maladies dues aux virus hendra et nipah

CHAPITRE 2.9.6.
MALADIES DUES AUX VIRUS HENDRA ET NIPAH
RÉSUMÉ
Le virus Hendra (HeV) et le virus Nipah (NiV) ont émergé durant la dernière décennie du 20e siècle
en tant qu’agents responsables d’épidémies de maladie respiratoire et neurologique qui infectent
plusieurs espèces animales. En 1994, le HeV causait une maladie respiratoire sévère et la mort de
13 chevaux et d’un entraîneur de chevaux dans une écurie à Brisbane en Australie. Entre
septembre 1998 et avril 1999, après dissémination d’une infection respiratoire ou encéphalitique
non reconnue chez des porcs en Malaisie, le NiV est apparu dans la population humaine locale
comme une cause d’encéphalite mortelle. HeV a entraîné la mort de 2 personnes tandis que 400
cas humains de NiV ont été signalés ayant entraîné environ 200 décès, en Malaisie, à Singapour,
au Bengladesh et en Inde. Les chauves-souris frugivores (« flying foxes ») du genre Pteropus sont
les hôtes naturels des deux virus.
L’infection au HeV chez le cheval est caractérisée par une fièvre importante, de la sudation faciale,
des difficultés respiratoires sévères et, enfin, un jetage nasal abondant et mousseux. Quelques
chevaux présentent des signes neurologiques. Les observations post mortem les plus fréquentes
sont la dilatation des vaisseaux lymphatiques pulmonaires, un œdème pulmonaire sévère et de la
congestion. La lésion sous-jacente est une dégénérescence généralisée des petits vaisseaux
sanguins dans beaucoup d’organes. Des syncytiums de cellules endothéliales contenant de
l’antigène viral sont fréquemment observés dans les capillaires et les artérioles. L’infection des
chevaux par le HeV n’est pas toujours fatale et certains chevaux manifestant des signes cliniques
peuvent survivre à l’infection. Des expériences de transmission en laboratoire ont montré que le
HeV n’est pas facilement transmis entre chevaux. Ce résultat correspond à l’observation faite au
cours de l’épizootie d’origine où l’infection ne s’était pas disséminée largement aux chevaux des
propriétés voisines.
L’infection par le NiV des porcs est fortement contagieuse, mais elle n’a pas été identifiée
initialement comme une nouvelle maladie parce que la morbidité et la mortalité n’étaient pas
marquées et que les signes cliniques n’étaient pas significativement différents des autres maladies
porcines connues. Les observations faites durant l’investigation de l’épizootie et durant des
infections expérimentales confirment que l’infection des porcs par le NiV est caractérisée par de la
fièvre avec atteinte du système respiratoire. Chez les animaux qui extériorisent la maladie ; les
signes nerveux ont été fréquemment décrits mais de nombreuses infections passent inaperçues.
Certains animaux infectés présentent une toux sèche inhabituelle. De l’avortement est décrit chez
les truies. Des lésions immunohistochimiques sont visibles sur le système respiratoire (trachéite,
bronchite et pneumonie interstitielle) et/ou le cerveau des animaux infectés. Des syncytiums
cellulaires contenant de l’antigène viral sont observés dans les petits vaisseaux sanguins, les
vaisseaux lymphatiques et l’épithélium respiratoire.
Les deux virus peuvent atteindre les animaux de compagnie. Le HeV cause des maladies
respiratoires chez le chat semblables à celles observées chez les chevaux. L’infection naturelle des
chiens avec le NiV cause un syndrome semblable à la maladie de Carré avec un taux de mortalité
élevé ; des arguments sérologiques existent qui laissent à penser que certains chiens survivent à
l’infection. Expérimentalement, le NiV cause une maladie similaire au HeV chez les chats. Les
syncytiums de cellules endothéliales contenant de l’antigène viral ont été observés dans des
infections par le HeV et le NiV chez le chat et dans des infections par le NiV chez les chiens.
Les hommes contractent l’infection par contact direct, habituellement plutôt à partir d’un hôte
amplificateur (le porc pour le NiV et les chevaux pour le HeV) que directement à partir de l’hôte
réservoir. Néanmoins, les recherches sur les foyers humains à NiV au Bengladesh ont montré que
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les hommes pouvaient s’infecter à partir des chauves-souris Pteropid. La transmission d’homme à
homme n’a pas été observée ni avec le HeV ni avec le NiV en Malaisie ou à Singapour, mais une
transmission d’homme à homme est suspectée dans les récents foyers d’infection par le NiV au
Bangladesh.
Le HeV et le NiV sont des membres très proches de la famille des Paramyxoviridae. Les
différences entre eux et les autres membres de la famille ont conduit à leur classification dans un
nouveau genre : les Henipavirus, dans la sous famille des Paramyxovirinae. Le HeV et le NiV sont
des agents de niveau 4 de biosécurité. Il est important que les échantillons provenant d’animaux
suspects soient uniquement transportés vers des laboratoires autorisés sous conditions de sécurité
biologique en accord avec des réglementations internationales.
Identification de l’agent pathogène : le HeV et le NiV peuvent être propagés sur une série de
lignées cellulaires. L’isolement du virus à partir d’échantillon de terrain peut être tenté, mais
seulement en situation où la sécurité de l’opérateur peut être assurée. Les procédures
d’identification suivent l’isolement du virus et comprennent des colorations immunohistochimiques
des cellules infectées, la neutralisation par un antisérum spécifique et la caractérisation
moléculaire. Une réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) est maintenant
disponible pour le diagnostic.
L’antigène viral est présent dans l’endothélium vasculaire, et dans le cas du NiV chez le porc on en
retrouve au niveau de l’épithélium respiratoire. Une large gamme de tissus fixés avec du formol
peut être examinée pour détecter les antigènes du HeV et de NiV. Les échantillons soumis à
l’immunohistochimie doivent inclure du cerveau (y compris les méninges), du poumon, de la rate et
du rein. Chez les animaux gestants ou en cas d’avortement, l’utérus, le placenta et les tissus
fœtaux doivent être inclus. Les échantillons pour l’isolement et la détection moléculaire du virus
doivent être des tissus récemment collectés à partir des mêmes organes que ci-dessus, ou de
l’urine ou des écouvillonnages nasaux.
