préparation et caractérisation de sondes fluorescentes des acides

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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2005, 144, 88-96
PRÉPARATION ET CARACTÉRISATION DE
SONDES FLUORESCENTES DES ACIDES
DOMOÏQUE ET STÉARIQUE (*)
Bou chra T OUIL ( 1 ) , Sou aad SL IMANE ( 1 ) ,
Azi za MOURADI ( 1 ) , Rachida AKALLAL ( 1 ) ,
Alain NICOLAS ( 2 ) , Rachid BENGUEDDOUR ( 1 )
Deux sondes fluorescentes, le bromure de panacyle et la
4-luminarine, ont été utilisées pour dérivatiser respectivement
l’acide domoïque, toxine d’origine algale, et l’acide stéarique. Par
CLHP, on obtient deux esters pour l’acide domoïque et un amide
pour l’acide stéarique. Ce dernier a pu être isolé et analysé par
SM.
INTRODUCTION
Les biomolécules sont généralement présentes à l’état de traces.
Nombre d’entre elles ne possèdent pas de propriétés physicochimiques
intrinsèques suffisantes pour permettre une analyse directe [5]. Certaines
peuvent avoir des structures chimiques proches et la technique permettant
de les dissocier doit être sensible et spécifique. On a alors recours à des
(*)
(1)
(2)
Manuscrit reçu le 3 mars 2005.
Laboratoire de Biochimie et de Biotechnologies marines, Faculté des Sciences,
Université Ibn Tofaïl, 14000 Kénitra, Maroc. [email protected],
[email protected]
Laboratoire de Chimie analytique et de Bromatologie, Faculté de Pharmacie,
Université de Nancy I, 54001 Nancy, France. [email protected]
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marqueurs comme les radio-isotopes [14], les enzymes [9], les fluorophores
[6-7], les sondes chimioluminescentes [3] et bioluminescentes [12].
La préparation de dérivés fluorescents permet un dosage
chromatographique [6-7] ou encore immunologique [8]. La fixation du
marqueur abaisse fortement la limite de détection.
L’acide domoïque est une neurotoxine d’origine algale [4,10-11,15],
libérée à très faible concentration dans l’eau de mer ou après culture. Il
s’agit d’un dérivé d’acide aminé de structure chimique relativement simple
[13]. Ses propriétés physicochimiques ne permettent pas une analyse directe
dans ces milieux et il est nécessaire d’utiliser des marqueurs.
Le bromure de panacyle a été retenu pour la dérivatisation de l’acide
domoïque. Une autre sonde fluorescente, la 4-luminarine, a été testée pour
la dérivatisation de l’acide stéarique.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Les solvants utilisés sont de qualité pour analyse ou bidistillés avant
emploi. L’acide domoïque (Fluka, 1 mg/ml) et le bromure de panacyle
(Molecular Probes, Junction City, Or, USA, 1,5 mg/ml) ont été solubilisés
dans l’acétonitrile. L’acide stéarique (Aldrich, Steims, Allemagne,
1 mg/ml), le N,N’-dicyclohexylcarbodiimide (Merck, Darmstadt,
Allemagne, 5 mg/ml) et le 1-hydroxybenzotriazole (Merck, 5 mg/ml) ont été
dissous dans le N,N-diméthylformamide. La 4-luminarine (Sigma, Saint
Louis, USA, 1,5 mg/ml) a été solubilisée dans le diméthylsulfoxyde.
Dérivatisations
L’estérification de l’acide domoïque par le bromure de panacyle
(Figure 1) conduit à plusieurs esters. Il se forme d’abord des carboxylates en
présence d’une base, la triéthylamine. Puis une substitution nucléophile de
l’halogénure du bromure de panacyle permet la formation d’ester.
L’amidification de l’acide stéarique par la 4-luminarine forme un
seul amide (Figure 2). La fonction carboxylique de l’acide stéarique est
activée dans un premier temps, puis il se forme l’amide correspondant en
présence de 4-luminarine.
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Fig. 1 : Estérification du groupe carboxyle de l’acide domoïque par le
bromure de panacyle.
Fig. 2 : Amidification du groupement carboxyle de l’acide stéarique par la
4-luminarine.
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Chromatographie liquide haute pression (CLHP)
Le système chromatographique comporte une pompe Spectra
Physics 8700 (Santa Clara, CA, USA), un injecteur à boucle 10 µl 7125
(Rhéodyne, Cotati, USA), un détecteur spectrophotométrique à longueur
d’onde variable UV-visible LC871 (Pye Unicam, Cambridge, UK), un
intégrateur calculateur Spectra Physics 4100.
Les phases mobiles sont filtrées sur membrane Sartorius en nylon
type 5M (0,45 µm) et dégazées par barbotage d’hélium avant emploi. Le
débit est de 1,2 ml par minute.
Deux colonnes ont été utilisées :
- une colonne apolaire pré-remplie avec un support de silice greffée
par des chaînons octadécyles (Lichrosorb 18, Merck).
- une colonne polaire pré-remplie avec un support de silice greffée
avec des fonctions diols (Lichrospher 100-diol, Merck).
Spectrométrie de masse
Les spectres de masse ont été réalisés à l’aide d’un spectromètre
Ribermag R10-10C (Delsi, France) associé à un système d’acquisition et de
traitement des données Ribmerg Sidar 111B (Delsi). Les mesures sont
effectuées par le service commun de Spectrométrie de masse du Centre du
Médicament de l’Université de Nancy I.
