CLONAGE DU FENOUIL DOUX PAR CULTURE D`APEX

43
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2001, 140, 43-58
CLONAGE DU FENOUIL DOUX
PAR CULTURE D’APEX (*)
Z. AMIMAR (1) , A. LAMARTI (1) , A. BADOC (2) ,
J.P. REDURON (3) , S. OUAHABI (4) , B. MUCKENSTURM
(4)
Par culture d’apex provenant de plantules de 15 jours
issues de germination in vitro, trois clones de Fenouil doux
(chémodème estragole) ont été sélectionnés. Sur l’un d’entre
eux, le milieu de multiplication a été amélioré. Partant des
microéléments et vitamines de Murashige et Skoog, de 2 %
de saccharose et 0,7 % d’agar, la solution de macroéléments
de Shah et Dalal a été retenue, de même que la
benzyladénine comme cytokinine. La meilleure combinaison
auxine - cytokinine est 0,57 µM d’AIA et 0,9 µM de BA.
INTRODUCTION
Le Fenouil est une Apiacée (= Ombellifère) aromatique cultivée
comme légume (Fenouil bulbeux), condiment (Fenouil doux) et pour la
production d’huile essentielle riche en (E)-anéthole, principe des boissons
(*)
(1)
(2)
(3)
(4)
Manuscrit reçu le 15 septembre 2001.
Laboratoire de Biotechnologie et d'Amélioration des plantes, Département de
Biologie, Faculté des Sciences M’hannech II, BP 2121 Tétouan, 93002 Maroc.
Laboratoire de Mycologie et Biotechnologie végétale, Faculté des Sciences
Pharmaceutiques, Université Victor Segalen Bordeaux 2, 3, place de la Victoire,
33076 Bordeaux Cedex. [email protected]
Conservatoire Botanique - Service des espaces Verts, Ville de Mulhouse, 2 rue
Pierre et Marie Curie, BP 3089, 68062 Mulhouse Cedex.
Laboratoire de Chimie Organique de Synthèse - Chimie des Plantes (UPRES-A
7015), ENSC Mulhouse, Université de Haute Alsace, Faculté des Sciences et
Techniques, 3, rue Alfred Werner, 68093 Mulhouse Cedex.
44
anisées qu’on tire aussi d’autres espèces comme la Badiane de Chine ou
l’Anis.
Le Fenouil se multiplie facilement par semis. Par contre, la
multiplication de pieds remarquables par voie végétative n’est pas pratique par
les techniques traditionnelles (division des touffes). On peut alors faire appel
à la culture in vitro. La micropropagation du Fenouil peut se faire par culture
d’apex, organogenèse directe ou indirecte et embryogenèse somatique sur
divers types d’explants [11].
La culture d’apex (apex caulinaires et bourgeons axillaires) a été
utilisée pour le clonage et la production à grande échelle de plantules des
Fenouils amer, doux et bulbeux :
Garcia-Rodriguez et al. [6] ont cultivé sur le milieu de Murashige et
Skoog [16] (MS) des apex de plantules de Fenouil doux (Tableau I). La
benzyladénine (BA) à 4,44 µM s’est avérée indispensable pour une formation
durable de bourgeons. Pour éviter le développement d’un cal et favoriser
l’allongement des bourgeons, les auxines doivent être absentes ou à faible
concentration.
Paupardin et al. [17-18] ont cultivé sur le milieu MS des apex
d’embryons immatures et de plantules de Fenouil doux. Pour l’obtention de
souches stables, ils ont fait varier d’un passage à l’autre les associations
d’auxines et de benzyladénine. Le milieu d’entretien permettant la
multiplication des bourgeons (Tableau I) renferme l’acide naphtalène acétique
ANA (0,54 µM) et la BA (0,44 µM). Les pousses présentent un cal à leur
base.
Badoc [1] a mis au point un milieu de micropropagation du Fenouil
amer par culture d’apex issus de plantules germées in vitro. Le milieu est
solidifié par 6,5 % d’agar et additionné d’un mélange vitaminique (Tableau I).
Partant des macroéléments MS dilués de moitié, le bourgeonnement est
amélioré en diminuant l’apport de nitrate d’ammonium par 6 (275 mg/l), voire
en le remplaçant par 2 fois moins de nitrate de sodium (825 mg/l). La
benzyladénine (0,22-0,44 µM) doit être ajoutée au milieu à chaque passage
pour obtenir un bon rendement en bourgeons. La combinaison à une auxine à
faible concentration n’est pas nécessaire à l’obtention de clones. Le glucose
est efficace entre 10 et 20 g/l et de bons résultats ont été obtenus avec 10 g de
glucose combinés à 10 g de mannitol. Ce même milieu a permis à Lamarti
[13–14], en présence de 7 % d’agar, de sélectionner 4 clones de Fenouil amer
avec des huiles essentielles de teneur et de profil variables.
