Sujet de thèse Pr. M. Fontecave / Dr. M. Lombard financé par le

Proposition de sujet de thèse au Collège de France:
“Structure et activité de complexes protéiques associés à la membrane pour la
biosynthèse de l’ubiquinone”
Laboratoire : UMR-CNRS 8229, Laboratoire de Chimie des Processus Biologiques, Collège de France
11, place Marcellin Berthelot, 75 270 Paris Cedex 05.
Thème de recherche : Structure de complexes protéiques associés à la membrane pour la biosynthèse
de l’ubiquinone, Pr. Marc FONTECAVE/ Dr. Murielle LOMBARD.
Personnes à contacter : [email protected], [email protected]
Financement par le Labex Dynamo : Ce projet a déjà obtenu le financement du Labex Dynamo dans le
cadre de la thématique « Supramolecular organization of membrane and membrane proteins »
Projet proposé :
L’ubiquinone, ou coenzyme Q, petite molécule lipophile ancrée dans les membranes
biologiques, assure les fonctions essentielles de transfert d’électrons entre les complexes de la chaîne respiratoire mais aussi d’anti-oxydant. La biosynthèse de l’ubiquinone est un processus biologique très
conservée des procaryotes jusqu’aux eucaryotes supérieurs : il s’agit d’une voie biosynthétique complexe, multi-étape et qui nécessite l’action d’au moins une dizaine de protéines, appelées Ubi chez
les procaryotes et Coq chez les eucaryotes. Parmi ces protéines, on trouve chez E. coli par exemple 8
enzymes qui participent aux réactions de prénylation (UbiA), décarboxylation (UbiD,UbiX),
hydroxylations (UbiF/H/I) et méthylations (UbiG, UbiE). En plus de ces enzymes, on trouve également
d’autres protéines essentielles à la biosynthèse de l’ubiquinone, mais qui n’ont pas un rôle enzymatique (UbiB, UbiJ, UbiK) :
ces
protéines
pourraient servir
de
chaperones
pour l’assemblage et
/ou
la
structuration de
toutes
les
protéines Ubi en
un large complexe
de plusieurs MDa,
qui serait associé à
la membrane.
L’existence d’un tel complexe a été assez bien documenté chez la levure S. cerevisiae, sans qu’il soit pour autant mis en évidence structuralement. Chez E.coli, très peu de données biochimiques ont été
obtenues jusqu’ici sur ce complexe.
Au laboratoire de Chimie des Processus Biologiques, nous nous intéressons depuis quelques
années d’un point de vue biochimique, enzymatique et structural à l’ensemble des protéines de ce complexe. Nous avons identifié 3 nouveaux gènes (ubiI, ubiJ, ubiK) dans cette voie de biosynthèse (1-3)
et nous avons aussi obtenu la structure cristallographique de 2 des 11 protéines Ubi connues
actuellement : celle d’UbiI, une hydroxylase à flavine (1), ainsi que celle d’une des deux décarboxylases,
UbiX, protéine à FMN (article en cours d’écriture) dont nous étudions le mécanisme au niveau
moléculaire.
Par ailleurs, nos collaborateurs généticiens (F. Pierrel, Laboratoire de Techniques de l’Ingénierie Médicale et de la Complexité, UMR 5529, Université Grenoble ; F. Barras, Laboratoire de Chimie
Bactérienne, UMR 7283, Université Aix-Marseille) ont également
mis en évidence de façon génétique (double hybride) et
biochimique (fractionnement cellulaire et western blot)
l’existence de sous-complexes protéiques composées de
certaines protéines Ubi : ainsi un sous-complexe soluble composé
des 3 hydroxylases UbiF-H-I a-t-il été proposé, ainsi qu’un complexe UbiJ-K associé à la fraction membranaire.
Le complexe UbiJ/K a été exprimé et purifié au laboratoire et des premiers cristaux ont pu être
obtenus récemment (diffraction 7 Å). UbiK présente une certaine similarité de séquence
avec des protéines scaffold de complexe protéique (Brick1, Wave complex) tandis
qu’UbiJ présente une certaine similarité de séquence avec des protéines de liaison de
lipides (SCP2, Yarrowia lipolytica).
Le projet de thèse consisterait donc à étudier ces complexes protéiques UbiF-H-I, tant au niveau
biochimique (stoechiométrie, Kd, capacité de liaisons de lipides), enzymatique (détermination d’activités enzymatiques pour les hydroxylases) que structural (détermination de structure cristallographique). Le
projet bénéficie de l’expertise du groupe de D.Picot sur les protéines membranaires, et notamment
l’utilisation de détergents pour leur stabilisation et leur activation.
Techniques utilisées au cours de la thèse :
- Biochimie des protéines : expression, purification, caractérisation (spectre UV-vis, DLS, CD)
- Cristallographie des protéines (plateforme de cristallographie présente au laboratoire)
- Tests d’activité enzymatique : chimie analytique (HPLC, spectrométrie de masse)
- Chimie des lipides et des liposomes : synthèse de sondes fluorescentes (notamment pour le
projet UbiJ-K)
1-
« UbiI, a new gene in E.coli coenzyme Q biosynthesis, is involved in aerobic C5-hydroxylation » Fontecave et Pierrel, J
Biol Chem, 288, 20085-92 (2013);
2- « ubiJ, a new gene required for aerobic growth and proliferation in macrophage, is involved in coenzyme Q
biosynthesis in Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium », Pierrel et Barras, J Bacteriol, 196, 70-9
(2014);
3 - « Biosynthesis and physiology of coenzyme Q in bacteria», Fontecave et Barras, 1837, 1004-11 (2014).