Épreuves sérologiques : les tests de séroneutralisation virale (SN) et immuno-enzymatiques
(ELISA) sont disponibles. Le test de SN est couramment considéré comme la méthode de
référence. Les antisérums dirigés contre HeV et NiV ne présentent de la neutralisation croisée que
jusqu’à un certain degré. Aussi une simple SN utilisant l’un des deux virus ne donne pas une
identification définitive de la spécificité des anticorps. Les anticorps neutralisants envers le HeV et
le NiV peuvent être différenciés par leur plus grande capacité à neutraliser le virus homologue que
le virus hétérologue. Ceci ne devrait pas être un obstacle majeur en situation épidémique où l’agent
causal est connu, mais les échantillons de sérum provenant de cas suspects ou provenant de
région du monde autre que l’Australie et la Malaisie doivent être soumis à des tests de VNT avec
les deux virus, HeV et NiV. L’apparenté sérologique entre le HeV et le NiV assure que l’ELISA
utilisant des antigènes du HeV ou du NiV peut être utilisé pour détecter des anticorps des deux
virus.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : il
n’y a pas de vaccin actuellement disponible pour HeV et NiV.
A. INTRODUCTION
Le virus de Hendra (HeV) et le virus de Nipah (NiV) sont des virus des chauves-souris frugivores communément
connues comme « flying foxes », membres du genre Pteropus. Des anticorps contre le HeV sont trouvés chez
approximativement 50 % des 4 espèces de Pteropus australien (35). Des enquêtes sérologiques des anticorps
contre NiV ont mis en évidence des prévalences de près de 20 % chez les chauves-souris Pteropid de Malaisie
(10, 18). Des anticorps contre NiV ou contre d’éventuels virus étroitement apparentés ont été détectés chez des
chauves-souris Pteropid au Bangladesh (15), au Cambodge (24, 27), en Indonésie (29), à Madagascar (19) et en
Thaïlande (31). Le HeV a aussi été isolé de « flying foxes » australiens (12), et le NiV a été isolé à partir de
chauves-souris en Malaisie et au Cambodge (4, 27). L’ARN du NiV a été détecté par amplification en chaîne par
polymérase (PCR) dans de l’urine, de la salive et du sang de chauve-souris Pteropid en Thaïlande (30, 31).
Le HeV a émergé à Brisbane, en Australie, en septembre 1994 comme la cause d’un foyer de maladie
respiratoire aiguë qui a tué 13 chevaux et un entraîneur (22). Le virus était initialement nommé morbillivirus équin,
mais les analyses génétiques subséquentes ont indiqué qu’il ne ressemblait pas assez à un morbillivirus pour
permettre l’insertion dans ce genre. Il y a eu d’autres cas d’infection mortelle à HeV chez des chevaux au Nord du
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Queensland avec des infections humaines subséquentes. Deux chevaux ont développé une maladie aiguë et
sont morts environ 1 mois avant l’épidémie de Brisbane, mais le HeV a été incriminé seulement après l’infection
d’un propriétaire de chevaux, qui a probablement été infecté par le HeV durant l’autopsie. Il est décédé 13 mois
plus tard d’une encéphalite due au HeV (28). Un troisième cheval est mort en janvier 1999 sans maladie humaine
associée (11). Deux autres cas équins sont survenus en 2004 (l’un confirmé l’autre non) ; le cas non confirmé a
été associé à une infection humaine (13). En 2006, deux autres cas ont été signalés en Australie, un dans l’état
de Southern Queensland et l’autre dans le nord de l’état de New South Wales. Tous les foyers enregistrés depuis
1995 ont impliqué seulement un cheval au pâturage sans transmission aux animaux en contact.
Des études rétrospectives d’échantillons histologiques archivés indiquent que le NiV a causé une faible mortalité
chez les porcs de Malaisie depuis 1996, mais est resté inconnu jusqu’en 1999 lorsqu’il a été responsable d’une
épidémie d’encéphalite chez les humains qui avait commencé en 1998 (3, 23). Contrairement à la maladie
respiratoire causée par le HeV chez les chevaux qui est fréquemment fatale mais caractérisée par une faible
contagiosité (33), la maladie respiratoire causée par le NiV chez le porc était souvent subclinique mais fortement
contagieuse. Ces propriétés ont conduit à une dispersion rapide du virus à travers la population de porcs
malaisiens et ont obligé les autorités à choisir l’abattage comme le premier moyen pour contrôler la dispersion
(23). Environ un million de porcs ont été détruits ; 106 des 267 humains infectés sont morts d’encéphalite,
principalement des éleveurs de porcs en Malaisie et des employés d’abattoir à Singapour. Ces personnes avaient
des contacts directs avec les porcs vivants (3, 26).
Par la suite, de nouveaux foyers de maladie humaine due au NiV sont déclarés au Bangladesh et en Inde. Dans
les foyers de 2001 et 2003, aucun animal n’a été retrouvé comme source de l’infection humaine (15), mais des
chauves-souris Pteropid, Pteropus giganteus, étaient présentes et possédaient des anticorps capables de
neutraliser le virus Nipah. Des études séquentielles et de regroupement de cas ont montré qu’une transmission
d’homme à homme est possible mais à un faible niveau (15). Lors d’un autre foyer en 2004 au cours duquel 27
patients sont morts sur 36 infectés, des études épidémiologiques ont démontré la transmission de personne à
personne et des enquêtes sérologiques ont mis en évidence des anticorps chez les chauves-souris frugivores
présentes sur les lieux (1). La boisson de vin de palme contaminé par la salive, l’urine ou les excréments de
chauve souris frugivores a été reconnue comme une voie possible de transmission de l’infection de la faune
sauvage à l’homme (20). Au vu de ces foyers en Malaisie, à Singapore, au Bangladesh et en Inde, on estime le
nombre de cas humains du au NiV à au moins 400 cas humains, ayant occasionné la mort d’environ 200
personnes.
Au plan taxonomique, le NiV et le HeV sont considéré comme des paramyxovirus, dans la sous-famille des
Paramyxovirinae, et ont été regroupés en un nouveau genre, les henipavirus (9).
