Fiche technique Numération cellulaire

SIS 051
Fiche technique
Numération cellulaire
sur l’hématimètre de Neubauer
De la bonne utilisation des cellules de
comptage dépend la qualité des résultats
des numérations cellulaires en hématologie
A la fin de la lecture de ce document vous devez être
capable de :
¾ choisir la bonne technique selon le type de cellules à compter
¾ rendre un résultat en tenant compte du facteur de
multiplication
¾ identifier et corriger les principales sources d’erreur
¾ entretenir l’hématimètre
ATTENTION : pour des raisons de sécurité, des pipettes en
verres ne devraient plus être utilisées dans le laboratoire.
Si malgré tout vous utilisez encore des pipettes Thoma, des étapes
complémentaires sont décrites en bleu et en italique.
1. Quel hématimètre choisir?
Il existe différents types d'hématimètres. Ils diffèrent par leur quadrillage, mais tous permettent de compter, dans
un volume précis et connu, les globules blancs, les globules rouges et les thrombocytes à l’objectif 40x ou 50x
(grossissement idéal : 400x). Dans ce document, on ne parlera que de l’hématimètre de NEUBAUER.
2. Materiel
- Le sang peut être dilué directement : Pipette réglable / Récipient pour dilution
- Hématimètre de Neubauer (ou modèle récent Neubauer improved) / lamelle en verre épais pour hématimètre
- Solution pour dilution : Türk ou Plaxan pour Leucocytes et Thrombocytes / réactif selon Dacie et Lewis pour
Erythrocytes (ne plus utiliser le réactif Hayem en raison de sa toxicité)
- Mélangeur pour les échantillons de sang (+ agitateur à pipettes pour pipette à dilution Thoma)
- Microscope avec oculaire 10x et objectif 40x ou 50x sans immersion.
3. Dilution de l'échantillon, préparation de la chambre de comptage
a) Mélanger le sang EDTA sur un mélangeur pendant 5-10 minutes au minimum et de préférence 10 minutes pour
le CQ.
b) Diluer le sang complet ou le sang capillaire bien mélangé de la manière suivante.
(Aspirer du sang jusqu'à environ 1 mm au-dessus de la marque 0,5 de la pipette de Thoma. Essuyer le bout de la pipette à l'aide d'un coton
humidifié. Ajuster le sang exactement jusqu'à la marque 0,5.)
Leucocytes
Thrombocytes
Erythrocytes
(utiliser la première goutte de
sang capillaire!)
Dilution 1:20
950 µL Türk ou Plaxan +
50 µL sang EDTA ou
capillaire
__________________ ______________________
Dilution 1:20
950 µL Türk ou Plaxan +
50 µL sang EDTA ou
capillaire
______________________
Dilution 1:200
1990 µL réactif selon
Dacie / Lewis + 10 µL sang
EDTA ou capillaire
_______________________
pipette de Thoma
avec boule blanche
Türk- ou Plaxan, aspirer exactement
la solution jusqu‘à la marque 11,
sans réajuster
avec boule rouge
réactif selon Dacie / Lewis, aspirer
exactement la solution jusqu‘à la
marque 101, sans réajuster
Récipient pour dilution
approprié
avec boule blanche
Türk- ou Plaxan, aspirer exactement
la solution jusqu‘à la marque 11,
sans réajuster
Prendre la pipette de Thoma entre deux doigts, en fermant les deux côtés et agiter vivement cinq à dix fois, puis la poser encore pendant 5
minutes sur l’agitateur à pipettes.
c) Coller la lamelle sur l’hématimètre, en humectant les deux bords de celui-ci avec un petit chiffon légèrement
humide. Puis faire glisser la lamelle sur la largeur de l’hématimètre et vérifier la bonne adhésion. Il doit
apparaître un anneau de Newton (couleur arc-en-ciel).
d) Vérifier la propreté de la cellule sous le microscope.
e) Laisser rentrer, par capillarité, une goutte de l'échantillon dilué entre l’hématimètre et la lamelle. La goutte ne
doit pas déborder dans les rigoles de l'hématimètre et elle doit recouvrir complètement et d'un seul coup toute la
surface quadrillée de l'hématimètre. (Rejeter les 2-3 premières gouttes de la pipette de Thoma, puis remplir l’hématimètre). Ne
jamais aspirer le surplus, éviter les bulles d’air.
f) Laisser reposer l'hématimètre à plat, en "chambre" humide (une boîte de Pétri avec un chiffon humide). pendant
10 minutes (20 minutes pour les thrombocytes) afin de laisser les éléments sédimenter. Ne jamais compter les
éléments dans une chambre de comptage desséchée.
g) Compter dans le quadrillage, selon une procédure bien établie, les éléments désirés (voir point 4).
h) Rendre le résultat en multipliant le nombre de cellules comptées par le facteur de multiplication adéquat (voir
point 5).