Le produit à analyser est dissous dans l’éthanol à une concentration
de l’ordre de 1 µg/µl et 1 à 2 µl de cette solution sont utilisés pour la
détermination par spectrométrie de masse. Les spectres sont obtenus selon la
technique DCI [Desorption-chemical ionisation]. L’intensité du courant
dans l’émetteur varie de 30 à 500 mA à un débit de 7 mA/s. La désorption
est généralement obtenue quand l’intensité atteint 250-300 mA
(correspondant à 150-200°C). La température de la source est de 140°C et la
pression du gaz ammoniac (qualité N 36) est maintenue entre 0,1 et 0,5 torr.
RÉSULTATS
Dérivatisations
L’excès de la sonde fluorescente, la température et le temps de la
réaction ont été optimisés (Tableau I).
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Tableau I :
Conditions retenues pour la dérivatisation des acides domoïque et
stéarique.
Bio molécule
Rapport molaire
sonde / biomolécule
Acide domoïque
bromure de panacyle
/ acide domoïque
5/1
Acide stéarique
4-luminarine
/ acide stéarique
3/1
Température
(°C)
Temps de la réaction
40
45 min
activation 20
24 h
dérivatisation 70
2h
Pour garantir l’estérification de tout l’acide domoïque, il faut cinq
fois plus de bromure de panacyle. L’amidification de l’acide stéarique
nécessite trois fois plus de 4-luminarine.
À 10 µl d’acide domoïque sont ajoutés 60 µl de bromure de
panacyle, 10 µl de triéthylamine (Aldrich). Le volume final est ajusté à
200 µl avec de l’acétonitrile. L’estérification se fait à 40°C pendant 45 min.
L’activation du groupement carboxyle est obtenue de la manière
suivante : à 10 µl d’acide stéarique (1 mg/l) sont ajoutés 10 µl de
dicyclohexylcarbodiimide (5 mg/l), 10 µl d’hydroxybenzotriazole (5 mg/l)
et 10 µl de triéthylamine. Le volume final est ajusté à 290 µl avec le
diméthylformamide.
10 µl de 4-luminarine (1,5 mg/l) sont ajoutés au mélange précédent.
La réaction de dérivatisation se fait à 70°C pendant 2 heures.
CLHP
Des parties aliquotes (10 µl) du volume réactionnel, de l’essai ou du
blanc sont injectés dans le système chromatographique (Tableau II).
Tableau II :
Conditions chromatographiques.
Bio molécule
Temps de rétention Facteur de capacité
K = tr-tm / tm
Phase mobile
Acide domoïque
3,72 - 6,56
2,38 - 4,96
hexane / éthanol 80 / 20
Acide stéarique
2,58
1,55
méthanol
tr = temps d’élution d’un soluté
tm = temps mort ou temps d’élution d’une substance inerte ou non retenue par la phase
stationnaire
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L’acide domoïque est capable de s’isomériser [1 ]. Le profil
chromatographique obtenu après dérivatisation montre la présence de deux
pics correspondant à deux isomères (Figure 3).
A
B
Fig. 3 : Chromatogrammes obtenus (A) sans dérivatisation ou (B) après
dérivatisation de l'acide domoïque par le bromure de panacyle.
Phase stationnaire : diol (5 µm), phase mobile hexane / éthanol (80 / 20),
1,2 ml/min, détection à 245 nm.
Les conditions chromatographiques retenues (Lichrospher 100-diol
comme phase stationnaire, mélange hexane-éthanol 80-20 comme phase
mobile) permettent une bonne séparation des dérivés de l’excès de réactifs.
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Des phases mobiles volatiles ont été retenues pour faciliter la
récupération des molécules marquées. Un mélange hexane - éthanol a été
utilisé pour l’analyse de l’acide domoïque et du méthanol pour l’acide
stéarique.
Purification et identification
Compte tenu du coût élevé de l'acide domoïque, cette étude n’a
concerné que l'acide stéarique. 100 µg de cet acide ont été dérivatisés et
purifiés par CLHP. La pureté de l’amide est proche de 100 %. Son
identification a été réalisée par spectroscopie de masse (Figure 4). Sa
structure est confirmée par l'obtention d'un pic à une valeur de m/z de 636
correspondant au pic quasi-moléculaire (M+1)+.
Fig. 4 : Spectre de masse de l'acide stéarique estérifié par la 4-luminarine.
CONCLUSION
La dérivatisation des acides domoïque et stéarique par des sondes
fluorescentes permet d’améliorer la limite de détection par CLHP d’un
facteur de 100 à 500. Les phases mobiles utilisées pour la séparation
chromatographique sont volatiles, permettant la récupération des dérivés par
simple évaporation sous courant d’azote, avec une très bonne pureté.
L’emploi de ces fluorophores ne modifie par l’immunoréactivité des
molécules et, par conséquent, ils peuvent servir à des immunodosages par
polarisation de fluorescence [2] ou à des dosages par CLHP avec un
détecteur de fluorescence.
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RÉFÉRENCES
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ABSTRACT
Preparation and characterisation of fluorescent probes of domoic and
stearic acids
Two fluorescent probes, panacyl bromide and 4-luminarine, were
used to derivatize domoic acid, an algal toxin, and stearic acid, respectively.
By HPLC, two esters were obtained for domoic acid, and an amide for
stearic acid. The latter was isolated and analyzed by MS.
Key-words: domoic acid, stearic acid, derivatization, fluorescent marker,
HPLC.
__________