Le diagnostic d’une maladie causée par un henipavirus se fait par isolement viral, par détection de l’ARN viral
dans les échantillons cliniques, ou par détection d’antigène viral dans les échantillons de tissus prélevés à
l’autopsie (8). La détection d’anticorps spécifiques peut aussi être utile particulièrement chez les porcs où
l’infection par le NiV n’est pas remarquée. L’identification des anticorps contre le HeV chez les chevaux est moins
utile vu le taux élevé de cas mortels dans cette espèce. Il a été possible de diagnostiquer rétrospectivement par
sérologie les infections humaines dues au NiV ou au HeV. La présence d’anticorps spécifiques contre le HeV ou
le NiV, tant chez l’animal que chez l’homme, constitue un élément diagnostic significatif en raison de la rareté de
l’infection et de l’implication zoonotique grave de la transmission de l’infection.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification de l’agent pathogène
a)
Isolement du virus et caractérisation
Le HeV et le NiV sont classés comme des agents de niveau de biosécurité 4 (BSL4), du fait qu’ils sont de
dangereux agents pathogènes pour l’homme entraînant un taux de mortalité élevé et pour lesquels il
n’existe pas de vaccin ou de traitement antiviral efficace. Le niveau BSL4 est semblable au groupe de
confinement 4 décrit dans les directives de biosécurité déterminées par l’OIE dans le Chapitre 1.1.2.,
« Biosécurité et Biosûreté au laboratoire de microbiologie vétérinaire et dans les animaleries ». Des
informations complémentaires sont également mentionnées dans ce chapitre. Cependant, en raison du
risque important d’infection humaine dans le laboratoire, les conditions BSL4 surpassent les conditions de
confinement de niveau 4 de l’OIE. L’isolement du virus facilite fortement les procédures d’identification. Le
diagnostic définitif ne devrait être réalisé que lorsque la sécurité de l’opérateur peut être garantie.
L’isolement est spécialement pertinent dans tout nouveau cas ou nouvelle épidémie, particulièrement dans
les pays ou les régions géographiques où l’infection par le HeV ou le NiV n’a pas été documentée
auparavant. La preuve que les espèces sauvages agissent comme hôtes naturels du virus demande soit
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une réponse sérologique positive, soit l’identification positive par PCR, soit l’isolement à partir d’animaux
capturés (7).
i)
Échantillonnage et traitement des échantillons
Les échantillons pour le diagnostic doivent être envoyés vers un laboratoire agréé dans des containers
spéciaux. Selon l’association internationale de transport aérien (IATA), la réglementation pour les
marchandises dangereuses (DGR, Dangerous Goods Regulations) doit être respectée pour l’envoi
d’échantillons provenant d’une maladie zoonotique suspecte (17). Les conditions sont résumées dans
le Chapitre 1.1.1., « Prélèvement et expédition des échantillons pour le diagnostic ».
Les tissus produisant du virus dans les cas naturels et expérimentaux ont été résumés (6). Le cerveau,
le poumon, le rein et la rate doivent toujours être envoyés. Les échantillons doivent être transportés sur
de la glace ou à 4 °C s’ils peuvent arriver au laboratoire dans les 48 h suivant la collecte. Si le temps
de transport est supérieur, les échantillons seront envoyés congelés sur carboglace ou dans des
vapeurs d’azote liquide. Ils ne doivent pas être maintenus à –20 °C pendant une longue période.
ii)
Isolement en culture de cellules
La propagation du virus doit être conduite sous conditions de biosécurité de niveau 4. Le respect strict
de cette condition limite les possibilités d’analyse d’échantillons à diagnostiquer quand la présence de
HeV ou NiV peut être suspectée. Dès lors, l’isolement du virus à partir d’échantillons suspects peut
être conduit si nécessaire sous conditions de biosécurité de niveau 3. Cependant, si ceci est tenté, des
directives locales rigoureuses doivent être respectées pour assurer la sécurité de l’opérateur et
appliquées si un « paramyxovirus-like » à effet cytopathogène (ECP) se développe dans les cultures
infectées. De telles directives seront en accord avec les bonnes pratiques de laboratoire, et l’utilisation
soit d’enceinte de sécurité biologique de classe II avec des combinaisons appropriées pour le
personnel, soit d’enceinte de sécurité biologique de classe III. Il faut exiger une fixation à l’acétone des
cellules infectées, pour détruire le virus infectieux, et pour ensuite permettre la détection par
immunofluorescence des antigènes d’Henipavirus. Le milieu de culture provenant de cellules positives
au Henipavirus doit être transféré dans un laboratoire de biosécurité de niveau 4.
Au laboratoire receveur, les tissus sont manipulés en conditions stériles, et des suspensions à
10 % (w/v) sont générées en broyant les tissus dans un système d’homogénéisation fermé, par
exemple un stomacher/mélangeur utilisant un récipient en plastique ou un mélangeur broyeur utilisant
des billes d’acier autoclavables dans des cylindres métalliques fermés. Toutes les manipulations
doivent être réalisées dans des enceintes de sécurité biologique de classe III ou de classe II si le
personnel est protégé de façon appropriée, le stomacher et les pots de centrifugation étant remplis et
vidés dans l’enceinte. Ensuite, après clarification de l’homogénat par centrifugation à 300 g, le
surnageant est ajouté à une culture de cellules en monocouche. L’isolement du virus est facilité par le
fait que les HeV et NiV se multiplient rapidement à haut titre en culture de cellules. Les cellules rénales
de singe vert africain (Vero) et de lapin (RK-13) sont particulièrement sensibles. Le HeV se réplique
aussi sur cerveau de souriceau non sevré et sur œufs embryonnés. Bien que le premier soit une
méthode valable pour l’isolement primaire, il n’y a pas de données sur la sensibilité relative des
systèmes in vivo. La sensibilité de l’isolement en culture de cellules a, quant à elle, été testée. Un ECP
se développe habituellement en 3 jours, mais un deuxième passage après 5 jours est recommandé
avant de déclarer un échantillon négatif. En condition de faible multiplicité d’infection, l’ECP est
caractérisé par la formation de syncytiums qui peuvent, après 24 à 48 h, contenir 60 noyaux ou plus.
Les syncytiums formés par le NiV sur les monocouches de cellules Vero sont significativement plus
grands que ceux induits par le HeV pendant le même délai. La distribution des noyaux dans les
syncytiums induits par le NiV au début de l’infection ressemble à celle induite par le HeV, avec les
noyaux agglomérés au centre du syncytium. Ensuite, les noyaux dans les syncytiums mûrs induits par
le NiV sont distribués au pourtour de la cellule géante (16).
iii)
Méthodes d’identification
•
Coloration immunologique des cellules fixées
La vitesse avec laquelle le HeV et le NiV se réplique et la forte concentration d’antigène viral générée
dans les cellules infectées fait de l’immunofluorescence une méthode de choix pour identifier
rapidement la présence d’Henipavirus par l’utilisation des sérums anti-NiV ou anti-HeV. A l’heure
actuelle, le genre Henipavirus ne comprend que le HeV et le NiV et il n’y a pas d’autre virus
antigéniquement semblable connu.
