Dosage des acides aminés par spectrophotométrie différentielle

Dosage des acides aminés par spectrophotométrie
différentielle
H
N
Ac-Tyr-NH2 (120 µM)
HO
O
NH2
O
N-acétyl-tyrosinamide
Ac-Trp-NH2 (20 µM)
H
N
NH2
O
O
NH
pH 7
N-acétyl-tryptophanamide
73
Ac-Trp-NH2
pH 7
Ordre zéro: A = f(λ)
1er ordre:
∂A
= f ′(λ )
∂λ
74
2
2e ordre: ∂ A = f ′′( λ )
2
∂λ
3
3e ordre: ∂ A = f ′′′( λ )
3
∂λ
4
4e ordre: ∂ A = f ′′′′( λ )
4
∂λ
75
pH 7
2
2e ordre: ∂ A = f ′′( λ )
2
∂λ
4
4e ordre: ∂ A = f ′′′′( λ )
4
∂λ
76
pH 13
A (u.a.)
Tyr
HO
pKa = 10.1
OH-
O
pH 13
pH 13
289 nm
O
...
292 nm
285.5 nm
77
Choix de la longueur d’onde pour la quantification
du Trp en présence d’autres acides aminés
* Source: rapport de laboratoire CHM 3173
Selon les moyennes et écart-types: 1er choix – 289 nm
2e choix – 285.5 nm
H
N
O
O
O
Ac-Phe-OEt
78
Détermination du Trp dans le lysozyme
Échantillon de lysozyme (MM 14 600 Da):
Le lysozyme contient 6 résidus Trp, 3 Tyr et 4 Cys.
ε280nm = 3.78·104 M-1 cm-1
[lysozyme] = 10,4 µM
A280nm
0.0E+00
y = -0.0027x + 2E-10
R2 = 0.997
d4A/dl4 (u.a.)
-5.0E-08
-1.0E-07
-1.5E-07
-2.0E-07
-2.5E-07
λ=285.5 nm
-3.0E-07
0.0E+00
2.0E-05
4.0E-05
6.0E-05
8.0E-05
1.0E-04
Concentration Ac-Trp-NH2 (M)
79
2.1.2 Méthodes colorimétriques pour le dosage
des protéines
™
Pour déterminer la concentration totale de protéines dans un
mélange complexe par spectrophotométrie d’absorption, des
méthodes colorimétriques sont souvent employées. Ces
méthodes sont basées sur la réaction d’agents chromophores
avec les liens peptidiques ou avec certains acides aminés des
protéines.
™
Cette réaction donne lieu à une coloration (dans la région visible)
dont l’intensité (l’absorbance) est directement proportionnelle à la
concentration de la protéine.
™
Les méthodes les plus utilisées pour quantifier les protéines sont
celles de Biuret, Lowry et Bradford.
80
Méthode de Biuret
Principe:
™
Les ions Cu2+ (ajoutés sous forme de sulfate de cuivre)
se lient aux atomes d’azote des liens peptidiques de
la protéine dans des conditions de pH alcalin,
produisant ainsi un complexe de couleur mauve
avec absorption maximale à 540-550 nm.
1. Chélation:
Cu2+/OH- + protéine
complexe [Cu2+-protéine]
couleur mauve
2. Réaction rédox:
Cu2+ + (acides aminés polaires, Trp, Tyr)red
Cu+ + (acides aminés)ox
™
Un temps d’attente d’environ 30 min est nécessaire pour le développement
de la couleur.
™
Méthode utilisée pour mesurer des concentrations élevées de protéines en
solution: 1-5 mg/mL
81
™ La formation d’un complexe
requiert au moins une structure
dipeptidique. Les acides aminés
ne réagissent pas.
™ Les ions Cu2+ se lie directement
au squelette peptidique des
protéines. La complexation du
Cu2+ ne dépend donc pas de la
séquences des acides aminés.
Spectre d’absorption
du complexe cuivre-protéine
™ Les acides nucléiques
n’interfèrent pas (ils n’ont pas de
structure peptidique).
™ L’ammoniac et certaines amines
peuvent interférer (eg. tampon
TRIS, sels d’ammonium sulfate).
(D’après D.J. Holme, H. Peck,
82
Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)
Méthode de Lowry
Principe:
™ Cette méthode couple les réactions impliquées dans la méthode de Biuret
avec une 2e réaction rédox (couleur).
1. Complexation d’ions Cu2+ avec les atomes d’azote des liens peptidiques
de la protéine dans des conditions de pH alcalin. Le Cu2+ est ainsi réduit
au Cu+:
Cu2+/OH- + protéine
complexe [Cu2+-protéine]
Cu2+ + (acides aminés polaires, Trp, Tyr)red
Cu+ + (acides aminés) ox
2. Les ions Cu+ et les radicaux du Trp, Tyr et Cys réduisent le complexe acide
phosphotungstique/acide phosphomolybdique (couleur jaune) contenu dans le
réactif Folin-Ciocalteau (Na2MoO4 + Na2WO4 + H3PO4), produisant ainsi une
couleur bleue.
Cu+ + (F-C)ox
Cu2+ + (F-C)red
bleu
83
™ L’absorbance peut être mesurée soit à 540 nm ou à 720 nm.
™ Un temps d’attente d’environ 40 min est nécessaire pour le développement de
la couleur.
™ Des courbes d’étalonnage non-linéaires sont obtenues due à la décomposition
du réactif F-C à pH alcalin.
™ Sensibilité: requiert seulement 10 à 200 µg de protéine
(1 µg/mL à 1.5 mg/mL)
™ Un bon choix pour doser des protéines qui contient des chromophores (flavines,
hèmes, etc.)
™ Interférents: K+, Mg2+, EDTA, phénols, détergents, agents réducteurs
™ Des variations de la composition des acides aminés ont une influence sur le
développement de la couleur. On doit préparer une courbe d’étalonnage avec
une protéine dont la composition est similaire à celle de l’inconnu.
™ Des variations de préparation du réactif F-C, de température et du temps
d’attente avant de prendre une mesure nécessitent la préparation d’une courbe
d’étalonnage pour chaque analyse.
84
Méthode de Bradford
Principe:
™ Un colorant, le Coomassie Brilliant Blue G-250, est ajouté à la solution de
protéine dans des conditions de pH acide.
™ Le Coomassie se lie à la protéine par des interactions non-covalentes
(ponts hydrogène, interactions hydrophobes et interactions ioniques)
et sa longueur d’absorption maximale augmente de 465 nm (rouge)
à 595 nm (bleu).
85
Spectre d’absorption du complexe
Coomassie-protéine
™ Détection de protéine de 1 µg/mL à
1.5 mg/mL
™ Courbe d’étalonnage non-linéaire
™ L’absorbance varie de protéine à
protéine
Coomassieprotéine
™ Méthode simple et rapide (5 min),
ajout d’un seul réactif
Coomassie
(D’après D.J. Holme, H. Peck,
Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)
86
2.1.3 Spectres d’absorption et structure
secondaire de polypeptides
Poly-L-lysine
pH 10.8 & 52°C
pH 6.0 & 25°C
pH 10.8 & 25°C
(D’après I. Tinoco, K.Sauer & J.C. Wang, Physical Chemistry:
Principles & Applications in Biological Sciences, 3è éd, 1995)
87