AT - Révisions - Validation de la préparation d`un milieu de culture

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AT de biotechnologies
Séance de révision : validation de la préparation d’un milieu de culture
L’objectif de la séance est de préparer un milieu de culture en bouillon qui sera utilisé
après autoclavage pour repiquer une souche de levures.
Le respect des dates limites de péremption et des consignes de préparation des
milieux de culture est indispensable en microbiologie pour permettre un bon
développement des germes que l’on ensemencera.
Il est donc impératif de vérifier certains paramètres comme par exemple, la
concentration de la source principale de carbone, pour valider un milieu.
Suite à la préparation du milieu de culture, vous devrez réaliser différents contrôles :
-un contrôle de la concentration en glucose du bouillon préparé,
-un contrôle de fertilité des milieux par ensemencement.
Liste des documents ressources :
-Fiche fournisseur du milieu de culture,
-Fiche fournisseur du kit enzymatique de dosage du glucose,
-Fiche technique d’usage du matériel (pipettes, balance…)
Jour 1
I-Préparation du milieu de culture
On préparera un bouillon Sabouraud, qui sera réutilisé en J2 pour étudier des levures.
A l’aide de la fiche fournisseur des milieux de culture, calculer la pesée de poudre à
prélever pour préparer 200 mL de bouillon Sabouraud
Remarque : les préparations seront effectuées par groupe de 4 élèves.
- Préparer 200 mL de bouillon Sabouraud : procéder à la pesée de poudre de
bouillon Sabouraud, puis dissoudre dans un bécher à l’aide d’eau distillée stérile.
- Prélever 8 x 10 mL que vous introduirez dans 8 tubes en verre avec bouchon à vis
(2 tubes par élève du groupe). Les tubes seront immédiatement autoclavés pour être
récupérés en fin de séance.
ATTENTION : ne pas jeter l’excédent qui sera utilisé pour le contrôle de la
concentration en glucose.
Remarque : annoter vos tubes et flacons de façon explicite et nette avec
un marqueur indélébile.
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II-Repiquage d’une souche de levures
On dispose d’une souche de Saccharomyces cerevisiae isolée sur gélose Sabouraud
inclinée. A partir d’une colonie, préparer une suspension dans 1 mL d’eau
physiologique stérile, puis :
-vérifier la pureté de la suspension par ré-isolement sur gélose Sabouraud.
-ensemencer un des deux bouillons Sabouraud préalablement préparés et
autoclavés : pour cela introduire stérilement une anse de la suspension dans le
bouillon et homogénéiser (le second tube non ensemencé sera conservé à
température ambiante jusqu’en J2).
Incuber les milieux à 30°C – 24 à 48H.
III-Contrôle de la concentration en glucose du bouillon Sabouraud
1-Préparation de la gamme d’étalonnage
• A partir d’une solution mère de glucose fournie à 4 g/L, préparer en tube à
hémolyse des solutions étalons filles à 1 g/L, 2 g/L et 3 g/L de glucose (volume total
à préparer = 2 mL). Calculer les volumes de prise d’essai de solution mère et
proposer le protocole pour préparer les solutions filles.
• Dans une série de 5 microcuves spectrophotométriques, réaliser la gamme
d’étalonnage selon le mode opératoire suivant :
Microcuves
Solution glucose à 1 g/L
Solution glucose à 2 g/L
Solution glucose à 3 g/L
Solution glucose à 4 g/L
Eau distillée
Solution réactionnelle
0
1
10 µL
2
3
4
10 µL
10 µL
10 µL
10 µL
1 mL / cuve
-Recouvrir les microcuves de parafilm. Homogénéiser par retournement.
-Laisser évoluer à température ambiante pendant 20 min (coloration stable 1h)
-Lire l'absorbance à 505 nm contre le blanc.
2-Dosage du glucose dans le bouillon Sabouraud
2.1-Réflexion préliminaire autour du protocole
-D’après la fiche technique du fournisseur, quelle est la concentration prévisible en
glucose du bouillon Sabouraud ?
-Quelle est la limite de détection maximale en glucose que nous permet notre
gamme d’étalonnage ?
-Que peut-on proposer pour réaliser le dosage du bouillon dans de bonnes
conditions ?
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2.2-Préparation du bouillon Sabouraud pour permettre le dosage
-Préparer 20 mL de bouillon Sabouraud dilué selon vos propositions précédentes.
-Réaliser le dosage spectrophotométrique (2 essais) du bouillon Sabouraud dilué
dans les mêmes conditions que la gamme d’étalonnage.
3-Exploitation
Questions de compréhension du protocole :
Le dosage du glucose met en jeu deux enzymes : la glucose oxydase et la
peroxydase.
-Indiquer le nom et la formule chimique développée des substrats de la glucose
oxydase.
-Indiquer le nom des produits de la réaction à la peroxydase mise en jeu dans ce kit.
-Expliquer l’intérêt de produire à partir de glucose de la quinonéimine ?
-Dans ce dosage une des réactions est dite « réaction principale », l’autre « réaction
indicatrice ». Expliquer ces expressions et identifier parmi les deux réactions mises
en jeu, laquelle est principale, laquelle est indicatrice.
