Karyotypanalysen durch Chromosomen

Karyotypanalysen durch
Chromosomen-Färbungen an HeLa-Zelllinien
Sonja Prohaska
9808503
A441
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Einleitung
HeLa-Zellen sind Zervixkarzinom-Zellen, die ihre begrenzte Teilbarkeit, wie
sie für differenzierte, tierische Zellen üblich ist, verloren haben. Den Namen
’HeLa’ haben sie nach den Initialien der Spenderin. Wegen ihrer Teilungsfreudigkeit und einfachen Kultivierung wurden sie von Labor zu Labor weitergegeben und sind heute weltweit für wissenschaftliche Zwecke in Verwendung.
Im Laufe der Zeit haben die Zelllinien eine Reihe von Mutationen angehäuft,
wesshalb sie sich durch einen stark veränderten Karyotyp auszeichnen.
Zur Beschreibung der ausgehändigten HeLa-Zelllinie sollen die Teilungsfreudigkeit (Mitoseindex), die Anzahl der Chromosomen und die Anzahl der NORtragenden Chromosomen bestimmt werden. Zur Erleichterung der Analyse
werden unterschiedliche, chromosomale Strukturen sichtbar gemacht, wofür
verschiedene Färbemethoden benutzt werden.
1.1 Verwendete Färbemethoden
1.1.1 GIEMSA
Die GIEMSA Färbung macht eine Bänderung der Chromosomen sichtbar, die
mit der Variablität und Aktivität der DNA-Abschnitte zusammenhängt.
1.1.2 Silberfärbung
Die Färbung mit Silber ist im Grunde ein Proteinfärbung. Es erfolgt eine
Reduktion von zweiwertigem Silber zu elemetarem Silber (schwarz) die quan-
Übungen zur Zellgenetik SS2002
23 April 2003
titativ mit der Anwesenheit der Transkriptionsmaschinerie in chromosomalen Abschnitten correliert, die vor der letzten Mitose stark aktiv waren. Der
genaue Prozess ist unklar. Es entstehen konstante Färbemuster. Dabei sind
NOR-Regionen (nucleolar organizing regions) am stärksten gefärbt. Darauf
folgen die Centromerregionen und zuletzt das ganze Chromosom. Das Silber
gefärbte Präparat muss mit GIEMSA gegegefärbt werden.
1.1.3 DAPI
DAPI steht für 4’-6-Diamino-2-phenylindol und ist ein DNA-Fluoreszenzfarbstoff. Er bindet über die kleine Furche an AT-reiche Regionen der DNA. Da
solche Regionen häufig und gleichverteilt auftreten, resultiert aus der DAPI-Färbung eine relativ unspezifische Visualisierung von DNA (in allen Lebenslagen). Der Fluorophor wird mit Licht der Wellenlänge 355nm-360nm angeregt
und hat sein Fluoreszenzmaximum bei 450nm.
1.1.4 DAPI/Distamycin A
Distamycin A ist ein Peptidantibiotikum, das an AT-reiche Regionen bindet,
deren Basen nicht alternierend sind. Es zeigt stärkere Affinität zu diesen Regionen als DAPI und verdrängt dieses somit in einer Kombinations-Färbung. Die
daraus resultierenden Bänder sind sind aus alternierenden AT-Paaren zusammengesetzt und entsprechen gewissen heterochromtischen C-Bändern.
1.1.5 Immunfluoreszenzfärbung
Wie andere Farbstoffe, können markierte Antikörper (oder Kombinationen)
zur Färbung spezieller, chromosomaler Strukturen herangezogen werden. Die
primären Antikörper sind dabei gegen DNA bindende Proteine gerichtet. Die
sekundären Antiköprer tragen einen Fluoreszenzfarbstoff, der im Fluoreszenzmikroskop unter definierten Bedingungen zum Fluoreszieren angeregt werden
kann.