La réaction sérologique croisée entre les HeV et NiV signifie qu’un antisérum polyclonal envers l’un et
l’autre virus ou un antisérum mono-spécifique contre des protéines individuelles de l’un et de l’autre
virus, ne peut pas faire la différence entre le HeV et le NiV. Des anticorps monoclonaux (AcM) ont été
générés et testés pour remplir cette fonction dans l’identification primaire du virus lors d’isolement. Ces
AcMs sont aussi utilisés pour des examens immunohistochimiques de tissus provenant de cas
suspects.
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•
Protocole
En condition de biosécurité L4, les monocouches de cellules Vero ou RK-13 qui ont été cultivées sur
des lames couvre-objet en verre ou sur une plaque sont infectées avec le virus isolé. Les
monocouches sont analysées pour détecter la présence de syncytium après incubation de 24 à 48 h à
37 °C. Il est recommandé qu’une série de dilution virale (non dilué, 1/10, 1/100) soit testée car les
syncytiums sont plus facilement observés après infection à faible multiplicité. Une fois que les
syncytiums sont détectés, les cellules infectées sont fixées par immersion dans un récipient d’acétone.
Le récipient est fermé hermétiquement et la surface externe est stérilisée avant de déplacer le
prélèvement vers un endroit du laboratoire moins sécurisé, par exemple de niveau L2, où les plaques
sont séchées à l’air. L’antigène viral est mis en évidence par un antisérum anti-HeV ou anti-NiV et
suivant les procédures normalisées d’immunofluorescence. Une caractéristique des syncytiums induits
par les Henipavirus est la présence de grandes structures polygonales contenant l’antigène viral. Cela
est plus facilement observé avec des anticorps monospécifiques et des AcMs dirigés contre la protéine
de la nucléocapside N et de la phosphoprotéine P.
•
Immuno-microscopie électronique
Le titre élevé généré par les HeV et NiV dans les cellules in vitro permet leur visualisation dans le
milieu de culture par microscopie électronique en contraste de phase négatif sans étape de
concentration par centrifugation. La détection de complexes virus-anticorps par immuno-microscopie
électronique fournit des informations précieuses sur la structure du virus et la réactivité antigénique,
même durant le premier isolement du virus. D’autres techniques ultrastructurales sont possibles. La
culture cellulaire sur grille peut être réalisée (13). Dans cette technique, les cellules sont cultivées,
infectées et visualisées sur des grilles au microscope électronique. Il est aussi possible d’identifier la
réplication des virus et des corps d’inclusion dans des coupes ultrafines de cultures cellulaire fixées. Le
détail de ces techniques et leur application dans la détection et l’analyse des HeV et NiV ont été
décrits (16).
b)
Test de séroneutralisation virale : différenciation entre HeV et NiV
Les tests de neutralisation reposent sur des méthodes de quantification. Trois procédures sont disponibles
pour titrer les HeV et NiV. Dans les méthodes de plages et de microtitrage traditionnelles, le titre est calculé
respectivement par la technique des unités formant plages (UFP) et par la dose infectieuse capable de
causer un ECP dans 50 % des puits inoculés (DICT50). Dans une procédure alternative, les virus sont titrés
sur des monocouches de cellules Vero dans des plaques de 96 puits. Après 18 à 24 h, les foyers d’infection
sont détectés immunologiquement sur les cellules fixées à l’acétone en utilisant un sérum anti-viral (5). Le
titre viral est exprimé comme une unité formant un foyer (UFF)/ml.
Les tests de séroneutralisation utilisant ces 3 méthodes sont décrits plus loin. Un isolat viral qui réagit avec
un antisérum anti-HeV et/ou anti-NiV dans un test d’immunofluorescence est considéré comme
sérologiquement identique à l’un et l’autre HeV ou NiV s’il présente la même sensibilité à la neutralisation
par un antisérum anti-HeV et anti-NiV. L’antisérum anti-HeV neutralise le HeV à une dilution généralement
4 fois plus grande que celle qui neutralise le NiV. Réciproquement, l’antisérum anti-NiV neutralise le NiV
approximativement 4 fois plus efficacement que le HeV (3). Les techniques de titrage du virus doivent être
réalisées dans des conditions de confinement de niveau 4 (BSL 4). Une nouvelle version du test de
séroneutralisation différentielle a été décrite récemment qui évite la manipulation de virus infectieux par
l’emploi de microbilles liées à l’éphrine-B2 (2). Bien que ce test doive encore être validé formellement, il
apparaît d’ores et déjà comme un outil de criblage utile dans les pays qui ne possèdent pas de structures de
confinement de niveau 4.
i)
Réduction du nombre de plages
Les stocks de HeV et NiV et les échantillons d’Henipavirus non identifiés sont dilués dans un milieu.
Les réplicats de chaque virus contenant approximativement 100 UFP dans 50 à 100 μl sont mélangés
avec un volume égal constitué soit d’un milieu minimum essentiel de Eagle (EMEM), soit d’une série
de dilutions d’antisérum anti-HeV ou anti-NiV dans du EMEM. Les mélanges virus-antisérum sont
incubés à 37 °C pendant 45 min. Après cette incubation, les mélanges virus-dilutions sériques sont
adsorbés sur des monocouches de cellules Vero à 37 °C pendant 45 min. Le nombre de plages est
déterminé par des méthodes traditionnelles de plages après incubation à 37 °C pendant 3 jours.
ii)
Neutralisation par microtitrage
Les HeV et NiV de stock et les échantillons d’Henipavirus non identifiés sont dilués de manière à
obtenir des réplicats de chaque virus contenant approximativement 100 UFP dans 50 à 100 μl. Ces
suspensions virales sont déposées dans des puits tests d’une plaque microtitre de 96 puits à fond plat.
Les suspensions virales sont mélangées avec un volume égal de EMEM ou une série de dilutions
d’antisérum anti-HeV ou anti-NiV dans du EMEM. Les mélanges sont incubés à 37 °C pendant 45 min.
