essentiels pour lutter contre ce 100
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE cancer. L’amélioration des stratégies thérapeutiques ainsi que l’expansion du dépistage permettent de traiter les tumeurs plus efficacement et à un stade plus précoce, ce qui explique la diminution de mortalité par cancer du sein (Belot et al., 2008 ; Hery et al., 2008). Brièvement, le cancer du sein, en France, aujourdʹhui c’est : -
le 2ème cancer sur l’ensemble de la population et le 1er chez la femme. 52 000 nouveaux cas estimés en 2009. 300 000 personnes vivent aujourd’hui avec un cancer du sein. L’âge moyen d’incidence est 61 ans. Moins de 10% des cancers du sein surviennent avant 40 ans, 25% avant 50 ans, près de la moitié avant 65 ans. Seulement 5% des tumeurs sont d’emblée métastatiques. 12 000 décès estimés en 2009, soit 19% des décès féminins par cancer, et 40% des décès prématurés avant 65 ans. Malgré des chiffres alarmants, seulement 49% de la population féminine participe au dépistage. Données issues du site web de l’Institut de Veille Sanitaire (http://www.invs.sante.fr) (INVS, 2009).
NB : les données sur l’incidence et la mortalité des cancers ne sont disponibles que jusqu’en 2005.
Toutes les estimations effectuées pour la période 2005-2009 sont donc des projections, à partir des
données observées jusqu’en 2005.
1.2.2. Facteurs de risque
Un facteur de risque est un élément de l’historique du patient qui peut favoriser l’apparition de la pathologie. Cependant, en aucun cas le ou les facteurs de risque ne constituent les seules explications au développement d’un cancer. Aujourdʹhui, nous ne connaissons toujours pas les causes exactes de lʹapparition du cancer du sein, même si différents facteurs de risques sont fortement liés au développement de la maladie. Il existe des facteurs de risque immuables, dont les principaux sont: Le sexe : Le cancer du sein est essentiellement un cancer féminin, moins dʹun cas sur 100 sera un homme (Herrinton et al., 1994; Lester, 2007; Pike et al., 1983; Ravandi‐Kashani and Hayes, 1998). Lʹâge : Le risque dʹavoir un cancer du sein augmente avec lʹâge (Lester, 2007; Pike et al., 1983). Il est rare avant l’âge de 30 ans et son incidence augmente ensuite jusqu’à l’âge de 75 ans (95% des cancers du sein surviennent après 40 ans). Lʹorigine géographique : Des différences significatives dans lʹincidence des cancers du sein ont été observés entre les pays à faible risque (lʹAfrique, lʹAmérique du Sud, lʹAsie et les pays de 101
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE lʹEst) et les pays à fort risque (lʹEurope du Nord et lʹAmérique du Nord). Cependant, ces résultats sont fortement discutés par de récentes études. En effet, à niveau socio‐économique égal, seules les personnes dʹorigine africaine présentent significativement moins de cancers du sein que les peuples hispaniques, japonais, européens ou américains (McTiernan, 2003). L’environnement : il existe également des facteurs environnementaux liés au style de vie. Parmi eux, la pollution aux pesticides (surtout organochlorés), lʹexposition à des rayons ionisants, la sédentarité avec la réduction de lʹactivité physique, la prise de la pilule, de tabac et/ou la consommation excessive dʹalcool, ainsi que certaines habitudes alimentaires (Dumitrescu and Cotarla, 2005; Lester, 2007). Les prédispositions génétiques : Dans 5 à 10% des cas, les patients présentent des prédispositions génétiques, soit 2 000 à 4 000 personnes chaque année (Sakorafas and Tsiotou, 2000). Environ 90% de ces cancers impliquent des mutations des gènes BRCA 1 et/ou BRCA 2 (breast cancer 1 et/ou 2) (Brose et al., 2002; Martin et al., 2001; Miki et al., 1994; Sakorafas and Tsiotou, 2000). Des mutations de ces gènes représentent un risque accru de développer un cancer du sein, 60 à 85% des personnes porteuses de cette modification auront un cancer du sein avant 70 ans (Dumitrescu and Cotarla, 2005). Ces gènes de prédisposition ont été localisés respectivement sur les chromosomes 17q21 et 13q (Hall et al., 1990; Wooster et al., 1995; Wooster et al., 1994). Ils codent des protéines impliquées notamment dans la recombinaison homologue ou la réparation de l’ADN (Powell and Kachnic, 2003; Zhang et al., 2006). Ces gènes sont de grande taille et des anomalies diverses et dispersées ont été observées. Près de 900 mutations sont décrites dans le monde. 200 mutations ont été retrouvées en France pour 400 familles touchées de prédisposition héritée. 1 à 2% des cancers du sein sont associés à une mutation sur BRCA1 ou BRCA2, et 35 à 65% des femmes qui présentent une mutation développent un cancer du sein (McClain et al., 2005). Les femmes qui héritent d’anomalies sur le gène BRCA1 ont un risque extrêmement élevé de développer un cancer du sein avant l’âge de 50 ans (Langston et al., 1996) et un cancer de l’ovaire. Par contre, une anomalie sur le gène BRCA2 s’associe uniquement à une augmentation du risque de cancer du sein. Les antécédents familiaux : La survenue dʹun cancer du sein ou de lʹovaire chez des parents de moins de 50 ans ou chez plusieurs parents au premier ou second degré représente un risque accru de développer la maladie (Dumitrescu and Cotarla, 2005; Gail et al., 1989; Lester, 2007). Les antécédents personnels : Une femme ayant déjà développé un cancer du sein a de grandes chances de développer à nouveau un cancer soit dans lʹautre sein (on dit alors que c’est un 102
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE cancer contralatéral) soit dans une autre partie du même sein (Dumitrescu and Cotarla, 2005; Lester, 2007; Pike et al., 1983). Lʹobésité et l’inactivité physique : l’Agence Internationale de Recherche sur le Cancer (IARC) estime que 25% des cancers du sein dans le monde sont dus à un surpoids ou à une obésité et à un style de vie sédentaire (McTiernan, 2003). Lʹaugmentation du tissu graisseux après la ménopause induit une augmentation du taux dʹœstrogènes sanguins via lʹactivation des aromatases, enzymes qui transforment les androgènes surrénaliens en œstrogènes, augmentant ainsi le risque de développement de cancer du sein. Au contraire, un surpoids ou une obésité sont associés à un risque plus faible de cancer pré‐ménopausique (Jensen and Jordan, 2003). Par ailleurs, le risque de développer un cancer du sein est nettement diminué (de 10 à 70%) chez les femmes pratiquant une activité physique modérée à élevée durant 3 à 4 heures par semaine. Cette diminution de risque est observée pour les cancers post‐ et pré‐ménopausiques (McTiernan, 2003). Mais ces données restent controversées puisqu’une étude réalisée sur près de 100 000 femmes en Suède et en Norvège a conclu récemment à une absence d’effet protecteur de l’activité physique sur le risque de cancer du sein primaire chez la femme en pré‐ménopause (Margolis et al., 2005). Les facteurs liés à la reproduction : Le risque de cancer du sein est fortement déterminé par la fenêtre dʹexposition du tissu mammaire aux œstrogènes (Dumitrescu and Cotarla, 2005; Lester, 2007). En effet, les hormones stéroïdes, et en particulier les œstrogènes conditionnent à la fois le développement/fonctionnement et la cancérogénèse de la glande mammaire. Lʹapparition du cycle menstruel à un jeune âge (ménarche) (Kelsey et al., 1993) et son interruption (ménopause) tardive (1997) constituent donc des facteurs de risque. La grossesse est associée à la différenciation des cellules mammaires, ce qui explique lʹaugmentation du risque pour des femmes nullipares (Ewertz et al., 1990; Layde et al., 1989) ou ayant leur première grossesse à un âge tardif (Albrektsen et al., 2005; Dumitrescu and Cotarla, 2005; Henderson, 1993; Kelsey et al., 1993; Lester, 2007; Pike et al., 1983; Purdie et al., 2001). En conclusion, une augmentation du nombre de cycles menstruels augmente le risque de cancer du sein du fait d’une plus longue exposition aux œstrogènes. Contraceptifs oraux : le risque de cancer du sein est légèrement augmenté pendant la prise de contraceptifs oraux, et ce jusqu’à 10 ans après l’arrêt. Ce risque augmente avec la durée de la prise (1996a; 1996b; Dumeaux et al., 2003). Traitement Hormonal de Substitution (THS) : les traitements hormonaux de la ménopause font également partie des facteurs de risque de développement de cancer du sein. En effet, des études ont montré que l’incidence du cancer du sein chez les femmes ménopausées est en diminution, et 103
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE ce depuis les années 2001 au cours desquelles a débuté la diminution de l’utilisation des THS (Allemand et al., 2008; Glass et al., 2007; Seradour et al., 2009; Verkooijen et al., 2008). Ces traitements étaient couramment prescrits dans le but de soulager les bouffées de chaleur et d’avoir un effet protecteur sur la masse osseuse et éventuellement sur le système cardiovasculaire. Cependant, des études ont mis en évidence que la prise de ces THS entraînait une élévation notable du risque de cancer du sein et plus généralement du fait que les risques encourus excédaient les bénéfices attendus (Azoulay, 2004; Beral et al., 2003; Lahmann et al., 2009; Rossouw et al., 2002). 1.2.3. REα et cancer du sein
Les cancers du sein sont cliniquement classés en deux catégories, en fonction du niveau d’expression du RE dans une biopsie de tumeur : les cancers du sein dits RE+ (RE positifs, hormono‐dépendants) et les cancers du sein RE‐ (RE négatifs). La majorité des cancers du sein sont hormono‐dépendants (60 à 70%), et 75% touchent les femmes post‐ménopausées (la proportion de cancers du sein hormono‐dépendants augmente avec l’âge). La présence du RE est actuellement corrélée avec un meilleur pronostic de survie. Elle peut également permettre de prédire la réponse à une thérapie hormonale comme celle basée sur l’utilisation d’anti‐
œstrogènes tels que le tamoxifène. Les œstrogènes sont impliqués dans le développement du cancer du sein hormono‐dépendant. Le RE apparaît alors être une cible importante pour développer des thérapies pour le traitement et la prévention de la maladie (Jensen and Jordan, 2003). L’interaction des œstrogènes avec le RE peut entraîner une prolifération des cellules cibles, augmentant le nombre de cellules dans le tissu mammaire (Deroo and Korach, 2006). L’augmentation de la division cellulaire et de la synthèse d’ADN élève le risque des erreurs de réplication, qui peuvent avoir comme conséquence l’acquisition de mutations nuisibles qui perturbent les processus cellulaires normaux tels que l’apoptose, la prolifération cellulaire ou la réparation de l’ADN. Une autre hypothèse serait que le métabolisme des œstrogènes conduirait à la production de sous‐produits génotoxiques qui pourraient directement endommager l’ADN, ayant encore pour résultat des mutations. Plusieurs mutations du gène codant le REα ont été associées soit à une augmentation soit à une diminution du risque de cancer du sein (de Caceres et al., 2006; Yaich et al., 1992; Zuppan et al., 1991). 104
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE Les œstrogènes, ainsi que le RE apparaissent largement impliqués dans la cancérogénèse mammaire. La logique de la thérapie hormonale est donc de bloquer la signalisation œstrogénique. Ce but peut être atteint en bloquant la production d’œstrogènes par ovariectomie, ou bien en inhibant la conversion de précurseurs stéroïdiens en œstrogènes par utilisation d’inhibiteurs d’aromatase (AI). Le RE peut aussi être ciblé directement en utilisant les SERM comme le tamoxifène et le raloxifène en tant qu’inhibiteurs compétitifs des œstrogènes, ou par dégradation du RE par des anti‐œstrogènes purs tels que l’ICI 182,780 (fulvestrant) (comme précédemment décrit dans la partie consacrée aux ligands) (Howell et al., 2000). Les manipulations endocrines résident parmi les thérapies les moins toxiques et les plus efficaces pour le traitement des cancers hormono‐dépendants. D’un point de vue clinique, des facteurs tels que les RE, PR, HER2, ainsi que le tissu nodal prédisent des réponses à l’hormono thérapie (Osborne et al., 2005b, Nguyen et al., 2008). Seuls les récepteurs hormonaux et HER2 sont aujourd’hui validés en clinique comme biomarqueurs prédictifs. Lorsqu’il est exprimé dans la tumeur (RE+), le RE est le reflet d’une bonne différenciation tumorale et constitue un facteur prédictif de la réponse à l’hormono‐thérapie. Les récepteurs de la progestérone, qui existent sous deux isoformes (PRA et PRB), constituent également un facteur pronostique et sont sous le contrôle des œstrogènes, reflétant ainsi la bonne fonctionnalité des RE. Les patients RE+ présentent un taux de réponse objective de 53% à la thérapie hormonale, et parmi les RE+, 69% pour les RE+PR+ et 32% RE+PR‐ (Horwitz, 1988). Comme attendu, seulement 13% des patients RE‐ répondent à l’hormonothérapie. La présence du gène HER2/neu (Human Epidermal growth factor Receptor) est également utilisé comme marqueur prédictif pour le choix de la thérapie envisagée pour les cancers du sein (Skliris et al., 2008). L’amplification de ce gène entraîne l’expression de la protéine erbB2, qui joue un rôle dans la carcinogénèse des tumeurs dites HER2+ (Slamon et al., 1987). Les quatre catégories thérapeutiques actuelles sont : RE+/HER2‐, RE+/HER2+, RE‐/HER2+, RE‐/HER2‐. Environ 30% des cancers du sein surexpriment HER2, et ceci est associé avec un mauvais pronostic, mais des anticorps monoclonaux dirigés contre HER2 (trastuzumab) sont utilisés en combinaison avec les autres traitements pour permettre une meilleure survie aux patientes (Arteaga et al., 2008). Il est cependant important de noter que les tumeurs HER2+ sont associées, par une étude clinique chez des patientes pré‐
ménopausées, au développement de la résistance au tamoxifène (Ryden et al., 2007). Il apparaît alors important de tenir compte du statut des RE et de HER2 des tumeurs puisque ce sont des biomarqueurs prédictifs de la réponse à l’hormono‐thérapie. 105
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE La mesure des statuts des récepteurs tumoraux par liaison au ligand a été remplacée par des méthodes immunohistochimiques. La positivité nodale est un autre indice pour la réponse à la thérapie endocrine. Les tumeurs contenant des ganglions positifs corrèlent avec une survie plus faible (DFS pour Desease Free Survival) (Gundlah et al., 2005). Si une population tumorale présente des ganglions, positifs ou négatifs, la présence du RE correspond à un meilleur pronostic de survie (DFS plus fort). Les stratégies de traitement actuelles ont montré que 5 ans de traitement adjuvant au tamoxifène est bénéfique sur les femmes pré‐ et post‐ménopausées ayant des tumeurs RE‐positives (1998). De plus, le tamoxifène peut également être utilisé pour la prévention du cancer du sein (Fisher et al., 1998). Les SERM qui sont utilisés en thérapie hormonale agissent comme les œstrogènes dans certains tissus cibles, mais comme anti‐œstrogènes dans d’autres tissus cibles (Jordan, 2001b). Le SERM idéal agirait comme un agoniste dans les tissus osseux, le foie, le système cardio‐vasculaire et le cerveau, et comme un antagoniste dans le sein et l’utérus. L’activité du tamoxifène dépend du taux circulant d’œstradiol (E2), qui est élevé chez la femme pré‐ménopausée mais faible chez la femme post‐
ménopausée. Le tamoxifène est un bon anti‐œstrogène dans le sein, et abaisse les taux de cholestérol lipoportéiques de faible densité chez la femme post‐ménopausée. D’un point de vue prévention de l’ostéoporose, un traitement au tamoxifène serait meilleur pour les femmes post‐ménopausées puisqu’il augmente la densité osseuse de celles‐ci, alors qu’il la diminue chez les femmes pré‐
ménopausées (Powles et al., 1996). Une activité œstrogénique du tamoxifène est observée dans l’utérus, résultant en une augmentation de l’incidence du cancer de l’endomètre chez les femmes post‐ménopausées (Fisher et al., 1998). Les bases moléculaires de la spécificité tissulaire ne sont pas aujourd’hui bien connues, mais une explication possible implique l’interaction du complexe RE‐
tamoxifène avec les co‐régulateurs. Dans certaines lignées cellulaires de cancers du sein où ce ligand est antagoniste, le tamoxifène recrute les corépresseurs, alors que dans les cellules endométriales, où il agit en tant qu’agoniste, le tamoxifène recrute les co‐activateurs (Shang and Brown, 2002). Ces résultats suggèrent que les différences dans le recrutement des co‐régulateurs à un promoteur peuvent déterminer la fonction du RE dans les différents tissus. Les changements des niveaux des co‐régulateurs affectent l’expression des gènes cibles et peuvent modifier le profil d’activation des gènes en un phénotype de prolifération. Cette mosaïque moléculaire apparait corréler avec les données cliniques. Des études sur l’analyse de SRC‐1 et le tamoxifène ont montré que des taux élevés de SRC‐1 peuvent être en accord avec une réponse 106
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE favorable au traitement au tamoxifène chez les femmes ayant un cancer du sein récurrent (Berns et al., 1998). L’amplification des gènes et la surexpression de gènes amplifiés dans le cancer du sein (comme AIB1/SRC‐3) ont été documentés dans des lignées de cancers du sein et des ovaires et dans des biopsies de cancer du sein (Anzick et al., 1997; List et al., 2001). Le traitement au tamoxifène entraîne de faibles résultats sur les patients présentant des tumeurs du sein RE+ exprimant de hauts niveaux de SRC‐3 et HER2 (Osborne et al., 2003). Au contraire, des taux élevés de SRC‐3 sont associés avec un meilleur pronostic chez les patients qui ne reçoivent pas de tamoxifène adjuvant. L’hypothèse des auteurs est que l’augmentation de la signalisation de HER2 résulte dans l’activation de SRC‐3 et du RE via la phosphorylation, ce qui entraîne une résistance au tamoxifène. Par conséquent, il parait essentiel d’établir le rôle joué par les REα et REβ dans les conséquences de la thérapie hormonale. Cette question pourrait être abordée et éclaircie grâce à l’utilisation des banques de tissus des tests ATAC qui comparent le tamoxifène à l’anastrozole (Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination) (Baum et al., 2002). Les AI, ou Aromatase Inhibitors font également partie des thérapies hormonales utilisées pour traiter le cancer du sein (Miller et al., 2007; Osborne, 1999 ). Les AI utilisés comme unique traitement ne sont pas plus efficaces que les autres thérapies. Cependant, l’utilisation d’AI comme thérapie initiale ou bien séquentiellement après le tamoxifène semble plus bénéfique que l’utilisation du tamoxifène seul. Ce sont les limites du tamoxifène qui ont poussé à développer de tels composés. Contrairement aux SERM et aux SERD, les AI n’interagissent pas directement avec les RE mais empêchent la synthèse d’œstrogènes par inhibition de l’enzyme aromatase qui convertit les androgènes en œstrogènes, au niveau de la tumeur (Bulun et al., 2009; Hong et al., 2009). Les AI de troisième génération (Exemestane, Letrozole et Anastrozole) sont aujourd’hui approuvés pour le traitement de cancer du sein avancé chez les femmes post‐ménopausées, après le traitement au tamoxifène (Miller, 2004). Ces composés présentent une meilleure efficacité et améliorent les profils de guérison en comparaison aux autres traitements. Les AI inhibent de plus de 95% l’activité de l’aromatase et répriment les œstrogènes circulant pour atteindre un niveau tout juste détectable lorsqu’ils sont utilisés à des doses cliniques appropriées sur les femmes post‐ménopausées (Ali and Coombes, 2002; Miller, 2004). L’utilisation des AI tels que formestane, anastrozole, ou letrozole devient de plus en plus répandue dans les thérapies de cancer du sein (Bai and Gust, 2009; Geisler and Lonning, 2006). Des tests de randomisation ont montré que les AI sont plus efficaces que le tamoxifène sur les femmes atteintes d’un cancer avancé lorsqu’ils sont utilisés en traitement adjuvant 107
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE (Baum et al., 2002; Howell et al., 2005). De plus, passer du tamoxifène aux AI après apparition de l’acquisition de résistance peut offrir des bénéfices cliniques, comme cela a été montré par l’IES (Intergroup Exemestane Study). Cette étude a démontré que l’utilisation de l’exemestane après 2‐3 ans de traitement au tamoxifène avait pour résultat une augmentation de la survie au cours des 3 années de randomisation, et même au bout de 5 ans (Coombes et al., 2004). Toutes ces observations soulignent l’importance de l’utilisation des hormonothérapies de manière séquentielle (Winer et al., 2005). 1.2.4. Résistance aux thérapies hormonales
Nous avons vu précédemment qu’environ 50 à 70% des cancers du sein sont REα+/HER2 ‐, et que les patientes présentant de telles tumeurs répondent bien aux thérapies hormonales (Jordan and Brodie, 2007). Cependant, l’efficacité clinique de tels traitements est relativement limitée par le développement de résistance. Effectivement, environ 40% des cancers du sein ER+ métastatiques ne répondent pas aux thérapies hormonales ; on dit que la tumeur présente une résistance de novo. Concernant les tumeurs traitées par les thérapies hormonales, il est souvent observé après plusieurs mois à plusieurs années de traitement le développement d’une résistance. On parle alors de résistance acquise, qui touche près de 60% des cancers du sein au stade précoce traités par l’hormono‐thérapie (Coser et al., 2009; Ellis and Hicklin, 2009). Les mécanismes d’acquisition de résistance sont aujourd’hui très étudiés, afin de mieux les comprendre et d’améliorer les thérapies. a) Résistance au tamoxifène
Les tumeurs qui initialement régressent avec le tamoxifène peuvent éventuellement récidiver et requérir des traitements alternatifs. Les mécanismes de la résistance cellulaire au tamoxifène sont aujourd’hui très étudiés (Le et al., 2002; Marino et al., 2001; Schiff et al., 2003). La plupart des tumeurs résistantes continuent à conserver un RE fonctionnel (Johnston et al., 1995), donc la perte du RE n’explique pas la résistance. Il est possible que la signalisation du complexe RE‐
tamoxifène soit différente dans les cellules résistantes, ou bien l’altération de l’expression des gènes antagonise la signalisation du tamoxifène. Lors du développement de la résistance, le Tamoxifène pourrait devenir un agoniste du RE par l’induction de gènes E2‐spécifiques (Vignon et al., 1984; Westley et al., 1984). La résistance au tamoxifène pourrait également être expliquée par des mutations du RE, des changements dans l’expression et le recrutement des co‐régulateurs, ou encore par l’interaction avec d’autres voies de signalisation. 108
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE De plus, un certain nombre de mécanismes non‐spécifiques pourrait contribuer au phénotype de résistance. Ces mécanismes pourraient inclure des évènements qui limitent la disponibilité intracellulaire du tamoxifène, comme par exemple la liaison à d’autres protéines, un transport intracellulaire altéré, le développement d’un stress oxydant, ou enfin la conversion du tamoxifène en d’autres métabolites. D’autres mécanismes incluent la surexpression de facteurs de croissance, l’augmentation de l’angiogénèse, ou bien l’hétérogénéité de la population cellulaire tumorale (MacGregor and Jordan, 1998). Des mutations du REα ont été montrées dans des tumeurs du sein, mais il n’existe pas à ce stade d’argument pour affirmer que ces mutations jouent un rôle majeur dans la résistance au tamoxifène. Néanmoins, si ces mutations se développent pendant la thérapie au tamoxifène, les cellules tumorales pourraient commencer à répondre au traitement de manière différente. La mutation K303R entraîne l’augmentation de la sensibilité aux œstrogènes (Fuqua et al., 2000) ; cependant, le tamoxifène est toujours efficace pour bloquer leur action. De plus, la mutation Y537N entraîne des variations dans l’activité constitutive du RE, à savoir qu’il n’est plus affecté par E2, le tamoxifène, ainsi que ICI (Zhang et al., 2006). La mutation D351Y a été découverte dans des modèles cellulaires dérivées de la lignée MCF‐7 stimulées au tamoxifène (Wolf and Jordan, 1994). Malgré le fait que cette mutation accroît l’action œstrogène‐like des SERM (Levenson et al., 1998; Liu et al., 2001), il n’existe pas d’augmentation générale des mutations dans les cancers résistants au tamoxifène (Bilimoria et al., 1996; Jiang et al., 1992; Karnik et al., 1994; Weatherman and Scanlan, 2001). Les connaissances sur la mutation D351Y dans le REα et l’association étroite de la D351 avec la chaîne latérale anti‐
œstrogénique des SERM ont fourni un important aperçu de la modulation moléculaire du complexe REα‐SERM (Baum et al., 2002; Liu et al., 2002a). La balance entre le REα et le REβ pourrait également jouer un rôle. Il a été montré que l’expression des ARNm du REβ était augmentée dans les tumeurs humaines ainsi que dans les lignées cellulaires résistantes au tamoxifène, suggérant que le REβ est un facteur de mauvais pronostic pour le développement de la résistance (Speirs et al., 1999a). Comme le RE est la cible de l’action des SERM, il est reconnu que les augmentations et les diminutions dans les expressions des co‐régulateurs vont moduler le complexe RE‐SERM pour le rendre respectivement œstrogénique ou anti‐œstrogénique. Ce principe est illustré par la détection de taux élevés du co‐activateur SRC‐3 (NCoA3) dans les tumeurs résistantes au tamoxifène (Osborne et al., 2003). Il est connu que la répression de l’activation des gènes par le tamoxifène est un processus actif, au cours duquel il y a recrutement de corépresseurs (Yamamoto et al., 2001). Si les niveaux de 109
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE corépresseurs sont faibles dans une tumeur particulière, le tamoxifène pourrait être incapable de recruter un nombre suffisant de corépresseurs pour éteindre la transcription des gènes cibles, contribuant ainsi à la résistance. Les altérations des voies de transduction du signal représentent un autre mécanisme de résistance au tamoxifène. En effet, ceci comprend par exemple les effets inhibiteurs de croissance de TGF‐β1 (Weatherman and Scanlan, 2001), une signalisation de AP‐1 augmentée (Dumont et al., 1996; Johnston et al., 1999; Schiff et al., 2000), ainsi que l’up‐régulation des niveaux d’expression de Akt/PI3K (Campbell et al., 2001; Sun et al., 2001), HER2 (Kurokawa et al., 2000; Lund et al., 2005; Pietras et al., 1995), le récepteur à IGF‐1 (Parisot et al., 1999), et enfin l’activation des MAP kinases (Rabenoelina et al., 2002). L’activation aberrante de ces voies de signalisation pourrait mener à l’activation ligand‐indépendante du RE via la phosphorylation, et mener à la résistance. Dans l’ensemble, il existe de nombreux mécanismes potentiels qui pourraient contribuer individuellement ou en combinaison au développement de la résistance au tamoxifène. Malgré la possibilité de résistance, il existe de potentiels traitements après le développement de la résistance. Ceux‐ci incluent l’utilisation des inhibiteurs d’aromatase pour bloquer la production d’œstrogène (Baum et al., 2002), de même que d’anti‐œstrogènes pur pour dégrader le RE (Howell et al., 2002). b) Résistance au fulvestrant
En raison du développement de résistance au tamoxifène, d’autres molécules ont été développées pour traiter les cancers du sein hormono‐dépendants, parmi lesquelles un SERD, le fulvestrant (Howell et al., 2000; Howell and Abram, 2005). Le fulvestrant est donc utilisé pour traiter les patientes post‐ménopausées présentant des cancers du sein de stade avancé RE+ après échec d’un premier traitement anti‐hormonal au tamoxifène (Howell et al., 2000; Howell et al., 2002). Cependant, certaines études réalisées in vitro montrent que de même que pour le tamoxifène, une résistance au fulvestrant peut être développée (Hu et al., 1993; Perey et al., 2007). C’est pourquoi il apparaît essentiel de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette résistance, et de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques pour pallier à ce problème. Une étude a été menée sur 7 lignées cellulaires résistantes au fulvestrant dérivées de la lignée de cancer du sein MCF‐7 (Frogne et al., 2009). Les auteurs ont montré que les lignées résistantes obtenues expriment toujours le REα, mais à des niveaux peu élevés (Frogne et al., 2005; Shaw et al., 2006), et que l’expression des gènes cibles du RE n’était pas altérée (Frogne et al., 2009). La résistance 110
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE au fulvestrant pourrait alors découler d’une dérégulation de l’expression d’autres gènes. L’étude des mécanismes moléculaires responsables de l’acquisition de résistance au fulvestrant est émergente, et beaucoup reste à comprendre, mais plusieurs protéines ont été associées à la croissance des lignées résistantes : Akt, EGFR/ErbB2, ErbB3, Erk, NFκB et la β‐caténine (Fan et al., 2006; Frogne et al., 2005; Frogne et al., 2009; Gu et al., 2002; McClelland et al., 2001). D’autres études ont montré que des inhibiteurs de voies de signalisations (PI3K, Akt, mTOR, MAPK) impliquées dans le développement de résistance aux thérapies hormonales restaurent la sensibilité des lignées cellulaires au traitement (Ghayad et al., 2008; Ghayad et al., 2010). A ce jour, encore trop peu d’études ont été réalisées sur les mécanismes d’acquisition de résistance au fulvestrant, et beaucoup reste encore à comprendre. Cependant, un certain nombre d’études cliniques montrent de meilleurs résultats (moins d’apparition de résistance aux anti‐œstrogènes) avec une utilisation séquentielle du fulvestrant en co‐traitement avec les autres thérapies hormonales (tamoxifène, inhibiteurs d’aromatase) (Dodwell et al., 2006; Perey et al., 2007). 1.2.5. REβ et cancer du sein
Le rôle du REβ dans la croissance et le développement du cancer du sein n’est pas aussi clair que celui du REα (Gustafsson and Warner, 2000; Palmieri et al., 2002). Le REβ pourrait présenter un effet modulateur dans le cancer du sein (Speirs et al., 1999 b) parce qu’il est exprimé dans les tissus mammaires sain et malin, qu’il est capable de lier le 17β‐œstradiol, et qu’il peut hétérodimériser avec le REα (Cowley et al., 1997; Hall and McDonnell, 1999; Ogawa et al., 1998; Pettersson et al., 1997). Cependant, la plupart des analyses du REβ ont été menées au niveau de l’ARNm grâce à des techniques basées sur la PCR. Ceci à cause de la difficulté d’analyse de la protéine REβ avec les anticorps aujourd’hui disponibles, qui continuent à fournir des résultats trop contradictoires. Le fait qu’il existe plusieurs anticorps différents de valeur incertaine a pu mener à des divergences dans la littérature. Par exemple, une étude indique que la présence du REβ est un bon indicateur pronostic pour le cancer du sein. L’expression du REβ a été associée avec une meilleure survie chez les patients recevant un traitement au tamoxifène (Prins et al., 2001). De plus, les tumeurs exprimant le REβ présentaient un meilleur taux de survie (DFS) (Omoto et al., 2001) et les niveaux de REβ étaient diminués dans les tumeurs pré‐invasives prolifératives (Pujol et al., 1998). Ces études ont suggéré un rôle protecteur pour le REβ dans le cancer du sein. Au contraire, certaines études mettent en évidence que le REβ est un indicateur de mauvais pronostic. Des tumeurs exprimant le REα et le REβ 111
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE présentaient des ganglions positifs et des tumeurs de stade plus avancé (Speirs et al., 1999b). De plus une étude a montré que les niveaux d’ARNm du REβ étaient également élevés dans les tumeurs qui présentaient une résistance à l’hormonothérapie (Speirs et al., 1999a). D’autre part, des polymorphismes différents dans le gène du REβ ont été associés au risque de développement du cancer du sein, particulièrement chez les femmes qui présentent des niveaux élevés d’œstrogènes circulant et une longue exposition aux œstrogènes endogènes (Zhang et al., 2006). Effectivement, deux différents SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ont été corrélés avec une longue durée de menstruation ainsi qu’avec l’augmentation du risque de cancer du sein chez la femme post‐ménopausée. Ces résultats concordent avec ceux des études épidémiologiques menées par ailleurs sur l’augmentation du risque de cancer du sein, mettant en avant l’influence d’un âge précoce lors de la ménarche et d’un âge retardé pour la ménopause, augmentant le nombre de cycles menstruels (Brose et al., 2002; Hulka, 2001). En général, la plupart des études suggèrent que la présence du REβ est un bon pronostic pour le cancer du sein ainsi que pour la prescription de thérapie aux anti‐œstrogènes (Esslimani‐Sahla et al., 2004; Jarvinen et al., 2000; Prins et al., 2001). Cependant, le taux relatif de REα et de REβ doit aussi être considéré. En effet, lorsqu’un tissu mammaire sain devient tumorigénique, le taux de REα augmente alors que celui de REβ diminue (Leygue et al., 1998). La majorité des RE présents dans les tumeurs mammaires est le REα, ainsi l’intérêt biologique du REβ dans le cancer du sein reste un véritable sujet de débat (Skliris et al., 2008). Néanmoins, des études complémentaires qui pourraient corréler les caractéristiques tumorales et les déterminations précises des taux d’ARNm et de protéine du REβ semblent nécessaires afin d’identifier les différentes situations spécifiques où le REβ pourrait jouer un rôle critique dans la carcinogénèse ou dans la progression de la maladie. 1.3. Cancer de l’ovaire
1.3.1. Evolution et incidence
Le cancer de l’ovaire présente une estimation d’environ 4 400 nouveaux cas diagnostiqués en France en 2009. Ce cancer est l’un des cancers majoritaires à l’origine des décès par tumeurs gynécologiques chez la femme (Rodriguez et al., 1995). Le cancer de l’ovaire est caractérisé par une forte morbidité dans les pays industrialisés (Greenlee et al., 2000). La mortalité par cancer de 112
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE l’ovaire a beaucoup augmenté jusqu’en 1987, mais elle diminue depuis de 0,7% par an, et notamment de 2,8% depuis 2000 (Belot et al., 2008). Cette diminution est due en grande partie à la diminution de l’incidence (‐1%) de ce cancer depuis les années 1980, et probablement à l’effet protecteur des contraceptifs oraux (Belot et al., 2008). Le cancer ovarien a été responsable de plus de 3 000 décès en 2009, ce qui représente 5,5% et le place au 5ème rang des décès par cancer chez la femme (données issues du site web de l’Institut de la Veille Sanitaire INVS, INVS, 2009). Figure 33 : Evolution de l’incidence et de la mortalité pour les cancers
de l’ovaire dans le monde de 1950 à 2005.