1.1.6 FISH
FISH ist die Abkürzung für ’Fluoreszenz in situ Hybridisierung’. Dabei werden
fluoreszenz-markierte DNA-Sonden mit den Chromosomen hybridisiert. DNA
Regionen, die in der Sequenz mit der Sonde identisch sind leuchten dadurch
auf.
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Material und Methoden
HeLa-Zellen wurden mit Colchizin behandelt, das den Aufbau der Spindel
hemmt. Die Chromosomen kondensieren wie gewohnt, liegen aber frei in der
Zelle vor. Die Zellen werden so in der Metaphase arretiert. HeLa-Zellen wurden in hypotonischer Lösung suspendiert und aus 1m Höhe auf Objektträger
getropft. Das bringt sie zum Platzen und spreitet die Chromosomen. Die
Proben wurden getrocknet und gefärbt.
2.1 GIEMSA
Mit 3% GIEMSA in 1xPBS pH = 6.8 5min. färben, waschen und anschliessend
trocknen. An Hand dieser Präparate wurde der Mitoseindex errechnet.
2.2 AgNO3 /GIEMSA
In Boratpuffer 10min. vorinkubieren, dann trocknen. Das mit 100µl AgNO3 Lösung und einem Neylonnetzchen bedeckte Präparat wird in der feuchten
Kammer bei 60◦ C getrocknet. Die Präparate wurden zur Bestimmung der
Anzahl von Chromosomen insgsamt und der NOR-tragenden Chromosomen
verwendet.
2.3 DAPI
Präparat für 10min. 20µl DAPI aussetzen, dann abspülen. Nach Auftropfen
von 10µl Antifade-Puffer mit einem Deckglas bedecken.
2.4 DAPI/Distamycin A
Präparat mit 20µl Distamycin A 10min. inkubieren. Nach Waschen mit Puffer
10min. in 10µl DAPI inkubieren. Mit Wasser waschen, Antifade-Puffer auftropfen und ordnugsgemäß versiegeln.
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Ergebnisse
3.1 Mitoseindex
Der Mitoseindex gibt den Anteil der Zellen an, die sich zum Zeitpunkt der
Betrachtung in der Metaphase befinden (Table 1). Er wird verwendet um
die Vitalität von Zellpopulationen zu bestimmen. Da die verwendeten Zellen
mit Colchicin arretiert wurden (inhibiert den Aufbau der Spindel und somit
das Trennen der Chromosomen), könnte es zu einer Anreicherung von Zellen
mit kondensierten Chromosomen kommen, wenn der Eintritt in die M-Phase
unbeeinträchtigt bleibt. In diesem Fall wäre der Mitoseindex ein Maß für die
Qualität des Arrests.
Table 1
Mitoseindex Colchicin-arretierter HeLa-Zellen, Zählergebnisse des gesamten Kurses.
M-Phase
Interphase
Mitoseindex
45
192
19.0%
3.2 Chromosomenaberrationen in HeLa-Zellen
In einer diploiden, menschlichen Zelle befinden sich 46 Chromosomen. Wie
in Fig. 2a zu sehen ist, variiert die Anzahl von Chromosomen in einer HeLaZelle stark. Im Mittel beträgt die Anzahl 61 Chromosomen. Die stark unterschiedliche Zahl von Chromosmen ist am ehesten durch Polyploidisierung mit
darauffolgender Ungleichverteilung und Verlust von einzelnen Chromosomen
zu erklären.
Fig. 1. Silberfärbung einer Colchizin-arretierten HeLa-Zelle.
4
A
B
3
6
5
2
frequency
frequency
4
3
1
2
1
0
46
48
50
52
54
56
58
60 62 64 66
# chromosomes
68
70
72
74
76
78
0
80
6
7
8
9
# NORs
10
11
12
Fig. 2. Chromosomenaberrationen in HeLa-Zellen. (A) Verteilung der Chromosomenanzahl in 44 ausgezählten Zellen. (B) Verteilung der Anzahl an NORs in 8 dieser
Zellen.