Du Manoir et al. [4] ont obtenu le clonage de pieds remarquables de
Fenouils à partir de bourgeons de jeunes tiges au stade végétatif. Le premier
passage a été réalisé en absence de phytohormone sur un milieu comprenant
45
les macroéléments de Shah et Dalal (SD) [20], les microéléments MS, du
saccharose, de l’agar (0,7 %) et les vitamines MS sans la glycine, mais avec
de l’acide folique et de la biotine. La multiplication a lieu par repiquage
mensuel sur le même milieu additionné d’acide indole acétique AIA et de BA
(Tableau I). L’acide folique et la biotine augmentent le nombre de bourgeons.
Les macroéléments MS dilués de moitié donnent un bourgeonnement
moindre. Le taux de multiplication atteint 7,5 et 4,5 bourgeons,
respectivement pour les Fenouils doux et amer.
Theiler-Hedtrich et Kägi [21] ont obtenu 15 clones à partir de 2
cultivars de Fenouil bulbeux par culture de bourgeons prélevés in vivo sur le
milieu MS additionné de thiamine (0,4 mg/l), d’agar (0,7 %), de saccharose,
de kinétine et d’ANA (Tableau I).
Hunault et Maatar [12] ont multiplié des bourgeons provenant de pieds
in vivo et d’apex de plantules de Fenouils amer, bulbeux et sauvage. Le
milieu utilisé renferme 0,6 % d’agar et 0,4 mg/l de thiamine (Tableau I).
Signalons au passage (données non publiées) que les graines de Corse
fournies par le Jardin Botanique de Liège, récoltées par J. Lambinon, ne
correspondent pas à la sous-espèce piperitum comme indiqué par ces
auteurs, mais d’après nos analyses à la sous-espèce vulgare var. vulgare
chémodème (= chémotype) estragole.
Hunault [9] a cultivé des apex de plantules issues de la régénération
d’embryons somatiques traités en suspension cellulaire par de la colchicine.
Sur le milieu SD additionné de glucose, d’agar (0,7 %), d’AIA et de BA
(Tableau I), il a obtenu des clones mixoploïdes, aneutétraploïdes et
eutétraploïdes.
Ce travail vise à améliorer la micropropagation conforme du Fenouil
doux via la culture d’apex prélevés sur des plantules issues de germination in
vitro. À partir d’un clone stable, différentes solutions minérales et
combinaisons phytohormonales ont été étudiées.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Les fruits ont été achetés dans le commerce à Meknès comme Fenouil doux.
Les akènes brun-verdâtre mesurent 5,6 mm de long en moyenne. L’analyse
par chromatographie en phase gazeuse de l’huile essentielle des akènes mûrs
confirme qu’il s’agit bien d’un Fenouil doux (Foeniculum vulgare Mill.
subsp. vulgare var. dulce (Mill.) Batt. & Trab.).
46
Tableau I : Milieux de multiplication utilisés pour la culture
d’apex de Fenouil.
Fenouil
Explant de
départ
Macroéléments,
Microéléments,
Phytohormones
(µM)
Vitamines (mg/l ), Sucres (%) Références
doux
apex de plantule
MS, MS, AIA (00,057) + BA (4,44)
thiamine (1), glucose (3 %)
doux
apex de plantule
apex d'embryon
MS, MS, ANA (0,54) thiamine (1), glucose (3 %)
+ BA (0,44)
Paupardin et al., 1980
amer
apex de plantule
MSm, MS, BA (0,44) acide nicotinique (0,25), mésoinositol (5), thiamine-HCl (0,5),
acide folique (0,05), pantothénate de
calcium (0,5), biotine (0,025),
glucose (1 %) + mannitol (1 %)
SD, MS, AIA (0,57)
MS sans glycine, acide folique (0,1),
+ BA (0,44)
biotine (0,1), saccharose (2 %)
Badoc, 1982 ; Lamarti, 1987 et
1994
doux et amer bourgeon de tige
bulbeux
bourgeon apical
ou axillaire
MS, MS, ANA (0,11) méso-inositol (100), thiamine-HCl
+ Kin (9,29)
(0,4), saccharose (3 %)
amer,
bulbeux et
sauvage
apex de plantule
bourgeon de tige
SD, MS, AIA (0,57)
+ BA (0,44)
amer
apex de plantule
régénérée
SD, SD, AIA (0,57) + SD, glucose (2 %)
BA (0,44)
Garcia-Rodriguez et al., 1978
Du Manoir et al., 1985 ;
Desmarest et al., 1988 ;
Hunault et al., 1989 ; Hunault
et Du Manoir, 1992
Theiler-Hedtrich et Kägi, 1992
acide nicotinique (0,5), méso-inositol Hunault et Maatar, 1995
(100), pyridoxine-HCl (0,5),
thiamine-HCl (0,4), biotine (0,1),
glucose (2 %)
AIA : acide indole acétique
AIB : acide indole 3-butyrique
ANA : acide naphtalène acétique
BA : benzyladénine
2,4-D : acide 2,4-dichlorophénoxyacétique
MS : Murashige et Skoog [16]
MSm : Murashige et Skoog modifié [1]
SH : Schenk et Hildebrandt [19]
Hunault, 1997
Vitamines MS : acide nicotinique (0,5), glycine (2), méso-inositol (100), chlorhydrate de pyridoxine (0,5),
chlorhydrate de thiamine (0,1 mg/l).