Après une augmentation de la mortalité par cancers de l’ovaire jusqu’en 1980, celle-ci décroît.
L’incidence de développement de ce cancer diminue également.
Données de l’Institut de Veille Sanitaire (INVS, 2009).
1.3.2. Facteurs de risque et facteurs protecteurs
Le risque de développement d’un cancer de l’ovaire pour les femmes dans les pays industrialisés est d’environ 2% (2002; Whelan, 1992). 113
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE a) Les facteurs de risque du cancer de l’ovaire :
Les prédispositions génétiques: les femmes porteuses de mutations de BRCA1 ou BRCA2 présentent de plus hauts risques, avec à l’âge de 70 ans environ 40% et 10% respectivement (Antoniou et al., 2003; Brose et al., 2002; Thompson and Easton, 2002). Dans un même pays, les taux d’incidence de ce cancer diffèrent selon le groupe ethnique (2002; Parkin, 1989). Aux Etats‐Unis, par exemple, les taux les plus hauts sont observés chez les femmes blanches non hispaniques, les taux intermédiaires chez les hispaniques et les plus bas pour les Afro Américaines et les Asiatiques (2002). Des études de migration ont montré que l’incidence du cancer ovarien tend à se rapprocher du pays dans lequel la patiente a immigré (Herrinton et al., 1994; Kliewer and Smith, 1995; Stabile et al., 2002). Une hypothèse probable serait que le mode alimentaire et/ou le mode de vie (pollution, nombre de grossesses, etc.) pourraient jouer un rôle dans le risque de développer un cancer de l’ovaire. Les facteurs reproducteurs : l’apparition de ménarche à un âge précoce ainsi que le retard de l’âge d’apparition de la ménopause augmentent modérément le risque de développement de cancer de l’ovaire. Il peut donc être supposé que l’amplitude de la vie menstruelle ne joue pas un rôle crucial dans la pathogénèse de ce cancer (Schildkraut et al., 2001). L’utilisation d’hormones exogènes pour le traitement des symptômes de la ménopause (THS) : le THS pourrait être associé avec un risque augmenté de développement de cancer de l’ovaire, voire de mortalité (Brekelmans, 2003; Folsom et al., 2004; Gambacciani et al., 2003; Garg et al., 1998; Lacey et al., 2002; Makar, 2000; Riman et al., 2002b; Rodriguez et al., 2001). Plusieurs études épidémiologiques et cliniques ont montré que des prises prolongées de THS (>5‐10 ans) confèrent un risque augmenté de 1,5 à 2 fois (Chiaffarino et al., 2001; Folsom et al., 2004; Lacey et al., 2002; Riman et al., 2002b; Rossouw et al., 2002). Ces traitements sont responsables d’environ 2% des cancers des ovaires. L’obésité : elle constitue également un risque, mais modéré, de développer un cancer de l’ovaire (Calle et al., 2003; Rodriguez et al., 2002). Cependant, dans de nombreuses études, l’association directe entre surpoids et cancer ovarien n’a pas montré de résultats statistiquement significatifs (Dal Maso et al., 2002; Fairfield et al., 2002; Kuper et al., 2002; Lahmann et al., 2009). Des études ont montré qu’une surcharge pondérale au cours de l’adolescence ou au début de l’âge adulte pourrait augmenter le risque de cancer ovarien (Engeland et al., 2003; Lubin et al., 2003; Rossouw et al., 2002), 114
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE ou pendant les années de pré‐ménopause (Fairfield et al., 2002), mais aucune association n’a été observée dans d’autres études (Kuper et al., 2002; Schouten et al., 2003). L’activité physique : de même que pour l’obésité, les études épidémiologiques sont peu concluantes, mais il semblerait que la diminution du taux d’œstrogènes circulant chez les sportives soit corrélée avec une diminution de risque de développement de cancer de l’ovaire (Bertone et al., 2002). Les autres risques aujourd’hui bien établis de développer un cancer de l’ovaire sont également l’âge, les antécédents familiaux et l’infertilité (Banks, 1997; Whittemore et al., 1992). Cependant, il existe des facteurs capables de réduire le risque de développement de cancer des ovaires. b) Les facteurs protecteurs :
Le risque décroît avec l’utilisation de contraceptifs, l’hystérectomie, ainsi que la ligature des trompes (Lukanova and Kaaks, 2005; Modan et al., 2001; Narod et al., 1998; Riman et al., 2002a; Whittemore et al., 1992). L’effet protecteur de la grossesse a été montré sur les femmes Nord‐Américaines, Européennes, et Asiatiques (Banks, 1997; Beral et al., 1999; Modan et al., 2001), avec 10 à 16% de diminution de risque à chaque grossesse supplémentaire (Hankinson et al., 1995a; Risch et al., 1996). D’autre part, plusieurs études ont mis en évidence que les œstrogènes pourraient être responsables de la favorisation de la progression tumorale ovarienne chez la femme ménopausée. Mais Il a été estimé que l’utilisation de contraceptifs oraux combinant œstrogènes et progestines pendant plus de 5 ans réduit le risque de cancer de l’ovaire de 30 à 50% (Hankinson et al., 1992; Whittemore, 1994; Whittemore et al., 1992). L’effet favorable a été observé pour une durée d’au moins 10 à 15 ans après arrêt de la contraception orale (Franceschi et al., 1991; Hankinson et al., 1992), et certaines études montrent même que la protection pourrait persister encore plus longtemps (>25 ans) (Ness et al., 2000; Riman et al., 2002b). Cependant, bien que les contraceptifs puissent être considérés comme des agents chémo‐préventifs pour la réduction du risque de cancer des ovaires, leur potentiel pour réduire le risque de cancer héréditaire (mutation BRCA1 et/ou BRCA2) demeure peu clair (Modan et al., 2001). La diminution du risque de développer un cancer de l’ovaire semble suivre l’évolution des modes de vie. Toute situation qui diminue le nombre d‘ovulations semble protectrice pour le cancer ovarien. 115
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE 1.3.3. RE et cancer de l’ovaire
L’ovaire est la principale source d’œstrogènes chez la femme. Ces hormones sont formées dans la granulosa des follicules maturés, à partir de précurseurs androgéniques dérivés de la thèque ovarienne (McGee and Hsueh, 2000). Au cours du cycle menstruel, les œstrogènes affectent de manière critique la croissance et le développement des follicules ovariens (Hsueh et al., 1984) en entraînant la prolifération des cellules de la granulosa des petits follicules, ainsi qu’une cascade de phénomènes menant à l’ovulation (Murdoch, 1996). Le REβ est le RE prédominant dans l’ovaire, où il est présent dans les cellules de la granulosa, alors que le REα est localisé dans les cellules de la thèque ainsi que dans les cellules interstitielles. Les études menées sur les ovaires humains (sains ou non) ont conduit à des résultats divergents. Une étude a montré que les niveaux relatifs d’ARNm du REα par rapport au REβ dans l’ovaire cancéreux étaient plus élevés que dans l’ovaire sain (Pujol et al., 1998). Une autre étude a mis en évidence des taux variables des RE dans l’ovaire normal, des taux plus faibles de REβ dans l’épithélium de tumeurs primaires d’ovaire, et uniquement du REα dans les tumeurs métastatiques (Rutherford et al., 2000). Une autre étude a montré que les niveaux du REβ dans le cancer ovarien étaient plus bas que ceux du REα en comparaison avec ceux du tissu normal (Sakaguchi et al., 2002). Au contraire, d’autres travaux rapportent qu’une diminution du niveau d’ARNm du REα a été observée par rapport au taux d’ARNm du REβ dans les cellules épithéliales ovariennes humaines (Lau et al., 1999). Contrairement au cancer du sein, la valeur pronostique du statut des récepteurs hormonaux n’a pas été clairement établie pour le cancer des ovaires (Perez‐Gracia and Carrasco, 2002; Rao and Slotman, 1991). L’expression du REα est observée dans tous les types de tumeurs, mais à des taux relativement peu élevés. Le REβ est exprimé majoritairement dans les tumeurs des cellules de la granulosa (Lund et al., 2005). Plusieurs études ont montré que dans des prélèvements de cancer des ovaires, les niveaux d’ARNm du REβ sont diminués par rapport aux ovaires sains, alors que les taux d’ARNm de REα sont similaires ou légèrement plus forts dans les biopsies cancéreuses que dans les biopsies saines (Bardin et al., 2004; Brandenberger et al., 1998; Fujimura et al., 2001; Hillier et al., 1998; Pujol et al., 1998; Rutherford et al., 2000). D’autres études appuient ces résultats par d’autres méthodes de détection que la quantification des ARNm. En effet, des expériences d’immunohistochimie ont permis d’affirmer que les niveaux de protéine du REβ étaient plus faibles dans les tumeurs ovariennes que dans l’ovaire sain (Fujimura et al., 2001; Lindberg et al., 116
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE 2003; Lindgren et al., 2004). Les mécanismes probables pour cette diminution du REβ restent peu clairs. Cependant, la majorité des études supportent par conséquent un scénario dans lequel le REα devient le RE dominant dans le cancer ovarien. Ceci implique un mécanisme qui résulte dans la dominance du REα ou une croissance sélective en faveur des cellules REα positives. Il apparaît alors nécessaire de mener des études complémentaires afin de mieux déterminer les contributions du REα et du REβ dans le cancer de l’ovaire. Les mécanismes moléculaires impliquant les œstrogènes dans la carcinogénèse ovarienne ne sont aujourd’hui toujours pas clairs, mais semblent différer de ceux de la progression tumorale mammaire. En effet, environ deux‐tiers des patients atteints de tumeurs mammaires RE+ répondent au tamoxifène. Bien que 38% des cancers des ovaires soient RE positifs (REα) (Havrilesky et al., 2001; Rao and Slotman, 1991), leurs réponses à la thérapie hormonale sont modestes (Makar, 2000) et seulement une mineure partie des patients (environ 7 à 18%) répond cliniquement aux traitements anti‐œstrogéniques (Hatch et al., 1991; Kurebayashi, 2003; Scambia et al., 1995). Deux formes de résistance aux anti‐œstrogènes apparaissent : la résistance acquise et la résistance de novo. Dans la résistance de novo, le mécanisme le plus commun est l’absence de RE, ce qui ne semble pas être le cas pour la résistance acquise (Lazennec, 2006). Dans la plus grande étude clinique publiée, lors du traitement de 105 patients aux stades III et IV de cancer ovarien avec le tamoxifène, 10% présentaient une réponse complète, 8% une réponse partielle, et 38% une stabilisation à court terme de la maladie (Hatch et al., 1991). Cette étude est relativement ancienne et il n’y a eu depuis que peu de preuves des traitements aux anti‐œstrogènes seuls pour les cancers des ovaires. Pourquoi ces différences entre cancer du sein et cancer de l’ovaire ? Diverses explications peuvent être proposées. L’expression des RE dans le cancer de l’ovaire est inférieure à celles des cancers du sein, et notamment moins que les 60% estimés par des analyses biochimiques (Rao and Slotman, 1991). des études immunohistochimiques de cellules épithéliales de cancer ovarien indiquent que seulement 38% des cancers des ovaires sont RE positifs (Kommoss et al., 1992). De plus, la concentration moyenne en RE dans les cellules de cancers de l’ovaire est plus faible que celle des cellules de cancers du sein ou de l’endomètre (Miller et al., 2005). D’autre part, les études cliniques sur les thérapies au tamoxifène semblent trop peu précises puisqu’elles n’ont été menées que sur un petit nombre de patients atteints d’un cancer de l’ovaire (Rao and Slotman, 1991), et de plus ce sont des études essentiellement rétrospectives et des informations sur les 117
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE caractéristiques des tumeurs manquent. En raison de ce manque de données, il apparait alors difficile de conclure sur le rôle du tamoxifène dans la thérapie du cancer de l’ovaire. 1.4. RE et cancers du sein et de l’ovaire, invasion, et motilité.
L’expression du REβ diminue lors de la carcinogénèse de l’ovaire ou du sein. Des études ont montré que la réintroduction du REβ dans les cellules de cancer du sein et de l’ovaire inhibait essentiellement de manière ligand‐indépendante la motilité et l’invasion cellulaires (Bardin et al., 2004; Lazennec et al., 2001). D’autre part, in vitro, la comparaison de lignées de cancer du sein montre que les lignées RE‐ ont une invasion nettement supérieure à celle des lignées RE+ (Garcia et al., 1997; Platet et al., 2000; Pujol et al., 1998), et de plus que l’œstradiol exerce un effet inhibiteur sur l’invasion cellulaire dans plusieurs lignées RE+ de cancer du sein (MCF‐7, T47D) et de cancer des ovaires (BG1, SKOV3, PEO4) (Maynadier et al., 2008; Pujol et al., 1998). Le REα semble donc être associé avec une invasivité et une motilité réduites dans les cancers RE+ (Platet et al., 2000; Thompson et al., 1992). Ces observations pourraient alors expliquer le rôle protecteur du REα contre l’invasion tumorale et la métastase précédemment observées dans ces cellules. En outre, lors de l’implantation de cellules cancéreuses mammaires REα positives dans des souris nude, les tumeurs apparaissaient uniquement en présence d’œstrogènes et étaient moins métastatiques que celles développées par les lignées cellulaires de cancer du sein REα négatives (Garcia, 2000). D’autre part, dans la cancérogénèse mammaire, bien que l’effet mitogène soit bien démontré, la présence du REα est associée avec des tumeurs plus différenciées et moins invasives, ainsi qu’un pronostic plus favorable. De plus, des études cliniques mettent en avant le potentiel protecteur des œstrogènes contre l’invasion tumorale. Des études épidémiologiques ont évalué le risque de cancer du sein chez des femmes sous thérapie hormonale de substitution, pour lesquelles 80% prenaient des préparations composées uniquement d’œstrogènes (1997; Marsden and Sacks, 1996). Parmi les femmes sous THS, le risque de cancer du sein était légèrement augmenté, mais les tumeurs des patients sous traitement à l’œstradiol étaient confinées, moins invasives, et de meilleur pronostic. D’autres études sur l’effet de la thérapie anti‐œstrogénique sur le cancer du sein primaire ont suggéré que le tamoxifène augmentait l’expansion des tumeurs primaires REα positives vers les sites en position contralatérale. L’utilisation du tamoxifène diminuait (de 0,8 fois) le risque pour les 118
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE tumeurs REα positives, mais il semblait augmenter (de 4,9 fois) le risque de développement de tumeurs contralatérales pour les tumeurs REα négatives (Li et al., 2001b; Li et al., 2001c). En conclusion, les données in vitro, in vivo et cliniques vont dans le même sens, à savoir que les œstrogènes présentent un double effet dans les cancers du sein et des ovaires RE+. Ils stimulent la croissance tumorale, mais présentent un effet d’inhibition de l’invasion et de la motilité. Ceci pourrait expliquer le pronostic plus favorable observé dans certaines études cliniques pour les patients atteints de cancers RE positifs par rapport à ceux développant des cancers RE négatifs. Dans le contexte du cancer, une telle réduction de l’invasion et de la motilité pourrait certainement conduire à des cancers moins agressifs à faible taux de métastase. Ces résultats concordent également avec de nombreuses études décrivant que les tumeurs exprimant le REβ sont moins métastatiques (Jarvinen et al., 2000). Dans l’ensemble, le REβ semble jouer un rôle protecteur contre le développement des cancers du sein et de l’ovaire. Divers mécanismes supportant un rôle antiprolifératif du REβ ont été proposés pour appuyer cette hypothèse (Arai et al., 2000; Lazennec et al., 2001; Sotoca et al., 2008a; Sotoca et al., 2008b). Le REβ serait capable de moduler négativement l’effet prolifératif du REα en présence d’E2 dans la lignée humaine de cancer du sein T47‐D (Sotoca et al., 2008b). La prolifération des cellules T47‐D entraînée par le REα en présence de phyto‐œstrogènes était également réduite par l’expression du REβ (Sotoca et al., 2008a). Ces deux études suggèrent un mécanisme influencé par l’affinité relative des deux récepteurs avec les ligands, ainsi que par l’interaction du complexe RE‐ligand avec les protéines co‐régulatrices. Une autre possibilité est que la présence du REβ pourrait simplement antagoniser les effets stimulateurs de croissance du REα. Ceci est suggéré par une étude dans laquelle le REβ inhibait l’activité agoniste du complexe REα‐tamoxifène (Hall and McDonnell, 1999). D’autres études sont toutefois nécessaires afin de préciser les interactions existant entre le REα et le REβ dans le contrôle de la prolifération cellulaire. 119
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE 2. Les autres physiopathologies
Les RE sont présents dans de nombreux tissus tels que les systèmes reproducteurs, les poumons (REβ dominant), le système cardio‐vasculaire, le foie (REα dominant), les os, les reins, la rate, la moelle osseuse (pour les 3 derniers : REβ non détectable) (Couse et al., 1997). Ils peuvent jouer un rôle dans diverses pathologies. Effectivement, les œstrogènes, via les RE, influencent de nombreux processus physiologiques tels que la reproduction, le système cardio‐vasculaire, l’intégrité osseuse, le système nerveux. Les œstrogènes sont également impliqués dans le développement ou la progression de nombreuses maladies, qui incluent, en plus de certains types de cancer (sein, ovaire, colorectal, prostate et endomètre), l’ostéoporose, les maladies neuro‐dégénératives, les maladies cardio‐vasculaires, et l’obésité. 2.1. Instabilité vasomotrice
Les œstrogènes ont beaucoup été utilisés en thérapie de remplacement chez les femmes pré‐ et post‐ménopausées afin de réduire les bouffées de chaleurs. Il est possible que les REα et/ou REβ soient des médiateurs de la suppression de l’instabilité vasomotrice par les œstrogènes car les deux récepteurs sont exprimés dans l’hypothalamus et le centre thermorégulateur du cerveau. Les études menées sur les souris KO et en utilisant les agonistes sélectifs des RE montrent que l’activation du REα est suffisante pour la modulation de la température chez des modèles de rongeurs présentant des bouffées de chaleurs (Harris et al., 2002). Ces résultats ont été confirmés sur des modèles de souris de type sauvages et invalidées pour le gène du REβ (Opas et al., 2006). 2.2. L’ostéoporose
Les œstrogènes régulent l’homéostasie squelettique chez les hommes et les femmes (Ohlsson and Vandenput, 2009; Riggs et al., 2002). L’ostéoporose est due à une augmentation de la résorption osseuse et est associée à une déficience en E2. Les œstrogènes inhibent la perte osseuse en réduisant la résorption due aux ostéoclastes, et en augmentant la formation osseuse par les ostéoblastes. E2 induit un signal pro‐apoptotique, diminuant la durée de vie des ostéoclastes. Ses effets sur l’expression génique permettent de maintenir une masse osseuse optimale (Almeida et al., 2006; Farach‐Carson and Davis, 2003). Des travaux ont montré que chez la souris mâle et femelle, le 120
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE récepteur des androgènes ainsi que le REα jouent un rôle dans la maintenance de la densité de l’os cortical et de l’os spongieux (Lindberg et al., 2001; Lindberg et al., 2002a; Lindberg et al., 2002b; Sims et al., 2003; Sims et al., 2002; Vidal et al., 2000). Ainsi, le REα relaye la stimulation induite par E2 pour la formation de l’os alors que le rôle du REβ demeure moins clair (Deroo and Korach, 2006). En effet, le REβ ne semble pas important pour la maintenance de l’os cortical chez les souris mâles (Vidal et al., 2000) (surtout lors de la maturation sexuelle), alors qu’il module l’action du REα dans l’os chez les femelles (Lindberg et al., 2003; Riggs et al., 2002). Reste à élucider pourquoi le REβ régule le REα chez la femelle et non chez le mâle (Ohlsson and Vandenput, 2009). Ce rôle inhibiteur du REβ sur l’activité du REα est maintenant généralement supposé être une fonction majeure du REβ dans de nombreux tissus, incluant également la régulation de la tumorigénèse. Par ailleurs, en 1994, le Dr Smith et son équipe ont décrit un homme âgé de 28 ans qui possédait naturellement une mutation dans le gène codant le REα, le rendant résistant aux œstrogènes (Smith et al., 1994). La croissance de ce patient était normale mais il présentait un retard marqué de l’âge de ses os. En effet, son ossature était celle d’un homme de 15 ans. De plus, malgré des taux sériques de testostérone normaux et des niveaux d’œstradiol élevés, il présentait une ostéopénie sévère associée à des niveaux élevés des marqueurs du remodelage osseux. Peu après, deux hommes présentant une déficience en œstrogènes, due à une mutation dans le gène de l’aromatase (CYP19) ont été décrits (Carani et al., 1997; Morishima et al., 1995). Ces patients avaient des niveaux d’E2 indétectables et quasiment le même phénotype osseux que l’homme résistant. Mais contrairement à ce‐dernier, qui ne répondait pas à la thérapie œstrogénique, ces patients déficients en aromatase répondaient au traitement aux œstrogènes par une augmentation significative de la masse osseuse, une suppression de la résorption de l’os. Des études d’autres cas de patients déficients en aromatase, présentant le même phénotype osseux que les deux précités, ont été menées, et ces hommes ont été traités avec différentes doses d’E2 afin de rétablir la maturation osseuse et la minéralisation. Ces études cliniques ont permis de mettre en évidence l’existence d’un seuil minimum d’œstradiol qui assure le maintien de l’équilibre osseux, la maturation osseuse, et prévient perte osseuse, et le risque de fracture (Bilezikian et al., 1998; Khosla et al., 1998; Khosla et al., 2002; Ohlsson and Vandenput, 2009). D’autre part, une association entre le déclin des niveaux d’œstrogènes à la ménopause et le développement de l’ostéoporose a été clairement établie, impliquant les œstrogènes dans la maintenance de la densité osseuse (Couse and Korach, 1999; Curtis Hewitt et al., 2000). 121
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE Il est alors possible d’affirmer que les œstrogènes et les RE sont d’importants régulateurs de la santé osseuse chez l’Homme. 2.3. Cerveau et comportement
Le REβ est présent partout dans le cerveau (Shughrue et al., 1997), et des équipes de recherche ont porté beaucoup d’intérêt à définir sa fonction. Les aspects d’investigation particulièrement abordés sont cerveau / neuroprotection, anxiété / dépression et apprentissage / mémoire. Les œstrogènes se révèlent être protecteurs contre la perte de neurones dans des modèles d’ischémie cérébrale. Des travaux ont montré que ce rôle protecteur est possible grâce à la présence du REα (Dubal et al., 2001). D’autres études ont montré que le REβ peut également jouer un rôle dans ce phénomène, car le DPN (agoniste du REβ) est capable de produire un effet de neuroprotection chez la souris ischémique (Carswell et al., 2004). D’autres travaux ont confirmé les deux résultats précédents, avançant un rôle pour les deux RE dans la neuroprotection œstrogéno‐dépendante (Miller et al., 2005). Un autre aspect beaucoup étudié quant aux rôles des RE est celui de leur action dans l’anxiété et/ou la dépression. Lors d’études de distribution tissulaire, l’œstradiol et le REβ ont été montré capables d’influencer le système sérotoninergique (Gundlah et al., 2005; Nomura et al., 2005), conduisant à l’hypothèse que le REβ pourrait contribuer à l’amélioration des états d’anxiété et/ou de dépression. Des travaux menés sur le comportement de modèles de souris transgéniques exposées à des agonistes sélectifs des RE, afin de déterminer les effets du REβ sur l’anxiété et la dépression, ont permis de montrer que le REβ est l’un des médiateurs de l’effet positif de l’œstradiol sur les souris en dépression (Rocha et al., 2005). En effet, les souris REβ KO ne réagissaient pas à l’œstradiol, mais il faut cependant rester vigilent face à ces données puisque les comportements des souris REα KO n’ont pas été étudiés. Toutefois, des études comportementales sur des rats ont montré, grâce à des agonistes sélectifs, que le REβ est impliqué dans l’amélioration de leur état, car l’œstradiol et le DPN montraient un effet comparable à celui de l’antidépresseur, mais pas le PPT (Lund et al., 2005; Walf and Frye, 2005; Walf et al., 2004). De plus, sur un modèle d’étude permettent de mesurer l’anxiété, une équipe a montré que les femelles invalidées pour le gène codant le REβ présentaient une augmentation de l’état anxieux (Krezel et al., 2001). Ce résultat a été confirmé par d’autres études (Imwalle et al., 2005). De plus, ces effets anti‐anxiété de l’œstradiol et du DPN étaient 122
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE bloqués par la co‐administration de tamoxifène, suggérant qu’effectivement l’effet bénéfique des œstrogènes sur l’anxiété serait médié par le REβ.
2.4. Le système cardio-vasculaire
L’indication que les œstrogènes pourraient être des facteurs protecteurs dans le développement des affections du système cardio‐vasculaire a été fondée sur les observations selon lesquelles les femmes pré‐ménopausées présentent un risque moins élevé pour ce type d’affection (Barrett‐
Connor, 1994; Barrett‐Connor and Bush, 1991; Sullivan, 1991) que les femmes ménopausées (taux d’E2 réduit) (Rossouw et al., 2002). Par conséquent, la possibilité d’un rôle du REβ dans les tissus du système cardio‐vasculaire est de grand intérêt. Cependant, dans la souris, tandis que le cœur des deux sexes possédait des niveaux de REβ peu détectables (Rubanyi et al., 1997; Weatherman and Scanlan, 2001), l’aorte de chaque sexe démontrait une expression du REα. Ces données pourraient suggérer que les actions des œstrogènes sur le système cardio‐vasculaire sont plutôt médiées par le REα. Cette hypothèse est appuyée par les données sur les phénotypes anormaux des systèmes cardio‐vasculaires observés pour les souris REα KO, incluant des désordres dans la synthèse de l’oxyde nitrique dans l’aorte (Rubanyi et al., 1997) et dans l’angiogénèse induite par les œstrogènes (Johns et al., 1996). D’autre part, chez des rats développant spontanément de l’hypertension, le REα a été montré nécessaire pour le relâchement des vaisseaux sanguins (Widder et al., 2003). Par ailleurs, le REβ joue un rôle important dans la réponse à l’infarctus myocardiaque (Harris et al., 2002). De faibles niveaux d’expression du REα ont été associés au développement de maladies touchant les artères coronaires (Losordo and Isner, 2001). Des prélèvements dʹartère coronaire provenant de femmes pré ou post‐ménopausées ont démontré une expression importante du REα dans des artères coronaires saines en comparaison avec la faible expression du REα dans les artères coronaires malades (Losordo and Isner, 2001). Ceci est soutenu par une augmentation de la méthylation du gène codant pour le REα (et donc une diminution de son expression) dans les plaques athérosclérotiques coronaires humaines par rapport au tissu aortique normal (Post et al., 1999). Les études cliniques soutiennent un rôle protecteur des œstrogènes et du REα dans la régulation du niveau lipidique du cholestérol, sur les cellules vasculaires, et sur le rétablissement des dommages vasculaires (Marino et al., 2001). Chez la femme adulte, l’incidence de l’athérosclérose est faible, 123
Etude bibliographique. G. Les fonctions physiopathologiques associées aux RE augmente après la ménopause, et est diminuée chez les femmes post‐ménopausées qui reçoivent une thérapie aux œstrogènes (Barrett‐Connor, 1997; Grady et al., 1992; Stampfer et al., 1991). L’effet protecteur des œstrogènes semble dépendre des altérations des lipides du sérum et des actions directes des œstrogènes sur les vaisseaux sanguins (Mendelsohn, 2000). E2 induit la vasodilatation, qui est considérée comme une réponse non génomique car elle se produit 5 à 20 minutes après lʹexposition à E2, et nʹest pas associée à des changements dʹexpression génique. Les effets génomiques dʹE2 sur les vaisseaux sanguins protègent contre lʹathérosclérose (Mendelsohn, 2000). 2.5. Obésité
Lʹobésité résulte d’un excès de tissu adipeux blanc capable de métaboliser les hormones stéroïdes (Siiteri, 1987). Le tissu adipeux est un site majeur du métabolisme des œstrogènes (Deslypere et al., 1985), et est le principal lieu de production d’œstrogènes après la ménopause (Hankinson et al., 1995b). Les œstrogènes régulent le métabolisme et le stockage du tissu graisseux blanc et jouent un rôle dans lʹadipogénèse, la lipogenèse, la lipolyse et la prolifération adipocytaire (Deroo and Korach, 2006; Ota et al., 1986). Chez la femme, la diminution d’œstrogènes circulant suivant la ménopause est associée avec l’augmentation du poids corporel, et cet effet est atténué par un traitement aux œstrogènes (Tchernof et al., 1998). Le REα et le REβ sont exprimés dans le tissu adipeux, l’isoforme du REα étant prédominant (Dieudonne et al., 2004). Bien que les mécanismes responsables de la régulation de l’adipogénèse par E2 demeurent peu clairs, ils pourraient impliquer la régulation de la lipase, dont le gène est une cible directe des œstrogènes (Couse, 2006). Le rapport complexe entre RE et adipogénèse reste à élucider et pourrait fournir des informations utiles pour la prévention et le traitement de lʹobésité, et notamment grâce à l’étude des modèles murins Knock out (Deroo and Korach, 2006). En conclusion, les œstrogènes ainsi que les RE semblent essentiels dans le développement, la fonction et la maintenance de certains organes, mais peuvent également jouer un rôle pathogène dans ces mêmes organes dans certaines conditions. La balance entre pathologie ou bon fonctionnement dépend également des désordres possibles dans l’expression génique et/ou les voies d’activation des récepteurs des œstrogènes, ainsi que dans la production des hormones. 124
ARTICLES ET TRAVAUX DE THESE ARTICLES ET TRAVAUX DE THESE 125
Articles et travaux de thèse CARACTERISATION DE LA SELECTIVITE ET DE L’ACTIVITE DE LIGANDS DES RECEPTEURS DES ŒSTROGENES ALPHA ET BETA. Rôle du domaine A/B du récepteur des œstrogènes bêta dans l’activité transactivatrice des ligands. Présentation de l’article : Differential response of estrogen receptor beta and delta AB domain estrogen receptor beta to partial and full estrogen agonists. Escande A, Busson M, Garcia A, Grimaldi M, Bellet V, Pillon A, Cavaillès V and Balaguer P. De précédents travaux réalisés dans l’équipe avaient permis d’établir, à partir de cellules HeLa (RE négatives), des lignées cellulaires exprimant le REα ou le REβ et le gène de la luciférase sous le contrôle des œstrogènes. Ces lignées cellulaires permettent actuellement à l’équipe d’étudier la sélectivité REα et REβ de ligands pharmaceutiques et environnementaux (Escande et al., 2006). Cette sélectivité des ligands est déterminée à la fois par des mesures d’affinité (test de liaison aux récepteurs en cellule entière), ainsi que par des mesures d’activité transactivatrice (expression de la luciférase). Lors de cette étude, l’équipe a pu confirmer que le 16α‐LE2 et le PPT sont des ligands sélectifs du REα, alors que le 8β‐
VE2 et le DPN sont des ligands sélectifs du REβ. De même, il a été montré que le raloxifène et le RU486 sont des antagonistes sélectifs du REα et du REβ respectivement. Les RE possèdent deux domaines d’activation : AF‐1 et AF‐2. Le domaine AF‐1 est situé dans la partie N‐terminale de la protéine, et son activité est indépendante de l’hormone. Le domaine AF‐2 est situé à l’intérieur du domaine de liaison à l’hormone. La contribution de chacun de ces domaines activateurs pour la transactivation dépend du type cellulaire et du promoteur du gène cible (Berry et al., 1990). De plus, la région N‐terminale est très peu conservée entre le REα et le REβ, et pourrait expliquer la différence d’activité de ces récepteurs (Delaunay et al., 2000). Ainsi, lorsque la transcription d’un gène nécessite à la fois les fonctions AF‐1 et AF‐2 du récepteur, le REα montre une activité plus forte que celle du REβ (Delaunay et al., 2000; Hall and McDonnell, 1999). Lorsque la fonction AF‐1 n’est pas 126
Articles et travaux de thèse requise, le REα et le REβ ont des activités transcriptionnelles similaires. Il a été montré, par exemple, que l’activité agoniste du tamoxifène résulte de l’activation du domaine AF‐1 seul pour le REα. A mon arrivée dans l’équipe, j’ai participé à l’établissement des lignées cellulaires qui expriment des récepteurs REα et REβ délétés de leur partie N‐terminale (HELN‐ΔABERα et HELN‐ΔABERβ, issues de la lignée HeLa‐ERE‐Luc‐Néo). La lignée exprimant le ΔABERβ nous a permis d’identifier des molécules à activité agoniste partielle et dont la capacité à activer le récepteur était partiellement ou complètement dépendante de cette région. Le but de cette étude a été de démontrer l’importance de la région A/B des deux isoformes du RE pour l’activité transcriptionnelle de ligands agonistes partiels. Nos résultats montrent que la délétion de la région A/B affecte peu l’activité du REα dans le contexte des cellules HeLa. Au contraire, la délétion de la région A/B modifie l’activité transcriptionnelle du REβ. Dans la lignée HELN‐ΔABERβ, en présence d’agonistes complets (comme E2, DPN, ou 8β‐VE2) et en absence de la région A/B, l’expression de la luciférase est deux fois plus importante. Cela suggère un rôle répresseur du domaine A/B du REβ dans les cellules HeLa. Nous avons également étudié l’effet de ces ligands sur la prolifération des cellules HELN‐ERα et HELN‐ERβ. La ré‐expression du RE dans les cellules RE négatives provoque une inhibition de la prolifération cellulaire, en présence d’œstradiol. Nous montrons que l’inhibition de la prolifération cellulaire par E2 n’est pas modifiée par la délétion de la région A/B du REα. Par contre, la délétion de ce domaine diminue l’effet antiprolifératif partiel de l’OH‐Tam. L’inhibition de la prolifération cellulaire par E2 est atténuée par la délétion de la région A/B du REβ. De plus, la délétion de ce domaine réduit l’effet antiprolifératif partiel des ligands environnementaux. Les résultats de ce travail montrent donc que l’activité transcriptionnelle du REβ est régulée aussi bien par son domaine A/B que par son domaine E/F pour les ligands agonistes partiels. Notre étude suggère que le domaine A/B du REβ possède une activité répressive dans le contexte des cellules HeLa qui peut s’exercer sur certaines réponses œstrogéniques. 127
DIFFERENTIAL RESPONSE OF ESTROGEN RECEPTOR BETA AND DELTA AB DOMAIN ESTROGEN RECEPTOR BETA TO PARTIAL AND FULL ESTROGEN AGONISTS Running title: Full length and deltaABER reporter cell lines Aurélie Escande, Muriel Busson, Aurélie Garcia, Marina Grimaldi, Virginie Bellet, Arnaud Pillon, Vincent Cavaillès and Patrick Balaguer* IRCM, Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, Montpellier, F‐34298, France; INSERM, U896, Montpellier, F‐34298, France ; Université Montpellier 1, Montpellier, F‐34298, France; CRLC Val d’Aurelle Paul Lamarque, Montpellier, F‐34298, France. * To whom correspondence should be addressed: Balaguer Patrick Plateforme CMT ‐ Equipe Signalisation Hormonale, Environnement et Cancer IRCM ‐ Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier INSERM U896 ‐ UM1 ‐ CRLC Val dʹAurelle ‐ Parc Euromédecine F‐34298 Montpellier Cedex 5 France Tel (33)‐4 67 61 24 09 ‐ Fax (33)‐4 67 61 37 87 [email protected] Keywords : SERM, Amino‐terminal Domain, transcription regulation, stable cell lines. 128
ABSTRACT
Estrogens regulate important physiological processes, which are mediated through
initial binding to the estrogen receptors (ER) α and β. Ligand induced transcription involves
the action of distinct transactivation functions (AFs) located in the N-terminal AB domain
(AF-1) and the C-terminal E/F domain (AF-2) of estrogen receptors. The respective
contribution of these AFs on ER activation depends on promoter and cell-type. Maximal
transcriptional activity of ER can require both AFs in some cells, but only a specific one in
others, suggesting a differential interaction of ER with the transcriptional machinery in cells.