Eine diploide Wildtyp-Zelle hat 10 NORs, lokalisiert an den kurzen Armen
der akrozentrischen Chromosomen 13, 14, 15, 21, und 22. In den ausgezählten
8 Zellen betrug die Anzahl an NORs im Mittel 8.75 (Fig. 2b) und liegt damit
unter der erwarteten Anzahl von NORs. Die niedrige Anzahl an NORs kann
durch zufällige Verluste der NOR-tragenden Chromosomen sowie durch Translokationen erklärt werden, bei denen die kurzen Arme verloren gehen. In
manchen Präparaten waren an einigen Chromosomen die Centromerregionen
stark gefärbt, was ebenfalls auf Translokationen hindeutet.
3.3 DAPI/DA Färbung
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Erklärungen sind in der Bildbeschriftung zu finden.
3.4 Immunfluoreszenzfärbung
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 bis Fig. 7 dargestellt. Erklärungen sind den
Bildbeschriftungen zu entnehmen.
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Fig. 3. (A) DAPI-Färbung vom Methaphasechromosomen. Die Färbung der Chromosomen ist deutlich und gleichmässig. (B) DAPI/Distamycin A-Färbung von kondensierten Chromosomen. Distamycin verdrängt DAPI auf der gesamten Länge der
Chromosomen ausser an den repetitiven, heterochromatischen Regionen rund um
die Kinetochore, die zu mehr als 50% aus alternierenden AT-Paaren bestehen.
Fig. 4. (A) DAPI-Färbung der Chromosomen zweier Zellen. Oben, Kern in der Interphase; Unten, Chromosomen in der Metaphase. (B) Färbung mit Antikörper A.
Nur die kondensierten Chromosomen in der Metaphase werden angefärbt. Es handelt sich um AK gegen Methaphase-spezifische Strukturen. In diesem Fall um AK
gegen phosphoryliertes Histon H3, das speziell in der Metaphase (und geringfügig an
stark transkriptionell aktiven Abschnitten auch in der Interphase (siehe Protokoll
Teil Miller) auftritt.
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Fig. 5. (A) DAPI-Färbung der Chromosomen zweier Zellen. Rechts, Kern in
der Interphase; Mitte, Chromosomen in der Metaphase. (B) Färbung mit Antikörper B. Sowohl die kondensierten Chromosomen in der Metaphase als auch
der Interphasekern werden gleichmässig angefärbt. Es handelt sich um AK gegen
Phasen-unspezifische Strukturen. In diesem Fall um AK gegen Histon H1, das immer
mit der DNA assoziiert ist.
Fig. 6. (A) DAPI-Färbung kondensierter Chromosomen. (B) Färbung mit Antikörper C. Das Bild zeigt diskrete Punkte, die immer paarweise auftreten. Durch
Vergleich mit der Chromosomenfärbung in A lässt sich erkennen, dass diese Punkte
mit den Centromerregionen zusammenfallen. Es handelt sich daher um AK des
CREST-Serums, welche mit CENP-A, einem Kinetochorprotein, reagieren und die
Kinetochore anfärben.
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Fig. 7. (A) DAPI-Färbung zweier Kerne. Mitte, Metaphasechromosomen in der
Aufsicht auf die Metaphaseplatte; Links unten, Interpasekern mit Aussparung der
Färbung, wo die Nukleoli liegen. (B) Färbung mit Anti-Tubulin-Antikörpern. Die
sternförmige Struktur in der Mitte entspricht einer mitotischen Spindel in der Aufsicht auf den Pol. Die verschiedenen Typen von Fasern können in diesem Bild
nicht unterschieden werden. Links unten sind weniger fasrige Tubulin-Strukturen
zu erkennen, die um den Interphasekern herum diffus verteilt sind.
Fig. 8. FISH-Färbung der Telomere. Bei genauer Betrachtung ist zu erkennen, dass
gepaarte Punkte auftreten, die im Gegensatz zur CREST-Färbung an den Ende der
Chromosomen liegen. Einem Chromosom können 4 Punke zugeordnet werden, die
den beiden Enden zweier Schwesterchromatiden entsprechen.
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