47
En effet, les fruits sont plus riches en limonène (18,7 %) qu’en α pinène (6,2 %). Ils correspondent au chémodème estragole et non (E)anéthole [2], ces 2 arylpropènes étant présents à raison de 61,7 et 0,4 %.
Seuls les akènes provenant de diakènes séparés, soit 12 % du matériel
du départ, ont été utilisés. Les akènes abîmés, immatures ou courbes ont été
éliminés et les akènes bruns (10 %) ont été stockés dans des sachets de
cellophane à l’obscurité et à température ambiante.
Après plusieurs essais, le protocole de stérilisation suivant a été
retenu : Mercryl laurylé® (10 % v/v) (association de mercurobutol et
laurylsulfate de sodium) 15 min, solution filtrée 10 % (p/v) d'hypochlorite de
calcium d'environ 120 degrés chlorométriques français 30 min, HgCl2 0,1 %
p/v 1 min, eau distillée stérile 5 et 10 min. Une imbibition de 2 heures permet
d’augmenter le taux de germination.
Le délai, la vitesse et le pourcentage de germination sont variables
chez les akènes de Fenouil doux. Afin d'obtenir un développement homogène
des plantules, les germinations ont été réalisées tout d'abord dans des boîtes
de Petri stériles en plastique (90 x 12 mm) à raison de 30 akènes par boîte
contenant 30 ml du milieu de Gautheret [7] solidifié par 0,6 % d’agar
bactériologique (pH 5,6) préalablement autoclavé à 120 °C pendant 20 mn.
Les semis sont placés dans une salle climatisée à 24 °C et 80 % d'humidité
relative. L'éclairement, d'une intensité de 2,5 W.m-2, est fourni 18 heures par
jour par des tubes fluorescents de type blanc de lux (Philips-40 W). Après
trois jours, 25 % des akènes germent et donnent une pointe racinaire de 5 à 6
mm. Ces akènes germés sont transférés dans des tubes à essais en verre (18 x
180 mm) à raison d'un akène par tube. Ces derniers contenant 15 ml du
milieu de Gautheret [7] solidifié par 0,6 % d’agar (bactériologique type E),
sont bouchés par du coton cardé, puis recouverts d'une feuille d’aluminium et
placés dans les mêmes conditions que précédemment.
Des apex de 2-3 mm ont été prélevés sur 100 plantules de 15 jours
(stade 2 feuilles cotylédonaires). Ils sont disposés verticalement à la surface
d’un milieu solidifié par 0,7 % d’agar (bactériologique type E) renfermant les
macroéléments SD [20], les microéléments et vitamines MS [16], du
saccharose à 2 % et 0,44 µM de BA (Figure 1). Le repiquage se fait tous les
30 jours et les explants hyperhydriques (photo 1) ont été éliminés. Trois
clones A, B et C ont été retenus à partir du 7 e repiquage. La mise au point du
milieu de culture a été réalisée sur le clone A.
Diverses solutions de macroéléments (Tableau II) différant notamment
par leur teneur en azote (NO-3 et NH+4) et en potassium, toutes additionnées
des microéléments et vitamines MS (1962), de saccharose (2 %) et de BA à
0,44 µM ont été testées.