Après cette incubation, on ajoute environ 2,4 × 104 cellules à chaque puits pour atteindre un volume
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Chapitre 2.9.6. — Maladies dues au virus Hendra et au virus Nipah
final d’environ 200 μl. Après 3 jours à 37 °C, le test est lu en utilisant un microscope inversé et les puits
sont évalués selon le degré d’ECP observé. Ceux qui contiennent uniquement des cellules ou des
cellules et de l’antisérum ne doivent pas montrer d’ECP. Au contraire, les puits contenant des cellules
et du virus doivent montrer des syncytiums et une destruction cellulaire. Un puits est considéré positif
lorsque toutes les cellules de la monocouche ou une proportion d’entre elles forment des larges
syncytiums typiques d’une infection à Henipavirus.
iii)
Coloration immunologique des plages
Des cellules Vero (2 × 104 dans 200 μl de milieu/puits) sont déposées dans des plaques à fond plat et
sont cultivées durant la nuit à 37 °C. Les virus HeV et NiV de stock et les échantillons d’Henipavirus
non identifiés sont dilués. Les réplicats contenant environ 60 FFU/50 μl sont mélangés avec un volume
égal soit de EMEM, soit d’une série de dilutions d’antisérum anti-HeV et anti NiV diluées dans du
EMEM. Les mélanges virus-antisérum sont incubés pendant 45 min à 37 °C. Après cette
incubation, ils sont adsorbés aux monocouches de cellules Vero pendant 45 min à 37 °C. Les
mélanges virus-antisérum sont enlevés, 200 μl de EMEM sont ajoutés à chaque puits et l’incubation se
poursuit à 37 °C. Après 18 à 24 h, le milieu de culture est aspiré et les plaques sont immergées dans
de l’acétone pure froide pendant 10 min. Elles sont ensuite placées dans des bacs en plastique, qui
sont remplis avec de l’acétone scellés à chaud et dont la surface est stérilisée avec 4 % (v/v) de lysol
avant le retrait hors du laboratoire de niveau L4. Le glutaraldéhyde peut aussi être utilisé pour la
stérilisation à une concentration de 0,1 % pendant 24 h. Il est recommandé que chaque laboratoire
détermine la concentration de glutaraldéhyde nécessaire pour la stérilisation dans un intervalle de
temps requis. Les plaques fixées à l’acétone sont séchées à l’air, les puits sont remplis avec une
solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,05 % de Tween 20 et 2 % de
poudre de lait écrémé. Ils sont incubés pendant 30 min à 37 °C avec soit un antisérum de HeV ou NiV
soit un sérum monospécifique d’une protéine virale. Les anticorps anti-viraux liés aux syncytiums
peuvent être détectés en utilisant un anticorps spécifique d’espèce conjugué à une phosphatase
alcaline et le substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate et un substrat p-nitro bleu tétrazolium
(NBT/BCIP ; Proméga, Numéro dans le catalogue S3771). Lorsque des plages violettes apparaissent
sur un arrière plan clair (10-30 min), le substrat est enlevé et les plaques sont rincées avec de l’eau
distillée et séchée à l’air. Les plages sont comptées en utilisant une loupe binoculaire.
c)
Méthodes de reconnaissance basée sur les acides nucléiques
Les génomes des deux virus HeV et NiV ont été entièrement séquencés (32), et des méthodes basées sur
des PCR ont été utilisées pour détecter les virus et ont été validées dans un certain nombre de laboratoires.
La PCR en temps réel apparaît être une approche sensible et utile pour la détection du génome
d’henipavirus dans les échantillons. En termes de sécurité, cette méthode présente l’avantage de ne pas
nécessiter la multiplication de virus infectieux vivant. Les protocoles et les amorces dépendent du plateau
technique et des produits chimiques disponibles dans les laboratoires (21, 30). Les réactifs spécifiques du
virus pour une telle épreuve basée sur la Taqman sont présentés ci-dessous (21) :
Pour la détection du virus Hendra :
Amorce n°1
(HENDRA-N1433F)
5’-ATC-TCA-GAT-CCA-GAT-TAG-CTG-CAA-3’
Amorce n°2
(HENDRA-N1572R)
5’-ATC-ATT-TTG-GGC-AGG-TTT-GG-3’
Sonde TaqMan
(HENDRA-N1510T-FAM)
5’-6FAM-AAC-CGC-CCT-CAG-GCA-GAC-TCA-GGA-TAMRA-3’
Pour la détection du virus Nipah :
Amorce n°1
(Nipah-N1198F)
5’-TCA-GCA-GGA-AGG-CAA-GAG-AGT-AA-3’
Amorce n°2
(Nipah-N1297R)
5’-CCCCTTCATCGATATCTTGATCA-3’
Sonde TaqMan
(Nipah-1247comp-FAM):
5’-6FAM-CCT-CCA-ATG-AGC-ACA-CCT-CCT-GCA-G-TAMRA-3’
Les laboratoires désireux de réaliser des méthodes moléculaires pour la détection doivent se référer aux
protocoles publiés ou contacter le Laboratoire de référence de l’OIE.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
1349
Chapitre 2.9.6. — Maladies dues au virus Hendra et au virus Nipah
d)
Détection d’antigènes d’Henipavirus dans des tissus fixés pour immunohistochimie
L’immunohistochimie s’est révélé être une des épreuves les plus utiles dans la détection des virus HeV et
NiV. Effectuée sur des tissus ou des cellules fixées au formol, cette méthode offre l’avantage d’être sûre du
point de vue de la biosécurité. Elle permet par ailleurs des investigations rétrospectives sur du matériel
archivé. Comme la réplication virale et la lésion primaire se produisent dans l’endothélium vasculaire (14), il
existe une large gamme de tissus dans lesquels les antigènes des HeV et NiV peuvent être détectés (8).
Étant donné que les antigènes du HeV peuvent être éliminés des tissus pulmonaires dans les phases
précoces de l’infection, les échantillons soumis doivent inclure une série de tissus, pas uniquement du
poumon. L’antigène du HeV a été détecté dans le rein d’un cheval 21 jours après infection (33). Cet organe
doit donc toujours être soumis au test. Idéalement une soumission pour l’immunohistochimie doit inclure des
échantillons de différentes parties du cerveau, du poumon, des nœuds lymphatiques médiastinaux, de la
rate et du rein. Chez les animaux gestants, l’utérus, le placenta et des tissus fœtaux doivent être inclus.
Plusieurs antisérums anti-HeV et NiV peuvent être utilisés dans les études immunohistochimiques des
tissus infectés par HeV et NiV, mais les sérums de lapin anti HeV et NiV purifiés par la méthode des plages
se sont révélés être particulièrement efficaces. Quelques AcMs sont aussi disponibles. Le Groupe de travail
sur le virus Nipah a décrit un système de détection (34). Un système de détection biotine-streptavidine lié à
une peroxydase a été utilisé avec succès dans le passé (14). Le système de détection préféré est un réactif
lié à un polymère dextran anti-lapin/anti-souris conjugué à une phosphatase alcaline.
