n°34

L
E
T
T
R
E
S
C
I
E
N
T
I
F
I
Q
U
E
iRTSV
Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant
Fonctions intégrées des protéines - Du vivant aux nanotechnologies
Direction des Sciences du Vivant
Résultats scientifiques
Biologie et µ-électronique
Manuel Théry
Page 1
Lettre n° 34 - Avril 2013
Soufre en Biologie
Mohamed Atta
Page 2
Angiogenèse
Jean-Jacques Feige
Page 3
Lysosome
Agnès Journet
Page 4
En bref
Flexi-meccano
Page 5
Des connexions biologiques pour la
micro-électronique
D’année en année, nos ordinateurs et téléphones portables deviennent plus performants grâce à la densification des
composants micro-électroniques qu’ils renferment. Cette densification résulte d’une miniaturisation de plus en
plus poussée. Elle est en train d’atteindre une limite technique liée à la taille de certains composants qui se rapproche de celle de quelques atomes. L’industrie de la microélectronique fait donc face à une barrière physique pour augmenter la densité d’intégration des composants que seule une rupture technologique pourrait permettre de surmonter.
Une solution pourrait venir de l’intégration de la
microélectronique en trois dimensions. En effet, les
circuits micro-électroniques actuels sont plans.
Empiler leurs composants les uns sur les autres est
une solution pour continuer de les densifier, et
améliorer ainsi leurs performances et réduire leur
consommation énergétique. Se pose alors un nouveau challenge : celui de connecter les composants
entre eux une fois
qu’ils sont empilés. Alors que leur
fabrication et leur
empilement reposent sur des technologies matures,
la réalisation de
connections verticales pour les
relier entre eux Visualisation en 3D d'un réseau
puis faire circuler de connexions réalisé à partir de
un courant reste micro-piliers d'actine (gris)
complexe. Si les ©CEA/R. Galland
techniques actuelles de la micro-électronique 3D permettent de
réaliser ces connections à haute densité, des technologies alternatives sont intéressantes à évaluer.
Des biologistes et des physiciens du CEA, du
CNRS, de l’UJF et de l’Inra à Grenoble ont eu l’idée
de mettre à profit les capacités extraordinaires
d’auto-assemblage de certains composés biologiques pour que ces connexions se construisent toutes seules. Dans nos cellules, de nombreuses structures complexes et régulières s’assemblent et se
désassemblent en permanence. C’est notamment le
cas des réseaux de filaments constitutifs du squePhysiologie Cellulaire & Végétale
lette des cellules (cytosquelette). Ces filaments sont
principalement constitués d’actine. Ils interagissent entre eux pour former des tresses, des faisceaux, des feuillets, des piliers dont l’architecture
et les propriétés mécaniques régulent et contrôlent
la forme des cellules. La formation de ces superstructures répond à des lois mécaniques et géométriques qui sont étudiées et maîtrisées par une
équipe du Laboratoire de Physiologie Cellulaire &
Végétale.
Ces
chercheurs
ont
mis au point une
technique
qui
permet de contrôler l’auto-assemblage
des
Visualisation en 3D d'un réseau filaments d’actine
d'actine (vert) assemblé à partir en 3D entre 2
d'une surface micro-patternée plaques de verre.
en forme de Logo CEA (rouge)
Grâce aux technologies du Laboratoire des Technologies de la Microélectronique
(CNRS/UJF) et du CEA-Leti, les plaques ont été
placées à 30 microns l’une de l’autre et microstructurées avec un faisceau laser. Les chercheurs
ont alors injecté entre les deux surfaces une solution contenant des monomères d’actine qui ont
polymérisés en réponse à la géométrie des microstructures. Des piliers d’actine de formes et de
tailles contrôlées se sont ainsi auto-assemblés à
partir des deux surfaces et rejoints pour établir des
connexions. De la même manière, les chercheurs
ont réussi à faire croître des piliers à partir d’une
surface, qui sont entrés dans des cylindres creux
formés à partir de l’autre, à la façon d’une prise
mâle/femelle. Puis, grâce au savoir-faire des chercheurs du CEA-Leti, ces connexions ont été métallisées avec des nanoparticules d’or, permettant le
passage d’un courant électrique entre les deux
surfaces.
Ces résultats montrent que ce procédé d’auto-assemblage des filaments d’actine peut avoir des
applications industrielles pour le moins inattendues. Ils illustrent la façon dont l’étude fondamentale de processus cellulaires élémentaires
peut être une source d’inspiration extrêmement
riche pour des processus d’ingénierie, y compris
dans des domaines très éloignés.
Contact : Manuel Théry
LPCV
Laboratoire Physiologie Cellulaire & Végétale
UMR 5168 - CEA - CNRS - UJF - Inra
Référence
Galland R, Leduc P, Guérin C, Peyrade D,
Blanchoin L and Théry M. Fabrication of
three-dimensional electrical connections by
means of directed actin self-organization. Nature
Materials, 2012, 109(36): 14440-14445
Actine : protéine qui constitue le squelette des cellules
vivantes et qui permet de réguler et contrôler leur forme.