Moreover, tissue selective activation of estradiol-responsive genes is dependent on ligand
structure. Indeed, ligands induce conformational changes in ER that affect interaction with
coactivators, cointegrators and corepressors required for transactivation.
In this study, we evaluated the influence of AB domain of ERα and ERβ on the activity
of several natural and synthetic estrogens. Reporter cell lines derived from HELN cells (HeLa
cells stably transfected with an ERE-driven luciferase plasmid) expressing wild type or
deleted AB domain ERα and ERβ were used.
We report that ERβ AB domain mediates a repressive function in the context of HeLa
cells. Furthermore we demonstrate that genistein, alpha-zearalenol, 3alpha-hydroxytibolone
and Ferutinine display partial to total AF-1 dependency.
Together these results demonstrate the usefulness of our stably transfected cell lines to
characterize the partial or full agonists activity on estrogen receptors AFs domains.
INTRODUCTION
Estrogens play important roles in regulating the growth, differentiation and function of
many reproductive tissues (Barkhem et al. 2004). In postmenopausal women, estrogens are
used in hormone replacement therapy (HRT) to prevent hot flashes, urogenital atrophy, and
osteoporosis. Unfortunately, HRT has been associated with an increased incidence of breast and
endometrial cancer. There is therefore a growing interest in the development of selective
estrogens receptor modulators (SERMs) and in using phytoestrogen as potential alternative to
the estrogens in HRT (Beck et al. 2005). Phytoestrogens can act as natural SERMs because they
may reduce but also stimulate estrogen-dependent tumor growth, depending on dose and timing
of exposure (Allred et al. 2001, Bhat & Pezzuto 2001). Moreover, they show estrogenic and/or
antiestrogenic activities (Mueller et al. 2004), and induce a differential recruitment of
coregulators to estrogen receptor (Leung et al. 2006, Hong et al. 2004).
129
Estrogen signal is known to be mediated by two receptors, estrogen receptor alpha
(ERα) and beta (ERβ), which are members of the nuclear receptors superfamily. ERα and
ERβ have similar affinities for estradiol (E2) and recognize a consensus estrogen response
element (ERE) (Weihua et al. 2003). Classically, the E2 activated receptors directly bind ERE
as homo- or heterodimers, and then recruit different types of transcription coactivators (Hall
& McDonnell 2005). However, the interaction of ER with target genes can occur indirectly
through recruitment by transcription factors such as AP-1 or Sp1 (Schultz et al. 2005).
ERs are structurally organized into six independent domains called A to F, each of which
encoding specific functions. The amino-terminal AB domain is involved in transactivation of
gene expression. The central C-domain contains two-zinc finger structure, which play an
important role in specific binding to DNA and in receptor dimerization. The carboxy-terminal
domain (or E/F domain) is crucial for ligand binding, nuclear translocation, receptor dimerization
and modulation of target genes expression in association with cofactors (Hanstein et al. 2004).
Transcriptional regulation by ERs involves two activation functions (AF) that reside on the
opposite ends of the receptor. AF-1 is located in the N-terminal region of the receptor whereas
AF-2 is present at the carboxy-terminal end of the E/F domain (Tora et al. 1989). Only AF-2
activity is entirely dependent on ligand binding and AFs can act in a promoter- and cell specific
manner. In some cells, maximal transcription activity of ERα can require both AFs, but only a
specific one in others (Cowley & Parker 1999). Whereas the molecular mechanisms of
transactivation involving the AF-2 of ERs are well understood, less is known about AF-1
transactivation mechanism (McDonnell & Norris 2002). It has been shown that the DEAD box
protein p68/p72 and SRA (steroid receptor RNA activator) enhance AF-1 transcriptional activity
(Watanabe et al. 2001, Deblois & Giguere 2003). However, some coactivators, like SRC-1 and
p300, that are known to mediate AF-2 activity could also interact with the N-terminal region of
ERs to mediate AF-1 activity (Kobayashi et al. 2000, Metivier et al. 2001).
Implication of the N-terminal region of ER may be responsible for interaction of SERM
with coactivators and corepressors (Lonard & Smith 2002). Indeed, SERMs exhibit mixed
antagonist-agonist tissue-specific activities, modulate ER expression, may alter ER
conformation and ligand binding, and change the expression or binding of coregulator proteins
(McDonnell 2004, Shang & Brown 2002). The 4-hydroxytamoxifen (OHTam) shows partial
ERα agonistic activity in certain cells, that can be attributed to the cell and promoter specificity
of AF-1 activity (Berry et al. 1990, Metzger et al. 1995, Tzukerman et al. 1994).
The present study focuses on the N-terminus of ERβ and its role in transactivation. The
N-terminal region of ERβ presents very poor sequence homology to that of ERα and is ~ 80
130
amino acids shorter (Delaunay et al. 2000). Thus, the variability in amino-terminal domain
sequence of ERs may explain a difference of activity between both receptors. We have
previously evaluated the ERα and ERβ selectivity of 19 known estrogens and antiestrogens
(Escande et al. 2006). In this study, we verified the full agonist activity of different ligands like
phytoestrogens or SERM. Using stably transfected HELN-ΔABERα or –ΔABERβ responsive
reporter cell lines, we observed that the AB domain of ERβ triggers a repressive function in the
HeLa cellular context. We also showed that ERβ AB domain is significantly important to
mediate the activity of genisteine, 3α-hydroxytibolone, and ferutinine.
MATERIALS AND METHODS
Materials
Materials for cell culture came from Life Technologies (Cergy-Pontoise, France).
Luciferin (sodium salt) was purchased from Promega (Charbonnières, France). [2,4,6,7,16,173
H]-E2 (41.3 Ci/mmol specific activity) was purchased from NEN Life Science Products
(Paris, France). 17-β estradiol (E2) (1,3,5[10]-estratriene-3,17β-diol), estrone (E1) (1,3,5[10]estratriene-3-ol-17-one), estriol (E3) (1,3,5[10]-estratriene-3,16α,17β-triol), 17α-ethynylestradiol (EE2) (17α-ethynyl-1,3,5[10]-estratriene-3,17β-diol), genistein (4',5,7-trihydroxyisoflavone), biochanin A (5,7-dihydroxy-4’-methoxyisoflavone), daidzein (4',7-dihydroxyisoflavone), coumestrol (2-(2,4-dihydroxyphenyl)-6-hydroxy-3-benzofuran carboxylic acid
lactone), α-zearalenol were purchased from Sigma Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France).
Ferutinine was from Funakoshi (Tokyo, Japan). 3α-hydroxytibolone (3α-OHtibolone)
[(3α,7α,17α)-7-methyl-19-norpregn-5(10)-en-20-yne-3,17-diol];
were
purchased
from
Organon (Oss, The Netherlands). 4- hydroxytamoxifen (OHTam) (1-[p-dimethylaminoethoxyphenyl]-1-(4-hydroxyphenyl)-2-phenyl-1-butene), ICI 182,780 (7α,17β-[9[(4,4,5,5,5pentafluoropentyl)sulfinyl]nonyl]estra-1,3,5(10)-triene-3,17-diol)
were
from
Zeneca
(Macclesfield, UK). Raloxifene (6-hydroxy-3-[4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenoxy]-2-(4hydroxyphenyl)-benzothiophene) was from Eli Lilly (Indianapolis, USA). RU486 ((11β,17β)11-[4-(dimethylamino)phenyl]-17-hydroxy-17-(1-propynyl)-estra-4,9-dien-3-one) was from
Sanofi-Aventis (Romainville, France). 3β,5α-NET was synthesized as already described
(Larrea et al. 2001). 4,4',4''-(4-propyl-[1H]-pyrazole-1,3,5-triyl)trisphenol (PPT) was
purchased from Tocris (Ellisville, USA). 8-vinylestra-1,3,5(10)-triene-3,17β-diol, named 8βVE2 was purchased from Research Laboratories of Schering AG (Berlin, Germany). These
131
-2
ligands were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 10 M. Successive dilutions were
performed in culture medium.
Vector constructs
pSG5ERαpuro and pSG5ERβpuro were already described (Balaguer et al. 2001).
ΔABERα puro was obtained by exchanging the fragment containing the ΔABERα sequence
from HEG19 vector (gift from P. Chambon) with fragment from pSG5puro vector (gift from
H. Gronemeyer). ΔABERβ puro was cloned by PCR from pSG5ERβpuro using the following
primers:
5’-GCGCGCGGATCCACCATGAAGAGGGATGCTCACTTCTGC-3’
5’-GCGCGCGGATCCTCACTGAGACTGTGGGTTCTG-3’.
The
PCR
product
and
was
subcloned into pSG5puro vector.
Cell lines
The stably transfected HELN ERα and HELN ERβ cell lines were already described.
Briefly, to generate HELN cells, we transfected HeLa cells with the ERE-βGlob-Luc-SVNeo
plasmid. HELN-ERα, HELN-ERβ, HELN-ΔABERα and HELN-ΔABERβ cell lines were
obtained by a second transfection of the corresponding pSG5puro plasmids (pSG5ERαpuro,
pSG5ERβpuro, pSG5ΔABERαpuro and pSG5ΔABERβpuro, respectively). Selection by
geneticin and puromycin was done at 1 mg/ml and 0.5 µg/ml, respectively. Luminescent and
inducible clones were identified with a photon counting camera (Argus 100 from Hamamatsu,
Japan or NightOWL LB 981 from Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) and the
most responsive clones were isolated.
Cell culture conditions
For the strain culture, HELN cell line was grown in phenol red containing Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1 g/l glucose, supplemented with 5% of fetal calf serum
(FCS) and 1% antibiotic (penicillin/streptomycin) in a 5% CO2 humidified atmosphere at
37°C. Because of phenol red and FCS estrogenic activity, HELN-ERα, HELN-ERβ, HELNΔABERα and HELN-ΔABERβ cell lines were grown in phenol red-free medium
supplemented with 6% dextran-coated charcoal (DCC)-treated FCS and 1% antibiotic
(penicillin/streptomycin) (6% DCC-FCS). Experiments were achieved in this 6% DCC-FCS
medium.
132
Ligand binding analysis
HELN-ERα, HELN-ERβ, HELN-ΔABERα and HELN-ΔABERβ cells were seeded at a
density of 105 cells/well in 24-well tissue culture plates and grown in 6% DCC-FCS. Cells
were labeled with 0.01-3 nM [3H]-E2 (41.3 Ci/mmol specific activity) at 37°C for 16h in the
absence or presence of 100 nM of non-radioactive E2. After incubation, unbound material
was aspirated and cells washed three times with 400 μl of PBS. Then, cells were lysed in 250
µl lysis buffer (400 mM NaCl, 25 mM Tris phosphate pH 7.8, 2 mM DTT, 2 mM EDTA,
10% glycerol, 1% triton X-100) for 5 min. Supernatant was mixed with 4 ml of LSC-cocktail
(Emulsifier-Safe, Packard BioScience) and [3H] bound radioactivity was counted (LS-6000SC, Beckman-Coulter, Roissy, France). Protein concentration was determined by Bio-Rad
protein assay.
Specific binding was determined by subtracting nonspecific binding from total binding
and free ligand concentration was estimated by subtracting total bound ligand from added
ligand. The dissociation constant (Kd) value was calculated as the free concentration of
radioligand at half-maximal binding by fitting data to the Hill equation and by linear
Scatchard transformation.
ERα and ERβ stable transactivation assays
HELN-ERα, HELN-ERβ, HELN-ΔABERα and HELN-ΔABERβ cells lines were
seeded at a density of 4.104 cells/well in 96-well white opaque tissue culture plates (Greiner
CellStar, D. Dutscher, Brumath, France) and maintained in 6% DCC-FCS. Compounds to be
tested were added 8 h later and cells incubated with compounds for 16h. Experiments were
performed in quadruplicate and repeated three times. At the end of the incubation, effector
containing medium was removed and replaced by 0.3 mM luciferin containing 6% DCC-FCS.
At this concentration, luciferin diffuses into the cell and produces a luminescent signal that is
stable from 5 min on. Intact living cell luminescence was measured for 2 s in a microplate
luminometer (Microbeta, Wallac). EC50 values were evaluated using Graph-Pad Prism
statistics software (version 5.0; Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA).
Fluorescence polarization assay
Fluorescent peptide (fluorescein-βA-686RHKILHRLLQGS698) corresponding to NR box
2-binding motif of SRC-1 was purchased from Neosystem (Strasbourg, France) and was
kindly provided by Vivian Pogenberg (CNRS U5048 – INSERM U554, Montpellier, France)
and described in Pogenberg et al., 2005 (Pogenberg et al. 2005).
133
The pET(A/THTEV*) -ERβ 255-509 and pET(A/THTb*)-ERα 302-552 were kindly
provided by Marc RUFF (IGBMC, Strasbourg, France). Recombinant ERα and ERβ ligand
binding domain were produced in BL21 DE3 electrocompetent Escherichia coli cells
(Promega, Charbonnières, France). Recombinant ERs were then purified on Ni-NTA-agarose
phase (Qiagen, Courtaboeuf, France). The concentration of active recombinant ERs were
measured by a [3H] 17β-estradiol ligand-binding assay.
Fluorescence anisotropy assays were performed using a BEACON 2000 polarization
instrument (Panvera Corp.) regulated at 4°C, using filters for fluorescein at a peptide
concentration of 2 nM. The assay solution for assays was 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM
NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM dithiothreitol, and 10% (v/v) glycerol. For the fluorescent peptide,
due to the rapid establishment of the equilibrium, the measurements were initiated at the
highest protein concentration, and then the sample was diluted successively by a factor of 2
with the buffer containing 4 nM of fluorescent peptide, allowing us to establish the titration
curve. For each titration point, anisotropy was measured successively until stabilized, and the
reported values are the average of five to eight measurements after stabilization. Binding data
were analyzed using the package BIOEQS (Royer et al. 1990).
Cell proliferation assays
HELN-ERα, HELN-ERβ, HELN-ΔABERα and HELN-ΔABERβ cells were plated
(5000 cells/well) in 24-well flat-bottom microtiter plates in 400 µl of 6% DCC-FCS. 24 h
later, medium was supplemented with compounds. Cells and ligands were incubated for 12 days
at 37°C with replenishment of ligands in fresh medium every 2 days. Cell number and viability
were determined by the use of a MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide) cell proliferation assay. At the end of experiment, cell medium was removed and
replaced by 400 μl of fresh medium containing 0.5 mg/ml MTT. Four hours later, precipitation
reaction was stopped, medium was removed and formazan salt was solubilized by adding 400
µl of DMSO. Solubilized formazan was then measured at 540 nm.
Western blot analysis
HELN-ERβ and HELN-ΔABERβ cells were treated with E2, ICI (10 nM), genistein, αzearalenol and ferutinine (1µM) for 24 hours. Cells were resuspended in 10 mM Tris-HCl, pH
7.4, 1.5 mM EDTA, and 10% glycerol containing a cocktail of protease inhibitors. Cells were
then lysed by cycles of freezing/thawing and the cellular debris were pelleted by centrifugation
at 13 000 g for 15 min. Proteins were quantified using the Bradford assay (Bio-Rad
134
Laboratories, Marnes, France). 50 µg of whole-cell extract proteins were subjected to SDS–
PAGE followed by electrotransfer onto a nitrocellulose membrane. The membranes were
satured in TBST buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, 5% dehydrated milk).
The blot was probed with specific antibodies for RARα (C-20, Santa Cruz Biotechnology) at a
1/500 dilution and actin (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) at a 1/2500 dilution
and then incubated according to the primary antibodies with antirabbit IgG horseradish
peroxidase conjugated antibodies (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) (1 mg/ml). An
ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington, IL, USA) was used for detection. The
chemiluminescence signals were scanned and analysed by PCBAS 2.09f.
RESULTS
Characterization of stable HELN-ERs reporter cell lines
The wild type ER cell lines HELN ERα and HELN ERβ were previously established in
our laboratory (Escande et al. 2006). The human cervix adenocarcinoma HeLa cell line,
which does not express endogenous ERs, was chosen as a host to generate stable reporter cell
lines to screen compounds that act via human ERα and/or ERβ. Briefly, generation of the
HELN-ΔABERα and HELN-ΔABERβ reporter cell lines was performed in two steps, as
follows. A luciferase reporter gene under the control of an estrogen responsive reporter gene
was first stably introduced into HeLa cells, generating the HELN cell line. In a second step,
HELN cells were transfected with either ΔABERα or ΔABERβ expression plasmid to obtain
the HELN- ΔABERα and HELN- ΔABERβ cell lines, respectively.
As shown in Figure 1A, receptor protein levels (ΔABERα or ΔABERβ) expressed in
each cell line was determined by saturation ligand binding assay. HELN-ΔABERα and
HELN-ΔABERβ expressed 109.5 fmol and 743.6 fmol of ER per mg of protein respectively.
Kd values, calculated from saturation curves, were 0.15 nM and 0.62 nM for ΔABERα and
ΔABERβ, respectively (Fig. 1A).
HELN-ERs cell lines showed E2-mediated luciferase gene transactivation whereas
HELN cell luciferase expression was not modulated (Fig. 1B), as previously reported
(Escande et al. 2006). The basal activity of HELN-ΔABERα and HELN-ΔABERβ (97 and
120× 104 RLU/mg of protein, respectively) was not reduced in presence of ICI 182,780, a
pure antiestrogen (85 and 95× 104 RLU/mg of protein, respectively). E2-mediated reporter
gene activity through ΔABERβ was dissimilar from those of ERα, ΔABERα and ERβ.
135
We compared natural estrogen (E2) dose response activity in HELN-ERα, HELN-ERβ,
HELN-ΔABERα and HELN-ΔABERβ cell lines (Fig. 1C, represented as % of maximal
activity obtained with 10 nM of E2). As previously reported (Escande et al. 2006), EC50
value for E2 was approximately 0.017 nM for ERα and 0.068 nM for ERβ. E2 displayed less
potency to transactivate ΔABERα and ΔABERβ, with EC50 values of 0.034 nM and 0.22 nM,
respectively.
Comparison of transactivation activities by ER ligands on ERs and ΔABERs responsive
cells
Our aim was to test several compounds for their estrogenic activity on ERs subtypes
deleted for their AB domain. Transactivation values for all tested compounds are shown in
figure 2, and represented as % of maximal activity obtained with 10 nM of E2.
We first tested natural estrogens estrone (E1) and estriol (E3) since these E2 metabolic
products are still capable of exerting various biological actions. E2, E1 or E3 transactivation
potencies were even improved by the deletion of ERβ AB domain (Fig. 2A).
We next tested selective agonists ligands PPT (4-propyl-1,3,5-tris(4hydroxyphenyl)
pyrazole) and an estradiol derivative, 8β-vinyl estradiol (8β-VE2), which are described as ERsubtype selective ligands. The member of the triarylpyrazole class (PPT) was found to have
the same transactivation capacity for ERα and ΔABERα. On the opposite, PPT had no activity
for ERβ or for ΔABERβ. 8β-VE2 showed a better activity for ΔABERβ than for wild type
ERβ, and a lack of affinity for ERα or ΔABERα (Fig. 2B).
We then tested synthetic ligands 17α-ethynylestradiol (EE2), a 3β,5α-tetrahydro
derivative of norethisterone (NET) and 3α-hydroxytibolone, a tibolone metabolite. The
transactivation activity of EE2 for ERα was equivalent to that for ERβ. The transactivation
potency was as strong as that of E2 for ΔABERβ confirming it is a full agonist ligand. The A
ring reduced metabolite of 19-nor synthetic progestins (3β,5α-NET) did not show any
modification of transactivation potency for ΔABERβ. The 3α-hydroxytibolone is a synthetic
steroid compound with relatively weak hormonal activity. After oral administration, it is
rapidly absorbed and converted by the liver into 2 estrogenic metabolites (3α- and 3β-OHtibolone), which bind to the ER. The deletion of ERβ AB domain did not influence its
transactivation potency (Fig. 2C).
We subsequently tested phytoestrogens which are plant constituents exhibiting
structural similarities with endogenous estrogens. Biochanin A and its metabolite genistein,
coumestrol and daidzein had a higher activity for ERβ than for ERα. Interestingly, the
136
deletion of ERβ AB domain had a partial effect on genistein and coumestrol transactivation
efficacy. On the contrary, biochanin A and daidzein had no potential effect on ΔABERβ.
Ferutinine, a sesquiterpenoid derived from the Umbelliferae family was an ERβ partial
agonist. This ligand lost its partial activity with ΔABERβ. We also tested a mycoestrogen, αzearalenol, which had the same potential activity with ΔABERβ and ERβ (Fig. 2D).
Last, we tested transcriptional response of ERs and ΔABERs to antiestrogens (Fig. 2E).
We did not observe any difference between ERs and ΔABERs responses to OHTam, ICI
182,780, Raloxifene or RU486.
We demonstrated that ligands known to be full agonists had the same transactivation
potency in ΔABERβ cell line compared to ERβ cell line. Interestingly, partial agonist ligand
transactivation was affected by AB domain deletion.
For the rest of our experiments, a representative ligand of these various responses to AB
domain deletion was chosen, i.e. estradiol, genistein, 3α-hydroxytibolone and ferutinine.
Analysis of natural agonist ligand selectivity on transcriptional activity
We tested the compounds previously chosen for their decreasing activities on ΔABERβ
in dose-titrations responses, on ERβ and ΔABERβ cell lines, and calculated their EC50.
Results showed that genistein EC50 value was 5.6 nM in HELN-ERβ cell line, and 12
nM in HELN ΔABERβ cell lines (Fig. 3A).
We then tested the activity of tibolone metabolite, 3α-hydroxytibolone (Fig. 3B). It fully
activated ERα (Escande et al. 2009) and with a lower affinity, ERβ (EC50 95 nM).
Interestingly, its activity was partially dependent on ERβ AF-1 domain, since its deletion
induced a lack of transactivation activity (EC50 127 nM)
Last, Ferutinine was tested on ΔABERs cell lines (Fig. 3C). This compound showed an
ERβ partial activity. When ERβ AB domain was deleted, Ferutinine lost its partial activity.
We reported thus a gradual efficiency of transactivation on ERβ and ΔABERβ by tested
ligands, i.e. genistein, 3α-hydroxytibolone and ferutinine.
Role of genistein, 3α-hydroxytibolone and Ferutinine in the recruitment of SRC-1
coactivator
The efficiency of ER agonists depends on the ability to induce the active receptor
conformation of the receptor to recruit the coactivator proteins such as SRC-1. We therefore
examined if the efficiency of the different agonists for SRC-1 recruitment correlated with the
transactivation potency seen in ERβ cell line. We measured the affinity of SRC-1/ERβ
137
interactions in the presence of E2, genistein, 3α-hydroxytibolone and ferutinine. The data were
fit to a simple model of one ER dimer binding to one SRC-1 monomer (Margeat et al. 2001),
and the Kd values are given in Table 1. No interaction between ERβ and SRC-1 was observed
in the absence of ligand (data not shown). The Kd values for E2, genistein and 3αhydroxytibolone were similar, and higher than Kd value for ferutinine, showing that genistein
and 3α-hydroxytibolone were much more efficient for recruiting SRC-1 to ERβ than ferutinine.
Effect of ligands on dependent-ER cell proliferation
In order to characterize the physiological role of genistein, 3α-hydroxytibolone and
ferutinine, we measured the proliferation of cells expressing truncated or wild type receptors.
In the stable HELN-ERs reporter cell lines, E2 strongly inhibited the proliferation. The total
cell content was reduced by 50% after 12 days of treatment, relative to that of untreated
HELN-ER cells. On the opposite, ICI had no effect on proliferation, at the concentration
tested. HELN cell line proliferation was not affected by any compound (Fig. 4). The
proliferation rate induced by estrogenic compounds in HELN-ERα cells was 52%, 50%, 55%
and 58% for E2, genistein, 3α-hydroxytibolone, and ferutinine, respectively. It was almost
similar in HELN-ΔABERα cells. Antiproliferative effect of genistein, 3α-hydroxytibolone and
ferutinine was abolished on HELN-ΔABERβ cells compared to HELN-ERβ cells (a
proliferation level of 76% compared to 110% for ferutinine, 56% compared to 87% for 3αhydroxytibolone, 51% compared to 82% for genistein on ERβ versus ΔABERβ, respectively).
The results correlated with the potency of transactivation observed between ERβ and
ΔABERβ. We showed that partials agonists need ERβ AB domain to have a strong effect on
cell proliferation.
Previous studies have described genistein and OHTam as partial agonists (Pike et al.
1999, Barkhem et al. 1998). The agonistic effect of OHTam proceeds through ERα, this effect
is not being observed with ERβ (McInerney et al. 1998). It was reported that this activity is
cell type and promoter context specific. We observed, in our model, a decrease in HELN-ERα
proliferation rate exposed for 12 days with OHTam, an effect abolished in ΔABERα (75%
with ERα compared to 103% with ΔABERα).
RARα protein expression modulation by ligands on HELN-ERβ cell lines
We last studied the effect of genistein, 3α-hydroxytibolone and ferutinine on the control
of an endogenous E2 target protein expression, RARα, in HELN-ERβ and HELN-ΔABERβ
(Fig. 5).
138
In HELN-ERβ cells, genistein and E2 moderately increased RARα protein levels (1.5
and 1.4 fold over EtOH respectively) whereas 3α-hydroxytibolone and ferutinine exhibited no
enhancement of RARα
(1.2 and 0.9 fold over EtOH respectively). ICI was not able to
promote protein level increase (0.7 fold over EtOH). In HELN-ΔABERβ, RARα protein level
was enhanced by treatment with E2 (3.9 fold over EtOH) and even with genistein and 3αhydroxytibolone (3.7, 3.3 over EtOH respectively), while ferutinine and ICI were no effective
(1.4 and 1.2 fold over EtOH respectively). We reinforce the hypothesis of a repressive effect
of ERβ AB domain, since ligands like E2, genistein and 3α-hydroxytibolone enhanced RARα
expression in HELN-ΔABERβ. Interestingly, this effect was not observed with partial agonist
ligand ferutinine.
DISCUSSION
The action of a particular estrogenic ligand is determined by three main components:
first, the structure of the ligand itself, second the ER isoform, and finally, the interaction of
this complex with an array of cofactors (Katzenellenbogen & Katzenellenbogen 2000).
We have previously used reporter cell lines expressing human ERα or ERβ to analyze
specificities in term of binding and transcriptional activation of ERα and ERβ (Escande et al.
2006). In the present study, we used cell lines derived from the same parental cell line, thus
with a responsive gene in the same chromatin environment, to express ERα and ERβ deleted
from their AB domain.
We observed an increase in ΔABER expression compared to wild type receptors cell
lines, with a 2-fold expression for ΔABERα and a 14-fold expression for ΔABERβ protein. It
has been previously described that the lack of amino terminal region induces a decrease of
receptor degradation (Picard et al. 2008, Valley et al. 2005, Tateishi et al. 2006). Since the
removal of amino terminus enhanced ERs expression rate, an increase of transactivation
induction cannot be excluded. Indeed, it was proposed that ERβ contains a repression domain
within its amino terminus that, when removed, increases the efficiency of the receptor to
induce transcription (Hall & McDonnell 1999, Delaunay et al. 2000). Another work proposed
that ERβ amino terminus could impair the ERE binding (Huang et al. 2005).
139
In this study, we showed that E2 seemed to be a weaker activator of both ΔABERs than
of full-length ERs. The difference of EC50 between ERs and ΔABERs was consistent with
the Kd values.
ERβ AF-1 and AF-2 domains are required for full activity in HeLa cells, even if these
cells were described to be predominantly sensitive to AF-2 for ERα (Metivier et al. 2001).
Interestingly, we found that ΔABERβ was more transcriptionally active than wild type ERs in
transiently transfected HeLa cells, as previously reported (Hall & McDonnell 1999). Our data
provide evidence for a functional importance of the ERβ AB domain in environments in
which ERα AF-2 is known to be sufficient. Experiments demonstrated that AF-1 and AF-2
contribution to the respective activities varied in a cell differentiation stage-dependent
manner. Yet, the stable expression of a functional ERα in strictly AF-2 permissive cells has
restored an AF-1 sensitive cell context (Merot et al. 2004). These observations drove us to
characterize the AB domain role in the HeLa stable cell lines.
We hypothesized that AB domains were essential for the transactivation of partial agonist
ligand, since the region is critical for the properties of SERMs. To address this question, we first
tested selective ERα and ERβ ligands on the truncated receptor containing cell lines.
The deletion of ERα AB domain produces little if any effect on potency transactivation.
On the contrary the activity of some compounds was affected when deleting ERβ AB domain.
Whereas genistein and biochanin A phytoestrogens were full agonists for ERα and ERβ, they
became partial agonists in ΔABERβ cell line. This suggests that biochanin A and genistein are
partial agonists, since they need the two AFs to act in a synergistic manner. It is interesting to
note that the crystallography structure shows that genistein adopts a partial agonist
conformational rather than a full agonist conformation (Pike et al. 1999). Tibolone appears to
be effective at reducing climacteric symptoms and bone loss, but its effects on sexual
function, lipids, and breast are less clear and await more definitive trials. In HELN cell lines,
3α-hydroxytibolone metabolite fully activated ERα and also ERβ, although with a lowest
potency. Interestingly its activity was partially dependent on ERβ AF-1 domain, because
removal of ABERβ domain induced transactivation loss. Ferutinine, another phytoestrogen,
presented an ERα full agonism and an ERβ partial activity, as was shown by Ikeda (Ikeda et
al. 2002). When ERβ AB domain was deleted, Ferutinine lost its partial activity. On the
contrary, ERα AB domain was dispensable for ferutinine activition of ERα. As it was
previously observed for OHTam towards ERα, the partial agonism of ferutinine, 3α-
140
hydroxytibolone and genistein seemed to be due to the ERβ AF-1 domain. That argues in
favor of a great importance for ERβ AB domain, even if it is smaller than ERα AB domain.
We then examined the differential effect of partial ER agonists on their capacity for
recruiting SRC-1 coactivator. We showed that genistein and 3α-hydroxytibolone recruited the
coactivator to ERβ more efficiently than did ferutinine.
In the presence of full agonist ligands, ERβ AF-2 alone is able to promote a full response.
Nevertheless the presence of AB repression domain affected this strong activity. In the
presence of partial agonist ligand, AF-2 alone was not sufficient and cooperation between AF1 and AF-2 enabled the induction of a full response.
As AF-1 is an important transcriptional function implicated in the overall activity of
ER, it seems to be essential to have a better understanding of the behaviour of partial
agonistic compounds on endogenous responses. Proliferation experiments in HeLa cell lines
expressing ERα, ERβ, ΔABERα or ΔABERβ revealed that estradiol inhibited the
proliferation, whereas ICI had no effect. A preventing effect of estradiol on the growth of ERtransfected cell lines has been reported in other ER negative cell types (Garcia et al. 1992).