•
Protocole
i)
Déparaffiner les lames contenant le matériel à éprouver fixé dans le formol et intégré dans de la
paraffine et des coupes de tissus témoins positif et négatif par immersions répétées 3 fois dans du
xylène pendant 1 min. Hydrater les sections par 2 bains successifs d’éthanol 98 à 100 %, un bain de
70 % d’éthanol et d’eau courante du robinet pour enlever l’alcool résiduel ;
ii)
Rincer les lames dans de l’eau distillée, immerger dans 0,01 M de CaCl2 (ajusté à pH 7,8 avec 0,1 M
d’hydroxyde de sodium) contenant 0,1 % (w/v) de trypsine (Difco Trypsin 250) pendant 20 min à 37 °C
et laver à l’eau distillée ;
iii)
Étendre les lames à plat dans une chambre humide et rincer avec du PBS pendant 5 min. Ajouter
200 μl d’H2O2 aqueuse 3 % à chaque lame pendant 20 min à température ambiante, pour bloquer
l’activité peroxydase endogène. Rincer les lames dans du PBS pendant 5 min ;
iv)
Ajouter 200 μl d’une dilution appropriée d’anticorps de lapin anti-HeV ou NiV dans du PBS contenant
0,1 % (w/v) de poudre de lait écrémé pour tester les lames de tissus et les lames témoin positif et
négatif. Ajouter à la série de tests et aux lames témoin positif et négatif des anticorps de lapin dirigés
contre un agent pathogène différent. Couvrir les lames et incuber à 37 °C pendant 1 h ;
v)
Rincer les lames dans du PBS pendant 5 min et appliquer 2 à 3 gouttes de solution d’Envision
(immunoglobuline anti-lapin conjuguée à un polymère dextran marqué d’une peroxydase [DAKO
corporation, 6392 Via Real Carpinteria, CA03013]). Incuber à 37 °C pendant 20 min ;
vi)
Préparer le substrat en dissolvant 2 mg de 3-amino-9-éthylcarbazole (AEC) dans 200 μl de diméthyl
formamide (Merck) et ajouter à 10 ml d’un tampon acétate 0,02 M, pH 5,0. Ajouter 5 μl d’H2O2 (30 %
w/v) et mélanger. Vérifier la lame témoin positive pour une coloration suffisante, habituellement durant
2 à 5 min, et stopper la réaction en rinçant à l’eau distillée. La solution de substrat doit être gardée au
frais avant utilisation ;
vii)
Colorer les lames dans de l’hématoxyline pendant 1 à 3 min, rincer à l’eau du robinet, ajouter de la
solution de Scott (0,04 M de bicarbonate de sodium et 0,3 M de sulfate de magnésium), et bien laver à
l’eau courante du robinet. Rincer les lames dans de l’eau distillée et couvrir avec une lame couvre
objet en utilisant un milieu de montage aqueux ;
TM
viii) Lire les lames pour rechercher des dépôts de chromogène (rouge) dans le cytoplasme, ce qui indique
la présence d’antigènes viraux. Une coloration granuleuse sera observée dans le cytoplasme des
cellules positives. Le noyau cellulaire est bleu ce qui facilite l’identification de la morphologie tissulaire
et aide à la localisation de l’antigène viral dans le tissu.
2.
Épreuves sérologiques
Dans les laboratoires réalisant des épreuves sérologiques surtout lors d’épidémies, plusieurs stratégies ont été
adoptées pour réduire le risque d’exposition du personnel de laboratoire avec le HeV et le NiV. Les sérums
peuvent être irradiés aux rayons gamma (6 kiloGreys) ou dilué au 1/5 dans du PBS contenant 0,5 % de Tween
20 et 0,5 % de Triton-X100 et inactivés par la chaleur à 56 °C pendant 30 min. Le protocole choisi le sera sur la
base d’une évaluation du risque. Les échantillons à des fins de surveillance et pour la certification dans le but de
mouvement d’animaux sont considérés comme présentant un risque pour la biosécurité plus faible que ceux
soumis pour recherche de la maladie. Dans certaines circonstances, l’inactivation par la chaleur peut être retenue
1350
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.9.6. — Maladies dues au virus Hendra et au virus Nipah
comme précaution suffisante. Cependant, il est préférable d’avoir une approche harmonisée et normalisée pour la
gestion de tous les échantillons plutôt que plusieurs méthodes différentes.
a)
Test de séroneutralisation du virus
Les Henipavirus peuvent être quantifiés par des tests de plage de lyse, de microtitrage ou de plages
colorées immunologiquement. Ces tests peuvent être modifiés pour détecter les anticorps spécifiques du
virus (voir ci-dessus). Le test de neutralisation virale (SN) est accepté comme étant le test de référence.
Pour le test de microtitrage, réalisé sous conditions de biosécurité L4, les sérums sont incubés avec du virus
dans des puits d’une plaque 96 puits. Les cellules Vero sont ajoutées après cette incubation. Les puits
incubés sont examinés en commençant par la dilution 1/2. Cependant, à cette dilution, une interférence liée
à la cytotoxicité du sérum peut être observée. Lorsque l’échantillon est de mauvaise qualité, ou lorsque de
faibles volumes sont disponibles (comme c’est le cas avec les sérums de chauves-souris « flying fox »), une
dilution initiale de 1/5 peut être utilisée. Les cultures sont lues après 3 jours d’incubation. Les sérums qui
inhibent complètement le développement de l’ECP sont considérés positifs. En cas de cytotoxicité liée au
sérum, le recours au test des plages de lyse révélées par coloration en immunofluorescence est l’alternative
de choix. En effet, le mélange virus/sérum est retiré de la monocouche cellulaire après la période
d’adsorption. De ce fait, leur cytotoxicité a un effet limité.