48
akènes
stérilisation
germination
15 jours
100 plantules
stade 2 feuilles cotylédonaires
apex de 2 mm
7 subcultures de 30 jours
élimination des explants
hyperhydriques (photo 1)
clone A
(photo 2)
clone B
(photo 3)
clone C
(photo 4)
Fig. 1 : Schéma illustrant le protocole expérimental suivi pour l’obtention
des clones A, B et C par culture d’apex de Fenouil doux.
Les effets de 4 cytokinines, benzyladénine (BA), kinétine, zéatine et
2-isopenténylaminopurine (2iP) ont été également testés, ainsi que leur
association à des auxines : acide indole acétique (AIA), acide indole
butyrique (AIB), acide naphtalène acétique (ANA) et acide
2,4–dichlorophénoxyacétique (2,4-D).
Les milieux sont ajustés à pH 5,6 par une solution tampon (MES à
50 µM) et autoclavés à 120 °C pendant 20 minutes. La zéatine et la kinétine
étant réputées sensibles à l’autoclavage, toutes les cytokinines ont été ajoutées
sous forme de solutions en faible volume préparées extemporanément à partir
de solutions mères et stérilisées par filtration sur des filtres de porosité
0,22 µM, de type Acrodisc (Gelman) ou Analypore (Osi), à usage unique.
Des fioles renfermant environ 30 ml de milieu obturées par une feuille
d’aluminium ont été placées dans une chambre climatisée à 24 ± 1 °C, à
80 % d’humidité relative, pourvue de tubes ″Philips-40W″ assurant un
éclairement de 10 W.m-2. La photopériode est de 16 heures de lumière pour 8
heures d’obscurité.
49
À chaque expérience, 50 bourgeons ont été utilisés par condition avec
3 répétitions. Les explants hyperhydriques ont été éliminés et ont été calculés :
- le nombre moyen des bourgeons par explant,
- la longueur moyenne des pousses feuillées (mm),
- le pourcentage d'hyperhydrie,
- le poids de matière fraîche de 100 explants.
Tableau II :
Composition ionique en mEq/l des 8 solutions de macroéléments
testées.
Milieux
White
(1943)
[22]
Heller
(1953)
[8]
MS
(1962)
[16]
B5
(1968)
[5]
SH
(1972)
[19]
0,6
1,7
1,8
-
SD
(1980)
[20]
MSm
(1982)
[1]
N30K
(1984)
[15]
2,0
1,0
10,1
8,0
3,0
6,0
20,6
20,0
-
2,0
2,0
2,0
24,7
1,1
3,2
2,7
2,6
24,7
-
5,0
7,2
6,2
10,6
-
1,5
3,0
3,4
10,0
-
2,0
5,0
6,0
15,0
-
0,6
0,9
2,5
0,1
2,0
11,1
7,1
0,9
3,0
6,0
39,4
1,2
4,1
2,0
24,7
1,1
3,2
2,7
24,7
2,6
5,0
7,2
16,1
0,7
1,5
3,0
12,8
0,6
2,0
1,0
24,0
1,0
2,5
7,1
60,0
27,8
27,6
22,4
16,25
30,0
8,2
42,2
99,3
63,8
66,6
58,1
35,8
56,0
Cations
Mg2+
Ca2+
NH+4
K+
Na+
Anions
SO42ClNO3H2PO4Azote
total
(atome g)
Ions
totaux
B5 : Gamborg et Eveleigh
MS : Murashige et Skoog
MSm : Murashige et Skoog modifié
N30K : Margara
SD : Schenk et Hildebrandt
SH : Shah et Dalal
50
RÉSULTATS
Les 3 clones sélectionnés à partir du 7 e repiquage diffèrent par leur
taille (valeurs établies après 30 jours de culture, à l’issue de la 7e subculture) :
- Le clone A (photo 1) est petit (pousses de 18,2 ± 0,3 mm) et a un
nombre moyen de bourgeons de 7,0 ± 0,1.
- Le clone B (photo 2) est de taille moyenne (22,2 ± 0,2 mm), et
présente 10,3 ± 0,3 bourgeons.
- Le clone C (photo 3) est de grande taille (33,1 ± 0,2 mm) avec un
fort bourgeonnement (16,0 ± 0,1).
Parmi les 8 solutions de macroéléments testées (Tableau III), celle de
Heller (1953) s’avère néfaste sur les apex dès le départ et celle de White
donne de mauvais résultats.
Tableau III :
Effet de 8 solutions de macroéléments sur la multiplication, la
croissance et l'hyperhydrie des bourgeons du clone A de
Fenouil doux après 30 jours de culture
Le milieu renferme les macroéléments SD (1980), les microéléments et
vitamines MS (1962), 2 % de saccharose, 0,7 % d’agar et 0,44 µM de BA.