Moreover, we demonstrated that the AB domain was required for partial agonist proliferation
inhibition. Thus, this assay with HELN-ERs cell lines allowed a ranking of the
antiproliferativity induced by E2, genistein, 3α-hydroxytibolone and ferutinine.
A previous study demonstrated that an ERE, located in the first intron of the RARα gene is
strongly bound by ERα in vitro and in vivo (Laganiere et al. 2005). By analyzing the
expression of RARα protein, we showed that the AB domain was essential for mediating
Ferutinine partial responses.
Altogether, our data underline that in the absence of AB domain, phytoestrogens and
SERM transactivate ERβ less efficiently than E2, whereas its absence did not change ERα
activity. The results were demonstrated on reporter and endogenous genes. Thus, our results
raise the interesting possibility that the activity of ERβ AF-1 is more important than that of
ERα, in HeLa cells. It remains to be seen whether these differences are also evidenced in a
transactivation assay system using different cellular backgrounds, for example, in HepG2
cells, which are almost entirely sensitive to ERα AF-1 (Metivier et al. 2001).
Ours cells, with their specific estrogen responsive reporter genes (Pillon et al., 2004),
will certainly be useful tools for the identification of new SERMs. These drugs offer great
141
promise for the development of optimal hormone replacement therapy for women, an
approach that might avoid stimulation of breast cancer while, at the same time, would
effectively treat menopausal symptoms, reduce post menopausal bone loss and perhaps reduce
the risk of cardiac disease.
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144
FIGURE LEGENDS
Fig. 1. Characterization of HELN-∆ABERα and HELN-∆ABERβ stably transfected cell
lines
A- Binding of [3H]-E2 to ∆ABERα (●) and ∆ABERβ (▲) in presence or absence of an excess
of E2. Specific bound counts were calculated by subtracting non specific counts from total
bound counts. Inset, Scatchard analysis of specific binding giving a Kd of 0.15 and 0.62 nM
for ∆ABERα and ∆ABERβ, respectively.
B- Stable luciferase gene expression in the HELN, HELN-∆ABERα and HELN-∆ABERβ
cell lines. Relative light units were normalized by mg of protein. Results are expressed as
104 RLU/mg of proteins.
C- Transcriptional activity of ERα, ERβ, ∆ABERα and ∆ABERβ in response to estradiol.
HELN-ERα (●), HELN-ERβ (■), HELN-∆ABERα (○) and HELN-∆ABERβ (□) cell lines
were treated with E2 at the indicated concentrations for 16h. RLU stands for relative
luciferase unit. Values are mean ± SD from three separate experiments.
Fig. 2. Maximum activities of compounds on HELN-ERα, HELN-ERβ, HELN-ΔABERα
and HELN-ΔABERβ transactivation in whole cell analysis
All cell lines were treated with E2 and ICI at 0.01 µM and the other compounds at 1 µM for
16h. Values are mean ± S.D. from three separate experiments.
Fig. 3. Transcriptional activity of ERβ and ∆ABERβ in presence of partial agonists
HELN-ERβ (●) and HELN-∆ABERβ (○) cell lines were treated for 16 h with genistein (A),
3α-hydroxytibolone (B) and ferutinine (C) at indicated concentrations.
Fig. 4. Effect of ERα and ERβ amino-terminal deletion on cell proliferation
HELN, HELN-ERα, HELN-ERβ, HELN-ΔABERα and HELN-ΔABERβ cells were plated at
5000 cells/well. One day after plating, medium was supplemented with EtOH, E2 (10 nM),
ICI (10 nM), genistein (1 µM), 3α-hydroxytibolone (1 µM), and ferutinine (1 µM).
Cells and ligands were incubated for 12 days with replenishment of ligands in fresh medium
every 2 days. Cell number and viability were determined by the use of MTT.
145
Fig. 5. Effect of ERβ amino-terminal deletion on RARα protein expression
Western blot analysis of RARα protein expression in HELN-ERβ, and HELN-∆ABERβ. Cells
were treated with EtOH, E2 (10 nM), ICI (10 nM), genistein (1 µM), 3α-hydroxytibolone (1
µM), and ferutinine (1 µM) for 24h. The blots were scanned and quantified by PCBAS 2.09f.
TABLE LEGENDS
Table 1: Binding of ERβ to Alexa labeled SRC-1686-698 in the presence of a variety of
agonists. Ligands were added to buffer at sufficient concentration to saturate receptor and
fluorescent peptide concentration was 4 nM. For sample preparation, dilutions were initiated
at the highest protein concentration (1 µM) and sample was diluted ten times successively, by
a factor 2, in 4 nM fluorescent peptide and ligands containing buffer, at 4°C to avoid
recombinant ERβ degradation. Fluorescent peptide (fluorescein-βA-686RHKILHRLLQGS698)
corresponding to NR box 2-binding motif of SRC-1.
146
FIGURES
147
148
149
150
151
152
Articles et travaux de thèse EFFET DIFFERENTIEL DES RECEPTEURS DES ŒSTROGENES ALPHA ET BETA SUR LA TRANSACTIVATION ET LA PROLIFERATION CELLULAIRE DANS UN CONTEXTE OVARIEN. Présentation de l’article : ERα/ERβ ratio influence estrogen receptor ligand induced transactivation and proliferation of human BG1 ovarian cancer cells. Garcia A, Busson M, Bellet V, Escande A, Muhn P, Cavaillès V and Balaguer P. Afin d’étudier les interférences transcriptionnelles entre le REα et le REβ, j’ai essayé d’exprimer le REβ constitutivement dans deux lignées cellulaires REα positives, les MCF‐7 (cancer du sein) et les BG1 (cancer de l’ovaire). L’établissement de la lignée MCF‐7 surexprimant le REβ n’a pas été possible. Par contre, nous sommes parvenus à établir différents clones BG1 qui surexpriment le REβ. Ce travail s’est déroulé en deux étapes successives. Dans un premier temps j’ai établi la lignée BELZ, obtenue par co‐transfection de la lignée BG1 avec le plasmide rapporteur ERE3‐TATA‐Luc et le plasmide PCDNA3‐Zéo (conférant la résistance à la zéocine pour procéder à la sélection des clones). Cette lignée cellulaire exprime le REα de manière endogène et possède le gène de la luciférase qui s’exprime sous le contrôle des ligands œstrogéniques via l’ERE. Dans un second temps, nous avons transfecté la lignée BELZ avec le plasmide qui permet l’expression du REβ (pSG5‐ERβ‐
Puro), et nous avons sélectionné ainsi plusieurs clones surexprimant le REβ. Les deux clones que nous avons choisi pour procéder à notre étude expriment donc le REα de manière endogène, et présentent deux niveaux d’expression différents du REβ que nous avons introduit. Ainsi nous avons pu procéder à des études de transactivation de l’ERE par le REα et par le REβ ainsi que de prolifération cellulaire dans ces lignées, en présence de divers ligands sélectifs synthétiques et de ligands environnementaux. En utilisant les ligands sélectifs du REα et du REβ que nous avions caractérisé (Escande et al., 2006), nous avons montré que la transactivation et la prolifération cellulaire sont 153
Articles et travaux de thèse différemment régulées par les deux récepteurs dans les lignées cellulaires BELZ et BELZ‐
ERβ. Ceci avait précédemment été démontré par Sotoca et coll., dans un contexte cellulaire de cancer mammaire (Sotoca et al., 2008b). De plus, les effets des ligands sélectifs sont différents suivant l’expression relative des deux récepteurs, ce qui permet de penser que dans le modèle cellulaire ovarien que nous avons généré, les récepteurs existent sous forme d’homodimères ou d’hétérodimères. D’autre part, ces lignées ovariennes REα positives surexprimant ou non le REβ, nous ont permis de mettre en évidence l’influence du ratio REα/REβ sur la transactivation et la prolifération cellulaire induites par différents xéno‐œstrogènes. Nous avons ainsi pu démontrer que lorsque le REβ est exprimé (lignée BELZ‐ERβ), les ligands environnementaux sélectifs du REα induisent une transactivation et une prolifération cellulaire plus élevées que les ligands environnementaux sélectifs du REβ. Ceci suggère que, de même que pour les ligands synthétiques, le ratio REα/REβ détermine la réponse fonctionnelle aux ligands sélectifs environnementaux. Ce ratio semble ainsi jouer un rôle important dans les effets des ligands environnementaux sur la prolifération cellulaire, et pourrait permettre d’expliquer l’influence des xéno‐œstrogènes sur les cancers hormono‐dépendants. Nous avons également réussi à obtenir une lignée BG1 qui exprime de façon inductible le REβ (BG1‐Tet off‐ERβ). Nous vérifierons sur cette lignée cellulaire, en faisant varier le taux de REβ, que nous reproduisons bien les effets observés sur les clones exprimant constitutivement le REβ. Cette lignée pourra également nous permettre l’étude in vivo de l’effet de ligands œstrogéniques sélectifs, en combinaison avec d’autres traitements, sur la prolifération tumorale. 154
ERα/ERβ RATIO INFLUENCES ER LIGANDS INDUCED TRANSACTIVATION AND PROLIFERATION IN HUMAN BG1 OVARIAN CANCER CELLS. Running title : ERβ decrease ERα activity in the BG1 ovarian cell line. Aurélie Garcia1, Muriel Busson1, Virginie Bellet1, Aurélie Escande2, Peter Muhn3, Vincent Cavaillès1, Patrick Balaguer1* IRCM, Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, Montpellier, F‐34298, France; 1
INSERM, U896, Montpellier, F‐34298, France ; Université Montpellier 1, Montpellier, F‐34298, France; CRLC Val d’Aurelle Paul Lamarque, Montpellier, F‐34298, France. UMR 5569 Hydrosciences, Université Montpellier 1, Av. Charles Flahault, 34060 2
Montpellier, France. Research Laboratories of Schering AG, D‐13342, Berlin, Germany. 3
* Corresponding author: Dr P. Balaguer, Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, Montpellier, F‐34298, France; INSERM, U896, Montpellier, F‐34298, France. Tel. (33) 467 61 24 09 Fax: (33) 467 61 37 87. E‐mail: [email protected] Keywords: estrogen receptor α and β, cancer cell proliferation, estrogen induced transactivation.
155
ABSTRACT
Breast and ovarian hormono-dependant cancer cells show overexpression of estrogen
receptor (ER) α relative to ERβ compared to normal tissues. This observation has leaded to
the hypothesis that ERβ may modulate the proliferative effect of ERα. In this study, we
investigate the effects of the variation of the ERα/ERβ ratio on ERs selective pharmaceutical
and environmental compounds induced transactivation and cell proliferation in an ovarian
cancer cell line. As there is a lack of suitable ovarian cell lines for studying the function of
ERβ, we first stably transfected the ovarian ERα positive BG1 cell line by an estrogen
responsive luciferase gene (BELZ cell line). In a second time, we transfected the BELZ cells
by an ERβ expression vector. Two clones expressing different amounts of ERβ were selected
and used for our studies.
To precise ERα and ERβ effects on transactivation and proliferation in wild-type and ERβ
expressing BELZ cells, we used E2 and selective pharmaceuticals estrogens (16α-LE2, PPT,
8β-VE2, DPN) identified by Hela ERα and ERβ reporter cells previously established in the
laboratory. We observed that E2-induced transactivation and cell proliferation in BELZ native
cells were reduced when ERβ was expressed, and that the level of inhibition was dependant
on the level of expression of ERβ. We also observed that ERα selective ligands responses
were less inhibited than ERβ selective or panagonists ligands. However, in presence of ERβ,
ERβ selective ligands (8β-VE2, DPN) partially induced transactivation and cell proliferation
although they were less potent than ERα selective ligands. Thus, the potency of these ligands
depends on the ERβ expression and could be explained by a variation of ERs homodimers and
heterodimers in the cells. Finally, we tested the activating and proliferative effects of some
ER selective environmental compounds (17α-ethynyl estradiol (EE2), benzophenone 2,
genistein, chlordecone) in the different BELZ reporter cell lines. Xenoestrogens with ERα
selectivity (EE2, Chlordecone) were found more active on transactivation and cell
proliferation than xenoestrogens with ERβ preferential ligands (genistein, benzophenone 2).
Again we found that the ERα/ERβ ratio influence the activity of ligands with ERs preference
indicating that this criteria need to be taking in account to evaluate xenoestrogens effects.
156
INTRODUCTION
Steroid hormones, such as estrogens, are required for normal developmental, physiological,
and reproductive processes in vertebrates (Harris, 2006). Many of these events are modulated
by both ERα and ERβ activity (Pearce and Jordan, 2004; Pettersson et al., 2000). These two
receptors are encoded by distinct genes and differ in their relative and absolute tissue
distribution (Nilsson et al., 2001). In the absence of estrogen, ERs are sequestered within the
nucleus and preserved in an inactive state by association with heat-shock proteins (Dauvois et
al., 1993). Binding of estrogen or estrogen-like compounds induces a conformational change in
the receptor, an event that promotes ER homo- or hetero-dimerization (Matthews and
Gustafsson, 2003). Once the ER protein complex is bound to the DNA, it regulates the
expression of estrogen-responsive genes. The ER homo- and hetero-dimers activate different
signaling pathways and, therefore, different sets of genes (Acconcia et al., 2004; Li et al., 2004;
Warner and Gustafsson, 2006).
During the last few years, an increasing number of studies have reported that xenobiotic
compounds from different sources are able to mimic the natural estrogens, thus exerting
comparable effects by activating gene transcription through ERα and/or ERβ (Effenberger et al.,
2005; Escande et al., 2006; Gutendorf and Westendorf, 2001; Molina Molina et al., 2008;
Sonneveld et al., 2006; ter Veld et al., 2006; van der Woude et al., 2005). Estrogens stimulate cell
proliferation in normal developing breast tissues and may prevent osteoporosis by increasing bone
mineral density (Douchi et al., 2007). However, several studies also suggest that estrogens may
stimulate the growth of a large proportion of ERα positive breast cancers (Hartman et al., 2006;
Lazennec, 2006; Monroe et al., 2005; Pedram et al., 2006; Weitzmann and Pacifici, 2006). It has
been shown that the ERα/ERβ ratio is higher in breast tumors than in normal tissues due to lower
expression of ERβ (Lazennec et al., 2001) and that ERα and ERβ are antagonistic to each other.
For example, ERβ appears to reduce the cell proliferation induced by ERα activation, as shown in
transient (Bardin et al., 2004; Stossi et al., 2004) or stable cell transfection studies (Strom et al.,
2004; Murphy et al., 2005). Breast cancer cell lines have been used for these studies, MCF-7
cells, which have a high ERα/ERβ ratio (Buterin et al., 2006; Murphy et al., 2005; Sartippour et
al., 2006), or T47D cells, with ERβ tetracycline-dependant expression (Strom et al., 2004; Sotoca
Covaleda et al., 2008a; 2008b). It has been proposed that estrogen-like compounds effect on cell
proliferation is dependent on the actual ERα/ERβ expression levels in the cells or tissues and on
the potential of the estrogen agonists to activate ERα and/or ERβ. Since the discovery of the ERβ
157
potential to reduce ERα transactivation and proliferation, it appears essential to better understand
ERβ’s mechanisms and function as well as its therapeutic utility.
Ovarian cancer is, after breast cancer, the second most common gynecological cancer in
terms of incidence but the first one in terms of morbidity in Western countries (Greenlee et al.,
2000). A loss of ERβ expression or a decreased in ERβ/ERα ratio in ovarian cancer as
compared with normal tissues has been reported consistently by several groups (Brandnberger
et al., 1998; Pujol et al., 1998; Rutherford et al., 2000). Like for breast cancer, this loss of ERβ
could thus constitute a crucial step in ovarian carcinogenesis and hormone unresponsiveness.
The overall objective of the present study was to quantitatively determine the
proliferative/antiproliferative effects of selective ER pharmaceutical or environmental agonists
in BG1 human epithelial ovarian cancer cells in the presence of ERα
and various amounts of
ERβ. The pharmaceutical compounds studied were propyl-pyrazole-triol (PPT) and 16αLactone E2 (16α-LE2), selective ERα agonists, and diarylpropionitrile (DPN) and 8β-Vinyl E2
(8β-VE2), preferential ERβ agonists. For comparison and validation of the different cellular
model systems, estradiol (E2) was used in the studies as well. The natural ligand E2 is known to
stimulate both ERs, with an approximately 4-fold higher affinity for ERα than for ERβ (Kuiper
et al., 1998; Escande et al, 2006). DPN and 8β-VE2 were reported to have a 50-60-fold higher
relative binding affinity for ERβ than for ERα (Escande et al., 2006; Hillish et al., 2004; Sun et
al., 2003). PPT and 16α-LE2 have a reported 80-160-fold higher binding affinity for ERα than
for ERβ (Escande et al., 2006; Hillish et al., 2004; Stauffer et al., 2000). Selective
environmental estrogens were the contraceptive pill component 17α-ethynylestradiol (EE2) and
the pesticide chlordecone, selective ERα agonists, and the phytoestrogen genistein (GEN) and
the UV-screen benzophenone 2 (BP2), preferential ERβ agonists. Genistein and BP2 were
reported to have a 27-4-fold higher relative binding affinity for ERβ than for ERα (Escande et
al., 2006; Molina Molina et al., 2008). EE2 have a reported 6-fold higher binding affinity for
ERα than for ERβ (Escande et al., 2006). Chlordecone has a similar affinity for ERs, but is
agonist on ERα and antagonist for ERβ (Lemaire et al., 2006).
In wild-type BG1 cells, ERα was endogenously expressed while ERβ was not detected.
We generated BELZ-ERβ cells which are BG1 cells stably transfected with a constitutive
ERβ. Two clones with differents amounts of ERβ were selected (50, 95 fmol of ERβ per mg
of protein). In subsequent experiments, the effect of the selective pharmaceutical and
environmental compounds on transactivation and proliferation were studied in BG1-ERβ cells
158
to determine to what extent the estrogen-induced responses depend on the balance between
the two ER subtypes.
Chemicals and materials
Culture medium and calf serum (FCS) were obtained from Life Technologies Inc. (CergyPontoise, France). Geneticin and luciferin were purchased from Promega (Charbonnières,
France). [3H]-E2 (41.3 Ci/mmol specific activity) was purchased from NEN Life Science
Products (Paris, France). 17β-estradiol (E2), 17α-ethynylestradiol (EE2) (17α-ethynyl1,3,5[10]-estratriene-3,17β-diol),
chlordecone,
2,2’,4,4’-tetrahydroxybenzophenone
(BP2),
genistein
puromycin,
(4’,5,7-trihydroxyisoflavone),
and
methylthiazolyldiphenyl
tetrazolium bromide (MTT) were obtained from Sigma-Aldrich Inc. (St Louis, MO, USA).
ICI
182,780
(7α,17β-[9[(4,4,5,5,5-pentafluoropentyl)sulfinyl]nonyl]estra-1,3,5(10)-triene-
3,17-diol) were from Zeneca (Macclesfield, UK). 4,4’,4’’-(4-Propyl-[1H]-pyrazole-1,3,5triyl)trisphenol (PPT) and 2,3-bis(4-hydroxyphenyl)-propionitrile (DPN) were purchased
from Tocris (Ellisville, USA). 3,17-Dihydroxy-19-nor-17α- pregna-1,3,5(10)-triene-21,16αlactone, named 16α-LE2 and 8-vinylestra-1,3,5(10)-triene-3,17β-diol, named 8β-VE2 were
purchased from Research Laboratories of Schering AG (Berlin, Germany). Stock solutions
(10 mM) were prepared in dimethyl sulfoxide (DMSO), and successive dilutions were
performed in culture medium. Stock solutions were kept at -20°C and dilution series were
extemporaneously prepared before each experiment. All other chemicals were of the highest
quality available from commercial sources. A MicroBeta Trilux luminometer (EGG Wallac,
Turku, Finland) was used to detect luciferase activity in intact cells.
Reporter cell lines and culture conditions
The stably transfected luciferase reporter HELN ERα and ERβ cell lines were obtained as
already described (Balaguer et al., 1999). Briefly, these reporter cell lines were established in two
steps. An estrogen-responsive reporter gene was first stably transfected into HeLa cells, generating
HELN cell line (named HELN for HeLa-ERE-Luciferase-Neomycin) (ERE : estrogen responsive
element). In a second step, these HELN cells were transfected with ERα or ERβ plasmid constructs
(pSG5-ER-puromycin) to obtain the HELN ERα and ERβ cell lines, respectively.
159
The BELZ cell line was obtained by co-transfection of the estrogen-responsive reporter gene
ERE3-TATA-Luc (gift of Ingemar Pongratz, Huddinge, Swedish) and the zeocin resistance
conferring plasmid pCDNA3-zeo (Invitrogen, Cergy Pontoise France). BELZ ERβ clones 1 and
2 were obtained by stably transfection of BELZ cells by the ERβ plasmid construct. HELN cells
were cultured in DMEM, supplemented with 5% FCS (fetal calf serum), 1% antibiotics (PS,
penicillin streptomycin), and 1 mg/ml G418. BELZ cells were cultured in DMEM,
supplemented with 5% FCS, 1% antibiotics (PS), and 0.25 mg/ml zeocin. HELN-ERs cells
were cultured in DMEM-F12 without phenol red, supplemented with 5% dextran-coated
charcoal (DCC)-treated FCS (5% DCC-FCS), 1% antibiotic (PS), 1 mg/ml G418 (geneticin),
and 0.5 μg/ml puromycin. BELZ cells were cultured in DMEM-F12, supplemented with 5%
FCS, 1% antibiotics (PS), 0.25 mg/ml zeocin, 0.125 μg/ml puromycin and 1 nM PPT.
Because of phenol red and FCS estrogenic activity, experiments were performed in test
culture medium: DMEM-F12 without phenol red, supplemented with 5% DCC-FCS and 1%
antibiotic in a 5% CO2 humidified atmosphere. Experiments were carried out at 37°C. Test
culture medium was used in transactivation assays as well as competitive binding and
estrogen-dependent proliferation assays.
Transactivation assays
Agonistic activities of reporter cells were tested in the presence of increasing compounds
concentrations (1 pM to 10 μM). Tests were performed in quadruplicate for each
concentration. Results were expressed as a percentage of maximal luciferase activity for
HELN ERs cell lines. Maximal luciferase activity (100%) was obtained in the presence of 10
nM E2. Concerning the BELZs cell lines, ERE-induced transactivation by ligands was
expressed relative to vehicle control (DMSO) set at 1. For each compound, the estrogenic
potency corresponding to the concentration yielding half-maximal luciferase activity (EC50
value) was calculated.
Whole-cell ER competitive binding assays
BELZs and HELN ERs cells cells were seeded at a density of 2.105 cells per well in 24-well
tissue culture plates and grown in test culture medium. After 24 h, cells were labeled with 1 nM
[3H]-E2 (41.3 Ci/mmol specific activity) at 37°C for 3 h in the absence or presence of unlabeled
E2 (1 μM), 16α-LE2 (30 nM) and 8β-VE2 (30 nM). The final incubation volume was 500 μl,
and each well was tested in duplicate. After incubation, unbound material was aspirated and
cells washed three times with 500 μl of cold PBS. Then, 250 μl lysis buffer (400 mM NaCl, 25
160
mM Tris phosphate pH 7.8, 2 mM DTT, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X-100) was
added, and plates were shaken for 5 min. Total cell lysate (200 μl) was mixed with 4 ml of
LSC-cocktail (Emulsifier-Safe, Packard BioScience), and [3H] bound radioactivity was liquid
scintillation-counted (LS-6000-SC, Beckman-Coulter, Roissy, France). Non-specific binding
was determined in the presence of 100 nM unlabeled E2. Specific binding was calculated by
subtracting non-specific binding from total binding. Bound radioactivity values were expressed
in disintegrations per minute (dpm). Protein quantifications were carried out using the Bradford
assay (Bio-Rad laboratories, Marnes France).
BELZ and BELZ ERβ cell proliferation assays
Briefly, BELZs cells were seeded at a density of 103 cells per well in 96-well tissue culture
plates and grown in test culture medium. Test compounds were added 24 h after seeding. Cell
lines were incubated for 7 days at 37°C in the absence or presence of tested ligands with
replenishment of ligands in fresh test culture medium every 2 days. Each concentration was
performed in quaduplicate. After the incubation period, the medium containing test
compounds was removed and replaced by 200 μl of test culture medium containing 0.4 mg/ml
MTT. After incubation (2 h), viable cells cleaved the MTT tetrazolium ring into a dark blue
insoluble formazan reaction product whereas dead cells remained colorless (Slater et al.,
1963). The MTT-containing medium was gently removed and DMSO was added to each well.
After shaking, the plates were read in absorbance at 540 nm. Results were expressed as
induction factor with respect to the ligand-free control.
RESULTS
Characterization of selective ligands
The selectivity of PPT, 16α-LE2, DPN and 8β-VE2 for ERα and ERβ were already
studied in the ERα and ERβ HELN cells (Escande et al., 2006). Typical dose-response curves
for the natural ligand E2 as well for these selective ligands are shown in Figures 1A and 1B.
As previously demonstrated, E2 showed higher binding affinity for ERα than for ERβ, with
EC50 values of 17 and 72 pM, respectively, but E2 is clearly both an ERα and ERβ agonist.
The ER α selective ligand 16α-LE2 showed higher binding affinity for ERα than for ERβ,
with EC50 values of 90 pM and 93 nM, respectively. On the contrary, PPT was unable to
induce any transcription of the reporter gene in the HELN ERβcell line (Fig. 1B).
161
Furthermore, PPT is able to antagonize E2 induced transactivation indicating that it is an ERβ
antagonist (data not shown). The EC50 for the ERα-dependent response of PPT and 16α-LE2
were 85 and 90 pM respectively (Fig. 1A).
As expected, DPN and 8β-VE2 showed ERβ preferential selectivity with EC50 values of
2.3 and 0.2 nM for ERβ and 27 and 15 nM for ERα, respectively. Nowadays, a more selective
ER β agonist could not be identified, and the ER specificity of DPN and 8 β-VE2 in the
HELN cells were at least higher than that of E2 since the ratios of the EC50 for ERα and the
EC50 for ERβ activation are, respectively, 0.25, 11.7 and 75 for E2, DPN and 8β-VE2.
Characterization of BELZ and BELZ ERβ reporter cell lines
The ovarian cancer BG1 cells were firstly stably transfected by an estrogen-responsive
luciferase gene (BELZ cell line). BELZ ERβ clones 1 and 2 were obtained by stably
transfection of BELZ cells by an ERβ expression plasmid. ERα and ERβ expression was
quantified in these cells by “whole-cell” binding. As shown in Fig. 2, receptor protein level
(ERα or ERβ) expressed in HELN ERα and ERβ, BELZ, BELZ ERβ 1 and ERβ 2 cell lines
was determined by saturation ligand-binding assay with [3H]-E2, 1 nM with and without 16αLE2 or 8β-VE2, 30 nM. As already described, HELN ERα and ERβ expressed 52.6 and 43.1
fmol of ER per mg of protein, respectively (Escande et al., 2006). Unlabelled 16α-LE2 (and
not 8β-VE2) prevented the binding of [3H]-E2 to ERα in HELN ERα. On the contrary,
unlabelled 8β-VE2 (and not or slightly, 16α-LE2) prevented the binding of [3H]-E2 to ERβ in
HELN ERβ. The same experiment performed in BELZ demonstrated that these cells express
predominantly ERα and in the same range than HELN ERα. On the contrary, BELZ ERβ 1
and ERβ 2 cells express ERα and ERβ. In BELZ ERβ 1, ERα and ERβ seems to be expressed
in a similar manner (approximately 50 fmol per mg of protein) while in BELZ ERβ 2, ERβ
(approximately 90 fmol per mg of protein) is more expressed than ERα.
E2 and selective ligands induced transactivation of BELZ and BELZ ERβ cells
We then tested the activating effects of E2 and selective ligands in the BELZ and BELZ ERβ
cell lines (Fig. 3A, 3B, and 3C). In BELZ cells, the ERα and ERβ selective compounds at
concentrations at which they bind ERα are as effective in transactivation as E2 (Fig. 3A). These
results are similar with those obtained in the HELN ERα
cells, indicating that in BG1 native
cells, ERα is the main mediator of estrogenic responses. In the BELZ ERβ clones (Fig. 3B and
162
3C), ERα selective compounds were more active than E2 and ERβ selective ligands. Moreover,
their induction factor was decreased compared to BELZ cells and the reduction of the induction
factor enhanced in the clone expressing the higher level of ERβ. Curiously, 16α-LE2 was more
active at concentrations lower than 1 nM (ERα selective) than at higher concentrations where it
activated both ERα and ERβ. This may indicate that ERα-mediated transactivation is reduced
by ERβ activation. Finally, ERβ selective compounds partially induced luciferase expression at
a concentration at which they only bind ERβ. This observation suggests that, at these
concentrations, these compounds activated ERE-transactivation through ERβ. Altogether, these
results indicated that ERβ reduce estrogen-induced luciferase expression, and that ERβ
compounds are less active than ERα.
Characterization of the selectivity of the environmental compounds
The ER selectivity of four environmental compounds, EE2, Chlordecone, genistein and BP2
was already studied in the ERα and ERβ HELN cells (Escande et al., 2006; Lemaire et al., 2006;
Molina Molina et al., 2008). Typical dose-response curves for these environmental compounds
are shown in figure 4A and 4B. As previously demonstrated, EE2 showed higher binding affinity
for ERα than for ERβ, with EC50 values of 8 and 250 pM, respectively. Chlordecone was only
able to induce transcription of the reporter gene in the ERα HELN cell line. Furthermore,
chlordecone was able to antagonize E2-induced transactivation in the HELN ERβ cell line
indicating that it is an ERβ antagonist (Lemaire et al., 2006). As previously described (Escande et
al., 2006; Molina Molina et al., 2008), genistein and BP2 showed ERβ selectivity with EC50
values of 5.8 and 585 nM for ERβ and 38 and 1749 nM for ERα, respectively.
Environmental ligands induced transactivation of BELZ and BELZ ERβ cells
We then studied the activating effects of E2 and the environmental ligands in the BELZs cell
lines. Results obtained in BELZ were similar than results obtained in the HELN ERα
cells
confirming that in BG1 native cells, ERα is the main mediator of estrogenic responses (Fig. 5A).
In the BELZ ERβ clones, we also observed that the induction factor was decreased and that the
inhibition is enhanced in the clone expressing the higher level of ERβ (Fig. 5B and 5C) .
Moreover, ERβ selective environmental compounds (Gen, BP2) only partially induced luciferase
expression at concentrations at which they do not bind ERα suggesting that this induction acts
through the ERβ isoform. The dose response curve of EE2 was shaped like an inverted U with the
greatest dose at 0.1 nM. Like E2 and 16α-LE2, EE2 was more active at concentrations where it
163
activated only ERα. Chlordecone, which is an ERα agonist and ERβ antagonist, showed the
strongest effect on luciferase expression. Altogether, these results confirmed that ERβ inhibited
estrogen-induced luciferase activity and that ERβ ligands were less active than ERα.
E2, selective and environmental compounds induced proliferation of BELZ and BELZ
ERβ cells
Finally, we investigated the effects of E2 and the different ligands used in this study on the
proliferation of BELZ and BELZ ERβ cell lines (Fig. 6a, 6b, 6c and 7). In BELZ cells, PPT, or
EE2 and chlordecon were able to fully induce proliferation. On the contrary, 8β-VE2, Gen and
BP2 were not able to activate proliferation at concentrations at which they only activate ERβ
(Fig. 6A, 6B, 6C and 7). These results showed that ERα is also the main mediator of estrogeninduced proliferation in these cells. As it was observed for transactivation, ERβ expression
decreased estrogen-induced proliferation. This inhibition was higher in the clone expressing the
higher level of ERβ. (Fig. 6A, 6B and 6C). ERα selective ligands were slightly more active than
ERβ selective ligands. As it was observed for transactivation, ERβ selective compounds were
able to partially induce cell proliferation. Altogether, these results indicate that similarly to
transactivation, ERβ have a dual effect on estrogen-induced proliferation. ERβ decreased cell
growth in a dose-response manner, but allows ERβ selective agonists to partially activate it.
DISCUSSION
Hormono-dependant (breast and ovarian) cancer cells show overexpression of ERα relative to
ERβ compared to normal tissues. In these tissues, the expression of ERs is markedly altered
between normal tissue and tumours (Cunat et al., 2004; Leygue et al., 1998; Murphy and Watson,
2002; Park et al., 2008; Roger et al., 2001). ERα is up-regulated in ER positive breast tumors
relative to normal breast epithelium whereas current data suggests that ERβ is downregulated in
breast tumours compared with normal breast epithelium (Leygue et al., 1998; Roger et al., 2001).
Since both in vitro and in vivo studies suggest that ERβ may be a negative regulator of ERα
action (Hall and McDonnell 1999; Weihua et al., 2000; Forster et al., 2002; Peng et al., 2003), it
has been speculated that the downregulation of ERβ during tumorigenesis removes a modulator
factor of ERα, important for maintaining normal sensitivity of cells to estrogen action. As the
responsiveness of ERα positive tumor cells to the proliferative effect of estrogen is direct, this
164
observation has lead to the hypothesis that ERβ may modulate the proliferative effect of ERα.
This would imply that high levels of ERβ stimulation lead to decreased cell proliferation whereas
high levels of ERα stimulation lead to increased cell proliferation.