b)
Épreuves immuno-enzymatiques
Les antigènes d’Henipavirus produits sur cultures cellulaires utilisés dans les tests immuno-enzymatiques
(ELISA) sont irradiés au moyen de 6 Kgreys avant leur incorporation. Ce traitement affecte de manière
importante le titre en antigène. En 1994, pour répondre à l’épidémie initiale à Hendra virus, un ELISA
indirect a été développé. L’antigène était produit à partir de cellules infectées par le HeV. Ces cultures
infectées étaient soumises à plusieurs cycles de congélation-décongélation et traitées ensuite dans une
solution à 0,1 % (w/v) de sodium dodécyl sulfate (P. Selleck, données non publiées). En 1999, le
programme national de surveillance des porcs en Malaisie recourait à un ELISA similaire dans lequel
l’antigène était obtenu par un traitement à base de détergent non ionique des cellules infectées par le
NiV (6). Par la suite et afin de contrôler les niveaux élevés d’activité de liaisons non spécifiques dans les
sérums porcins, un ELISA modifié a été mis au point. Celui-ci était basé sur la réactivité relative des sérums
avec l’antigène du NiV par rapport à leur réactivité avec un antigène témoin obtenu par le traitement de
cellules Véro non infectées. Aux Centers for Diseases Control à Atlanta (USA), une double approche
sérologique a été mise en œuvre. Un ELISA indirect était utilisé pour la détection des IgG. Un ELISA de
capture permettait quant à lui la détection des IgM. Un ELISA utilisant un antigène recombinant de la
nucléocapside a été décrit pour le NiV (36), qui permet aussi de différencier entre les IgM et IgG.
La spécificité de l’ELISA indirect pour le NiV (98,4 %) (25) signifie que, dans les programmes de
surveillance, le test va générer des faux positifs. Ce n’est pas un problème significatif en face d’une
épidémie de NiV où une grande proportion des porcs est infectée et dont le but de la surveillance est de
détecter les fermes infectées. Cependant, ce niveau de spécificité est un problème réel en dehors du
contexte épidémique ou si le nombre d’échantillons à tester est limité. Si un résultat positif en ELISA était
indicatif d’une véritable infection, l’absence de mesures adéquates et le délai de réponse peuvent conduire
à une dispersion du virus et à des décès humains. Au contraire, les mesures de contrôle initiales excessives
en réponse à un faux positif résultant de l’ELISA constitueraient une fausse alerte et des dépenses
inutiles (8). L’approche courante consiste à tester tous les sérums positifs en ELISA par le test de SN, avec
des sérums témoin positif au test de SN. Un test de SN de confirmation doit être fait sous conditions de
biosécurité L4 et ceci peut nécessiter un envoi des échantillons dans un laboratoire reconnu.
La procédure suivante d’ELISA pour le NiV a été développée au laboratoire de santé animale d’Australie
(AAHL) pour les sérums porcins et normalisée après des études en collaboration avec l’institut de recherche
vétérinaire, Ipoh, Malaisie.
•
Protocole
Préparation des antigènes de NiV
i)
Produire des cellules Vero jusqu’à ce qu’elles confluent dans un flacon roulant avec du EMEM
contenant 10 % (v/v) de sérum fœtal de veau. Pour infecter le virus, verser tout le milieu sauf 5 ml de
chaque flacon et, dans un laboratoire L4, ajouter du NiV purifié à une multiplicité d’infection de
0,1 DICT50 par cellule.
ii)
Faire rouler les flacons roulants pendant 30 min à 33 °C pour adsorber le virus, ajouter 60 ml de
EMEM contenant 10 % de sérum fœtal de veau à chaque flacon et faire tourner pendant encore 48 h à
33 °C. La multiplicité de l’infection, le temps d’incubation et la température sont choisies de sorte que
peu de cellules se détachent dans le milieu de culture bien que la majorité des cellules soient infectées
et incorporées dans des syncytiums après 48 h. Le milieu de culture cellulaire infecté dans ces
conditions représente une excellente source de virus après purification.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
1351
Chapitre 2.9.6. — Maladies dues au virus Hendra et au virus Nipah
iii)
Laver les monocouches de cellules infectées une fois avec du PBS 0,01 M froid et, en utilisant un large
racleur, racler les cellules de chaque flacon roulant dans 5 à 10 ml de PBS refroidi sur glace.
iv)
Transférer les cellules raclées dans des tubes de 50 ml conservés dans de la glace et centrifuger les
cellules à 300 g pendant 5 min à 4 °C. Verser le PBS et resuspendre les cellules dans 0,5 ml de TNM
glacé (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, pH 7,2) par flacon.
v)
Ajouter du NP 40 (détergent non ionique, Nonidet P40) à 1 % (par addition d’un volume de 1/10 de
NP40 10 % [v/v] dans de l’eau) et lyser les cellules en utilisant 5 à 10 coups d’un homogénéiseur de
Dounce. Cette étape permet la libération des antigènes viraux du cytosquelette qui sinon seraient
retirés par centrifugation (étape vi).
vi)
Centrifuger les noyaux à 600 g pendant 10 min à 4 °C. Dans ces conditions, les noyaux ne sont pas
lysés et il doit former un granulé blanc dense.
vii)
Enlever doucement le surnageant cytoplasmique dans un tube propre et ajouter de l’éthylène diamine
tétra-acétique acide à 1,5 mM. Compléter jusqu’à 10 ml avec du TNE, aliquoter en petites quantités,
congeler à –80 °C et irradier aux rayons gamma avec 6 kiloGreys. Stocker les aliquots à –80 °C.
Préparation du témoin, des cellules Vero non infectées
viii) Produire des cellules Vero dans des flacons roulants avec du EMEM contenant 10 % de sérum fœtal
de veau. Quand elles confluent, laver les monocouches une fois avec du PBS froid et racler les
cellules de chaque flacons dans 5 à 10 ml de PBS glacé. Procéder comme décrit pour les cellules
infectées dans les étapes iv à vii.
Préparation des sérums à tester
ix)
Dans une enceinte de sécurité biologique de classe II (avec un équipement de protection approprié) ou
de classe III, diluer 5 fois le sérum à tester dans du PBS contenant 0,5 % (v/v) de Triton X-100 et
0,5 % (v/v) de Tween 20 dans les puits d’une plaque de microtitrage de 96 puits. Fermer
hermétiquement la plaque. Le personnel du laboratoire doit porter un tablier et des gants et s’asperger
les mains et la plaque fermée avec du Virkon 1 % avant d’enlever la plaque de microtitrage de
l’enceinte de sécurité biologique pour ensuite la chauffer à 56 °C pendant 30 min.
x)
Mélanger 22,5 μl de sérum inactivé à la chaleur avec un volume égal de cellules Vero non-infectées
avec l’antigène dilué à 1/100 dans du PBS. Mélanger complètement et incuber à 18-22° C pendant
30 min.
xi)
Ajouter 405 μl de solution bloquante (PBS contenant 5 % de sérum de poulet et 5 % de poudre de lait
écrémé) pour donner une dilution finale de sérum de 1/100 et incuber entre 18 et 22 °C pendant
30 min. Des aliquots de 100 μl sont ajoutés aux 2 puits contenant des antigènes de NiV et aux 2 puits
contenant des cellules Vero non infectées comme décrit en xiv.