Macroéléments
Nombre moyen
de bourgeons
par explant
White (1943) [22]
1,3 ± 0,1
6 ± 0,5
0
Heller (1953) [22]
0
-
-
MS (1962) [16]
3,2 ± 0,4
36 ± 3
5±2
B5 (1968) [5]
3,1 ± 0,4
29 ± 2
3±2
SH (1972) [19]
2,7 ± 0,1
9±4
0
SD (1980) [20]
7,7 ± 0,4
26 ± 3
0
MSm (1982) [1]
5,2 ± 0,3
27 ± 4
1±1
N30K (1984) [15]
8,5 ± 0,6
32 ± 5
10 ± 4
B5 : Gamborg et Eveleigh
MSm : Murashige et Skoog modifié
SD : Schenk et Hildebrandt
Longueur moyenne Hyperhydrie
des pousses
(%)
(mm)
MS : Murashige et Skoog
N30K : Margara
SH : Shah et Dalal
51
L
p
l
1
2
3
4
Clonage par culture in vitro d’apex prélevés sur des plantules de
Fenouil doux obtenues par germination d’akènes.
Photo 1 : Explant hyperhydrique avec malformation du pétiole (P) et
du limbe (L) (2e subculture).
Photo 2 : Explant de 30 jours du clone A (7e subculture).
Photo 3 : Explant de 30 jours du clone B (7e subculture).
Photo 4 : Explant de 30 jours du clone C (7e subculture).
Le meilleur bourgeonnement est obtenu avec les macroéléments N30K
[15], avec des pousses de bonne taille (32 mm), mais un pourcentage
d'hyperhydrie élevé (10 %).
Parmi les autres macroéléments, ceux de SD [20] donnent un
bourgeonnement élevé, des pousses de taille correcte (26 mm) et un
pourcentage d'hyperhydrie nul. Ces macroéléments ont donc été retenus pour
les manipulations suivantes.
52
Des bourgeons du clone A ont été ensuite cultivés en présence de 4
cytokinines à différentes concentrations (Tableau IV).
Tableau IV :
Effets de 4 cytokinines à 3 concentrations sur le
bourgeonnement, la croissance et l’hyperhydrie de bourgeons du
clone A de Fenouil doux 30 jours après le repiquage.
Le milieu renferme les macroéléments SD [20], les microéléments et vitamines
MS [16], 2 % de saccharose et 0,7 % d’agar.
µM
Cytokinines
Nombre
moyen de
bourgeons
par explant
Longueur
moyenne
des pousses
(mm)
Hyperhydrie
(%)
Matière
fraîche
par 100
explants
(g)
0
Témoin
4,8 ± 0,2
53 ± 3
0
7,9
BA
7,7 ± 0,6
26 ± 3
0
55,0
Kinétine
6,0 ± 0,3
54 ± 3
4±1
22,7
Zéatine
3,5 ± 0,3
23 ± 3
22 ± 4
4,6
2iP
3,1 ± 0,3
34 ± 2
0
16,3
BA
7,9 ± 1,2
24 ± 4
0
49,3
Kinétine
6,5 ± 0,5
57 ± 3
7±2
37,3
Zéatine
11 ± 0,9
29 ± 3
30 ± 6
7,7
2iP
3,6 ± 0,3
61 ± 5
11 ± 3
16,5
BA
4,2 ± 0,2
15 ± 3
10 ± 3
17,1
Kinétine
5,1 ± 0,2
35 ± 6
15 ± 4
23,0
Zéatine
10 ± 0,4
23 ± 7
32 ± 6
16,8
2iP
3,4 ± 0,2
50 ± 9
25 ± 5
39,1
0,44
0,90
2,22
BA : benzyladénine
2iP : 2-isopentényladénine
À 0,44 et 0,90 µM, la BA favorise la multiplication (7,7 et 7,9
bourgeons par explant) et la croissance (pousses de 26 et 24 mm) avec une
hyperhydrie nulle. Le poids de matière fraîche de 100 explants est maximal. À
2,22 µM, le nombre de bourgeons diminue, les pousses sont réduites et le
pourcentage d'hyperhydrie s'élève à 10 %.
53
La kinétine à 0,44 et 0,90 µM donne des pousses de bonne taille (54
et 57 mm ), mais le taux d’hyperhydrie est non nul et le nombre moyen de
bourgeons par explant ne dépasse pas 6,5.