Exploitation des résultats expérimentaux
- Tracer sur papier millimétré la courbe d’étalonnage A à 505 nm = f (ρ Glucose).
- Que pensez-vous de la qualité de l’alignement de votre gamme d’étalonnage ?
Quelles sont les sources d’erreurs techniques possibles qui permettent d’expliquer
ces erreurs d’alignement ?
- Pour chacun des essais, déterminer la concentration massique en glucose dans le
bouillon dilué puis calculer la concentration massique en glucose dans le bouillon non
dilué.
- Comparer la concentration massique en glucose du bouillon obtenue
expérimentalement et le résultat théorique attendu.
Donnée : Sr (concentration en glucose du bouillon pur) = 0,2 g/L
Jour 2
I-Repiquage de la levure (suite)
A partir de la gélose et du bouillon Sabouraud ensemencés, réaliser un examen
macroscopique. Conclure sur la pureté de votre suspension en J1 et sur la fertilité du
Bouillon Sabouraud préparé.
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II-Numération des levures cultivées en bouillon
1-Mode opératoire
A partir de la culture en bouillon Sabouraud, préalablement homogénéisée :
-Réaliser une mesure d’absorbance à 600 nm, contre un blanc adapté (si
l’absorbance mesurée dépasse 0,6 recommencer après dilution de la culture).
-Réaliser une numération sur lame de Malassez :
Au préalable, à l’aide des données 1 et 2, prévoir la dilution éventuelle de la culture
pour obtenir entre 10 et 100 levures par rectangle de la chambre.
A l’aide de la culture ou de sa dilution, faire la mise en chambre, laisser sédimenter
au moins 5 min, puis réaliser le comptage sur 10 rectangles dans la chambre.
2-Exploitation
-Après numération sur lame de Malassez, calculer la concentration en levures dans le
bouillon (en levures / mL).
-En intégrant les résultats de la mesure d’absorbance et de la numération sur lame
de Malassez, exprimer la relation entre absorbance et concentration en levures :
0,1 d’absorbance en bouillon Sabouraud <-> xxxx levures / mL
-Comparer les résultats expérimentaux et les résultats théoriques extraits de la fiche
technique du Mac Farland.
Données :
1- La lame de Malassez comporte 100 rectangles de comptage. Le volume total
de la chambre de comptage correspond à 1 µL.
2- Extrait de la fiche technique du Mac Farland
Etalon Mac Farland
Concentration bactérienne Densité optique théorique
à 550 nm
x 106/mL (1)
0,5
150
0,125
1
300
0,25
2
600
0,50
3
900
0,75
(1) La concentration bactérienne varie avec la taille des micro-organismes. Les
chiffres indiqués représentent une moyenne valable pour les bactéries. Pour
les levures, de taille plus grosse, il faut diviser ces concentrations par 30
environ.
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III-Contrôle de la qualité du pipetage avec une P1000
Afin de vérifier que les erreurs d’alignement de la droite d’étalonnage tracée en J1 ne
sont pas liées aux pipettes automatiques, on vérifiera par exemple une P1000.
L'objectif est de vérifier que le volume délivré correspond bien au volume affiché sur
la pipette. On évaluera deux qualités la P1000 :
- la justesse : aptitude à délivrer un volume le plus proche possible du volume réglé
exprimée par la moyenne d'une série de mesures.
- la fidélité : aptitude à délivrer des volumes les plus proches possibles les uns des
autres exprimée par l'écart-type de la série de mesures.
Remarque : vous réaliserez le contrôle de la P1000 que vous avez utilisé pour
concevoir votre gamme d’étalonnage.
1-Mode opératoire
Le contrôle sera réalisé par méthode gravimétrique : il consiste à peser, à l’aide
d’une balance de précision, des échantillons d'eau prélevés à la pipette.
On pèse successivement dans un bécher de 100 à 200 mL, des volumes d'eau
distillée prélevés à la pipette. Tous les ajouts se font dans le même récipient, sans le
vider, en annulant la valeur de la pesée précédente par le tarage de la balance avant
chaque nouvelle mesure.
La P1000 ayant été utilisée précédemment pour prélever 1 mL de solution
réactionnelle dans la gamme d’étalonnage, on réglera la pipette sur ce volume
maximal pour faire le contrôle. On réalisera 5 pesées successives en utilisant le
même cône après une mise en milieu préalable.
2-Exploitation
A partir des résultats des 5 pesées, calculer la moyenne (en µL) et l’écart type* (en
µL). Conclure sur la qualité de la pipette à l’aide de l’extrait ci-contre de la fiche
constructeur qui recense les erreurs systématiques (systematic error) et les erreurs
aléatoires (random error) maximales tolérées. Au regard des résultats, que penser
des erreurs techniques expliquant les résultats de l’alignement de la courbe
d’étalonnage ?
* Formule de l’écart-type : S ou σ (utiliser n-1 au lieu de n au dénominateur lorsque
le nombre d’échantillons testés est inférieur à 30).
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Extrait de la fiche de contrôle des pipettes Gilson
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