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4. Comptage des cellules
Les leucocytes (A) sont comptés dans les quatre grands carrés bleus composés de 16 petits carrés (= 64).
Les érythrocytes et les thrombocytes (B) sont comptés dans les 4 lignes rouges dans le quadrillage central
composé de 20 très petits carrés (= 80).
La hauteur entre la chambre et la lamelle est de 0,1mm.
Le volume est de :
3
- grand carré
1mm x 1mm x 0,1 mm = 0,1 mm = 0,1 µL
3
- très petit carré
0,05mm x 0,05mm x 0,1 mm = 0,00025 mm = 0,00025 µL
Quel que soit l'hématimètre et la surface à compter, on compte tous les éléments situés à l'intérieur des lignes
délimitant cette surface. Pour les éléments situés sur les lignes, on applique la règle de la limite des lignes :
compter les cellules touchant la ligne du haut et celle de droite. Ne pas compter les cellules touchant la ligne du
bas, ni celle de gauche.
compter
toutes les cellules internes au carré
+
Dans cet exemple, les cellules à compter sont :
13 + 8 = 21 cellules.
toutes les cellules touchant la ligne du haut et
la ligne de droite.
5. Exemple de calcul des cellules
Formule du calcul :
nombre de cellules x facteur de dilution x facteur de conversion
-----------------------------------------------------------------------------------nombre de carrés x volume d‘un carré
LEUCOCYTES - Comptage
THROMBOCYTES - Comptage
ERYTHROCYTES - Comptage
Leucocytes (Lc) comptés par carré :
28 ; 25 ; 27 ; 26 = 106 leucocytes
Thrombocytes (Tc) comptés par carré:
35 ; 45 ; 50 ; 50 = 180 thrombocytes
Erythrocytes (Ec) comptés par carré:
85 ; 95 ; 80 ; 100 = 360 érythrocytes
Nombre de leucocytes comptés: 106
Nombre de carrés comptés : 4 grands
Volume d‘un carré bleu : 0,1 µL
Facteur de dilution : 1/20
Facteur de conversion µL en L:
Nombre de thrombocytes comptés : 180
Nombre de carrés comptés : 80 très petits
Volume d‘un carré rouge : 0,00025 µL
Facteur de dilution : 1/20
Facteur de conversion µL en L:
Nombre de érythrocytes comptés : 380
Nombre de carrés comptés : 80 très petits
Volume d‘un carré rouge : 0,00025 µL
Facteur de dilution : 1/200
Facteur de conversion µL en L:
6
1L =1 x10 µL
6
1L =1 x10 µL
6
1L =1 x10 µL
106 Lc x 20 x 106
4 x 0,1 µL
180 Tc. x 20 x 10
80 x 0,00025 µL
£ 106 Lc x 50 x 106 / L
6
9
= 5 300 x 10 Lc / L = 5,3 x 10 Lc / L
ou 5,3 Lc G / L (Giga / L)
£ 180 Tc x 1000 x 106 / L
6
9
= 180 000 x 10 Tc / L = 180 x 10 Tc / L
ou 180 Tc G / L (Giga / L)
6
360 Ec x 200 x 106
80 x 0,00025 µL
£ 360 Ec x 10 000 x 106 / L
12
= 3 600 000 Ec / L = 3,60 Ec x 10 / L
ou 3,60 Ec T / L (Tera / L)
Lors du comptage des érythrocytes dans un hématimètre, le technicien doit être conscient que le coefficient de
variation peut être très élevé avec cette détermination.
6. Entretien d‘un hématimètre
a) Rincer la cellule et la lamelle à l’eau courante puis à l’alcool à 70 % (v/v).
b) Sécher la cellule et la lamelle avec un torchon sec, doux et non pelucheux (éviter de la rayer).
Entretien de la pipette de Thoma
a) Vider la pipette immédiatement après usage, pour éviter un dessèchement ou, entreposer la pipette dans un récipient contenant de l‘eau.
b) Rincer la pipette à l‘eau courante, puis à l‘eau distillée, et enfin à l‘alcool à 70 % (v/v).
c) Sécher à l’acétone ou dans un four à air chaud.
Précautions : la bille doit être libre avant de réutiliser la pipette, la pipette ne doit pas être ébréchée.
7. Principales sources d’erreurs
Cellule à numération non nettoyée et/ou non dégraissée / empreinte de doigt sur la lamelle / mauvaise
homogénéisation / erreur de pipetage, temps non respectés / comptage dans une chambre de comptage
desséchée / présence de bulles d’air dans la cellule / absorption du liquide en cas de débordement / mauvais
réglage du microscope / erreurs de dilutions / erreurs de calculs / erreurs d’unités / Pipette de Thoma sale / fausse
pipette.
Fiche revue Septembre 2010 Dagmar Kesseler, Ada Rieder, avec remerciements à Barbara Jost
 CSCQ 2010. AUCUNE COPIE DE CE DOCUMENT N'EST AUTORISEE SANS L’ACCORD DU CSCQ.
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