The opposite actions of ERα and ERβ on cell proliferation in ERα positive breast tumor
cells are not totally understood. In ER negative cells, overexpression of ERα and ERβ has
resulted in growth inhibition (Escande et al., 2006; Garcia et al., 1992; Molina Molina et al.,
2008; Stender et al., 2007). However, when over-expression of ERβ in an ERα positive
background was achieved, more consistent results have been obtained, and in particular overexpressed ERβ results in growth inhibition (Paruthiyil et al., 2004; Strom et al., 2004). This
different effect of estrogens on cell proliferation in ERα positive cells or ER negative cells
with ERα reintroduced was proposed to be due to a different effect on E2F1 expression. In
ERα positive cells (MCF-7), E2F1 expression is up-regulated by E2 while it is inhibited in
ER negative cells where ER is reintroduced (Stender et al., 2007).
The opposed effect of ERβ on ERα has been mainly studied in ERα positive breast cancer
cells (Lindberg et al., 2010; Murphy et al., 2005; Strom et al., 2004). These studies have been
carried out in T47D and MCF-7 cell lines expressing ERβ under control of an inductible
promoter (Lindberg et al., 2010; Strom et al., 2004; Sotoca et al., 2008a, 2008b).They showed
that ERα was active on cell proliferation while ERβ inhibited cell proliferation. If these studies
have examined the different effects of ERα and ERβ action on cell proliferation, few studies
have investigated their roles on gene transactivation. Experiments performed with transient
transfection in both ERα and ERβ negative cell lines have indicated that ERβ is generally less
active than ERα (Kuiper et al., 1998; Delaunay et al., 2000). On the contrary, stably reporter
cell lines expressing ERα and ERβ established in the laboratory or by other groups have shown
that, at least in HeLa and human embryonic kidney cells (HEK293), ERβ was as
transcriptionally active as ERα (Escande et al., 2006; Barkhem et al., 1998). Finally, the
opposed effect of ERβ on ERα has been mainly studied in ERα positive breast cancer cells
(Lindberg et al., 2010; Murphy et al., 2005; Strom et al., 2004) and few studies have been
investigated in ovarian cell lines (Roger et al., 2001).
The objectives of the present study were first to determine if ERα and ERβ also present
opposite effects in an ovarian cellular context (ER positive BG1 cells), and secondly to
compare these effects on both gene transactivation and cell proliferation. In order to study the
effects on transactivation, we first transfected an ERE driven luciferase gene in BG1 cells
(BELZ cell line) and secondly we introduced an ERβ expression plasmid. In the aim of
165
investigate the influence of the ERα/ERβ
ratio
on these responses, we selected two clones
with different ERβ expression levels.
Using the ligand-binding assay, we determined that in the clone BELZ ERβ 1 expression of
ERβ increased specific binding of radiolabeled E2 in around 200% compared with that of
BELZ. Expression of ERβ in the clone BELZ ERβ 2 resulted in about a 300% increase in
specific E2 binding over controls. Because BELZ parental cells mainly endogenously express
ERα, control reflects predominant ERα levels. In the clone BELZ ERβ 1, this subtype was
expressed to less or equimolar levels as endogenous ERα (estimated by ligand binding assays),
suggesting that the majority of ERβ proteins would form heterodimers with ERα (Cowley et al.,
1997). However, this depends on the kinetics of dimer formation in vivo and hence some
homodimers of ERα may also exist. In the BELZ ERβ 2 clone, ERβ was expressed to higher
levels than in the other clone, suggesting that all ERα proteins may be heterodimerized with
ERβ
with a possibility that a small population of ERβ homodimers may also exist.
We showed that in BELZ cells transactivation and proliferation are fully activated by E2
and ERα selective agonists. On the contrary, DPN and 8β-VE2, at concentrations which they
do not bind ERα, were not able to induce transactivation and proliferation. These results
indicate that in parental BELZ, endogenous ERβ cannot or is not expressed enought to
mediate estrogen responses. Therefore, to study the role of ERβ in transactivation and cell
proliferation, we used BELZ ERβ clones. These cells allowed us to directly compare the
effects of ERβ in the same cellular background.
We observed that in these cells, ERβ inhibed estrogen-induced transactivation and
proliferation. The more potent ligands were ERα selective compounds, but their capacity to
induce transactivation and proliferation was reduced compared to BELZ cells. Furthermore this
inhibition was higher in the clone 2 (high ERβ) than in the clone 1 (low ERβ), indicating that ERβ
inhibit ERα-mediated responses in a dose dependant manner. Interestingly, 16α-LE2 was more
active at concentrations lower than 1 nM (ERα selective) than at higher concentrations where it
activates both ERα and ERβ. These results are consistent with data obtained in breast cancer cell
lines, in which surexpression of ERβ results in reduced cell growth in presence of E2 (Murphy et
al, 2005; Strom et al., 2004; Sotoca et al., 2008a). However, we noticed that ERβ selective
compounds were able to partially induce luciferase expression at concentration which they only
bind this subtype. ERβ selective compounds were even as potent to mediate transactivation or
proliferation as ER pan agonists (E2 or 16α-LE2 at high concentrations). These results indicate
166
that intermediary ERβ expression levels allow ERβ selective compounds to mediate estrogenic
responses. As these effects were observed at concentrations which these compounds bind only
ERβ subtype, and because they decreased when ERβ was overexpressed, this suggests that they
are mediated by ERα/ERβ heterodimers. These effects of ERβ selective ligands were not
observed in other studies investigated in breast cancer cell lines. It is possible that this effect is
cell-specific, or more probably, only observed at equivalent concentrations of ERα and ERβ.
Similar results were observed in presence of environmental estrogens. EE2 and chlordecone
were more active than genistein or BP2. ERα selective ligands were thus more active than ERβ
selective agonists to mediate transactivation and proliferation when both ERs were expressed.
As ERβ selective agonists are able to partially induce transactivation and proliferation, it is
tempting to speculate that in BG1, ERβ is less active than ERα but not completely inactive. Our
results clearly show an important role of the ERα/ERβ ratio in estrogen-induced transactivation
and cell proliferation, and could indicate that ERα and ERβ heterodimerize in BG1 cell lines.
ERα/ERβ heterodimers and ERα homodimers have been shown to be preferentially formed in
intact cells. Furthermore, heterodimers were shown to bind DNA estrogen-responsive elements
(ERE) with similar affinity than ERα homodimers, and both dimers bind ERE with higher
affinity than ERβ homodimers (Cowley et al., 1997). This suggests that the partial EREinduced transactivation, as well as the partially induced cell proliferation, in BELZ ERβ clones
could be due to the presence of ERα/ERβ heterodimers. We can also hypothesize that in these
cell lines, increased ERβ isoform expression can initiate ERβ homodimerisation, leading to the
inhibition of ligand-induced transactivation and proliferation.
To better understand the interaction between ERα and ERβ, quantification of both ERs exact
expression levels remains crucial. In addition, our findings demonstrate that the ER subtype ratio
determines both quantitatively and qualitatively the functional ER response to selective ligands.
Finally these results also suggest that ERβ downregulation in ovarian tumors compared with
normal ovary tissue, which alters both ERs’ relative expression, is functionally involved in
ovarian tumoregenesis, at least for ER positive ovarian cancers. They also point out the
importance of ERα/ERβ ratio for the ultimate effects of environmental ligands on cell
proliferation, and this may provide a basis to explain the differential effects reported for the
influence of xenoestrogens on cancer incidence.
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170
FIGURES LEGENDS
Figure 1 : transcriptional activity of ERα or ERβ selective agonist ligands on HELN ERs cell
lines. Induction of ERE-mediated luciferase activity in the HELN ERα (A) and HELN ERβ
(B) cell lines upon exposure to ranges of E2 (), PPT (°), DPN (●), 16α-LE2 (▼) and 8βVE2 (▲). HELN ERs cell lines were treated with each ligand at the concentrations indicated
for 24h. Induction was expressed relative to maximal E2 response (10 nM) set at 100%. Data
points represent the mean of three independent experiments ± standard deviation.
Figure 2 : quantification of estrogen receptors in HELN ERs and BELZs cell lines. Binding
of [3H]-E2 to ERα and ERβ in presence or absence of an excess of E2, 16α-LE2 or 8β-VE2.
Cells were incubated with [3H]-E2 alone (10 nM), or coupled with E2 (1 µM), 16α-LE2 (30
nM) and 8β-VE2 (30 nM). For each cell line, proteins were quantified using the Bradford
assay (Bio-Rad Laboratories, Marnes, France). Results are expressed in fmol of ERs / mg of
protein. Values are means ± standard deviation of three independent experiments
Figure 3 : transcriptional response of BELZs cell lines to ERα or ERβ selective ligands.
Induction of ERE-mediated luciferase activity in the BELZ (A) BELZ ERβ 1 (B), and BELZ
ERβ 2 (C) cell lines upon exposure to ranges of E2 (), PPT (°), DPN (●), 16α-LE2 (▼) and
8β-VE2 (▲). BELZs cell lines were treated with each ligand at the concentrations indicated
for 24h. Induction was expressed relative to control response set at 1. Data points represent
the mean of three independent experiments ± standard deviation.
Figure 4 : effect of environmental ligands on the transactivation of HELN ERs cell lines.
Transcriptional activities of HELN ERα (A) and HELN ERβ (B) cell lines in response to
ranges of EE2 (●),genistein (), benzophenone 2 (▲) and chlordecone (). HELN ERs cell
lines were treated with each compound at the concentrations indicated for 24h. Values are
expressed as described in the legend of figure 1.
Figure 5 : transcriptional activity of environmental ligands on BELZs cell lines. Induction of
ERE-mediated luciferase activity in the BELZ (A),
BELZ ERβ 1 (B), and BELZ ERβ 2 (C)
cell lines upon exposure to ranges of EE2 (●), genistein (), benzophenone 2 (▲) and
171
chlordecone (). BELZs cell lines were treated with each compound at the concentrations
indicated for 24h. Means are expressed as indicated in the legend of figure 3.
Figure 6 : differential effects of selective ligands E2 (), PPT (°) and 8β-VE2 (▲) on the
proliferation of BELZ (A),
BELZ ERβ 1 (B), and BELZ ERβ 2 (C). BELZs cell lines were
treated with each ligand at the concentrations indicated for 7 days. Data are presented
normalized with respect to the proliferation of control cells set at 1. Each normalized data
point represents the mean of three independent experiments ± standard deviation.
Figure 7 : environmental ligands differentially regulate proliferation of BELZ (A),
BELZ
ERβ 1 (B), and BELZ ERβ 2 (C). BELZs cell lines were treated with PPT, EE2, chlordecone,
genistein (Gen) and benzophenone 2 (BP2) at the concentrations indicated for 7 days. Results
are expressed as indicated in the legend of figure 6.
172
FIGURES
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175
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178
179
Articles et travaux de thèse ETABLISSEMENT DE MODELES CELLULAIRES PERMETTANT L’ETUDE DE L’EFFET DES RECEPTEURS DES ŒSTROGENES ALPHA ET BETA SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE IN VIVO. Présentation de l’article : A novel in vivo model of estrogen responsive ovarian cancer using non‐invasive bioluminescence imaging. Busson M, Garcia A, Lazennec G, Cavaillès V and Balaguer P. Le cancer de l’ovaire est la première cause de décès par cancer gynécologique après le cancer du sein. L’amélioration des traitements de cette pathologie est sans cesse à l’étude, et requiert le développement et la disponibilité de modèles d’étude in vivo. L’objectif de notre travail a été d’élaborer un modèle cellulaire ovarien luminescent, afin de procéder à des études in vivo de croissance tumorale et de développement métastatique, en présence de ligands synthétiques pharmaceutiques et d’œstradiol. Afin d’étudier la régulation par le REα et le REβ de la prolifération cellulaire in vivo, nous avons établi des lignées cellulaires (MCF‐7 et BG1) qui expriment la luciférase de façon constitutive. Ainsi la bioluminescence émise par ces lignées cellulaires est proportionnelle à la quantité de cellules, et donc à la taille de la tumeur. Le marquage de cellules par la luciférase permet de suivre la prolifération tumorale chez l’animal sans sacrifice. De plus, la détection des métastases est facilitée par l’aptitude de ces cellules à émettre de la luminescence. Le modèle MCF‐7 permet d’étudier la formation de xénogreffes sous‐cutanées ou dans la glande mammaire. Le modèle BG1 permet d’étudier la formation de tumeurs dans l’ovaire ainsi que le développement de métastases dans d’autres organes. Notre travail a permis de montrer que la lignée BG1‐Luc que nous avons établie produit des tumeurs chez les souris immunodéprimées, et que la croissance de la tumeur est œstrogéno‐
dépendante. De plus, ce modèle semble constituer un bon modèle d’étude puisque les métastases que nous avons observées sont situées dans les mêmes organes que celles développées chez l’humain. Le modèle BG1‐Luc apparaît donc être un bon modèle représentatif de la situation clinique, permettant une démarche d’étude in vivo valide.
180
Articles et travaux de thèse Introduction préalable concernant la bioluminescence in vivo
1/ La bioluminescence
La luminescence est lʹémission dʹun photon lumineux lors de la désactivation dʹune molécule excitée vers un état énergétique moins élevé. Selon le mode dʹexcitation de la molécule, on distingue plusieurs types de luminescence. La bioluminescence ou bio‐chimi‐
luminescence, présentée par certains êtres vivants, est due à lʹémission de photons par une molécule organique (substrat), excitée à la suite dʹune réaction dʹoxydation catalysée par une enzyme. Le phénomène de bioluminescence est présent chez beaucoup dʹêtres vivants : bactéries, protozoaires, champignons (pleurotes), animaux marins (méduses, calmars, crustacés planctoniques, ou poissons des grands fonds), insectes (lucioles). La réaction chimique de bioluminescence implique la luciférase comme enzyme, la luciférine comme substrat, lʹATP et lʹoxygène (figure 1). Au début de la réaction, lʹATP se lie avec le substrat (luciférine) après avoir lié lʹion magnésium (Mg). Le complexe Mg‐ATP sert de support à la luciférase. Ensuite, la luciférine va réagir avec lʹenzyme et donner une forme intermédiaire, la luciferyl‐AMP. Sur ce complexe, lʹoxygène va réagir en donnant lʹoxyluciférine, peroxyde qui se cyclise et libère de lʹAMP. Cette molécule, dans un état électronique excité, retourne à lʹétat stable avec lʹémission dʹun photon. Figure 1 : Réaction de luminescence.
181
Articles et travaux de thèse 2/ Bioluminescence in vivo
Pour que la réaction de bioluminescence puisse avoir lieu dans un organisme contenant des cellules cancéreuses bioluminescentes, il faut injecter la luciférine. Cette molécule est capable de traverser les membranes cellulaires et les barrières cérébrales aussi bien que placentaires, ce qui permet une imagerie de tout lʹorganisme. Cependant la luciférine est métabolisée et éliminée rapidement, le pic dʹexpression de la luciférase nʹest stable que pendant 20 min environ (figure 2). Figure 2 : Signal luciférase en fonction du temps après injection de luciférine.
L’intensité du signal va dépendre, entre autres, du choix du marqueur utilisé (luciférase de luciole/renilla…). Il est désormais acquis que la nature du signal luminescent, et notamment la longueur d’onde d’émission des photons, a plus d’effet sur la difficulté de détection du signal que l’atténuation due aux tissus traversés. Dans le spectre du visible (λ ~ 400 à 760 nm), l’hémoglobine est le principal chromophore qui absorbe la lumière au niveau des tissus ; la mélanine de la peau contribue également à l’absorption de façon significative chez les animaux pigmentés. L’hémoglobine absorbe principalement aux longueurs d’ondes bleues et vertes du spectre du visible mais de façon plus faible au‐delà de 600 nm permettant alors aux longueurs d’ondes rouges de traverser les tissus. De ce fait, les propriétés spectrales de la luciférase peuvent avoir un impact significatif sur la transmission du signal luminescent depuis l’intérieur de l’animal jusqu’à sa détection en surface. 182
Articles et travaux de thèse Pour les expérimentations in vivo, le signal bioluminescent émis par les enzymes dont le pic spectral se situe dans le bleu et le vert (λ : 475 à 520 nm), est fortement absorbé (notamment par l’hémoglobine). En revanche, le signal des enzymes dont le pic spectral se situe dans l’orange et le rouge (λ : 590 à 650 nm) est beaucoup moins absorbé et possède une meilleure pénétration dans les tissus. De ce fait, les luciférases qui émettent un signal dans les longueurs d’ondes supérieures à 600 nm (FLuc à 37°C et Click Bettle Red) ont une atténuation moindre dans les tissus et sont recommandées pour la bioluminescence in vivo. Le problème majeur de la détection de bioluminescence in vivo est l’injection du substrat dans l’animal. Différents modes d’injection ont été testés (ip : intra péritonéale, iv : intra veineuse, sc : sous cutanée). L’injection iv est incompatible avec une détection sous caméra à accumulation car la réponse est trop rapide (quelques dizaines de secondes) et le signal obtenu n’est pas stable. Les injections ip et sc donnent de bons résultats et l’imagerie peut être effectuée environ 10 minutes après l’injection. Malgré tout, l’injection du substrat est souvent non reproductible (injection dans l’intestin, dans les graisses,…) et la biodisponibilité et la diffusion de la luciférine est alors très variable. 183
A NOVEL IN VIVO MODEL OF ESTROGEN RESPONSIVE OVARIAN CANCER USING NON‐INVASIVE BIOLUMINESCENCE IMAGING Running title: In vivo bioluminescence imaging of estrogen‐responsive ovarian cancer Muriel Busson1*, Aurélie Garcia1, Gwendal Lazennec2, Vincent Cavaillès1, Patrick Balaguer1 1 IRCM, Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, Montpellier, F‐34298, France; INSERM, U896, Montpellier, F‐34298, France ; Université Montpellier 1, Montpellier, F‐34298, France; CRLC Val d’Aurelle Paul Lamarque, Montpellier, F‐34298, France. 2 INSERM, U844, Site Saint Eloi ‐ Bâtiment INM ‐ 80 rue Augustin Fliche, Montpellier, F‐34091, France; University of Montpellier I, F‐34090, France. * Corresponding author : Dr M. Busson, Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, Montpellier, F‐34298, France; INSERM, U896, Montpellier, F‐34298, France. Tel. (33) 467 61 24 10 Fax: (33) 467 61 37 87. E‐mail: [email protected] Keywords: ovarian cancer, estrogen, metastasis, bioluminescence. 184
ABSTRACT
Ovarian cancer is the gynecological cancer exhibiting the highest morbidity. More than
40 % of ovarian cancers exhibit estrogen receptor (ER), but they respond modestly to hormonal
treatment in vivo. Thus in vivo models could be useful to improve treatments. Here, we present
a novel hormono-dependant preclinical model of ovarian cancer, based on luminescent
orthotopic xenograft in athymic nude mice. BG-1 epithelial ovarian cancer cells, which express
estrogen receptor alpha (ERα), were stably transfected with luciferase gene. These cells, grafted
on immunodeficient mice, form tumors that can be monitored using CCD cameras.
In this work, we observed a good correlation between subcutaneous (SC) xenografts
monitoring by the camera and tumor size measurement with a slide caliber. When implanted
under the bursal membrane of the ovary, more than 95% of the animals developed a tumor.
Both SC and orthotopic tumor growth was responsive to estradiol. Survival experiments
indicated a median death at 48 days. Metastases were observed in the peritoneal cavity, kidney,
liver, spleen and lungs, which is close to the clinical situation. All together, these results
demonstrated that our model represents an excellent tool to identify molecular changes in the
early and late progression of ovarian cancer, and to test novel therapeutic approaches.
INTRODUCTION
Ovarian cancer is the seventh most common cancer, with an estimated 21,650 new cases in
2008, but is the fourth most deadly, with 15,520 projected to occur in the United States in 2008
(Jemal et al., 2008). Indeed 60% of the women who develop ovarian cancer die from their disease
(Vanderhyden et al., 2003). This is undoubtedly due to late diagnosis combined to rapid progression
to chemoresistance. 90% of ovarian cancer derive from ovarian surface epithelium (Garson et al.,
2003) and can be categorized into four major types: serous, endometrioid, mucinous or clear cell
tumors (Auersperg et al., 2002).
While the prognostic value of hormone receptor status has not been fully established for the
ovarian cancer as it is for breast cancer (Brandenberger et al., 1998; Fujimura et al., 2001),
epidemiological studies have still highlighted the role of steroid hormones and their receptors in
ovarian carcinogenesis. Gonadotropins, estrogen, and androgen may be causative factors, while
gonadotropin-releasing hormone and progesterone may be protective factors in ovarian cancer
pathogenesis (Syed et al., 2001; Zheng et al., 2007). Among the various ovarian cancer subtypes,
185
ER-alpha mRNA and protein levels were found in the majority of adenocarcinomas, except the
clear cell carcinoma specimens (Fujimura et al., 2001; Lee et al., 2002). On a clinical level, Slotman
and Rao, in a review of 52 studies have reported the presence of ERα in more than 60% of primary
cancers ovary (Slotman and Rao, 1988). In vitro experiments have shown that ovarian cancer is an
estrogen-sensitive cancer (Galtier-Dereure et al., 1992; Miller and Langdon, 1997). In several
strains ER + ovarian cancer, estrogens regulate cell proliferation (Langdon et al., 1994; Miller and
Langdon, 1997) and the expression of many proteins associated with invasion and proliferation
(Geisinger et al., 1989; Miller and Langdon, 1997).
However, while two-thirds of patients with ER + breast tumors respond to tamoxifen,
response of ovarian cancer to hormonal therapy remains modest (Gambacciani et al., 2003) and
only a minor part of patients (about 7 to 18%) responded clinically to anti-estrogen (Kommoss et
al., 1992; Lazennec, 2006; Miller et al., 2005). Therefore, it appears interesting to have an in vivo
model of estrogen-sensitive ovarian cancer to understand the mechanisms involved in ovarian
carcinogenesis.
Furthermore, ovarian cancer metastases frequently appear disseminated throughout the
peritoneal cavity, leading to the invasion and adhesion of cancer cells to many organs (Shaw et al.,
2004). Several models have been developed to understand the molecular mechanisms involved in
the development and the dissemination of the disease, but also to evaluate the efficacy of novel
therapeutic drugs in vivo. These models include different xenograft and transgenic models, no one
being fully satisfactory. The xenograft models currently used are: intraperitoneal (ip), subcutaenously (sc) and orthotopically intrabursal (ib) in the ovary. The majority of ovarian cancer
xenografts described involve ip or sc inoculation of the tumor cells. Although ib xenograft was
reported more than 10 years ago (Fu and Hoffman, 1993), only a few reports describe orthotopic
xenograft (Shaw et al., 2004). Nevertheless, ib cells implantation can be perceived as more
physiological, as the cancer cells are directly inoculated in the ovarian environment. In all cases, the
difficulty of monitoring ip or orthopically disease formation and progression in vivo is the major
limitation of the xenograft models.
Our goal was to generate xenograft mouse model of human estrogen responsive ovarian
cancer that would provide rapid tumor growth, produce metastasis to clinically relevant tissues and
permit quantitative in vivo non invasive detection. We used BG-1 cells, which correspond to a
human ovarian epithelial cell line derived from a solid primary tumor tissue from a patient with
stage III, poorly differentiated ovarian adenocarcinoma (Geisinger et al., 1989). These cells express
mainly estrogen receptor α (Geisinger et al., 1989), and their proliferation is estrogen-regulated in
186
vitro (Cunat et al., 2004). We stably transfected BG-1 cells to express constitutively a luciferase
reporter gene. We then injected intrabursally the cells into the ovary of athymic nude mice, and the
luminescent BG-1 cells were monitored for primary tumor development and metastases appearance.
This model gives rise to metastases in the same locations (peritoneal cavity, spleen, liver, digestive
tract) as those described for human ovarian cancer (Shaw et al., 2004), and gives the possibility to
visualize the tumor formation but also the metastases without sacrifice of any animals. Tumor take
in the ovary was more than 90%, and median death was 48 days. Tumor growth could be monitored
from the first day, due to the high sensitivity of the detection, which allows the analysis of very early
events of tumor formation. Thus, our model represent an excellent in vitro and in vivo estrogen
responsive model used to characterize molecular or cellular events associated with ovarian
carcinogenesis and also to evaluate the efficiency of several therapeutic compounds designed for the
treatment of ovarian cancer, and also to characterize molecular or cellular events associated with
ovarian carcinogenesis.
Materials
Estradiol-17β (E2) and cholesterol were from Sigma Chemical (Saint Quentin-Fallavier,
France). Luciferin and G418 were purchased from Promega (Charbonnières, France). 4Hydroxytamoxifen (4OH-Tam) was from Sanofi-Aventis (Romainville, France) ICI 182,780 (ICI)
was from Zeneca (Macclesfield, United Kingdom).
Tumor cell line
The human ovarian cell line BG-1 (ERa and Progesterone Receptor positive cells) were
grown in DMEM/F12 supplemented with 10% FCS (fetal calf serum), 1% antibiotics (PS, penicillin
streptomycin), at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2. To wean the cells off
steroids, they were cultured in phenol red-free DMEM-F12 medium supplemented with 10%
charcoal dextran-treated FCS (CDFCS) for 4 days.
The stably transfected BG-1 luc cell line was obtained after transfection with the plasmid
CMV-LUC-Neo encoding the luciferase reporter gene under the control of CMV promoter and also
the neomycin gene confering resistance to the aminoglycoside G418. Transfected cells were then
selected by G418 at a concentration of 1 mg/ml. After a 30 days treatment, luminescent clones were
identified using photon-counting camera (NightOWL II LB 983 from Berthold, France) by addition
187
of luciferin in the growth medium (0.33 mM), and the most luminescent clones were isolated. One
clone was then used for all the in vivo experimentsand cultivated in presence of 1 mg/ml G418.
In vitro proliferation
BG-1 cells were seeded at 1000, 2000, and 4000 cells per well in 96 well plates. They were
treated every 2 days with ethanol (EtOH), estradiol (E2), OHT and ICI at a concentration of 10-8 M.
Proliferation was evaluated on the 8th day by adding 50 µg of MTT reagent at 0.4 mg/ml final
concentration. After incubation for 4 hours at 37°C, the MTT solution was replaced by DMSO for
cell lysis, and reading is done at 540 and 620 nm.
Genomic DNA extraction and quantitative PCR
Genomic DNA was extracted from blood and peritoneum fluid using the perfect gDNA blood
mini kit (Eppendorf). Real-time PCR quantification was then performed using a SYBR Green
approach (Light Cycler; Roche, France) (Duong et al., 2006). For each sample, luciferase mRNA
levels were corrected for mouse RS9 mRNA levels (reference gene). Primers used were as
followed:
Luc forward :
5’-GGCGCGGTCGGTAAAGTTGTT-3’
Luc reverse :
5’-AGCGGGAGCCACCTGATAGC-3’
mRS9 forward :
5’-CGGCCCGGGAGCTGTTGACG-3’
mRS9 reverse :
5’-CTGCTTGCGGACCCTAATGTCACG-3’
Animals
Female Nu/Foxn1 athymic nude mice, 7 weeks old were obtained from Harlan. Mice were
acclimatized for 1 week before the experiment, and were kept under pathogen-free conditions in
laminar-flow boxes (5 mice/cage) maintained under standard conditions (22 ± 2 °C, 45 ± 10%
relative humidity, 12h light/12h dark cycle each day, standard diet and water ad libitum). All
experiments were performed in accordance with the French guidelines for experimental animal
studies (Agreement No. B-34-172-27).
Xenograft
When indicated, before cell implantation, a silicone tube (silastic, Ø 0.15 cm ID, Ø 0.24 cm
OD, 1 cm length, Dow Corning) filled with a solid mixture of E2 and cholesterol as a carrier (1:10,
v:v) was implanted subcutaneously (sc) in the interscapular region of ovariectomized mice. Two
days later, 5.106 BG-1 cells prepared in 75 µl serum-free culture medium, combined with phenol red
188
free Matrigel (1:1, v:v, Matrigel Basement matrix, BD Biosciences) were sc grafted on both flanks
of these mice.
Alternatively, BG-1 cells prepared in 20 µl serum-free culture medium combined with
matrigel (2:1, v:v) were orthotopically grafted in the left ovary surgically exposed of anaesthetized
mice. Briefly, mice were anaesthetized with isoflurane gas anesthesia system (T.E.M., Bordeaux,
France), placed on the right flank, and then incised. The left ovary is released and held with forceps.
30 µl of medium containing cells are injected using a 30G insulin needle (BD microfine), then the
ovary was replaced in the peritoneal cavity. An antibiotic is administered to the animal in the
peritoneal cavity (penicillin / streptomycin, Invitrogen), and an analgesic is administered by
intramuscular injection to the animal (Temgesic, 0.05 mg/kg). Animals were sewn using 6-0
surgical thread (Prolene), and monitored for their awakening to prevent hypothermia or
hypoventilation.
In vivo bioluminescent imaging BG-1 cells
To measure luciferase activity, mice were injected intraperitoneally with 125 mg/kg body
weight of luciferin (sodium salt; Promega) in aqueous solution and then sedated by isoflurane gas
anesthesia system. Luminescence was measured using NightOWL II LB 981 CCD camera and
integrated for a 4-min period. The signal intensities from regions of interest (ROI) were obtained
and data were expressed as photon (counts/mm). Background was defined from a region of the
same size placed in a non-luminescent area nearby the animal and then subtracted from the
measured luminescent signal intensity. All light measurements were performed under the same
conditions, including camera settings, exposure time, distance from the animals, and region size. A
pseudocolor luminescent image from blue (least intense) to red (most intense), representing the
spatial distribution of the detected photons emitted within the animal, was generated using WinLight
software (Berthold Technologies).
Tissues extracts luciferase activity
Tissue pieces were put into ceramic beads-containing special centritubes (Lysing matrix,
Qbiogen), and twice the weight of samples of luciferase buffer (25 mM Tris Phosphate pH 7.8, 2
mM DTT, 2 mM EDTA, 10% Glycerol, 1% Triton X100, 1 mg/ml BSA) was immediately added,
and subjected to two oscillations made by the MagNA Lyser machine at 7000 r/min for 15 seconds.
The lysate was then centrifuged at 10 000 rpm for 30 minutes at 4°C, and the supernatant was saved
and assayed. 10 µl of the supernatant were loaded onto 96-well white opaque tissue plates (Lumitrac
200), and luciferase activity was measured after injection of luciferase detection buffer (20 mM
189
Tricine, 1.07 mM (MgCO3)4 Mg(OH)2 5H2O, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DDT,
adjusted to pH 7.8) and luciferase assay substrate (0.48 mM luciferin, 0.53 mM ATP, 0.27 mM
coenzyme A) using a Centro LB 960 luminometer (Berthold Technologies). Luminescence was
measured for 2 s and results expressed as Log10 luciferase activity (count/sec).
Histology and Immunohistochemistry
Ovaries, lungs, liver and tumors were collected at necropsy and routinely fixed for 4
hours at room temperature in PFA (PBS / 4% paraformaldehyde). For histological analysis,
formalin-fixed paraffin-embedded tumor 5 µm sections were cut and stained with H&E.
Sections were also subjected to immunostaining in accordance to the standard DAKO
protocol included in the En-vision kit. Primary monoclonal antibody against luciferase was
diluted 1:70 (anti-luciferase, Europa Bioproducts Ltd). Slides were counterstained with
Mayer’s hematoxylin, and mounted in a mounting medium (Surgipath Europe Ltd).
Statistical analysis
Wilcoxon test was used to compare differences between two groups. Significance is
presented as * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001; and NS as non significant.
RESULTS
BG-1 luc cell line establisment and in vitro characterization
The BG-1 Luc cell line was obtained by transfection of the reporter gene CMV-Luc+Neo (Pillon et al., 2004) and selected by geneticin resistance.
To determine the limit of detection of BG-1 Luc cells, several amounts of BG-1 cells were
plated onto 96 well plates, and luciferase expression was measured (Figure 1A). After cell
adhesion, luminescence detection was realized on living intact cells, adding luciferin to the
medium (final concentration 0.33 mM) and photon emission measured on a Wallac
MicroBeta Trilux luminometer (EGG Wallac, Turku, Finland). As few as 100 cells could be
visualized, and correlation between cell number and photon emission was 0.99.
Estrogen receptors expression were quantified in BG-1 and BG-1 Luc, using an RTqPCR approach, and expression of receptors ERα and ERβ were comparable in both cell lines
(Data not shown), ERα being the major isotype.
190
In vitro proliferation was compared between BG-1 and BG-1 Luc cells. Steroids were
wean-off for 4 days, and plated onto 96 well plates. Ligands were added every 2 days for 8
days, and proliferation was measured on 8th day by a MTT method (Figure 1B). Basal
proliferation of BG-1 Luc cells is lower than BG-1 cells (Medium supplemented with EtOH
vehicle), but induction factor by E2 is comparable (ratio of about 3 at the endpoint). OHT
stimulates proliferation in both cell lines, and ICI does not significantly regulate proliferation
in our conditions.
These observations showed that both BG-1 and BG-1 Luc cell lines present the same
proliferation properties, thus our BG-1 Luc model could be used for in vitro and in vivo
proliferation studies.
Assessment of luciferase activity in SC xenograft
To determine whether BG-1 Luc cells responded to E2 in vivo, cells were injected
subcuteanously in both flanks of ovariectomized female nude mice that were previously
implanted with a silastic of estradiol (or cholesteraol as a control) in the interscapular region.
We subsequently imaged the mice every 5 days until day 25 (Figure 2A). Luciferase
expression was detected in the tumor from day 1 in both groups but it only increased strongly
in E2-treated animals from day 10 until day 25. Bioluminescence signal ranged from 2×103 to
104 pixels/sec for the control group and 5×104 to 2×106 pixels/sec for the E2 group, indicating
a ratio of about 200 at the endpoint between the two groups. Simultaneously, tumor size was
monitored using a slide caliber, and again, at the endpoint, the ratio between the two groups
was exactly 200. The correlation between tumor volume and luciferase expression was 0.9, as
already described for other cancer models (Pillon et al., 2005). In conclusion, tumor take was
100 % in all cases (in presence or absence of estradiol), and growth was responsive to
estradiol.
