Effets génotoxiques d`une exposition combinée aux HAP et au

Les cibles de l’action cancérigène des HAP
Poumon
Effets génotoxiques d’une exposition
combinée aux HAP et au rayonnement UV
- voie d’absorption
Vessie
Thierry Douki(1), Zakaria Ksoury(1), Caroline Marie(1)(2), Jean-Luc
Ravanat(1), Anne Maître(2)
Peau - accumulation
- action phototoxique
(1) DSM/INAC/SCIB UMR-E 3 CEA-UJF/Laboratoire "Lésions des Acides
Nucléiques",CEA-Grenoble, France.
(2)Equipe EPSP, Environnement et prédiction de la santé des populations
Laboratoire TIMC (UMR 5525) Faculté de Médecine, La Tronche, France
Action de 2 agents mutagènes :
- Les HAPs
- Le rayonnement ultraviolet
Effet du rayonnement UV sur des cellules en culture
Oxydation photosensibilisée de l’ADN par les UVA
1
Absorption
de l’ADN
Action relative par quantum
10-1
En UVB (280 < λ < 320 nm) :
- Effet direct
- Formation des dimères de pyrimidines
PS
10-2
O
O
OH
HN
HN
NH
O
O
N
dR
10-3
N
dR
O
N
dR
O
N
O
NH2
N
N
dR
dR
HN
N
O
10-6
250
Transfert
d’énergie
triplet
ADN+y + PS-y
Arrachement d’électron
type I
oxydation de Gua majoritaire
2
O2
ADN
Chimie de type Fenton
O2°-
8-oxoGua
mitochondries
En UVA (320 < λ < 400 nm) :
- Effet indirect
- Photosensibilisateurs endo- ou exogènes
- Stress oxydant intense
d‘après Coohill
(1987)
3PS*
O2
1O
O
létalité
10-5
1PS*
N
dR
10-4
UVA
(PS: photosensibilisateur)
O
Dimères
cyclobutane
type II
H2O2
Fe2+/Fe3+
libération
de fer
UVA
°OH
Coupures de chaîne et bases oxydées
Mutagénèse
350
400
300
Longueur d’onde (nm)
1
Spectre solaire et absorption par les HAP
Evidence de l’action synergique UV/HAP
900
- 5 HAP sur 16 testés photomutagènes dans le test d’Ames (dont le BaP)
Puissance (mW/m2/nm)
800
UVB
UVA
(Yan et al. Mutat. Res. 2004)
Visible
700
- Augmentation de la mutagénèse du BPDE et des UVA lors d’un traitement
combiné (à doses seules non mutagènes) de cellules Big blue mouse
600
(Besaratinia et al. Cancer Res. 2003)
500
absorption
BPDE
400
- Augmentation du taux de mutation par transfection de plasmides traités par
du BPDE et des UV (par rapport à BPDE seul)
300
(Routledge et al. Carcinogenesis 2001)
200
- Traitement combiné BaP + UVA tumorigène chez la souris
(Wang et al. Int J Cancer. 2005)
100
0
280
300
320
340
360
380
400
420
440
- Induction de dommages à l’ADN par UV + BaP/BPDE (cassures de
chaîne et 8-oxoGua)
(Routledge et al. Carcinogenesis 2001; Toyooka et al. FEBS Lett. 2005; Liu et al.
Biochemistry 1998; Gao et al. Free Radic. Biol. Med. 2005)
Longueur d’onde (nm)
Identification du mécanisme de photooxydation par les HAP
Manque de spécificité
Données contradictoires :
Oxygène singulet ?
Anion superoxyde ?
La nature des lésions formées comme signature du mécanisme
Quantification de plusieurs lésions oxydatives et des photoproduits bipyrimidiques
O
H2N
Piégeurs :
NaN3
1O
2
SOD Catalase
O
N
N
dR
DMSO
8-oxodGuo
O2y-
H2O2
O
H
N
HN
H2N
O
H
O
N
HN
N
H
N
dR
FapyGua
H
O
NH2
OH
HN
N
OH
O
O
OH
N
N
dR
dR
diols Thd
5-OHdCyd
CH3 H3C
O
NH
HN
O
N
N
H
H
O
TT CPD
HOy
- Oxygène singulet : 8-oxo-7,8-dihydroguanine lésion quasi unique
- Arrachement d’électron : 8-oxodGuo + FapyGua lésions majoritaires
(G base la plus facilement oxydée)
- Radical °OH : nombreux types de lésions de G, T A et C
Alternative proposée : quantification des différentes lésions dans l’ADN
-Transfert d’énergie triplet : formation de dimère cyclobutane surtout aux sites TT
(pas d’autre type de dimères)
2
Procédure expérimentale
Le BaP, un mauvais photosensibilisateur
ADN 0.1 mg/ml; photosensibilisateurs 10 µM; mesure du taux de 8-oxodGuo
250
2) HAP étudiés
OH
200
HO
HO
HO
OH
OH
Benzo[a]pyrène (BaP) 7,8-diol-9,10-epoxy-BaP (BPDE) 7,8,9,10-tetraol-BaP (tetraol)
3) Source UV : lampe UVA Waldmann 700L (330 nm < λ)
8oxo-dGuo/106 bases
O
3000
BaP
Contrôle
Bleu de méthylène
Acétophénone
8oxo-dGuo/106 bases
1) ADN génomique isolé de thymus de veau (sigma) en solution aqueuse
150
100
Riboflavine
2500
2000
1500
1000
50
500
4) Quantification des bases oxydées par hydrolyse enzymatique
suivi d’une analyse par HPLC couplée à la spectrométrie de masse
0
0
5
10
15
UVA (J.cm-2)
20
0
0
5
10
15
UVA (J.cm-2)
20
Les dérivés du BaP comme photosensibilisateurs
Aspects quantitatif (mesure de 8-oxodGuo)
p < 0.01
1000
8oxoGua/106 bases
Le BaP est très peu efficace
800
- Mesure de 8-oxodGuo
600
O
HN
400
H2N
p < 0.01
Pour les dérivés : BaP < BPDE < Tétraol
H
N
O
N
dR
Quels sont les modes d’action impliqués ?