La zéatine donne le maximum de multiplication (11 et 10 bourgeons
par explant à 0,90 et 2,22 µM), mais quelle que soit la concentration, les
pousses sont de petite taille, le poids de matière fraîche de 100 explants faible
et le taux d’hyperhydrie élevé (>22 %).
La 2iP donne des pousses de grande taille à 0,90 µM, mais le
pourcentage d’hyperhydrie est non nul et la multiplication est toujours faible.
La BA est donc la cytokinine donnant les meilleurs résultats, à 0,44 et
0,90 µM (7,7 et 7,9 bourgeons par explant).
En présence de 0,9 µM de BA, diverses auxines ont été testées
(Tableau V).
Tableau V :
Interaction entre 0,9 µM de benzyladénine et diverses auxines
sur bourgeonnement et la croissance des pousses de bourgeons
du clone A de Fenouil doux 30 jours après le repiquage.
Le milieu renferme les macroéléments SD (1980), les microéléments et
vitamines MS (1962), 2 % de saccharose et 0,7 % d’agar.
µM
Auxines
Nombre moyen de
bourgeons par
explant
Longueur moyenne
des pousses
(mm)
Hyperhydrie
(%)
AIA
7,2 ± 0,3
25 ± 3
0
AIB
6,1 ± 0,2
25 ± 3
0
ANA
5,8 ± 0,2
24 ± 2
0
2,4-D
3,1 ± 0,1
19 ± 3
3±1
AIA
8,6 ± 0,4
28 ± 4
0
AIB
5,2 ± 0,3
27 ± 5
0
ANA
4,9 ± 0,2
28 ± 3
1±1
2,4-D
2,9 ± 0,2
15 ± 2
5±2
0,30
0,57
AIA : acide indole acétique
ANA : acide naphtalène acétique
AIB : acide indole butyrique
2,4-D : acide 2,4-dichlorophénoxyacétique
54
L'AIA donne les meilleurs résultats à 0,3 comme à 0,57 µM : 7,2 et
8,6 bourgeons par explant de 25 et 28 cm sans hyperhydrie. L’AIB et l’ANA
fournissent une production de bourgeons moindre. Le 2,4-D présente la
multiplication et la croissance la plus faible et favorise l’hyperhydrie.
L'AIA à 0,57 µM a été retenu pour la suite des essais.
Diverses cytokinines à 3 concentrations ont été testées en association
avec 0,57 µM d’AIA (Tableau VI).
Tableau VI :
Action de 4 cytokinines associées à 0,57 µM d’AIA sur la
multiplication et la croissance des bourgeons du clone A de Fenouil
doux après 30 jours de culture.
Le milieu renferme les macroéléments SD (1980), les microéléments et
vitamines MS (1962), 2 % de saccharose et 0,7 % d’agar.
AIA
(µM)
0
0,57
0,57
0,57
Cytokinines
(µM)
0
0,44
0,90
2,22
Nombre
Longueur Hyperhydrie Matière
moyen de
moyenne
(%)
fraîche
bourgeons des pousses
par 100
par explant
(mm)
explants
(g)
Témoin
4,8 ± 0,2
53 ± 3
0
7,9
BA
7,0 ± 0,7
28 ± 2
0
49,3
Kinétine
6,0 ± 0,4
53 ± 3
0
37,3
Zéatine
10 ± 0,6
38 ± 2
25 ± 4
7,7
2iP
3,1 ± 0,2
57 ± 3
5±1
16,5
BA
8,6 ± 0,4
28 ± 2
0
21,2
Kinétine
6,5 ± 0,4
53 ± 3
5±1
36,3
Zéatine
9,7 ± 0,3
28 ± 4
40 ± 6
18,2
2iP
3,6 ± 0,4
32 ± 2
35 ± 5
21,5
BA
4,1 ± 0,6
10 ± 6
29 ± 4
17,1
Kinétine
5,8 ± 0,4
40 ± 3
12 ± 2
23,0
Zéatine
8,1 ± 0,8
24 ± 6
33 ± 3
16,8
2iP
3,6 ± 0,6
32 ± 4
20 ± 3
39,1
AIA : acide indole acétique
BA : benzyladénine
2iP : 2-isopentényladénine
55
La BA donne une bonne multiplication à 0,44 et surtout à 0,9 µM (7,0
et 8,6 bourgeons par explant). Le pourcentage d’hyperhydrie est alors nul,
mais la taille des pousses est faible, d’où un aspect touffu. Le poids de
matière fraîche des explants est maximal à 0,44 µM. À 2,22 µM, il diminue et
l’hyperhydrie est importante (29 %).