Protocole pour l’ELISA
xii)
Diluer des cellules Vero témoin et les antigènes de NiV dans du PBS pour assurer que les puits
témoins et d’antigènes viraux soient sensiblisés avec une concentration similaire de protéine.
L’antigène est habituellement dilué à 1/1 000 jusqu’à 1/4 000, mais un facteur de dilution spécifique
doit être déterminé pour chaque groupe d’antigène. Ajouter 50 μl de virus et de cellules témoins aux
puits d’une plaque de microtitrage de 96 puits de Nunc Maxisorp comme suit : les antigènes viraux
dans les colonnes 1, 3, 5, 7, 9 et 11 et les cellules témoin dans les colonnes 2, 4, 6, 8, 10 et 12 (Fig.1).
Incuber à 37 °C pendant 1 h en secouant. Les plaques peuvent être ainsi incubées à 4° C durant la
nuit.
xiii) Laver les plaques d’ELISA 3 fois avec du PBS contenant 0,5 % de Tween 20 (PBST) (250 μl/ puits) et
bloquer la réaction avec du PBS contenant 5 % de sérum de poulet et 5 % de poudre de lait écrémé
(100 μl /puits) pendant 30 min à 37° C sur un agitateur.
xiv) Laver les plaques 3 fois avec du PBST et ajouter 100 μl de sérum inactivé, obtenu à l’étape xi, à
chaque puits comme indiqué dans le format ci-dessous. Ajouter 100 μl de PBS contenant 5 % de
sérum de poulet et 5 % de poudre de lait écrémé aux puits contenant le conjugué ou le substrat
témoin. Incuber les plaques sans secouer pendant 1 h à 37° C et laver 3 fois avec du PBST.
xv)
1352
Diluer le conjugué protéine A-peroxydase G de raifort (Protein-A/G-Conjugate produit par Pierce,
disponible chez Progen Biosciences, Produit No. 32490) dans du PBST contenant 1 % (w/v) de poudre
de lait. Le facteur de dilution est d’approximativement 1/50 000. Bien mélanger et ajouter 100 μl de
protéine A conjuguée à tous les puits excepté les puits contenant le substrat témoin. Incuber les
plaques pendant 1 h à 37° C sans secouer et laver 4 fois avec du PBST.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.9.6. — Maladies dues au virus Hendra et au virus Nipah
xvi) Préparer le substrat (3, 3’, 5, 5’-tétraméthylbenzidine ; TMB ; Sigma, catalogue numéro T3405) en
disolvant une tablette (1 mg) dans 10 ml de tampon citrate phosphaté 0,05 M, pH 5,0, et ajouter 2 μl
d’H2O2 30 % (v/v) fraîche. Ajouter 100 μl du substrat TMB à chaque puits. Incuber pendant 10 min
entre 18 et 22 °C et arrêter le test en ajoutant 100 μl d’acide sulfurique 1 M à chaque puits.
xvii) Lire les plaques après avoir vérifié le puits témoin. Les densités optiques (DO) à 450 nm sur les
antigènes de NiV et les antigènes de cellules Vero témoin sont utilisées pour calculer un rapport de
densité optique pour chaque sérum (DO sur les antigènes de NiV/ DO sur les antigènes de cellules
Vero témoin).
Interprétation des résultats
xviii) Un rapport de DO > à 2,0 avec une DO pour l’antigène de NiV > à 0,20 est considéré comme positif.
xix) Un rapport de DO > à 2,0 avec une DO pour l’antigène de NiV < à 0,20 est considéré comme négatif.
xx)
Les sérums donnant un rapport de DO entre 2,0 et 2,2 doivent être considéré comme douteux.
xxi) Les sérums douteux et positifs doivent être testés par la SN.
Fig. 1. Plaque d’ELISA type et fiche de résultat.
A
B
C
D
E
F
G
H
Ni
Ni
U
U
Ni
Ni
U
U
Ni
Ni
U
U
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
H+
H+
H+
H+
L+
L+
L+
L+
N–
N–
N–
N–
CC
TMB
CC
TMB
Sérum à
Sérum à
Sérum à
Sérum à
tester n°1
tester n°1
tester n°1
tester n°1
Sérum à
Sérum à
Sérum à
Sérum à
tester n°2
tester n°2
tester n°2
tester n°2
Sérum à
Sérum à
Sérum à
Sérum à
tester n°3
tester n°3
tester n°3
tester n°3
Sérum à
Sérum à
Sérum à
Sérum à
tester n°4
tester n°4
tester n°4
tester n°4
Sérum à
Sérum à
Sérum à
Sérum à
tester n°5
tester n°5
tester n°5
tester n°5
Sérum à
Sérum à
Sérum à
Sérum à
tester n°6
tester n°6
tester n°6
tester n°6
Sérum à
Sérum à
Sérum à
Sérum à
tester n°7
tester n°7
tester n°7
tester n°7
Sérum à
Sérum à
Sérum à
Sérum à
tester n°8
tester n°8
tester n°8
tester n°8
Plaque Nunc Maxisorp à 96 puits ; Ni : antigène du virus Nipah sur cellules ; U : cellules Vero non infectées (témoin) ;
H+ : sérum témoin fortement positif (c-à-d sérums du porc 6 LAF) ; N : sérum témoin négatif (c-à-d sérum de porc négatif) ;
L+ : sérum témoin faiblement négatif (c-à-d sérums du porc 6 LAF dilué à 1/800)
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS
ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Il n’y a pas de vaccin disponible pour l’HeV et le NiV.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
1353
Chapitre 2.9.6. — Maladies dues au virus Hendra et au virus Nipah
REMERCIEMENTS
Les épreuves décrites dans ce manuel ont été développées principalement au laboratoire australien de santé
animale (Australian Animal Health Laboratory) et plus spécifiquement par Peter Hooper, Gail Russell and Megan
Braun (immunohistochimie), Paul Selleck, Chris Morrissy, Brenda van der Heide, Greer Meehan and John White
(ELISA) and Gary Crameri (test de plages colorées immunologiquement).
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*
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NB : Il existe un Laboratoire de référence de l’OIE pour les Maladies dues au virus Hendra et au virus Nipah
(se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site internet de l’OIE pour une liste
actualisée : www.oie.int).
Manuel terrestre de l’OIE 2008
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