TP - Comptage d`organismes unicellulaires : Malassez

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Travaux pratiques / Mic robiologie
TP - Comptage d'organismes unicellulaires : Malassez
Etude de la croissance d'une population cellulaire et de son métabolisme en fonction des conditions de culture.
Comptage avec des cellules de Malassez (simple ou double)
- Passer la culture au vortex pour dissocier les amas cellulaires.
Fichiers joints
- Repérer à l'?il nu le quadrillage sur le centre de la lame.
imgsommairemala.jpg
- Recouvrir avec la lamelle ; astuce : humecter les plate-formes latérales pour faire adhérer la lamelle ; appuyer sur
imgsommairemala.jpg
cette lamelle en effectuant des mouvements de va et vient jusqu'à perception d'une résistance et apparition de franges
TP00161.pdf TP00161
irisées.
- Remplir le quadrillage par capillarité :
- Déposer la culture à l'aide d'une pipette pasteur (une goutte) ou une micropipette. Appliquer l'extrémité de la pipette
légèrement inclinée sur la plate-forme centrale près de la lamelle. Le liquide s'étend par capillarité et l'exacte quantité vient remplir le quadrillage. Le remplissage doit être
rapide et réalisé en une fois, sans débordement dans les rigoles et sans bulles d'air.
- Laisser les cellules sédimenter 1 à 2 mn avant observation
- Observer au microscope : Condenseur d'Abbe en position haute et diaphragme fermé
- Objectif × 10 ou 20 pour avoir une vue d'ensemble du quadrillage ; Vérifier la répartition homogène (si elle est hétérogène, recommencer la mise en cellule)
- Repérer un rectangle de Malassez (RM), compter les levures présentes dans ce RM (lui-même subdivisé en 20 petits carrés élémentaires) en déplaçant éventuellement la
platine.
Pour chaque rectangle, compter toutes les cellules présentes carré après carré
- Choisir une convention pour compter celles qui sont présentes sur les bords (ex. compter celles présentes sur le bord supérieur et sur le bord gauche) pour éviter de les
compter 2 fois.
- Compter les cellules dans 4 rectangles RM au minimum et faire la moyenne de ce résultat. Le volume du rectangle RM est de 1/100 e mm 3
Calcul :
Dans un rectangle : si Y est le nombre de cellules comptées (moyenne sur 4 numérations) Y × 100 = nombre de cellules/mm 3 (à multiplier par le coefficient de dilution).
Caractéristiques techniques :
Cellule de Malassez
Tracé sur cellule simple
Format de la lamelle correspondante (planée à 2
franges)
22 × 17 mm
Tracé sur cellule double
Format de la lamelle correspondante (planée à 2
franges)
Profondeur
Caractéristiques
22 × 22 mm
0,2 ± 0,002 mm
Cellule de base suivant Ecole
française. QM divisé en 100
rectangles égaux (RM)
subdivisés ou non.
Surface du quadrillage total (QM)
QM = 5 mm 2
Volume total correspondant
5 × 0,2 = 1 mm 3
Surface élémentaire (eM)
eM = 1/400 mm 2
Volume élémentaire correspondant
1/400 × 0,2 = 1/2000 mm 3
Autre surfaces utilisées : rectangle (RM)
RM = 1/20 mm 2
Volume correspondant
Illustrations :
1/20 × 0,2 =1/100 mm 3
Nettoyage/entretien des cellules de Malassez :
Particulièrement important lors d'utilisation de cellules animales ou de bactéries :
- Décontaminer immédiatement par trempage dans l'eau de javel diluée (10 %)
- Rincer à l'eau distillée ou osmosée
- Tremper dans une solution de détergent
- Rincer à l'eau distillée
- Passer à l'alcool (éthanol 70 °C)
- Pas de rinçage mais mettre à sécher à l'étuve (pas plus de 60 °C)
- Ne jamais frotter pour ne pas rayer le verre
- Stocker les cellules protégées dans un étui
- Ne pas les laisser à l'air libre (elles risquent de se rayer et la poussière peut s'incruster dans le quadrillage ce qui fausserait le volume de la cellule).
Lien utile : Comptage par acquisition d'une image vidéo
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