On day 25, mice were killed and isolated organs and tumor were imaged. There was no
apparent signal in any organs tested (lung, liver, bone or kidney, data not shown).
Orthotopic ovary xenograft
Tumor progression
In order to generate a more physiological model, we injected intrabursally BG-1 Luc
cells into the left ovary of athymic mice. The controlateral ovary was used as a control. Mice
were implanted with a silastic filled of estradiol or cholesterol as a control. Disease
191
progression was monitored every 5 days, up to day 25 (Figure 3A and 3B). The take rate was
95%, whatever the presence of a silastic of estradiol. From day 10 to the endpoint, the tumor
luciferase activity increased exponentially (Figure 3A) from 8×103 to 1.5×105 (control) or 104
to 5×105 (estradiol). Luciferase follow-up images indicates that light signals in the chests
were apparent from day 10 (Figure 3B), suggesting the presence of metastases.
At 25 days, tumor volume and weight were measured, the tumors, lungs, liver, serum
and ascites were collected, and organs were paraffin-embedded for immunostaining. The
detected luminescent signal at each time point was quantified and plotted against the
corresponding volume or weight determined for each animal (Figure 3C). Linear regression
analysis revealed a good correlation (r>0.84 in both cases) between the measurement of
tumors using these two modalities. The difference was obviously due to the necrosed tissues
not reported by the luciferase measurement as previously reported (Nyati et al., 2002) and
assessed by the H&E staining of the parrafin-embedded sections.
Figure 4 shows both macro- and microscopic pathology of the ovarian tumors. When
cells were engrafted in mice that have received a silastic of estradiol, tumor progression
enhanced faster and tumor volume at 25 days was about twice (Figure 4A, right side). Since
the presence of a silastic filled of estradiol is not physiological, the rest of the experiments
have been done in absence of the silastic. Figure 4B shows tumor growth of the left ovary at
day 15, 25 and 40. At day 15, no tumor growth was yet observable; beginning of the
expansion at day 25 was consistent with tumor luciferase progression (Figure 3A). From day
25 to 40, abdominal swelling was observed, revealing metastatic diffusion and the presence of
ascites (Figure 4C).
To analyze the histopathology of the ib xenograft tumors, we performed
immunohistochemical staining on all tumor types to determine expression of luciferase
(Figure 4D). The Hematoxylin staining of the 25 days tumor sections informed us about the
tissue organization. The bursal membrane of the ovaries appeared structurally intact and the
intrabursal space was entirely occupied by tumor (Figure 4D). At 25 days, we found some
normal ovarian structures and follicules within the tumor. The immunostaining confirmed the
presence of the BG-1 luc cells into the intrabursal space especially in the circumference of the
tumor (Figure 4D). At 40 days, no ovarian structures were recognizable within the tumor.
Metastases
Metastases appeared at day 25, and covered the entire peritoneum cavity at day 40
(mesentery, secondary tumors disseminated...) as shown in Figure 4C. At day 25, isolated
192
organs were observed (Figure 5A, visual detection) and imaged immediately in the CCD
camera (Figure 5A, luciferase detection). Metastases were viewed on the intestines, liver,
kidneys, spleen, lining of the peritoneum (sub-cutaneous), and lungs. The luciferase signals in
the chest were found to originate from lungs, but also kidney and liver (Figure 5A and 5B).
Isolated organs were lysed using magna lyser beads (Roche), and assayed for luciferase
activity (Figure 5C). Luciferase activity was recorded in all metastases isolated: kidney, lung,
and less but significantly (P<0.05) in liver and spleen. Most of the metastases were found on
the surfaces of organs, but an immunostaining with the antibody against the luciferase
revealed some penetrated cancer cells into the tissue as illustrated with sections of lung and
liver (Figure 5D).
Genomic DNA was also extracted from the blood and the ascites of injected mice or
control mice, and luciferase was measured by real-time PCR (Light Cycler) (Figure 5E). We
compared the luciferase expression from 20 blood and ascites samples by Student’s t test. We
noted that luciferase was expressed in blood and ascites of injected mice, and no significant
signal was measured in genomic DNA of blood from control mice (P=0.018, P=0.025
between control and blood or ascites, respectively). Luciferase was twice higher in ascites
compared to blood (P=0.5, NS), suggesting a higher concentration of cancerous cells in this
liquid compartment.
Survival
In a third set of in vivo experiments, the morbidity rate of the mice was measured. After
orthotopic injection, animals were observed daily for the development of limb paralysis,
weight loss, and respiratory distress and sacrificed immediately if noted. Median survival time
was 48 days (Figure 6). Each arm represents the percentage of animals alive at the indicated
time point following injection.
DISCUSSION
Research in ovarian cancerology has been hampered by a lack of clinically relevant,
experimental models. Here, we present a new model based on implantation of luminescent ovarian
cancer cells, into surgically exposed ovaries of athymic nude mice. The take rate of the BG-1 Luc
cell line orthotopic xenograft is almost 100%, which is greater than those obtained for all cell lines
used for this type of engraftment. For example, in Shaw’s work (Shaw et al., 2004), take rate is 40%
or 86%, depending on the cell line used. The model show extensive peritoneal dissemination
193
comparable to the phenotype obtained with ip injection (Louis et al., 2006; Shaw et al., 2004), that
is representative of the human ovarian metastases. Nevertheless, the injection of ovarian cancer cells
into the intra-bursal space results in tumor formation that can be perceived as more physiological, as
the cancer cells were placed directly in the environment where ovarian tumors normally arise.
The formation of the tumor is rapid, compared to the transgenic mouse models proposed
(Flesken-Nikitin et al., 2003; Garson et al., 2003), especially if the duration of the establishment of a
transgenic mouse line is taken into account. Moreover, bioluminescence is very useful to provide a
continuous follow-up of the tumor formation without sacrificing the animals, which presents the
ethical advantage to avoid the use of numerous animals. In addition, we eliminate a part of the
variability due to the sacrifice of groups of animals at different times. Last, this model will be very
useful to study several drugs, since it is well adapted for highthrouput screening in vitro and permits
a comparison between in vitro and in vivo responses.
In conclusion, the chosen BG-1 cell line is representative of 90% of the ovarian cancer
(epithelial cell line). This ovarian cancer model allows rapid, physiological and quantitative study of
ovarian cancer, and should be useful for non invasive investigations of mechanisms underlying
ovarian cancer metastasis and therapeutic applications. The BG-1 cell line chosen is representative
of 90% of the ovarian cancer (epithelial cell line). Finally, the methodology used to develop this
model may also be suitable for other types of human ovarian cancers.
Acknowledgments
This work was supported by grants from INSERM and the Association de la Recherche contre le
Cancer. We thank I Aitarsa and M Brissac for their technical assistance and advices
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FIGURES LEGENDS
Figure 1 : In vitro characterization of BG-1 Luc cells. A, Correlation between bioluminescence
detected and cell number. BG-1 Luc cells were seeded at increasing concentration in a 96 wells
plate. After adhesion, medium was removed and replaced by detection medium. Values represent
means ± SD of 2 independent experiments. B, BG-1 and BG-1 Luc proliferation is regulated by
hormones. Cells were seeded at 2000 cells per well in a 96 wells plate, and were subjected to EtOH
vehicle, E2, OHT or ICI (10-8 M) every 2 days. On day 8, proliferation rate is calculated. Values
represent means ± SD of 2 independent experiments.
Figure 2 : In vivo monitoring of sub-cutaneous injection of BG-1 Luc cells. Female nude mice were
anesthetized and imaged using a Berthold imaging system 5 min after ip injection of luciferin for 15
min (25 mg/ml mouse body weight). At each time, average of 2 luciferin signals at the plateau is
measured and used for the kinetic.
A-left, SC tumor Luciferase kinetic; A-right, Same tumor volume was monitored using a slide
caliber. These curves are representative of 3 independent experiments using 5 animals per group.
B, Representative images of one representative mouse per group (control and E2) is shown.
Figure 3 : In vivo monitoring of orthotopically injected BG-1 Luc cells in the left ovary. 2×106 cells
were injected into the bursal membrane of the left ovary and animals were monitored for 25 days.
Female nude mice were anesthetized and imaged from day 5 after surgical injection (J0) of cancer
cells using a Berthold imaging system. Images were taken 5 min after ip injection of luciferin (25
mg/ml mouse body weight), for 15 min and average of the signal at the plateau was calculated at
each time. At day 25, animals were euthanized.
A, Kinetic of the luciferase progression monitored. These curves are the average of 3 independant
experiments using 5 animals per group.
B, Representative images of 1 animal per group at day 5, 10, 20 and 25 post cell implantation.
196
C, Tumor volume calculated at the endpoint (day 25), and correlation with the luciferase or weight
at this date.
Figure 4 : Mice ib injected with BG-1 Luc cells presented ovarian tumor and ovary-specific
metastases. At necropsy, the reproductive tracts were removed and photographed.
A, Representative pictures of the reproductive tracts of 30 days-injected animals implanted with a
silastic filled of estradiol or cholesterol as a control.
B, Representative images of the reproductive tracts of 15, 25 and 40 days of estadiol treated group
animals. At day 40, mice present sever ovarian disease.
C, Representative photos at day 25 and 40. Upon necropsy, 100% of the animals were found to have
severe unilateral ovarian disease. At day 40, animals present some ascetic fluid.
D, Representative image of immunohistochemical of tumors and controlateral ovaries obtained with
anti-luciferase antibody (Europa Bioproducts LTD).
Figure 5 : Metastatses detection.
A, Upon necropsy, organs were dissected and observed for metastasis detection. Concommitantly,
organs were analysed using the Berthold imaging system after a wash in luciferin.
B, Representative pictures of metastases observed in liver, spleen, kidney, intestine and mesentery.
C, Luciferase activity of some target tissues of treated and control groups.
D, Representative images of liver and lung immunohistochemical obtained with anti-luciferase
antibody.
E, Genomic DNA was extracted from the blood and the ascites of injected mice or control mice, and
luciferase expression was quantified by real-time PCR. Results represent the mean of two
independent quantifications, after normalization for the RS9 gene.
Figure 6 : Kaplan-meier survival curve. 10 mice were ib xenografted, and followed-up daily for the
development of respiratory distress, limb paralysis and weight loss, and sacrificed immediately if
noted.
197
FIGURES
198
199
200
201
202
Articles et travaux de thèse MODELES CELLULAIRES MAMMAIRE ET OVARIEN BIOLUMINESCENTS RESISTANTS AU TAMOXIFENE ET A ICI 182,780 L’hormono‐thérapie conduit souvent à un phénomène de résistance au traitement. En effet, il apparaît que 30 à 40% des tumeurs RE positives mammaires possèdent une résistance innée, et qu’il existe également une résistance acquise. La résistance acquise se développe après quelques mois à plusieurs années de traitement, et est observée chez 60% de femmes traitées par le tamoxifène (Riggins et al., 2007). En ce qui concerne le cancer des ovaires, la résistance hormonale semble innée. En effet, bien qu’une proportion non négligeable des cancers de l’ovaire soit RE+, ils se révèlent relativement réfractaires aux traitements hormonaux (Cunat et al., 2004). Il serait donc intéressant de mieux comprendre les mécanismes qui confèrent cette résistance dans le cancer des ovaires. Afin d’étudier le mécanisme de la résistance dans ces deux cancers, nous avons établi à partir de nos lignées cellulaires MCF‐7 et BG1 exprimant la luciférase des clones cellulaires résistants aux conditions de culture sans estrogènes (MCF‐7 ou BG1‐Luc DCCR), avec l’anti‐œstrogène partiel hydroxy‐tamoxifène (MCF‐7 ou BG1‐Luc OHTR), ou avec l’anti‐
œstrogène complet ICI182,780 (MCF‐7 ou BG1‐Luc ICIR). Ces différents modèles cellulaires ont été établis in vitro et testés in vivo par xénogreffe chez les souris nudes. 203
CANCERS DU SEIN ET DE L’OVAIRE HORMONODEPENDANTS: MECANISMES DE LA RESISTANCE AUX THERAPIES HORMONALES Muriel Busson12, Aurélie Garcia1, Marina Gurdak1, Patrick Balaguer1, Vincent Cavaillès1, Eric Badia1 IRCM, Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, Montpellier, F‐34298, France; 1 INSERM, U896, Montpellier, F‐34298, France ; Université Montpellier 1, Montpellier, F‐34298, France; CRLC Val d’Aurelle Paul Lamarque, Montpellier, F‐34298, France. IPABS, Imagerie du petit animal en bioluminescence et scintigraphie, Montpellier, F‐34298, 2
France, INSERM, U896, Montpellier, F‐34298, France ; Université Montpellier 1, Montpellier, F‐34298, France; CRLC Val d’Aurelle Paul Lamarque, Montpellier, F‐34298, France. Mots clés : Cancer, sein, ovaire, hormonothérapie, résistance. 204
RESUME
Chez la femme, le cancer du sein est de très loin le plus fréquent, et son incidence
augmente de façon régulière depuis les années 1980. En France, en moyenne, une femme sur
huit sera confrontée au cours de sa vie à un cancer du sein. Le cancer de l’ovaire est la
première cause de décès par cancer gynécologique, et cela en raison du diagnostic tardif et de
l’apparition rapide d’une chimiorésistance. Il est donc important de rechercher des
alternatives thérapeutiques pour ce cancer.
Le récepteur des œstrogènes ERα est présent en même proportion dans les cancers de
l’ovaire que dans les cancers du sein et les lignées de cancer de l’ovaire présentent le même
caractère d’œstrogéno-sensibilité que les lignées mammaires. Cependant, seuls quelques 10%
des cancers de l’ovaire répondent au traitement hormonal contre près de 70% pour le cancer
du sein. Le fait qu’une proportion non négligeable des cancers de l’ovaire soit ER+ pose la
question de savoir pourquoi ces tumeurs se révèlent relativement réfractaires aux traitements
anti-hormonaux. Ce projet a donc visé à décrypter les mécanismes de la résistance aux
hormonothérapies du cancer du sein et comprendre ceux impliqués dans la résistance
intrinsèque du cancer de l’ovaire.
Pour cela, nous avons utilisé deux modèles de cancer ER+, un modèle mammaire (MCF7)
et un modèle ovarien (BG1), rendus bioluminescents par transfection stable du gène de la
luciférase. Ces cellules ont été cultivées pendant une longue période en présence de
tamoxifène ou de fulvestrant, et ceci afin de créer un modèle mammaire résistant aux
thérapies hormonales, et d’intensifier le caractère intrinsèque de résistance aux traitements
hormonaux de la lignée ovarienne. Nous avons observé une dérégulation de la prolifération in
vitro et in vivo des cellules MCF7 et BG1 résistantes au fulvestrant, donnée qui a été
confirmée par l’étude de marqueurs du cycle cellulaire (P21, cycD1). En outre, nous avons
montré une perte de l’expression d’ERα dans le modèle ovarien résistant au fulvestrant.
Cette étude a permis de mieux comprendre le rôle des œstrogènes et de leurs récepteurs
dans la tumorigénèse des cancers du sein et de l'ovaire et surtout de commencer à décrypter
les mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance aux thérapies hormonales. Ce projet
de recherche pourrait déboucher sur l’identification de nouvelles combinaisons associant
ligands de récepteurs nucléaires (anti-œstrogènes ou ligands sélectifs d’ERβ) et différents
inhibiteurs enzymatiques (inhibiteurs de HDAC ou de kinases) pour le traitement du cancer
de l’ovaire, qui seraient appliqués de manière adjuvante à une chimiothérapie classique. D’un
point de vue plus fondamental, la compréhension des mécanismes impliqués dans la
résistance hormonale d’un modèle ER+ non mammaire sera intéressante.
205
INTRODUCTION
Avec 50 000 nouveaux cas diagnostiqués en France en 2005, et près de 12 000 victimes
par an, le cancer du sein est la première cause de mortalité parmi les cancers gynécologiques.
Environ 70% de ces cancers ont une croissance œstrogéno-dépendante et l’hormonothérapie
tient une place importante dans l’arsenal thérapeutique de lutte contre cette pathologie.
Cependant, l’utilisation des anti-œstrogènes (AEs) dans le traitement du cancer du sein
conduit très fréquemment à un phénomène de résistance. Les mécanismes de la résistance
cellulaire au tamoxifène sont aujourd’hui à l’étude (Marino, Distefano et al. 2001; Le, Gomez et
al. 2002; Schiff, Massarweh et al. 2003). Ils concernent des mutations du RE, des changements
dans l’expression et le recrutement des co-régulateurs. Elles concernent encore l’interaction
avec d’autres voies de signalisations : TGF-β1 (Weatherman and Scanlan 2001), AP-1
(Dumont, Bitonti et al. 1996; Johnston, Lu et al. 1999; Schiff, Reddy et al. 2000), Akt/PI3K
(Campbell, Bhat-Nakshatri et al. 2001; Sun, Paciga et al. 2001), HER2 (Pietras, Arboleda et al.
1995; Kurokawa, Lenferink et al. 2000; Lund, Rovis et al. 2005), IGF-1 (Parisot, Hu et al.
1999), et enfin les MAP kinases (Rabenoelina, Semlali et al. 2002). Enfin, ils font intervenir des
mécanismes non-spécifiques tels que la limitation de la disponibilité intracellulaire du
tamoxifène, la surexpression de facteurs de croissance, l’augmentation de l’angiogénèse, ou
bien l’hétérogénéité de la population cellulaire tumorale (pour revue, MacGregor and Jordan
1998). La balance entre ERα et ERβ pourrait également jouer un rôle, et ERβ serait un facteur
de mauvais pronostic pour le développement de la résistance (Speirs, Malone et al. 1999).
Dans tous ces cas, des traitements hormonaux complémentaires peuvent être proposés
après le développement de la résistance. Ceux-ci incluent l’utilisation d’inhibiteurs
d’aromatase (Baum, Budzar et al. 2002) ou d’anti-œstrogènes purs pour dégrader le RE
(Howell, Robertson et al. 2002).
Le cancer de l’ovaire est la cinquième cause de cancer en France avec près de 4500
nouveaux cas et 3200 décès par an. Près de 90% des cancers de l’ovaire sont d’origine
épithéliale (Auersperg, Wong et al. 2001), leur extension est souvent locale, mais peut aussi être
ganglionnaire ou péritonéale (intestin, reins, rate…). Le traitement est basé sur une chirurgie qui
peut être conservatrice en cas de tumeur de stade précoce survenant chez une femme jeune, et
qui est le plus souvent suivie d’une chimiothérapie. Cependant, seules 10 à 15% des patientes
atteintes d’un cancer de l’ovaire ayant une rechute peuvent être soignées. Il semble donc
important de chercher des alternatives thérapeutiques moins toxiques et plus efficaces.
206
Différentes expériences in vitro ont montré que le cancer de l’ovaire est un cancer œstrogénosensible (Galtier-Dereure, Capony et al. 1992; Miller and Langdon 1997). De plus, les antiœstrogènes, comme le tamoxifène (un anti-œstrogène partiel), inhibent la croissance induite par
les œstrogènes dans des lignées de cancer de l’ovaire ER+, in vitro et chez la souris in vivo
(Galtier-Dereure, Capony et al. 1992; Trope, Marth et al. 2000). Sur un plan clinique, Slotman et
Rao, dans une revue de 52 études, ont rapporté la présence du récepteur des œstrogènes ERα dans
plus de 60% des cancers primaires de l’ovaire (tumeurs dites ER+) (Slotman and Rao 1988).
Paradoxalement, alors que 66% des cancers du sein ER+ répondent à l’hormono-thérapie, seuls 5
à 18% des cancers de l’ovaire y sont sensibles (Havrilesky, McMahon et al. 2001).
Dans notre étude, deux types de lignées cancéreuses épithéliales humaines ER+ ont été
utilisées: la lignée MCF7 de cancer mammaire (Brooks, Locke et al. 1973) et la lignée BG1
qui dérive d’un carcinome ovarien (Geisinger, Kute et al. 1989). A partir de ces lignées, des
modèles cellulaires bioluminescents exprimant le gène de la luciférase de luciole de manière
stable ont été générés (lignées MCF7-Luc et BG1-Luc). Les cellules ont également été
rendues résistantes aux anti-œstrogènes : après 3 mois de culture, elles ont acquis la capacité
de proliférer en absence d’œstrogènes (contrôle, lignées DCCR) et en présence d’antiœstrogènes : un anti-œstrogène partiel (hydroxytamoxifène ou OHT – lignées OHTR) et un
anti-œstrogène total (fulvestrant, ICI 182,780 ou ICI– lignées ICIR). Dans le cas des cellules
BG1, le but était de renforcer le caractère résistant aux traitements par les anti-hormones.
L’objectif de ce travail a été de caractériser ces modèles cellulaires résistants au niveau de
différents paramètres tels que la croissance cellulaire et l’expression de certains gènes
(récepteurs aux estrogènes en particulier), et ce dans le but de mieux décrypter les
mécanismes de la résistance aux hormonothérapies du cancer du sein et de comprendre ceux
impliqués dans la résistance intrinsèque du cancer de l’ovaire. Ce projet pourrait permettre
d’évaluer de nouvelles combinaisons de traitements ciblés, en nous appuyant sur les données
obtenues pour la pathologie mammaire.
MATERIELS ET METHODES
1/ lignées cellulaires
Les lignées cellulaires MCF7 ET BG1 sont cultivées à 37°C, dans une atmosphère contenant
5% de CO2 et 95% d’humidité. Le milieu de culture utilisé pour la maintenance des lignées est
le DMEM-F12 contenant du rouge de phénol (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Gibco,
207
Invitrogen, France), supplémenté avec 5% de FCS (Fetal Calf Serum, sérum de veau fœtal) et
1% d’antibiotique (pénicilline et streptomycine : PS). Les conditions de maintenance des
lignées OHTR, ICIR, et DCCR sont le milieu DMEM-F12 sans rouge de phénol, supplémenté
avec 5% de DCC (dextran coated charcoal -treated FCS, sérum de veau fœtal déstéroïdé au
dextran et au charbon actif), 1% d’antibiotique (PS). Nous maintenons les clones ICIR et OHTR
en ajoutant dans le milieu de culture également 10-8M d’ICI et 10-8M d’OHT respectivement.
2/ Prolifération in vitro
Les cellules sont ensemencées à raison de 1000, 2000, et 4000 cellules par puits en plaques
96 puits. Elles sont traitées tous les 2 jours par l’éthanol (EtOH), œstradiol (E2), OHT et ICI à
10-8M. La mesure de la prolifération se fait au 8ème jour par ajout du réactif MTT (0,5mg/mL,
100µL par puits). Après incubation pendant 4 heures à 37°C, la solution de MTT est remplacée
par du DMSO qui va lyser les cellules et donc libérer et solubiliser les cristaux bleus de
Formazan formés dans les cellules. La lecture au spectrophotomètre est faite à 540 et 620 nm.
3/ Prolifération in vivo
Des souris immunodéficientes nudes athymiques de 6 semaines reçoivent une greffe souscutanée périmammaire de 8 millions de cellules MCF7-Luc mères ou MCF7-Luc-ICIR. Un
silastic d’E2 est implanté dans la région interscapulaire de la moitié des souris pour observer
l’effet de l’E2 sur la croissance des tumeurs. Chaque groupe comprend 3 souris. Le suivi de la
croissance est réalisé une fois par semaine après injection de 250 µL de luciférine 10mg/mL
(substrat de la luciférase), puis imagerie par bioluminescence des souris sous anesthésie
gazeuse, avec une caméra CCD.
Dès le 21è jour post greffe, le volume des tumeurs est mesuré au pied à coulisse.
4/ Western Blot
Les cellules sont traitées 24 heures par les différents ligands, puis les protéines extraites et
dosées par la méthode de Bradford. 40 µg de protéines sont déposés sur un gel d’acrylamide
(12%). La révélation est réalisée avec un anticorps primaire dirigé contre ERα (HC20, Santa
Cruz, Allemagne, 1/4000) puis un anticorps secondaire anti-rabbit (1/5000). Alternativement, la
révélation est faite avec un anticorps primaire dirigé contre p21 (1/100) et un autre contre p27
(Santa Cruz, Allemagne, 1/200) ; puis un anticorps secondaire anti-mouse (1/4000).
208
5/ PCR quantitative
L’extraction des ARNm totaux est réalisée avec le kit Nucleospin™ RNAII sur les cellules
BG1-Luc traitées 24h par EtOH, E2, OHT et ICI à 10-8M. La transcription reverse (RT) est
effectuée à partir de 3 µg d’ARNm avec le kit invitrogen RT superscript II. La PCR
quantitative est réalisée avec une approche SyBrGreen (LightCycler 480, Roche), et rapportée
aux valeurs obtenues pour un gène invariant (protéine ribosomale RS9).
6/ Activité transcriptionnelle
Les cellules MCF7-Luc et ICIR sont transfectées de manière transitoire (JetPEI) avec un
plasmide contenant le gène de la luciférase de Gaussia, sous le contrôle d’un élément de
réponse aux œstrogènes (ERE), ainsi que par un plasmide codant le gène de la βGalactosidase. La détection de la luciférase de Gaussia est réalisée par ajout de tampon
contenant la Cœlenterazine (NaCl 1,1M, EDTA 2,2 mM, KxPO4 220 mM, NaN3 1,3 mM,
Cœlenterazine 1,43 µM, BSA 0,44 mg/ml) et lecture au luminomètre (Mithras, Berthold). Les
données sont normalisées par un dosage β-Galactosidase (tampon de détection : 100 mM
NaHPO4 pH 7,5 ; 10 mM KCl ; 1 mM MgCl2 ; 50 mM βMercaptoethanol ; 1/6ème ONPG 4
mg/mL), dont la lecture est effectuée à 420 nm.
7/ Expression de la luciférase en cellules entières
Les cellules sont ensemencées en plaques 96 puits opaques blanches (Greiner CellStar, D.
Dutcher, Brumath, France), à raison de 5x104 cellules par puits. 24h après, le milieu est
remplacé par le milieu de détection, DMEM-F12 sans rouge de phénol contenant 0,3 mM de
luciférine. A cette concentration, la luciférine diffuse dans la cellule qui produit alors un
signal luminescent stable à partir de 5 minutes, et pendant plusieurs heures. La luminescence
des cellules vivantes est mesurée pendant 2 secondes par puits (Microbeta Wallac).
RESULTATS
1/ Obtention des lignées résistantes
Pour les deux lignées, on nommera la lignée surexprimant le gène de la luciferase « –
LUC », et les lignées dérivées cultivées en présence de milieu privé d’œstrogènes « DCCR »,
en présence d’hydroxytamoxifène « OHTR », et de fulvestrant ou ICI 182,780 « ICIR ».
Les cellules MCF7-Luc ont été cultivées en présence d’anti-œstrogènes de manière
séquentielle (Figure 1A) selon un protocole déjà décrit par le laboratoire (Badia, Oliva et al.
209
2007). En effet, l’obtention de clones résistants à l’ICI 182,780 à 10-8M était impossible, la
pression de sélection faisant mourir toutes les cellules. Ainsi, les clones résistants à l’ICI
182,780 ont été obtenus à partir d’un clone résistant à l’hydroxytamoxifène. Parallèlement,
des clones ont été obtenus par culture des cellules en milieu déprivé d’œstrogènes.
Comparativement aux MCF7, les cellules BG1 ont un comportement différent lorsqu’elles
sont
cultivées
en
présence
d’anti-œstrogènes.
En
effet,
à
même
concentration
d’hydroxytamoxifène ou de fulvestrant (10-8M), on n’observe pas de mort cellulaire. Une
différence de prolifération entre les lignées BG1 n’a été observée qu’à partir de 40 jours de
culture en présence d’anti-œstrogènes comme attesté figure 1C. Au bout de 90 jours de culture,
le pool de cellules a été utilisé pour les expériences in vitro et in vivo (Figure 1B).
Dans un premier temps, nous avons voulu vérifier que les clones obtenus par sélection
avec les anti-œstrogènes avaient une réponse aux ligands œstrogéniques en terme de
prolifération, identique aux lignées mères (Figure 2A et 2B). Les cellules ont été cultivées
pendant 8 jours en présence de ligands (10-8M), et la prolifération a été évaluée par la
méthode de MTT, en normalisant la valeur du jour 8 par rapport à celle du jour
d’ensemencement (J0). Les facteurs d’induction par les ligands ont été calculés par rapport
aux cellules cultivées en présence d’Ethanol (Figure 2C). Pour les deux lignées non
transfectées, on observe une régulation positive de la prolifération par E2 comme
précédemment décrit (Pavlik, Nelson et al. 1991; Pratt and Pollak 1993), et une diminution de
la prolifération sous anti-œstrogènes qui est significative pour l’ICI 182,780 pour les cellules
MCF7, comme précédemment décrit (Pratt and Pollak 1993). En revanche, pour les BG1, on
ne note pas de régulation négative par OHT ou ICI, voire même une régulation positive par
OHT (Wong and Matsumura 2006). Le facteur d’induction par E2 est diminué d’un facteur
2,8 pour les MCF7-Luc, par contre, la régulation par les anti-hormones est du même ordre.
Dans le cas des BG1, les facteurs d’induction en présence d’œstradiol comme d’antiœstrogènes sont du même ordre.
Nous avons donc poursuivi notre étude par un suivi de la prolifération des lignées
résistantes dans les mêmes conditions (8 jours de traitement par les ligands). Pour les cellules
MCF7-Luc OHTR, la régulation par E2 est perdue mais on note une augmentation de la
prolifération basale. Par contre, La régulation par l’ICI est maintenue. La lignée MCF7-Luc
ICIR ne présente aucune régulation par les hormones, par contre, le niveau basal de
210
prolifération est augmenté d’un facteur 2,5. Enfin, la lignée -Luc DCCR présente le même
profil que la lignée OHTR.
Concernant les lignées BG1, nous observons une régulation de la prolifération identique
pour les OHTR que pour la lignée BG1-Luc, avec un niveau basal de prolifération augmenté.
La lignée ICIR ne présente plus aucune régulation par les ligands, comme dans le cas de la
lignée MCF7-Luc ICIR. Enfin, la lignée DCCR présente le même profil que la lignée ICIR.
3/ Expression de marqueurs du cycle cellulaire
Au vu des résultats obtenus en prolifération cellulaire, nous avons voulu tester l’expression
protéique de quelques marqueurs du cycle cellulaire (Figure 3A et 3B). Pour les MCF7-Luc,
nous n’observons pas de différence notable de l’expression ou de la régulation des marqueurs
du cycle cellulaire p21 ou p27 par les ligands entre les lignées résistantes et la lignée mère.
Concernant les lignées BG1-Luc, nous notons une diminution de l’expression de p21 dans la
lignée ICIR mais pas de p27 (donnée non montrée). Nous avons voulu confirmer ce dernier
résultat par PCR quantitative, afin d’analyser si cette régulation s’effectue au niveau
transcriptionnel (Figure 3C). Nous constatons une diminution d’un facteur 3 de l’expression
au niveau transcriptionnel de p21 et également de cycline D1 (Figure 3D) dans les cellules
BG1-Luc-ICIR. En revanche, nous confirmons qu’il ne semble pas y avoir de variation du
niveau d’expression de p27 (donnée non montrée).
4/ Expression des récepteurs des œstrogènes
Nous avons comparé dans un premier temps l’expression relative des niveaux d’ARN messagers
de ERα et ERβ dans les lignées MCF7 et BG1 par rapport aux lignées HELN ERα et HELN ERβ
précédemment caractérisées (Escande, Pillon et al. 2006). Nous observons des niveaux comparables
et importants de ERα dans les lignées BG1 et MCF7 (Figure 4A). Par contre, l’expression de ERβ
est très faible dans les BG1 et quasi nulle dans la lignée MCF7 (figure 4B).
Puis, nous avons voulu comparer les niveaux d’expression relative des protéines ERα
dans les lignées mères et résistantes, après culture pendant 24h en présence de ligands (E2,
OHT, ICI, 10-8M). Pour les cellules MCF7-Luc mères, nous observons une diminution de
l’expression du récepteur ERα sous E2 et sous ICI et une augmentation de l’expression sous
OHT (figure 4C). Les mêmes profils d’expression sont observés pour les trois autres lignées
résistantes. Concernant la lignée mère BG1-Luc, le même type de régulation est observé, ainsi
211
que pour les lignées DCCR et OHTR (Figure 4D). De manière très intéressante, l’expression
d’ERα semble complètement abolie pour la lignée ICIR, et cela même en présence d’OHT.
Nous avons voulu confirmer ce résultat par PCR quantitative en temps réel, et ceci afin
d’analyser si cette abolition d’expression apparaît au niveau transcriptionnel ou traductionnel
(Figure 4E). Nous confirmons l’abolition quasi complète de l’expression de ERα au niveau
messager, avec une diminution d’expression d’un facteur 10, et cela quelque soit le ligand
ajouté dans le milieu de culture.
Concernant l’expression du récepteur bêta des œstrogènes, nous l’avons analysée par PCR
quantitative, aucun anticorps n’étant disponible dans le commerce pour visualiser des niveaux
d’expression endogènes très faibles. Nous n’avons pas noté de variation d’expression de cet
isotype dans les cellules MCF7-Luc ou MCF7-Luc résistantes (données non montrées). Nous
observons par contre une légère diminution de ERβ dans les lignées BG1-Luc OHTR et ICIR.