- pas de transfert d’énergie (pas de dimère cyclobutane)
- mécanisme de photooxydation à déterminer
200
0
contrôle
BaP
BPDE
Tétraol
3
Effet du TRIS sur la photoxydation par le BPDE
Mécanismes de photosensibilisation par BPDE et tétraol
O
HN
O
N
OH
BPDE
O
Tétraol
50
CH2 OH
HN
O
N
5-(hydroxymethyl)-uracile
O
25
O
0
Produits
d’oxydation
de la
thymine
O
C
HN
H
FordU
OH
NH2
100
8-oxodGuo
5-FordUrd
5-HMdUrd
ThdGly
50
N
0
5-formyl-uracile
8-oxoGua HmdU
HO
HO
150
Diols de thymine
lésions per 106 bases
proportion (%)
75
Tris (tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane), piègeur de HOy
CH3
OH
diols
0
2
4
6
8
10
Concentration de TRIS (mM)
Tétraol : seulement 8-oxoGua (1O2)
Pas de production de HOy
BPDE : aussi oxydation Thy (HOy ou type I)
Les adduits du BPDE comme photosensibilisateurs ?
Un rôle pour le tétraol dans l’effet du BPDE ?
Effet d’une hydrolyse d’une heure sur
la photosensibilisation de l’ADN
Evolution des capacités du BPDE à former
des adduits à l’ADN en solution aqueuse
O
4
BPDE-dGuo pour 106 bases
8-oxoGuo/106 bases par J.cm-2
700
3
2
1
600
H2N
OH
OH
N
N
O
O
OH
400
O
O
O
300
200
H2N
HO
OH
5
10
15
20
Temps d’hydrolyse du BPDE (h)
HO
N
H
N
N
Contribution du
tétraol limitée
N
N
N
O
O
OH
O
O
O
O
O
- hydrolyse du BPDE en tétraol est lente.
- pas le profil typique des lésions de l’ADN par 1O2 avec BPDE
N
HN
H2N
O
N
HN
0
0
N
O
HO
BPDE 10 µM BPDE 10 µM
hydrolysé
N+
HN
100
control
OH
OH
O
500
OH
0
OH
Adduit N7 instable
N
HN
Adduit N2 stable
O
4
Effet d’une extraction sur la photooxidation de l’ADN
Mise en évidence du rôle des adduits à l’ADN
300
BPDE
O
adduits
à l’ADN
HO
UVA ?
OH
phase aqueuse
EXTRACTION
AcOEt
phase organique
OH
HO
BPDE
HO
- 45 %
8oxodG
lésions / 106 bases
adduits
à l’ADN
ThdGly
200
HMdUrd
FordUrd
100
OH
tétraol
tétraol
adduits
dépurinés
adduits
dépurinés
0
contrôle
BPDE
BPDE + extraction
Les adduits représentent 2 % du BPDE ajouté mais font plus de 50% des lésions
Le mécanisme impliqué est le même avec ou sans extraction (distribution identique)
SOLUTION ADN + BPDE
Les adduits, des photosensibilisateurs au cœur de la cible
Action photooxydante du BaP et de ses dérivés sur l’ADN
BPDE-dGuo
HO
eHO
O
O
HO
N
H
HO
HN
H2N
N
O
N
H
ADN
N
HN
N
N
N
N
HN
OH
N
N
N
Addition
à l’ADN
OH
BaP
tétraol
OH
?
HO
métabolisation
HO
OH
O
hydrolyse
BPDE
HO
Position du noyau BPDE plaqué sur le petit
sillon ou intercalé dans la double hélice
OH
Douki, Ksoury, Marie, Favier, Ravanat & Maitre (2008) Genotoxicity of combined exposure to polycyclic
aromatic hydrocarbons and UVA: a mechanistic study. Photochemistry & Photobiology, 83, 1133-1140
5
Perspectives
- Action différentielle des différents diastéréoisomères des adduits
- Action photosensibilisatrice d’adduits d’autres HAP
- Photosensibilisation dans des cellules ou de la peau
- Effet du type cellulaire et des différentes voies de métabolisation du BaP
6