Préparation des échantillons congelés en gomme adragante pour

Protocole : PREPARATION DE TISSUS
CONGELES EN GOMME
ADRAGANTE POUR COUPE
CRYOSTAT
Référence : PRMH/PO/010/4
Rédigé par : M. FAVIER
Création/Mise à jour : 21/10/2014 Approuvé par : M. FAVIER
Version : 3
Rédacteur
Vérificateur
Approbateur
Fonction
Responsable plate-forme
Ingénieur Qualité
Responsable plate-forme
Nb de pages : 1/2
Nom
Signature
M. FAVIER
Y. LOTTIN
M. FAVIER
Révisions
Version
1
2
3
4
Description
Création
Mise à jour
Mise à jour (logo
nomenclature à part)
Maj gomme adragante
et
Auteur
nouveau
doc
M. Favier
M. Favier
M. Favier
Date
15/01/2011
13/09/12
07/01/2013
M. Favier
21/10/2014
1. Objet et domaine d’application
Ce protocole est utilisé pour la préparation de tissus congelés pour coupe Cryostat. Il est
spécifique aux tissus qui demandent une orientation particulière, impossible à ajuster en
inclusion OCT, de par leur finesse ou leur manque de rigidité.
Quelques exemples :
- peau à orienter en transversal pour voir les différentes couches cellulaires,
- muscle en transversal pour avoir la section des fibres,
- côlon, duodénum, jéjunum, etc….à orienter en transversal avec vue de la lumière.
2. Matériel
- Bouchon en liège > VWR, Réf : 217-1017, 22x15x12mm :
À découper avec une lame de rasoir en rondelles de 3mm d’épaisseur environ.
- Gomme adragante > VWR, Réf : 24 437-260 (Prolabo) :
Gomme à préparer à 9%, soit 2,25g à diluer dans 25ml d’eau distillée dans un contenant type
pilulier.
Laisser à 37° ON en remuant à la spatule de temps en temps jusqu’à obtenir une pâte compacte
et homogène, de couleur brun clair.
La gomme adragante se conserve à -20°C jusqu’à utilisation puis se conserve à 4°C en vérifiant
que rien ne pousse dedans.
3. Documents associés
- Fiche de demande de coupes cryostat.
4. Description
Remarque préalable : Afin d’obtenir de belles coupes histologiques, les échantillons que
vous nous donnez sont les PLUS BEAUX (pas de coups de pince, pas de déchirure, pas
trop petits…).
À préparer avant tout prélèvement :
Préparation de tissus congelés pour coupe cryostat
2/2
Réf : PRMH/PO/010/2
Les tissus prélevés seront congelés dans de l’isopentane refroidi à l’azote liquide puis montés
sur des bouchons en liège (FOURNI). Pour cela :
- Découper des rondelles de bouchon en liège (VWR, Réf : 217-1017, 22x15x12mm),
d’environ 3mm d’épaisseur, à l’aide d’une lame de rasoir, et les identifier sur un des côtés et
sur la tranche au STYLO BILLE (le feutre s’effacerait).
- Maintenir le sachet ou tube de conservation des échantillons dans de la carboglace après avoir
pris soin d’indiquer les références nécessaires sur les récipients.
- Faire refroidir un bécher d’isopentane dans un fond d’azote liquide. La température idéale de
l’isopentane pour la congélation des tissus est atteinte (entre -80 et -100°C) lorsqu’il se forme
une couronne blanche au fond du bécher d’isopentane qui ne disparaît pas à l’agitation.
Les prélèvements peuvent commencer :
1- Prélever rapidement les organes. La bonne conservation d’un tissu n’excédant pas 10
minutes. Travailler sur aluminium et sans lumière directe pour éviter le dessèchement du
tissu.
2- L’échantillon ne dépassera pas plus de 5mm de hauteur.
3- Dans une boule de gomme adragante déposée à la spatule sur le bouchon en liège, fixer le
tissu en appuyant légèrement dessus et dans l’orientation de coupe souhaitée, à l’aide
d’une petite pince.
Exemple : Coupe transversale de muscle : le muscle sera monté perpendiculairement à la
rondelle de liège, avec un dépassement de quelques millimètres. Attention, un montage
minutieux de votre part facilitera l’obtention de coupe correctement orientée.
4- À l’aide d’une pince solide, attraper la rondelle de liège et plonger dans l’isopentane à
bonne température, en tournoyant doucement pendant quelques secondes et laisser
congeler quelques minutes.
5- Mettre les tissus montés dans le récipient conservé dans la carboglace.
6- Stocker à -80°C jusqu’à utilisation.
Lorsque vous nous amenez les prélèvements :
Lorsque vous amenez vos échantillons à la plate-forme, les transporter en CARBOGLACE
UNIQUEMENT et accompagnés de la fiche « Demande de coupes cryostat » dûment remplie
et que vous nous aurez également envoyée par mail.