5/ Prolifération in vivo
Dans un premier temps, nous avons voulu vérifier les niveaux d’œstrogènes dans le sérum
des souris après administration par un silastic d’œstradiol. En effet, bien que les niveaux
attendus soient bien plus élevés que les niveaux physiologiques observés chez la souris, nous
souhaitions que les niveaux circulant soient plus proches de ceux observés pour une femme
proche de la ménopause (pré-ménopause ou post-ménopause), puisque les tumeurs greffées
sont d’origine humaine.
Cette méthodologie avait déjà été présentée dans de précédentes études (O'Regan, Cisneros
et al. 1998; Pillon, Servant et al. 2005; O'Regan, Osipo et al. 2006). Dans notre étude, un tube
de type « silastic » est rempli d’un mélange œstradiol/cholestérol (1 :9, v :v), alors que dans
de précédents travaux où les niveaux d’œstradiol avaient été rapportés (O'Regan, Cisneros et
al. 1998; O'Regan, Osipo et al. 2006), le silastic était rempli d’œstradiol pur. Nous avons
donc posé un silastic à des souris immunodéprimées, et ceci afin d’avoir le même fond
génétique que celui des expériences impliquant des xénogreffes. Les animaux ont été
euthanasiés à différents temps, le volume total sanguin prélevé par la veine porte, et le sérum
dosé pour ses niveaux d’œstradiol (Figure 5A). Les niveaux d’œstradiol d’une souris nude
athymique sont de 97 pg/ml, ils sont doublés par la pose d’un silastic (1 semaine), ce qui
correspond aux niveaux d’une femme pré-ménopausée, qui varient au cours du cycle entre
150 pg/mL et 350 pg/mL (Osborne and Schiff 2005). A 6 semaines, les niveaux d’œstradiol
sont revenus aux niveaux observés pour une souris nude.
212
Les niveaux d’œstradiol d’une souris nude ovariectomisée sont de 12,5 pg/ml, à la limite de
détection du dosage. Ils sont en dessous des niveaux observés pour la moyenne des femmes
post-ménopausées (niveaux allant de 35 mg/jour à 40mg/jour, (Buzdar, Marcus et al. 1988).
Dans un second temps, nous avons voulu vérifier les niveaux d’expression de la luciférase
des lignées MCF7-Luc résistantes par rapport à la lignée mère MCF7-Luc (Figure 5B). En
effet, pour comparer la prolifération entre des souris greffées avec les différentes lignées, il
fallait connaître le nombre de photons émis par cellule dans les différentes lignées. Pour cela,
les cellules ont été ensemencées en dilutions successives sur une plaque 96 puits, et la lecture
réalisée par ajout de luciférine dans le milieu, et lecture au luminomètre (E&G Wallac). Nous
observons une diminution du niveau d’activité luciférase pour les lignées résistantes, d’un
facteur 3,5 ; 1,8 et 5,9 pour la lignée ICIR, DCCR et OHTR, respectivement. Dans la suite, pour
les expériences in vivo, le niveau d’activité luciférase sera donc corrigé par ces facteurs.
Nous avons enfin voulu comparer la prolifération in vivo entre les lignées MCF7-Luc et
ICIR, qui présentaient le profil le plus différent sous administration d’E2 in vitro. Pour cela, la
moitié des animaux a reçu un silastic d’œstradiol 2 jours avant la greffe, puis toutes les souris
ont été greffées au niveau de la glande mammaire (entre les mamelons inguinaux 4 et 5, pour
une greffe au niveau du nœud lymphatique inguinal), à raison de 8 millions de cellules par
animal. La prolifération tumorale a été suivie par bioluminescence une fois par semaine dès le
jour de la greffe (Figure 6C), et par mesure au pied à coulisse dès l’apparition de tumeurs
mesurables (jour 21, Figure 6D). Nous observons une corrélation entre la mesure de
bioluminescence des cellules MCF7-Luc et la mesure au pied à coulisse de 0,88 (Figure 6A et
6B), ce qui correspond aux données observées dans la littérature (Pillon 2005). En effet, la mesure
par bioluminescence ne prend en compte que les cellules vivantes et pas les cellules nécrosées, à
l’inverse de la mesure au pied à coulisse, expliquant ce coefficient de corrélation.
Nous avons observé que la prolifération des xénogreffes de cellules MCF7-Luc mères est
plus faible que celle des MCF7-Luc ICIR, comme observé in vitro. A 21 jours post-greffe, le
volume tumoral des cellules MCF7-Luc ICIR est 10 fois plus élevé que celui des cellules
mères. Le même ratio est observé par mesure de bioluminescence. A 28 jours, ce ratio est à 30
pour la bioluminescence, et toujours à 10 pour la mesure au pied à coulisse, soulignant sans
doute un début de nécrose.
Sous E2, le volume tumoral des cellules MCF7-Luc ICIR est 2 fois plus élevé que celui
des cellules mères, que ce soit à J21 ou J28, tandis que par bioluminescence, ce ratio est de 3.
213
De plus, la prolifération tumorale des MCF7-Luc est augmentée sous E2 d’un facteur 22 à J21
et 18 à J28, tout comme décrit dans la littérature (Soule and McGrath 1980; Shafie and
Grantham 1981; Seibert, Shafie et al. 1983). De manière intéressante, la prolifération
tumorale des MCF7-Luc ICIR est également augmentée sous E2, d’un facteur 2,4 à J21 et 3,4
à J28, données qui ne concordent pas avec ce qui est observé in vitro.
DISCUSSION
1/ Conclusions
Dans cette étude, nous avons généré des modèles hormonodépendants résistants aux antiœstrogènes hydroxytamoxifène et ICI 182,780. Parallèlement, des clones ont été obtenus par
culture des cellules en milieu privé d’œstrogènes, ce qui reflète, d’une certaine manière un
traitement des cellules cancéreuses par anti-aromatases. Nous avons caractérisé ces modèles
cellulaires in vitro et in vivo avec des résultats intéressants.
Concernant les cellules BG1 issues de cancer ovarien, nous avons constaté qu’au cours du
processus de sélection par les anti-œstrogènes, l’action inhibitrice de l’hydroxytamoxifène et
du ICI 182,780 sur leur prolifération était moins importante que dans le cas des cellules
MCF7, alors que l’induction de la croissance par l’œstradiol est aussi importante voire plus.
Dans les cellules de cancer du sein rendues résistantes à l’ICI, nous avons mis en évidence une
croissance plus rapide que la lignée mère. Elles perdent également toute régulation par les ligands
des récepteurs des œstrogènes in vitro. En revanche, un effet de l’œstradiol qui n’apparaît pas in
vitro a été démontré in vivo. L’effet de l’E2 sur la croissance des tumeurs in vivo pourrait être lié à
l’influence de facteurs de croissance sécrétés dans le stroma, et non uniquement à une action de
l’E2 sur les récepteurs des œstrogènes des tumeurs. Ceci expliquerait la différence de régulation
par l’E2 observée entre les proliférations in vitro et in vivo.
Dans les cellules de cancer de l’ovaire, nous avons observé une perte de la régulation de la
prolifération par les hormones, et d’autre part, une diminution de l’expression de protéines
impliquées dans le cycle cellulaire (p21 et CycD1).
Concernant la régulation de l’expression de la protéine ERα dans les MCF7, nos résultats sont
en accord avec la bibliographie. En effet, ERα est une protéine ubiquitinylée dont la stabilité et la
dégradation sont affectées différemment selon si le récepteur est lié à des agonistes ou des
antagonistes. En présence d’E2, la dégradation est accélérée et la demi-vie du récepteur diminuée.
214
Par ailleurs, le tamoxifène stabilise ERα après traitement prolongé alors qu’un antagoniste pur
comme l’ICI a été démontré comme pouvant diminuer la demi-vie du récepteur.
Enfin, pour expliquer la perte de l’expression du récepteur ERα dans les BG1, plusieurs
hypothèses sont possibles, parmi lesquelles la perte d’un allèle du gène, ou une modification
du promoteur par méthylation comme décrit pour certaines lignées mammaires résistantes
(Ferguson, Lapidus et al. 1995).
2/ Perspectives
Des expériences complémentaires doivent compléter ce travail, in vitro et in vivo. Un suivi
de la prolifération in vivo des BG1-Luc résistantes pourra être réalisé. Nous en avons validé le
modèle par xénogreffe orthotopique dans l’ovaire avec la lignée mère (article : A novel in
vivo model of estrogen-responsive ovarian cancer using non-invasive bioluminescence
imaging). Nous chercherons également à étudier l’expression des gènes cibles des récepteurs
des œstrogènes, tels que RARα, LRH-1 (Annicotte, Chavey et al. 2005), SDF1 (Hall and
Korach 2003), PR, CathepsinD ou PS2 (Rio, Bellocq et al. 1987; Rochefort 1999).
Dans un second temps, ce travail pourra être complété par l’étude de la modulation de la
voie de signalisation des récepteurs ErbB. En effet, il a été montré que les lignées de cancer
du sein qui expriment HER2 ont une résistance accrue au tamoxifène, et que ce mécanisme
impliquerait un dialogue entre ERs et HER2 (Massarweh and Schiff 2006). Bien qu’une métaanalyse (de Graeff, Crijns et al. 2009) ait montré que les statuts de HER2 et EGFR ne soient
pas de bons marqueurs pronostiques pour le cancer de l’ovaire, il serait cependant intéressant
de connaître le niveau d’expression et d’activation des récepteurs à tyrosine kinase (HER2,
EGFR, HER3 et HER4) dans nos cellules résistantes aux anti-œstrogènes. De même, il
faudrait connaître les niveaux d’expression des ligands de ces récepteurs (amphiregulin, EGF,
epiréguline…) et les éventuelles dérégulations dans l’expression et la phosphorylation des
différents acteurs impliqués dans les voies de signalisation aval que sont les voies
PI3K/Akt/mTOR et MAPK (Ras/Raf/MEK/ERK) (Ghayad, 2009).
Par ailleurs, notre laboratoire a récemment obtenu des données intéressantes concernant
l’expression de certaines HDACs dans les lignées de cancer du sein résistantes aux antiœstrogènes (résultats non publiés). Nous pourrions, pour explorer le rôle des HDACs dans la
résistance aux thérapies hormonales des lignées cancéreuses ovariennes, mesurer l’expression
des 11 HDACs (classe I, II et IV) puis l’effet de traitements par différents inhibiteurs de
HDACs (sélectifs ou non) et disponibles au laboratoire (Duong, Bret et al. 2008), sur
215
l’expression des récepteurs des œstrogènes et sur d’autres gènes importants dans le contrôle
du cycle cellulaire ou de l’apoptose.
Nous pourrions également, pour mieux comprendre les mécanismes de la résistance
intrinsèque aux thérapies hormonales des cellules de cancer de l’ovaire, réaliser une étude
globale transcriptomique pour préciser l’expression des cofacteurs transcriptionnels, des gènes
cibles des voies œstrogéniques, ainsi que des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire.
Enfin, nous pourrions étudier l’effet de traitements combinés in vitro et in vivo, afin
d’inverser la résistance des lignées de cancer ovarien aux traitements hormonaux. Nous
pourrions tester in vitro différentes combinaisons de traitements sur la prolifération cellulaire
des lignées BG1 résistantes. En fonction des résultats obtenus ci-dessus, différentes molécules
pourraient être testées : Lapatinib (qui inhibe la phosphorylation de HER2 et EGFR) ou
Trastuzumab (anticorps qui bloque la partie extracellulaire du récepteur trans-membranaire),
LY294002 (inhibiteur de PI3K) , PD98059 (inhibiteur de MEK) (Ghayad, Vendrell et al.
2010), rapamycine (inhibiteur de mTOR) (Ghayad, Bieche et al. 2008) et différents
inhibiteurs de HDACs (SAHA, MS-275, MC1575) (Munster, Lacevic et al. 2009). Pour
toutes ces molécules, leur effet seul ou combiné serait analysé avec l’utilisation de ligands des
ERs (anti-œstrogènes ou ligand sélectifs d’ERβ). Enfin, ces traitements pourraient aussi être
appliqués in vivo et la croissance tumorale et l’apparition des métastases suivie.
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LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Obtention des lignées résistantes aux anti-œstrogènes MCF7 (A) et BG1 (B). C,
nombre de cellules cumulé suite à la sélection des lignées MCF7 et BG1, par OHT
Figure 2 : La modulation de la prolifération par les ligands est modifiée dans les cellules
résistantes aux anti-œstrogènes. Les ligands sont appliqués à 10-8M et renouvelés tous les 2
jours pendant 8 jours. La prolifération est représentée en % du nombre de cellules au jour 0.
A, B, comparaison des niveaux de prolifération entre la lignée MCF7 et la lignée MCF7-Luc
(A) ou entre la lignée BG1 et BG1-Luc (B), en présence du véhicule (EtOH), E2, OHT ou
ICI. C, facteurs d’induction de la prolifération des lignées par les ligands par rapport au
véhicule (Ethanol). D, Prolifération normalisée des lignées MCF7-Luc et résistantes en
présence du véhicule (ctrl), E2, OHT ou ICI. E, Prolifération normalisée des lignées BG1-Luc
et résistantes en présence du véhicule (ctrl), E2, OHT ou ICI.
Figure 3 : Niveaux d’expression de marqueurs du cycle cellulaire. A, B, Niveaux
d’expression des protéines p21 et p27 dans les lignées MCF7-Luc (A) ou BG1-Luc (B), après
24h d’induction par les ligands, véhicule (DCC), E2, OHT ou ICI. C, D, niveaux d’expression
des ARNm dans les lignées BG1-Luc, après 24h d’induction par les ligands, véhicule (ctrl),
E2, OHT ou ICI.
Figure 4 : Niveaux d’expression des récepteurs des œstrogènes dans les lignées résistantes.
A, B, Niveau d’expression des ARNm de ERα et ERβ dans les lignées HELN ERα, MCF7,
BG1 et HELN ERβ. C, D, Niveaux d’expression protéiques de ERα dans les lignées MCF7219
Luc et résistantes, et BG1-Luc et résistantes. E, Niveaux d’expression ARNm de ERα dans
les lignées BG1-Luc et résistantes.
Figure 5 : A, Niveaux d’œstradiol chez une souris nude, ovariectomisée, ayant reçu un
silastic d’œstradiol depuis 1 semaine ou 6 semaines (pg/ml). B, comparaison des niveaux
d’activité luciférase dans les lignées MCF7-Luc et résistantes.
Figure 6 : Prolifération des lignées MCF7-Luc et MCF7-Luc ICIR in vivo. Les cellules
MCF7-Luc et ICIR ont été greffées au niveau de la glande mammaire, et la prolifération
tumorale suivie par imagerie et mesure au pied à coulisse. A, superposition de l’image en
luminescence et de la photographie d’une souris représentative de chaque groupe. B,
corrélation entre le volume tumoral et l’activité luciférase. C, D, prolifération par mesure de
l’activité luciférase (C) ou par mesure au pied à coulisse (D). E, F, facteur d’induction du
volume tumoral des lignées MCF7-Luc et ICIR par l’E2 au jour 21 (E) et 28 (F) post-greffe.
220
FIGURES
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222
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224
225
226
Articles et travaux de thèse EFFET D’UN INHIBITEUR D’HISTONE DESACETYLASE (LA TSA) SUR LES LIGNEES CANCEREUSES MAMMAIRE MCF‐7 ET OVARIENNE BG1 INTRODUCTION PREALABLE SUR LES HDAC ET LES HDACI
1/ Les histones désacétylases (HDAC)
a) Structure et organisation de la chromatine
Chez les eucaryotes, l’empaquetage de l’ADN et la dynamique de la structure chromatinienne jouent un rôle primordial dans la régulation de l’expression des gènes modulant l’accès des facteurs de transcription sur l’ADN. L’unité fondamentale de la chromatine est le nucléosome, constitué d’environ 146 pb, sur lequel vient s’enrouler un octamère d’histones composé de deux copies de chaque isoforme d’histones H2A, H2B, H3 et H4. Les histones subissent une série complexe de modifications post‐traductionnelles, tout comme les RE, que sont la phosphorylation, la méthylation, l’acétylation, l’ubiquitinylation, et la sumoylation dont l’enchaînement et la combinaison respectent un code. Ce code est déterminé par les enzymes qui modifient spécifiquement les résidus des histones et sera lu par des protéines non histones qui viendront s’associer au niveau de l’ADN (Turner, 2002). L’acétylation est une modification très étudiée et dépend de la balance entre deux activités enzymatiques opposées : HAT et HDAC. De façon simplifiée, l’acétylation des lysines atténue la charge positive des histones, provoquant une baisse de leur affinité pour l’ADN, ce qui favorise l’accès à la machinerie transcriptionnelle et l’activation de la transcription. A l’opposé, le recrutement des HDAC est associé à une structure hautement condensée de la chromatine et la répression de la transcription (Figure 1). L’acétylation de la chromatine peut donc également jouer un rôle très important dans l’activité des RE. La figure 2 propose un mécanisme d’activation de la transcription faisant intervenir l’état de condensation de la chromatine. 227
Articles et travaux de thèse Figure 1 : Acétylation des histones et état de la chromatine.
D’après Johnstone, 2002.
La transcription est régulée par deux activités enzymatiques opposées, HAT (vert) et HDAC (marron).
L’état désacétylé des histones est associé à une structure chromatinienne dite fermée et à la répression
de la transcription. L’acétylation des histones par les HAT permet alors l’ouverture de la chromatine et
l’activation de la transcription.
Figure 2 : Représentation schématique de l’assemblage du complexe de
transcription des RE faisant intervenir l’acétylation.
D’après Shang et al., 2000.
Formation séquentielle des complexes menant à l’activation de l’expression des gènes cibles par les
agonistes (tels que l’E2). L’E2 lie le REα, puis ce complexe se fixe à l’ADN. Cette étape est
immédiatement suivie par le recrutement des complexes d’histones acétyl transférases (HAT)
comprenant p160, p300 et PBP. Le complexe HAT p300 modifie localement la structure de la
chromatine via l’acétylation pour faciliter le recrutement de l’ARN polymérase II. La partie Cterminale de l’ARN pol II est phosphorylée et CBP remplace p300 dans le complexe, qui recrute alors
pCAF (p300/CBP-Associated Factor, également nommé K (lysine) acetyltransferase 2B (KAT2B)).
CBP acétyle p160 et mène à la libération de p160 et du RE. Enfin, CBP et pCAF se désassemblent du
complexe et le cycle est répété.
228
Articles et travaux de thèse b) Les différentes familles de HDAC
Les HDAC sont des protéines très conservées au cours de l’évolution depuis la bactérie jusqu’aux organismes eucaryotes supérieurs. Chez l’Homme, 18 HDAC ont été décrites et sont réparties en quatre classes selon leur homologie de séquence (Figure 3). Les HDAC possèdent un domaine catalytique leur conférant la faculté de désacétyler les protéines. Le domaine catalytique des HDAC de classe I (HDAC 1, 2, 3 et 8) est situé dans la région N‐terminale et représente la majeure partie de la protéine. Ces HDAC possèdent une séquence NLS qui suggère leur localisation nucléaire (de Ruijter et al., 2003). Les HDAC de classe II (HDAC4, 5, 7, 6, 9 et 10) ont leur domaine catalytique dans la partie C‐terminale. Elles possèdent, comme les HDAC de classe I, une séquence NLS, mais également un motif d’export nucléaire NES (Nuclear Export Sequence). Ces deux motifs confèrent aux HDAC de classe II la capacité d’effectuer la navette entre le noyau et le cytoplasme et témoignent donc de leur trafic intracellulaire (Grozinger and Schreiber, 2000; McKinsey et al., 2001). Les HDAC de classe I, II et IV présentent une activité enzymatique zinc dépendante. Les HDAC de classe III forment une famille particulière, dont l’activité désacétylase est dépendante du NAD+. Figure 3 : HDAC de classe I, II et IV humaines : domaines catalytiques.
D’après Minucci et al., 2006.
Les HDAC humaines de classe I, II et IV sont représentées, avec leurs domaines catalytiques, de
différentes couleurs pour chaque classe. Les degrés d’homologie (séquences entières) entre les HDAC
de même classe sont indiqués entre parenthèses.
Les HDAC régulent la transcription en s’associant aux complexes co‐répresseurs, et ainsi, par le biais d’interactions directes ou indirectes via les co‐régulateurs, jouent un rôle dans l’inhibition 229
Articles et travaux de thèse de l’activité transcriptionnelle (Bertos et al., 2001). Elles peuvent participer indirectement à la régulation de la transcription par la désacétylation de facteurs de transcription tels que p53 (Ito et al., 2002) et les protéines cellulaires dont hsp90 (Glozak et al., 2005). Afin d’étudier les fonctions biologiques des HDAC, des modèles de souris transgéniques ont été développés par différentes équipes. Les observations ont démontré un rôle des HDAC de classe I dans le maintien de la prolifération et la survie cellulaires (Glaser et al., 2003b; Huang et al., 2005a; Lagger et al., 2002). A l’opposé, les HDAC de classe II, dont l’expression est tissu spécifique, seraient plutôt impliquées dans les phénomènes de différentiation cellulaire (Dequiedt et al., 2003; Glaser et al., 2003a). c) Acétylation et cancer
La balance acétylation/désacétylation joue un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes et son déséquilibre peut conduire à de graves pathologies dont les cancers. De plus, les HDAC sont impliquées dans de multiples processus cellulaires dont le développement, la différentiation, la prolifération et la survie cellulaires, et des altérations de l’activité ou de l’expression des HDAC pourraient alors participer à la tumorigénèse. Effectivement, il a été rapporté qu’un recrutement aberrant des HDAC entraînait une altération de la transcription des gènes et jouait un rôle dans le développement de la leucémie aigue promyélocytaire (LAP) (Minucci et al., 2001). De plus, étant donné le rôle des HDAC de classe I et II dans la prolifération et la survie cellulaire, il n’est pas surprenant que ces enzymes soient surexprimées dans les cancers, comme par exemple le cancer colorectal (Huang et al., 2005a; Wilson et al., 2006) et les leucémies (Bradbury et al., 2005) pour les HDAC de classe I, ou bien les carcinomes pulmonaires pour lesquels la diminution des HDAC de classe II serait un mauvais pronostic (Osada et al., 2004). Le rôle des HDAC dans le tissu mammaire normal ou tumoral reste encore aujourd’hui mal connu. Plusieurs arguments suggèrent cependant qu’elles jouent un rôle important dans ce tissu. En effet, plusieurs travaux ont mis en évidence des interactions entre les HDAC et le REα (Kawai et al., 2003) ou certains cofacteurs des RE tels que NRIP1 (RIP140) (Castet et al., 2004), SMRT ou N‐COR (Fischle et al., 2002). D’autre part, la surexpression de HDAC1 dans les cellules tumorales mammaires augmente leur prolifération et leur capacité d’invasion (Kawai et al., 2003). De plus, le gène codant pour la protéine HDAC6 fait partie des gènes œstrogéno‐régulés dans la lignée tumorale mammaire MCF‐7 (Inoue et al., 2002). 230
Articles et travaux de thèse L’expression de HDAC6 a été mise en évidence par immunohistochimie dans les tumeurs du sein, et notamment son expression est plus élevée dans les tumeurs RE négatives (Zhang et al., 2004). Par contre, les études de l’expression de HDAC6 en tant que valeur pronostique ont donné lieu à des résultats contradictoires (Saji et al., 2005). Enfin, une étude portant sur HDAC1 et HDAC3 dans des biopsies de tumeurs mammaires a montré que l’expression de ces HDAC était corrélée avec celle du REα, et au statut prolifératif des tumeurs, avec HDAC1 comme marqueur de bon pronostic (Krusche et al., 2005). 2/ Les inhibiteurs de HDAC (HDACi)
L’activité ou l’expression des HDAC étant altérée dans certains cancers, ces enzymes représentent des cibles attractives pour la thérapie. De nombreux travaux se sont portés sur les inhibiteurs de HDAC et ont mis en évidence leur capacité à exercer une activité anti‐tumorale sur des modèles de culture cellulaire ou animaux. Des résultats préliminaires issus d’études cliniques confirment également cet effet sur différents types de cancers à des doses relativement bien tolérées (Prince et al., 2009). Les HDACi semblent donc représenter une nouvelle classe d’agents thérapeutiques. Il existe à ce jour 6 classes de HDACi. Cette classification est basée sur leur structure chimique, ainsi que sur celle de leur groupe fonctionnel permettant d’inhiber l’activité HDAC (Mottet and Castronovo, 2008) (Figure 4). Parmi ces différents groupes, on distingue les HDACi provenant de source naturelle et les molécules synthétiques (Drummond et al., 2005). La trichostatine A (TSA), qui a été le premier acide hydroxamique naturel découvert (Yoshida et al., 1990a), est issue du produit de fermentation du champignon Streptomyces. La TSA appartient aux HDACi de classe I. La classe II de HDACi comprend le SAHA (Suberoyl Analide Hydroxamic Acid (Richon et al., 1998)) et LAQ824. Les peptides cycliques représentent une classe de structure complexe contenant le depsipeptide (FK‐228), une prodrogue métabolisée en agent actif provenant de la bactérie Chromobacterium violaceum. Les principaux carboxylates décrits dans la littérature sont le butyrate de sodium (NaBu), le phénylbutyrate et l’acide valproïque. L’acide valproïque est un médicament prescrit pour le traitement de l’épilepsie et son activité inhibitrice des HDAC a été découverte ultérieurement (Gottlicher et al., 2001). 231
Articles et travaux de thèse Figure 4 : Structures chimiques et classement des HDACi.
D’après (Drummond et al., 2005).
Les HDACi sont répartis dans 6 classes. (a) classe I : carboxylates, molécules de faible poids
moléculaire ; (b) classe II : acides hydroxamiques ; (c) classe III : benzamides ; (d) classe IV : époxyketones ; (e) classe V : peptides cycliques ; (f) classe VI : molécules hybrides.
232
Articles et travaux de thèse D’une manière générale, les HDACi de classes II et V/VI (acides hydroxamiques et peptides cycliques) sont efficaces et présentent une activité inhibitrice de l’ordre du nanomolaire, alors que les HDACi de classe I et III (carboxylates et benzamides), tels que le MS‐275 sont utilisés à des concentrations de l’ordre du millimolaire (Drummond et al., 2005). Parce que les HDACi présentent une certaine variété de structure, et qu’ils sont supposés présenter des dispositions spatiales et des fonctionnalités différentes selon les systèmes biologiques, les travaux de recherche actuels focalisent une attention particulière sur le ciblage pour inhiber sélectivement les HDAC (Marks et al., 2004b). Effectivement, Les HDACi présentent peu de sélectivité, et ceux qui sont connus à ce jour sont dits à large spectre, i.e. capables d’inhiber plusieurs classes de HDAC (Bolden et al., 2006). Ainsi, par exemple, la TSA, le SAHA et LAQ824 sont des HDACi de classe II, et inhibent les HDAC des classes I, II et IV. (Figures 4 et 5). Figure 5 : Les différentes classes de HDAC et les HDACi qui les inhibent.
D’après Bolden et al., 2006.
233
Articles et travaux de thèse Dans la cellule, les inhibiteurs de HDAC induisent à la fois l’acétylation des histones et des protéines non histone. Au travers de ces deux actions, les HDACi peuvent exercer des régulations transcriptionnelles et post‐traductionnelles, qui d’une manière générale, conduisent à l’arrêt du cycle cellulaire, la différentiation cellulaire et/ou l’apoptose (Dokmanovic and Marks, 2005 ; Bolden et al., 2006). Les HDACi peuvent réguler la transcription des gènes soit directement par l’acétylation des histones, soit indirectement via l’acétylation des facteurs de transcription dont l’activité est modulée par cette modification (Glaser et al., 2003b; Peart et al., 2005). Ainsi, les HDACi sont capables de moduler la prolifération et la progression du cycle cellulaires (oncogènes ou gènes suppresseurs de tumeurs), la survie cellulaire (voies de signalisation des cytokines ou facteurs de croissance), et la synthèse ou la dégradation des protéines par le système ubiquitine/protéasome (Drummond et al., 2005). Pour exercer leurs fonctions antiprolifératives, les HDACi régulent l’expression de gènes qui participent à l’arrêt du cycle cellulaire et à l’inhibition de la croissance cellulaire. Par exemple, p21, un inhibiteur du cycle cellulaire, est compté parmi les gènes cibles des HDACi et est le plus décrit dans la littérature. L’induction de p21 suite à l’inhibition des HDAC serait en partie nécessaire pour l’arrêt du cycle cellulaire (Gui et al., 2004; Richon et al., 2000). Le blocage de l’activité des HDAC conduit également à l’inhibition des voies de signalisation des cytokines du facteur de transcription NF‐κB (Mitsiades et al., 2004). Les HDACi interfèrent également avec les voies de signalisation de la prolifération cellulaire par la répression de l’expression du gène c‐
myc ou l’induction de l’expression de gènes antagonistes à ses fonctions (Peart et al., 2005). Les HDACi sont également capables d’induire l’apoptose via l’induction de la transcription de gènes pro‐apoptotiques ou alors la répression de gènes anti‐apoptotiques (Lindemann et al., 2004). Ainsi, les HDACi apparaissent comme de bons agents thérapeutiques afin de traiter certains cancers (Dokmanovic and Marks, 2005; Drummond et al., 2005; Glaser et al., 2003a; Johnstone, 2002; Lindemann et al., 2004; Marks and Dokmanovic, 2005; Mottet and Castronovo, 2008; Wang et al., 2001b). Ceci a été confirmé in vivo par des travaux qui ont décrit le potentiel antitumoral de certains HDACi dont la TSA, le SAHA, le MS‐275 capables d’inhiber la croissance d’une variété de tumeurs solides ou hématologiques (Marks et al., 2004a ; Dokmanovic and Marks, 2005). De plus, les HDACi sont capables de diminuer la croissance tumorale indirectement par l’inhibition de la 234
Articles et travaux de thèse néovascularisation des tumeurs, en bloquant l’angiogénèse, comme ceci a été montré in vivo pour le SAHA et la TSA par exemple (Deroanne et al., 2002; Kim et al., 2001; Kwon et al., 2002). D’autre part, plusieurs études ont mis en évidence l’effet antiprolifératif des HDACi dans des modèles in vitro et in vivo de tumeurs mammaires (Davis et al., 2000; Margueron et al., 2003; Vigushin et al., 2001). De plus, cet effet antiprolifératif était plus marqué dans les lignées tumorales mammaires REα positives que dans les lignées REα négatives (Margueron et al., 2003). Enfin, les HDACi semblent capables de réguler l’expression des RE. Dans les lignées tumorales mammaires RE+, les HDACi diminuent de manière drastique lʹexpression de REα au niveau transcriptionnel (Margueron et al., 2004). Lʹexpression de REβ, actuellement considéré comme un gène suppresseur de tumeur, est, quant à elle, augmentée sous lʹeffet des HDACi (Duong et al., 2006; Jang et al., 2004). Les HDACi ont également des effets complexes sur lʹactivité transcriptionnelle des RE. Duong et coll. ont ainsi montré que ces inhibiteurs augmentaient lʹactivité transcriptionnelle des RE avec un effet plus marqué pour le REβ que le REα (Duong et al., 2006) (travail effectué dans l’équipe). De plus, dans les lignées mammaires RE+, le traitement par les HDACi réverse lʹeffet anti‐œstrogénique de lʹhydroxy‐tamoxifène vers une activité agoniste (Margueron et al., 2004). Des études portant sur les HDACi ont comparé les réponses des lignées tumorales avec celles de lignées cellulaires « normales » et ont montré que les lignées tumorales étaient environ 10 fois plus sensibles aux HDACi (Qiu et al., 1999). Malgré que ces observations restent mal comprises, elles ne semblent pas être dues à une différence de capacité à inhiber l’activité HDAC. Effectivement, l’accumulation des histones acétylées est observée dans les deux types cellulaires (Butler et al., 2000). Comme les HDACi ciblent une activité qui a lieu dans toutes les cellules, le potentiel thérapeutique de ces composés observé in vitro, in vivo, et dans les études cliniques pourrait être le résultat d’une différence entre les cellules cancéreuses et les cellules saines pour la réponse à l’inhibition de l’activité HDAC (Marks et al., 2004b). Plusieurs des HDACi sont actuellement évalués au cours d’essais cliniques de phase I et II chez des patients porteurs de tumeurs solides ou d’hémopathies malignes (Tableau 1) (Liu et al., 2006; Minucci and Pelicci, 2006). Le seul HDACi aujourd’hui accepté par la FDA est le SAHA (Tableau 1), accepté en juin 2006 pour le traitement du lymphome cutané réfractaire avancé à cellules T (CTCL) par le Vorinostat (Zolinza®, Merk) (Marks and Breslow, 2007). 235
Articles et travaux de thèse Tableau 1 : Description des HDACi en essais cliniques.
D’après Glaser, 2007 ; Lane and Chabner, 2009 ; Minucci and Pelicci, 2006.
Classe
Classe II :
Acides
hydroxamiques
Classe III
Benzamides
Classe I
Carboxylates
HDACi
Sélectivité
pour les HDAC
Efficacité
in vitro
Etude / phase
clinique
SAHA
Classes I, II, IV
µM
Approuvé par
la FDA
TSA
Classes I, II, IV
µM
/
LAQ824
Classes I, II, IV
nM
Phase I
MS-275
Classe I
(en particulier
HDAC1 et HDAC2)
µM
Phase II
acide
valproïque
Classes I, IIa
mM
Phase II
phényl
butyrate
Classes I, IIa
mM
Phase II
AN-9
ND
µM
Phase II
A ce jour, ces molécules apparaissent donc comme de nouveaux agents potentiels de ciblage thérapeutique antitumoraux efficaces, même si les mécanismes par lesquels les HDACi induisent une activité antitumorale n’ont pas été complètement élucidés. 236
Articles et travaux de thèse Effet de la TSA (un HDACi) sur les lignées cancéreuses mammaire MCF‐7 et ovarienne BG1 Les HDACi présentent des propriétés antiprolifératives en exerçant des régulations
transcriptionnelles et post-traductionnelles (Dokmanovic and Marks, 2005). Des travaux
réalisés dans l’équipe ont mis en évidence que les HDACi sont capables de moduler
l’expression des RE dans la lignée de cancer du sein MCF-7 en diminuant celle du REα
(Margueron et al., 2004) et en augmentant celle du REβ (Duong et al., 2006).