La kinétine donne des pousses de bonne taille, mais un
bourgeonnement moyen. À 2,22 µM, l’hyperhydrie atteint 12 % et le poids
de matière fraîche des explants diminue.
La zéatine fournit le maximum de bourgeonnement, mais présente un
taux d’hyperhydrie élevé (>25 %) s’accompagnant d’un faible poids des
explants.
La 2iP donne les pousses les plus longues (57 mm à 0,44 µM), mais
le bourgeonnement est le plus faible et l’hyperhydrie est non négligeable. Le
poids de matière fraîche des explants augmente avec la concentration.
La meilleure combinaison avec 0,57 µM d’AIA est donc obtenue avec
0,9 µM de BA.
DISCUSSION - CONCLUSION
Trois clones de Fenouil doux ont été obtenus par culture d’apex
prélevés sur de jeunes plantules provenant de la germination in vitro d’akènes
préalablement stérilisés.
C’est la première fois à notre connaissance qu’est décrite la
micropropagation du chémodème estragole de la variété dulce.
En travaillant sur un même clone, les résultats ne dépendent plus de la
variabilité intrapopulationnelle et sont plus faciles à interpréter. Ainsi, le clone
A a permis d’étudier le comportement des pousses en présence de plusieurs
solutions minérales et l’action des cytokinines seules ou associées à d’autres
auxines sur le bourgeonnement, la croissance et l’hyperhydrie.
Cependant, le milieu, mis au point pour un seul clone, n’est pas
forcément idéal pour tous les apex de Fenouil doux. Au cours du clonage,
une sélection s’opère par l’élimination des explants hyperhydriques et le suivi
des explants fournissant le plus de bourgeons. Cette sélection pourrait
expliquer les milieux plus ou moins riches en éléments nutritifs et en
phytohormones décrits pour la culture d’apex du Fenouil.
L’apport d’auxines n’est pas indispensable à la micropropagation.
Ajouté à 0,90 µM de BA, l’AIA à 0,57 µM (Tableaux IV et VI) augmente
56
cependant la longueur moyenne des bourgeons (28 au lieu de 24 mm) et
pourrait améliorer le bourgeonnement (8,6 bourgeons par explant au lieu de
7,9).
Les 3 clones ont été stabilisés sur le milieu mis au point composé des
macroéléments SD (1980), des microéléments et vitamines MS (1962), de
saccharose (2 %), d’agar (7 %), de 0,44 µM de BA, mais sans AIA. Ils ont
été multipliés à raison d’une centaine de bourgeons par clone afin d’être
comparés dans un essai agronomique en bloc à 3 répétitions.
BIBLIOGRAPHIE
1-
Badoc (A.) - Contribution à l’étude des phénomènes d’organogenèse et
de callogenèse de tissus de Fenouil vulgaire (Foeniculum vulgare
subsp. capillaceum var. vulgare (Mill.) Thellung) cultivés in vitro,
analyse des constituants de l’huile essentielle des explants. – D. E. A.
Univ. Lille Univ. Lille Flandres Artois, 1982, 74 p.
2-
Badoc (A.), Lamarti (A.) - Contribution à l'étude du genre Foeniculum
Mill. Actes Inst. Agron. Vet. Hassan II, 1997. no. spécial, Plantes
aromatiques et médicinales et leurs huiles essentielles, B. Benjilali, M.
Ettalibi, M. Ismaïli-Alaoui et S. Zrira Eds, Actes Editions, 21-36.
3-
Desmarest (P.), Du Manoir (J.), Hunault (G.) - Amélioration du fenouil
amer par clonage et embryogenèse somatique. - 8e Colloq. Int. Assoc.
Plant Tissue Cult., Angers, 8-9 Oct. 1987, 1988, p 79-89.
4-
Du Manoir (J.), Desmarest (P.), Saussay (R.) - In vitro propagation of
fennel (Foeniculum vulgare Miller). - Sci. Hortic., 1985, 27(1-2),
15–19.
5-
Gamborg (O.L.), Eveleigh (D.E.) - Culture methods and detection of
glucanases in suspension cultures of wheat and barley. - Can. J.
Biochem., 1968, 46(5), 417-421.
6-
Garcia-Rodriguez (M.J.), Paupardin (C.), Saussay (R.) - Sur la
formation d'un tissu sécréteur et la synthèse d'anéthole par des tissus de
Fenouil (Foeniculum vulgare Mill. var. Doux) cultivés in vitro. - C. R.