Les HDACi se présentent donc comme de bons candidats potentiels pour être utilisés seuls ou
en co-traitement avec des anti-œstrogènes dans le cas de cancers hormono-dépendants comme
le cancer du sein ou de l’ovaire.
Une partie de mon travail de thèse a consisté à étudier l’effet d’un HDACi, l’antifongique et
antibiotique naturel TSA (Tsuji et al., 1976; Yoshida et al., 1990b), sur la prolifération de la
lignée cellulaire ovarienne BG1 exprimant le REα de manière endogène (BELZ, présentée
dans l’article ERα/ERβ ratio influence estrogen receptor ligand induced transactivation and
proliferation of human BG1 ovarian cancer cells). Nous avons comparé l’effet de la TSA sur
cette lignée ovarienne avec celui de la lignée MELN, dérivée stable de la lignée MCF-7
(MCF-7 – ERE-Luc-Néo) (Pillon et al., 2005).
MATERIELS ET METHODES
1/ lignées cellulaires et conditions de culture
Les lignées cellulaires MELN et BELZ sont cultivées à 37°C, dans une atmosphère contenant 5%
de CO2 et 95% d’humidité. Le milieu de culture utilisé pour la maintenance des lignées est le
DMEM-F12 contenant du rouge de phénol (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Gibco,
Invitrogen, France), supplémenté avec 5% de FCS (Fetal Calf Serum, sérum de veau fœtal) et 1%
d’antibiotiques (pénicilline et streptomycine : PS). Nous maintenons les lignées MELN et BELZ
en ajoutant dans le milieu de culture également 1% de G418 et 1% de Zéocine respectivement par
rapport au volume de culture final. Ces deux lignées cellulaires possèdent une construction
plasmidique contenant un ERE couplé au gène codant pour la luciférase de luciole (ERE-Luc).
Pour procéder aux différentes études, il est nécessaire d’enlever toute trace de stéroïde du milieu.
Pour cela, les cellules sont cultivées durant 5 jours dans un milieu ne contenant aucun stéroïde. A
237
Articles et travaux de thèse cause de l’activité œstrogénique du rouge de phénol et du sérum, le milieu utilisé est le DMEMF12 sans rouge de phénol, supplémenté avec 5% de sérum déstéroïdé, ainsi qu’avec 1% de PS et
les antibiotiques de sélection. Le milieu utilisé pour les expériences est le même, sans les
antibiotiques de sélection.
2/ Expression de la luciférase en cellules entières (transactivation)
Les cellules sont cultivées sans stéroïdes pendant 5 jours. Puis, elles sont ensemencées en plaques
96 puits opaques blanches (Greiner CellStar, D. Dutcher, Brumath, France), à raison de 5×104
cellules par puits. 8h plus tard, le milieu d’ensemencement est remplacé par le milieu contenant les
ligands à tester aux concentrations voulues. Après 24h d’incubation en présence du ligand, le milieu
est remplacé par le milieu de détection, DMEM-F12 sans rouge de phénol contenant 0,3 mM de
luciférine. A cette concentration, la luciférine diffuse dans la cellule qui produit alors un signal
luminescent stable à partir de 5 minutes. Ce signal est approximativement 10 fois moins intense
qu’en cellule lysée, mais est parfaitement stable pendant plusieurs heures. La luminescence des
cellules vivantes est mesurée pendant 2 secondes par puits (Microbeta Wallac).
3/ PCR quantitative
L’extraction des ARNm totaux est réalisée avec le kit Nucleospin™ RNAII sur les cellules
MELN et BELZ traitées 24h par EtOH ou TSA à 1,7 µM. La transcription reverse (RT) est
effectuée à partir de 3 µg d’ARNm avec le kit invitrogen RT superscript II. La PCR
quantitative est réalisée avec une approche SyBrGreen (LightCycler 480, Roche), et rapportée
aux valeurs obtenues pour un gène invariant (protéine ribosomale RS9).
Après avoir été cultivées en absence de stéroïdes pendant 5 jours, les cellules sont
ensemencées à raison de 850 cellules par puits en plaques 96 puits. Elles sont traitées tous les
2 jours par l’œstradiol (E2) ou la TSA à des concentrations croissantes. La mesure de la
prolifération se fait au 8ème jour par ajout du réactif MTT (0,5 mg/mL, 100 µL par puits).
Après incubation pendant 4 heures à 37°C, la solution de MTT est remplacée par du DMSO
qui va lyser les cellules et donc libérer et solubiliser les cristaux bleus de Formazan. La
lecture de la DO (Densité Optique) est réalisée à 540 nm.
238
Articles et travaux de thèse RESULTATS
1/ Transactivation via l’ERE
Nous avons étudié l’effet de la TSA sur l’activité transcriptionnelle via l’ERE du REα des lignées
cellulaires REα positives MELN (cancer du sein) et BELZ (cancer de l’ovaire) (figure 1).
Des travaux effectués dans notre équipe avaient montré que les HDACi, incluant la TSA,
modulaient l’activité ligand-dépendante du REα et du REβ (Duong et al., 2008; Duong et al.,
2006; Margueron et al., 2004).
Nos résultats sont en accord avec ces travaux, et montrent que la TSA augmente l’activité
transcriptionnelle du REα en présence ou en absence de ligands dans la lignée MELN (p<0,05
pour les différentes conditions). L’inhibition des HDAC en utilisant la TSA augmente également
la transactivation du REα en présence ou en absence de ligand dans la lignée ovarienne BELZ
(p<0,01 pour toutes les conditions). Cependant, cette augmentation de la transactivation apparaît
plus élevée dans le modèle ovarien que dans le modèle mammaire, suggérant que ce modèle serait
plus sensible à l’effet de la TSA que le modèle MCF-7. Nous montrons également que cette
augmentation de l’activité transcriptionnelle du REα dans ces deux modèles ne dépend pas de la
nature du ligand. En effet, cette observation est vraie pour le panagoniste (E2), pour l’agoniste du
REα (PPT), ainsi que pour l’agoniste du REβ (8β-VE2).
239
Articles et travaux de thèse A) MELN
B) BELZ
Figure 1 : Effets de la TSA sur la transactivation des lignées cellulaires MELN et BELZ.
Les cellules MELN (A) et BELZ (B) ont été traitées pendant 24h avec le contrôle (EtOH), le
panagoniste 17β-œstradiol (E2 ; 10-8M), un agoniste du REα (PPT ; 10-9M), ou un agoniste du
REβ (8β-VE2 ; 10-9M) en présence ou en absence de la TSA (1,7 µM). L’induction de
transactivation est exprimée en fonction du contrôle, sans TSA (contrôle = 1). L’activité luciférase
a été quantifiée. Les colonnes représentent la moyenne d’induction de la transactivation de 3
expériences distinctes pour la lignée MELN, et d’une expérience représentative pour la lignée
BELZ. MELN : p<0,05, BELZ : p<0,01.
2/ Niveaux d’expression des récepteurs des œstrogènes
Nous avons déterminé les niveaux d’expression des ARNm des récepteurs des œstrogènes
dans les deux lignées cellulaires MELN et BELZ (figure 2).
Des travaux effectués dans notre équipe avaient montré que les HDACi, incluant la TSA,
augmentaient les niveaux d’expression d’ARNm du REβ et diminuaient ceux du REα dans les
lignées cellulaires cancéreuses mammaires et ovariennes OVCAR3 (Duong et al., 2008; Duong
et al., 2006; Margueron et al., 2004).
De même, nos résultats montrent que dans la lignée MELN, les niveaux d’expression de
l’ARNm du REα sont réduits par le traitement par la TSA pendant 6h. Nous observons
également une diminution des niveaux d’expression d’ARNm du REα dans la lignée BELZ, et
une augmentation d’expression d’ARNm du REβ.
240
B) BELZ
Figure 2 : Les niveaux d’expression des ARNm du REα et du REβ
sont régulés différemment par la TSA.
Afin de déterminer les niveaux d’ARNm du REα, les cellules MELN (A) et BELZ (B) ont été
traitées pendant 20h avec le contrôle (EtOH) ou avec la TSA (1,7 µM), et pendant 6h pour la
détermination des niveaux d’ARNm du REβ. Les ARN totaux ont été extraits et l’expression
des ARNm des RE ont été déterminés par RT-qPCR, et rapportés aux niveaux d’un ARN
invariant (RS9). Les résultats sont présentés en % du contrôle (sans traitement).
3/ Prolifération cellulaire
Différents travaux ont montré que la TSA présentait des effets antiprolifératifs sur les cellules
cancéreuses mammaires REα positives in vitro et in vivo (Margueron et al., 2003; Vigushin et al.,
2001). Le mécanisme reste aujourd’hui peu clair, mais pourrait en partie impliquer la diminution
de l’expression du REα, celui-ci induisant la prolifération dans les cellules cancéreuses
mammaires (Alao et al., 2004; Reid et al., 2005).
a) Effet de l’œstradiol sur la prolifération cellulaire
Dans un premier temps, nous avons étudié la prolifération des lignées mammaire et ovarienne
dépendante de l’œstradiol (figure 3).
Nos résultats, en accord avec l’équipe de Alao et coll., montrent que la lignée cellulaire MELN
présente une prolifération dose-dépendante de l’œstradiol (EC50 = 8 ± 0.76 pM) (Alao et al.,
241
Articles et travaux de thèse 2004). De même, la prolifération en présence d’œstradiol de la lignée BELZ est dose-dépendante
(EC50 = 18,5 ± 5,6 pM ). Ces résultats indiquent que le REα exprimé dans ces deux lignées
cellulaires est fonctionnellement actif. De plus, l’EC50 de cette prolifération œstrogénodépendante dans la lignée ovarienne est plus élevé que celui de la lignée mammaire, laissant
supposer que la lignée BELZ est moins sensible à l’E2 que la lignée MELN.
A) MELN
B) BELZ
Figure 3 : Effets d’E2 sur la prolifération des lignées cellulaires MELN et BELZ.
Les cellules MELN (A) et BELZ (B) ont été traitées pendant 7 jours avec une gamme croissante
d’E2 (10-13M à 10-8M). La prolifération a été mesurée au jour 7 en utilisant la méthode de
révélation au MTT. Ces graphiques montrent la moyenne de 5 expérimentations indépendantes
pour chaque lignée cellulaire. Les valeurs représentent le pourcentage de prolifération par
rapport à E2 10-8M.
b) Effet de la TSA sur la prolifération cellulaire
Dans un second temps, nous avons étudié l’effet de la TSA, sur la prolifération des cellules
cancéreuses mammaires (MELN) et ovariennes (BELZ) (figure 4).
Des travaux effectués par l’équipe de Kushner en 2007, ont mis en évidence le potentiel
antiprolifératif de la TSA seule sur la lignée cellulaire MCF-7 (Hodges-Gallagher et al., 2007;
Reid et al., 2005).
Nos résultats sont en accord avec ces observations, et nous montrons ici que la TSA inhibe la
prolifération des cellules cancéreuses mammaires MELN et ovariennes (BELZ) de manière dosedépendante (IC50 = 57 ± 1,6 nM et IC50 = 39 ± 1,3 nM, respectivement).
242
B) BELZ
Figure 4 : Effets de la TSA sur la prolifération des lignées cellulaires MELN et BELZ.
Les cellules MELN (A) et BELZ (B) ont été traitées pendant 7 jours avec une gamme croissante
de TSA (10-10M à 10-5M). La prolifération a été mesurée au jour 7 en utilisant la méthode de
révélation au MTT. Ces graphiques montrent la moyenne de 5 expérimentations indépendantes
pour chaque lignée cellulaire. Les valeurs représentent le pourcentage de prolifération du contrôle
(solvant sans TSA).
CONCLUSIONS
De nombreuses études se sont focalisées sur le rôle des HDAC et de leurs inhibiteurs dans la
carcinogénèse mammaire (Duong et al., 2008; Krusche et al., 2005; Saji et al., 2005). Cependant,
peu de données sont disponibles sur la contribution des HDACi dans le cancer des ovaires.
La TSA est décrite pour être un inhibiteur de HDAC panagoniste (Vigushin et al., 2001; Yoshida et
al., 1990a) capable de moduler l’expression du REα et du REβ dans les lignées cancéreuses
mammaires, ainsi que le REβ dans la lignée ovarienne OVCAR3 (Duong et al., 2006). Nous
montrons ici que cet inhibiteur de HDAC module de la même manière les deux isoformes du
récepteur des œstrogènes, en diminuant les niveaux d’expression du REα et en augmentant ceux du
REβ dans la lignée de cancer de l’ovaire BG1.
De plus, ce HDACi a été décrit comme présentant des effets antiprolifératifs sur différents modèles de
tumeurs (Minucci and Pelicci, 2006; Mottet and Castronovo, 2008). Nous avons montré que la TSA,
inhibiteur de HDAC des classes I et II, en plus d’être capable d’inhiber la prolifération des lignées
mammaire (MELN) (Alao et al., 2004; Reid et al., 2005), diminue également celle d’une lignée
243
Articles et travaux de thèse ovarienne (BELZ) in vitro, de manière dose-dépendante. Nous avons également montré que ce
HDACi est plus antiprolifératif dans la lignée ovarienne que dans la lignée mammaire (figure 4).
Nos résultats, ainsi que ceux précédemment montrés dans la littérature, présentant l’augmentation de
l’activité transcriptionnelle du REα via l’ERE (Duong et al., 2006; Margueron et al., 2004), laissent
penser que différentes voies de signalisation sont impliquées dans l’effet antiprolifératif des HDACi.
Au vu de l’importance des HDACi qui apparaissent comme de bons agents thérapeutiques en combinaison avec les traitements standard afin de traiter certains cancers (Prince et al., 2009 ; Schrump, 2009), et qui sont (pour certains) en essais cliniques, il apparaît nécessaire d’étendre ces études à d’autres HDACi tels que le SAHA, le MS‐275 ou le VPA. De plus, des études avaient montré l’efficacité de la TSA comme agent antitumoral sur des cellules de cancer du sein in vitro et in vivo (Vigushin et al., 2001), et même que l’utilisation de ce HDACi rend les lignées cellulaires de cancer du sein REα négatives sensibles au traitement au tamoxifène (Jang et al., 2004). Plus récemment, des essais cliniques ont montré que le Vorinostat (SAHA) restaure la sensibilité au tamoxifène chez des patientes atteintes de cancer du sein avancé qui avaient développé une résistance à la thérapie hormonale (Munster et al., 2009). Il est alors possible d’imaginer qu’à l’avenir, certains HDACi seront utilisés en co‐traitement avec l’hormono‐thérapie afin d’instaurer une sensibilité aux traitements hormonaux dans les cancers du sein RE négatifs, ou de restaurer la sensibilité chez les patientes ayant développé une résistance. Il apparaît très intéressant de se poser la question suivante : l’utilisation d’un HDACi en combinaison avec le tamoxifène permettrait‐elle également d’obtenir de tels effets concernant les cellules et les tumeurs ovariennes ?
244
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 245
Conclusions et perspectives Les récepteurs des œstrogènes exercent des rôles importants en physiopathologie, mais les mécanismes moléculaires impliqués ne sont pas encore totalement élucidés. Le cancer du sein et le cancer de l’ovaire sont deux cancers hormono‐dépendants dans lesquels les RE jouent un rôle important. Ces cancers sont de nos jours la première cause de décès prématurés par cancer chez la femme, et représentent un problème majeur de santé publique. Au cours de ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à l’étude du rôle des récepteurs des œstrogènes alpha et bêta dans ces deux cancers hormono‐dépendants. Pour étudier les rôles de ces récepteurs, nous avons utilisé des ligands sélectifs. Les ligands avaient été caractérisés pour leur sélectivité dans une étude précédente (Escande et al., 2006). Afin d’étudier leur activité (agoniste complet ou partiel), j’ai contribué à l’établissement de lignées cellulaires exprimant les récepteurs délétés de leur partie N‐terminale. Nous avons ainsi pu étudier le rôle que joue le domaine A/B des récepteurs des œstrogènes dans l’activité des ligands. Ces lignées nous ont permis de caractériser des composés dont l’activité dépend partiellement ou complètement de cette région. Nous avons pu confirmer que l’activité agoniste partielle de l’hydroxy‐tamoxifène (OH‐Tam) est complètement dépendante de l’AF‐1 du REα dans les cellules HeLa. Nous avons d’autre part mis en évidence une activité de répression du domaine A/B du REβ dans le contexte cellulaire HeLa. En effet, la délétion de ce domaine provoque la suractivation de l’expression de la luciférase en présence des ligands agonistes complets. Nous émettons l’hypothèse que la fonction AF‐2 du REα est prédominante dans les cellules HeLa quelque soit le ligand (total ou partiel). Ceci explique l’absence d’effet de la délétion du domaine A/B pour ce récepteur. A l’inverse, la présence du domaine AF‐1 dans le REβ serait nécessaire pour des ligands agonistes partiels. Ce mécanisme n’explique pas l’effet répresseur du domaine A/B du REβ observé dans nos expériences et par d’autres équipes (Hall and McDonnell, 1999). Nous supposons que cette région serait capable de recruter des co‐répresseurs. La délétion du domaine A/B du REβ annulerait ainsi le recrutement de ces co‐répresseurs et permettrait à un ligand agoniste complet de suractiver le récepteur par la seule fonction AF‐2. Cette hypothèse est en accord avec celle de Matthews et coll., selon qui, contrairement au REα, le 246
Conclusions et perspectives REβ possède une fonction AF‐1 moins puissante dans la partie N‐terminale, qui présenterait des activités répressives (Delaunay et al., 2000; Matthews and Gustafsson, 2003). Les différences ainsi déterminés par les domaines A/B des deux isoformes du RE ne semblent pas surprenants, puisque cette région est l’une des régions les moins conservées dans la structure des deux RE (seulement 18% d’homologie) (Saunders, 1998). D’autres expérimentations s’avèrent nécessaires pour préciser les observations mises en évidence dans les lignées cellulaires HELN. Des expériences d’immuno‐précipitation de la chromatine permettraient, avec différentes conditions de traitement par les ligands, de déterminer les partenaires recrutés (co‐facteurs) dans les lignées HELN‐ERβ et HELN‐
ΔABERβ. L’utilisation de siRNA pourrait permettre de confirmer le rôle des co‐facteurs dans ce contexte cellulaire. Il serait également intéressant d’étendre cette étude au REα, en utilisant d’autres lignées cellulaires telles que les cellules d’hépatocarcinome humain Hep G2, où le contexte cellulaire est « AF‐1 fort » pour ce récepteur. D’autre part, l’établissement de lignées cellulaires bioluminescentes ovariennes, répondant aux œstrogènes, nous a permis de caractériser les activités agonistes et antagonistes de ligands des RE (BELZ, et BELZ‐ERβ). Ces modèles permettent aussi l’étude du rôle des deux récepteurs dans la transactivation via l’ERE et dans la prolifération cellulaire in vitro, dans un contexte ovarien. Le modèle BELZ‐ERβ, issu dʹune lignée RE positive, présente l’avantage d’exprimer le REβ de manière stable. Ce modèle n’avait encore jamais été réalisé dans un contexte cellulaire ovarien. En utilisant ces lignées, nous avons montré que, comme dans des cellules mammaires, l’expression du REβ diminue la transactivation via l’ERE. Nous avons également démontré in vitro que la prolifération cellulaire œstrogéno‐dépendante des cellules BG1 exprimant le REβ est diminuée. En parallèle de ce travail, nous avons développé une lignée cellulaire BG1 exprimant la luciférase de manière constitutive (BG1‐Luc). Cette lignée cellulaire ovarienne constitue un bon modèle d’étude in vivo, car elle permet de suivre la croissance tumorale sans sacrifice de l’animal. Ce modèle entraîne la génération de métastases proches de celles développées chez l’humain. Ces observations, et le fait que la majorité des cancers ovariens soient des tumeurs épithéliales (Chen et al., 2003), valident l’intérêt de l’utilisation de notre modèle in vivo. 247
Conclusions et perspectives Pour étudier les effets du REβ et de son niveau d’expression sur la prolifération tumorale in vivo, nous avons généré une lignée cellulaire BG1‐tet off‐ERβ. Nous souhaitons poursuivre notre étude concernant l’effet du REβ dans la lignée BG1 en utilisant cette lignée. Nous pourrons faire varier l’expression du REβ en fonction de différentes concentrations de doxycycline. Nous espérons réussir à exprimer fortement le REβ, de manière à entraîner la formation majoritaire d’homodimères REβ. Nous étudierons les effets de cet homodimère sur la transactivation via l’ERE et sur la prolifération cellulaire in vitro. Nous vérifierons l’hypothèse selon laquelle, plus le REβ est exprimé, plus la transactivation et la prolifération œstrogéno‐dépendantes sont inhibées. Ce travail complèterait celui de Sotoca et coll., qui ont démontré que l’augmentation de l’expression du REβ augmente l’inhibition de la prolifération cellulaire dans le modèle mammaire inductible T47D (Sotoca et al., 2008b). D’autre part, comme nous avons montré que les clones dérivés de la lignée cellulaire ovarienne BG1 sont de bons modèles pour l’expérimentation in vivo, nous pourrions utiliser les lignées BELZ, BELZ‐ERβ et la lignée BELZ‐tet off‐ERβ pour étudier l’effet du REβ sur la prolifération tumorale in vivo. Il serait alors intéressant de déterminer si l’augmentation de l’expression du REβ entraîne une inhibition de la prolifération tumorale œstrogéno‐régulée, comme c’est le cas in vitro. En utilisant ces différentes lignées ovariennes, nous pourrons mener des études de régulation des gènes cibles des RE, et examiner plus particulièrement ceux impliqués dans le cycle et la prolifération cellulaires et l’apoptose. Un travail similaire a été effectué récemment dans la lignée BG1, par Albanito et coll., mais uniquement dans la lignée BG1 exprimant le REα, et seulement sur quelques gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire (Albanito et al., 2007). Des études se sont portées sur les gènes impliqués dans la prolifération cellulaire et tumorale, grâce à des expériences de puces à ADN mais ces études ont été réalisées dans d’autres modèles ovariens (Lu et al., 2004; OʹDonnell et al., 2005; Welsh et al., 2001). En revanche, aucune étude n’a été réalisée sur la lignée BG1 à l’aide de puce à ADN, il apparait alors intéressant de comparer grâce à ce système les lignées cellulaires BG1 exprimant à des niveaux différents les deux isoformes du RE (BELZ, BELZ‐ERβ, BELZ‐tet off‐ERβ). Nous pourrons déterminer les gènes différemment régulés dans ces 3 lignées cellulaires sans ligand, ainsi qu’en présence d’E2, ou de ligands sélectifs du REα et du REβ. Cette étude nous permettrait de mettre en évidence, dans un contexte ovarien, les gènes 248
Conclusions et perspectives régulés par chaque RE et qui sont impliqués dans la prolifération tumorale, le cycle cellulaire, et dans l’apoptose. Nous pourrons alors comparer nos observations dans les modèles ovariens avec celles de Rae et coll. (Rae et al., 2005), et préciser si les mêmes gènes sont régulés dans les lignées ovariennes que dans les lignées mammaires. Ces études permettront de mieux caractériser le mécanisme de la régulation de la prolifération par les œstrogènes dans un contexte ovarien. Il serait intéressant, suite aux expériences in vivo, de prélever les tumeurs et de les remettre en culture. Nous pourrons alors comparer leur comportement avec les lignées mères (BELZ, BELZ‐ERβ, BELZ‐tet off‐ERβ). En effet, après avoir formé des métastases, on peut se demander si ces lignées tumorales réagiraient de la même manière que les lignées mères en présence de ligands sélectifs en transactivation et en prolifération in vitro, et existe t‐il une régulation différente des gènes cibles ? Un autre volet de mon travail a été de caractériser les effets d’un HDACi (la TSA) sur la prolifération cellulaire in vitro. La TSA est décrite comme un inhibiteur de HDAC panagoniste (Vigushin et al., 2001; Yoshida et al., 1990a) qui présente des effets antiprolifératifs sur différents modèles de tumeurs (Minucci and Pelicci, 2006; Mottet and Castronovo, 2008). Ces effets ont été reliés à l’arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et/ou en phase G2 (Alao et al., 2004; Bolden et al., 2006; Reid et al., 2005). Parmi les gènes régulés par les HDACi, l’expression de l’inhibiteur du cycle cellulaire p21 est augmentée par ces composés, ce qui pourrait en partie expliquer leurs effets antiprolifératifs (Duong et al., 2008; Duong et al., 2006; Margueron et al., 2004). Nous avons montré in vitro que la TSA, inhibiteur de HDAC des classes I et II, est capable d’inhiber la prolifération de la lignée ovarienne BG1 de manière dose‐dépendante, comme ceci avait déjà été montré pour la lignée mammaire MCF‐7. Nous avons également démontré que ce HDACi, en plus d’être antiprolifératif dans la lignée mammaire, induit également un effet antiprolifératif dans la lignée ovarienne (voir chapitre VI, figure 4, IC50). Il serait intéressant de déterminer si d’autres HDACi spécifiques d’une seule classe de HDAC pourraient apporter des précisions sur la nature des HDACs impliquées dans cet effet antiprolifératif dans la lignée BG1. D’autre part, nous pourrions déterminer si les effets antiprolifératifs de la TSA dans la lignée BG1 sont aussi dus à l’augmentation de l’expression 249
Conclusions et perspectives de p21, comme ceci avait été montré dans l’équipe pour la lignée MCF‐7 (Duong et al., 2008; Margueron et al., 2004). De plus, il serait intéressant d’étudier les effets combinés de la TSA et de l’OH‐Tam sur l’expression de la protéine REα, ainsi que sur la prolifération œstrogéno‐induite des cellules cancéreuses ovariennes in vitro. Cette combinaison a montré des effets plus efficaces qu’avec la TSA seule sur les cellules MCF‐7 (Hodges‐Gallagher et al., 2007), ce qui suggère que cette molécule pourrait présenter un grand intérêt pour développer de futures approches thérapeutiques en combinaison avec les anti‐œstrogènes. Une telle démarche pourrait présenter un intérêt également dans un contexte ovarien. De plus, en utilisant les lignées cellulaires résistantes que nous avons développées dans le laboratoire, nous pourrions comparer les effets de la TSA sur la prolifération des cellules mammaires et ovariennes résistantes avec les effets que nous avons observés sur les lignées non résistantes. Enfin, nous avons établi des modèles mammaires (MCF‐7) et ovariens (BG1) résistants aux anti‐œstrogènes OH‐Tam et ICI. Les lignées BG1‐Luc et BG1‐Luc résistantes pourront permettre de mener des études de prolifération tumorale et de développement métastatique in vivo. En effet, sur des animaux greffés avec les lignées mères traités par l’OH‐Tam en combinaison avec un inhibiteur de HDAC, nous pourrions étudier la combinaison OH‐Tam / HDACi en comparaison avec le traitement au HDACi seul. Dans le but de trouver d’autres traitements alternatifs à l’hormono‐thérapie que ceux déjà utilisés en cas de développement de résistance. L’étude des lignées résistantes nous permettrait de nous placer dans un contexte proche de la réalité. Nous pourrions alors tester l’effet antiprolifératif des HDACi in vivo sur les différentes lignées résistantes mammaires et ovariennes que nous avons développées. Le cancer de l’ovaire touche les femmes de tout âge. La nécessité de préserver la fertilité ultérieure des patientes jeunes est un point d’importance capitale. En effet, très souvent, les femmes affectées par les tumeurs à la limite de la malignité sont en âge de procréer (Camatte et al., 2002). Certaines tumeurs ovariennes développent une résistance à la chimiothérapie. La majorité des tumeurs ovariennes exprime les récepteurs des œstrogènes (Rao and Slotman, 1991). Pourtant, le cancer de l’ovaire a longtemps été considéré comme peu hormono‐
sensible, en raison notamment du faible taux de réponses cliniques observé après traitement 250
Conclusions et perspectives par le tamoxifène (Makar, 2000). Il faut rappeler que le tamoxifène a toujours été évalué en seconde ou troisième ligne, après échec de la chimiothérapie (Perez‐Gracia and Carrasco, 2002; Trope et al., 2000). Le développement de nouveaux traitements alternatifs représente alors un intérêt majeur. La poursuite des études des mécanismes moléculaires de la carcinogénèse ovarienne liée aux œstrogènes apparaît alors très importante pour permettre d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques anti‐hormonales. Une alternative proposant le traitement au tamoxifène en parallèle à la chimiothérapie pourrait être envisagée. Une autre alternative, serait l’utilisation des HDACi en parallèle au traitement anti‐hormonal. Ainsi, des études in vitro et in vivo sur l’effet antiprolifératif de l’OH‐Tam en combinaison avec un HDACi sur nos lignées ovariennes BG1 et BG1‐OHTR, pourraient apporter des informations intéressantes sur de cette hypothèse. En conclusion, nos observations ont permis de préciser les effets du REβ et de son domaine A/B dans la médiation des réponses œstrogéniques, comme l’activation des gènes cibles et la prolifération cellulaire. Depuis sa découverte, le REβ suscite un grand intérêt dans la communauté scientifique, car il semble jouer un rôle répresseur sur les actions œstrogéno‐
régulées. Beaucoup décrivent le REβ comme une cible potentielle thérapeutique pour les traitements des cancers hormono‐dépendants. C’est pourquoi, dans le cadre de la recherche sur le cancer, ce travail concernant l’étude des mécanismes d’action de cet isoforme, qui permettra d’apporter des précisions sur les effets différents des RE et leur fonctionnement, ouvre également des perspectives thérapeutiques. Ces travaux nous ont également permis d’obtenir des modèles d’étude qui donneront des précisions sur le mécanisme de développement de résistance à l’hormono‐thérapie. La résistance des cancers hormono‐dépendants est aujourd’hui au cœur de nombreuses études, visant à améliorer les traitements. L’étude in vitro et in vivo du développement de l’hormono‐
résistance, grâce aux outils que nous avons développé, et en présence de HDACi, ouvrira des perspectives de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques alternatives à l’hormono‐thérapie en cas de résistance. 251
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 252
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Résumé Les récepteurs des œstrogènes α et β (REα et REβ) régissent de manière opposée lʹexpression de gènes nécessaires à la prolifération et à la différentiation cellulaire. Leur activité transcriptionnelle dépend dʹun ligand naturel et de molécules environnementales capables de perturber leur fonctionnement. Les cancers du sein et de l’ovaire peuvent être hormono‐dépendants. Les thérapies visant à contrecarrer la progression des cancers du sein exprimant le REα reposent sur son inactivation par inhibition de la production dʹœstrogènes et inhibition de son activité. L’hormonothérapie n’est pas proposée pour traiter les cancers de l’ovaire, en raison d’une résistance de novo qu’il faudrait mieux comprendre. Il est également nécessaire de mieux appréhender les mécanismes de la résistance acquise dans le cas de cancers du sein, afin de rechercher de nouvelles thérapies. L’objectif de cette thèse a été de préciser les effets des RE sur la prolifération cellulaire et l’activation des gènes. Pour cela, nous avons établi des modèles cellulaires bioluminescents de cancer du sein et de l’ovaire, dont la bioluminescence est dépendante des ligands œstrogéniques. Ces lignées nous ont permis de préciser les effets de ligands sélectifs naturels, synthétiques et environnementaux sur l’activation de gènes par les RE α et β. L’autre volet de ce travail a consisté à établir d’autres modèles bioluminescents mammaires et ovariens permettant d’étudier la prolifération cellulaire et tumorale in vitro et in vivo. Nous démontrons également l’intérêt de ces modèles pour l’étude du mécanisme d’acquisition de l’hormono‐résistance et la recherche de nouveaux traitements antitumoraux. Mots clés : cancer – ovaire – sein – prolifération – récepteur des œstrogènes – ligand – résistance. Abstract Estrogen Receptors α and β (ERα and ERβ), which are members of the nuclear receptors superfamily, impact on cell proliferation and differentiation genes expression in an opposite manner. Both transcription factors activity belong to a natural ligand, but also to many environmental molecules, efficient to bind and disrupt their mechanism. Breast and ovarian cancers are hormono‐dependant cancers. Therapies aimed at counteract ERα positive breast cancers progression are mainly based on its invalidation. Nowadays, two strategies are applied: estrogen production inhibition using aromatase inhibitors, and ERα activity inhibition by anti‐estrogens. On the contrary, hormono‐therapy is not proposed for ovarian cancer treatment, because of a de novo resistance which remains to be better understood. It also appears essential to improve our knowledge about breast cancer resistance acquisition mechanisms, in order to research new therapies. The aim of this work was first to precise estrogen actions on cell proliferation and target genes activation. For that, we established estrogen‐responsive bioluminescent breast and ovarian cancers models. These cell lines allowed us to determine effects of natural, synthetic and environmental selective ligands on natural and synthetic genes activation through ERα and ERβ. The other part of this study consisted in establishing other breast and ovarian bioluminescent cell lines, allowing us to study cell and tumor proliferation in vitro and in vivo. We also show these bioluminescent models relevance to investigate hormono‐resistance acquirement mechanisms and new anti‐tumoral treatments. Key words: cancer – ovarian – breast – proliferation – estrogen receptor – ligand – resistance. 288

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