Séances Acad. Sci., Ser. D., 1978, 287(7), 693-696.
7-
Gautheret (R.J.) - La culture des tissus végétaux. Techniques et
réalisations. Paris : Masson et Cie ed., 1959, 863 p.
57
8-
Heller (R.) - Recherches sur la nutrition minérale des tissus végétaux
cultivés in vitro. Ann. Sci. Nat, Bot. Biol. Veget., 1953, 14, 1-223.
9-
Hunault (G.) - Tétraploïdisation du fenouil (Foeniculum vulgare
Miller) par application de colchicine à une suspension cellulaire
embryogène. Acta Bot. Gallica, 1997, 144(1): 83-93.
10 - Hunault (G.), Desmarest (P.), Du Manoir (J.) - Fennel (Foeniculum
vulgare Miller): Cell Culture, Regeneration, and the Production of
Anethole. In Bajaj Y. P. S. (ed.), Biotechnology in Agriculture and
Forestry. Vol. 7. Medicinal and Aromatic plants II, Berlin Heidelberg :
Springer Verlag, 1989, 185-212.
11 - Hunault (G.), Du Manoir (J.) - Micropropagation of Fennel
(Foeniculum vulgare Miller). In Bajaj Y. P. S. (ed.), Biotechnology
in Agriculture and Forestry. Vol. 19. High-Tech and
Micropropagation III, Berlin Heidelberg : Springer Verlag, 1992,
199–217.
12 - Hunault (G.), Maatar (A.) - Enhancement of somatic embryogenesis
frequency by gibberellic acid in fennel. Plant Cell, Tissue Organ Cult.,
1995, 41(2): 171-176.
13 - Lamarti (A.) - Évolution de l'huile essentielle de Fenouil amer
(Foeniculum Vulgare Mill.) dans les différents organes de plantules
cultivées «in vitro». Thèse Doct. Univ. Lille Flandres Artois, 1987,
n°129, 387 p, 396 réf.
14 - Lamarti (A.) - La culture in vitro du Fenouil amer (Foeniculum
vulgare Mill.), modèle expérimental pour l’étude analytique et
structurale de l’évolution et de la régulation de la biosynthèse des huiles
essentielles. Thèse Doct. ès-Sciences, Univ. Tétouan, 1994, 246 p.
15 - Margara (J.) – Base de la multiplication végétative. Versailles,
Paris : INRA, 1984, 262 p.
16 - Murashige (T.), Skoog (F.) - A revised Medium for Rapid Growth and
Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant., 1962,
15(3), 473–497.
17 - Paupardin (C.), Garcia-Rodriguez (M.J.), Bricout (J.) - Application de
la culture in vitro à l’amélioration des plantes potagères. Culture de
tissus de plantes aromatiques: production d’huile essentielle,
propagation végétative. Colloq. Eucarpia, Versailles, C.N.R.A. ed.,
1980a, 201-210.
58
18 - Paupardin (C.), Garcia-Rodriguez (M.J.), Bricout (J.) -. Multiplication
végétative de quelques plantes aromatiques : problèmes posés par la
production d'essence. C. R. Acad. Agric. Fr., 1980b, 66(8), 658-666.
19 - Schenk (R.U.), Hildebrandt (A.C.) - Medium and techniques for
induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant
cell cultures. Can. J. Bot., 1972, 50(1), 199-204.
20 - Shah (R.R.), Dalal (K.C.) - In vitro multiplication of Glycyrrhiza.
Curr. Sci. (India), 1980, 49(2), 69-71.
21 - Theiler-Hedtrich (R.), Kägi (A.C.) - Cloning in vitro and somatic
embryogenesis in Foeniculum vulgare Mill. (fennel) of ‘Zefa Fino’ and
‘Zefa Tardo’. Acta Hortic., 1992, (300), 287-291.
22 - White (P.R.) - A handbook of plant tissue culture. Lancaster, Penn. :
The Jacques Cattell Press, 1943, 277 p.
ABSTRACT
Clonage of sweet fennel by axillary bud culture
By apex culture issued from 15 days plantlets from germination in
vitro, three clones of sweet fennel (chemotype estragole) have been selected.
On one of these, the multiplication medium was improved. With
microelements and vitamins of Murashige and Skoog and 2% sucrose, the
macroelement solution of Shah and Dalal was retained, as benzyladenine as
cytokinin. The best combination auxin - cytokinin was 0,57 µM IAA and
0,9 µM BA.
Key-words: Foeniculum vulgare var. dulce, in
micropropagation, somaclonal variation.
__________
vitro
culture,