1
L
E
T
T
R
E
S
C
I
E
N
T
I
F
I
Q
U
E
Le Soufre en Biologie
Le Soufre, du fait de sa réactivité intrinsèque, confère aux molécules dans lesquelles il est inséré des propriétés uniques. C'est un élément essentiel pour tous les êtres vivants ; il intervient dans la formule de deux acides aminés
naturels, la cystéine et la méthionine et, par conséquent, dans de nombreuses protéines. Cependant, la façon dont le
Soufre est inséré dans les biomolécules est une question encore mal comprise en chimie bio-inorganique.
a
b
Figure 1.
Réactions catalysées
par MiaB (a) et RimO (b).
Les mécanismes d’incorporation du Soufre dans
les biomolécules ne sont que partiellement compris
et deux grandes voies réactionnelles sont proposées. La première, bien établie, est la substitution
par le sulfure d’un précurseur oxygéné. La
deuxième voie, mal comprise, consiste en l’insertion radicalaire directe d’un atome de soufre dans
une liaison C-H. À ce jour, on ne connaît que 4
systèmes capables de réaliser ce type d’insertion. Il
s’agit de la biotine synthase, de la lipoate synthase
et de deux méthylthiotransférases, MiaB et RimO.
Ces quatre systèmes sont des protéines à centres
FeS capables de réaliser au mieux un seul turnover
in vitro. Pour cette raison, il a été proposé et admis
que ces systèmes étaient « sacrificiels », c'est-à-dire
que le soufre constitutif des centres FeS était celui
retrouvé dans le substrat. Ces quatre systèmes
appartiennent à la classe des enzymes « Radical
SAM » avec comme particularité de contenir deux
centres [4Fe-4S], chacun coordonné par 3 cystéines
et laissant donc une position de coordination disponible. Le premier centre FeS dit « centre RS » est
coordonné par les trois cystéines d’un motif
CysXXXCysXXCys caractéristique des enzymes
« Radical SAM ». Son quatrième site de coordination est occupé par la S-Adénosylméthionine
(SAM). Le deuxième cluster (cluster II) est également lié à trois cystéines et présente lui aussi un
quatrième site de coordination disponible.
Afin de comprendre les mécanismes d’insertion du
Soufre par voie radicalaire, des chercheurs de
l’équipe Biocatalyse du laboratoire de Chimie et
a
Biologie des Métaux, se sont intéressés aux méthylthiotransférases MiaB et RimO. Ces enzymes
modifient par méthylthiolation une adénine spécifique de certains ARNt ou un résidu aspartate
d’une protéine ribosomale (Figure 1). Dans les
deux cas, il s’agit d’une réaction chimiquement
difficile qui fait intervenir des intermédiaires radicalaires extrêmement réactifs que le système doit
contrôler. Pour cette étude, les chercheurs sont
partis de l’hypothèse que la fonction du cluster II
était de fixer et d’activer un ion sulfure pour générer un radical S• capable de se coupler au substrat
lui-même activé sous forme de radical. De fait, les
résultats montrent que MiaB et RimO fixent un ion
sulfure sur le cluster II (Figure 2, réaction a), puis
le méthylent grâce à une première molécule de
SAM (Figure 2, réaction b). Enfin, elles transfèrent
ce groupement méthylthio au substrat activé grâce
à une seconde molécule de SAM fixée au premier
cluster RS (Figure 2, réaction c). Dans ce scénario le
cluster II est capable de fixer et d’activer plusieurs
fois de suite un ion sulfure exogène pour, après
méthylation, être transféré au substrat permettant
d’obtenir un système catalytique et donc de réaliser plus d’un turnover in vitro. Le mécanisme proposé par ces chercheurs est conforté par la structure tridimensionnelle de RimO (Figure 3) qui
révèle que les deux centres sont à 8 Å de distance
ce qui suggère une forte synergie dans les transferts électroniques impliqués dans ces réactions.
Ces résultats constituent une avancée majeure
dans la compréhension des mécanismes d’insertion du soufre dans les macromolécules biologiques.
Contact : Mohamed Atta
LCBM
Laboratoire Chimie et Biologie des Métaux
UMR 5249 - CEA - CNRS - UJF
Référence
Forouhar F, Arragain S, Atta M, Gambarelli S,
Mouesca
JM,
Hussain
M,
Xiao
R,
Kieffer-Jaquinod S, Seetharaman J, Thomas B,
Acton T, Montelione GT, Mulliez E, John F,
Hunt JF and Fontecave M. Two Fe-S clusters
catalyze sulfur insertion by radical-SAM
methylthiotransferases. Nature Chemical Biology,
2013, 9(5): 333-338
b
Figure 2. Mécanisme proposé pour l’insertion radicalaire du soufre dans les macromolécules biologiques.
Cube bleu : centre RS ; cube blanc : cluster II.
c
Figure 3. Structure tridimensionnelle de l’enzyme RimO.
En bleu le domaine N-terminal UPF0004 avec le centre Fe-S II,
en jaune le domaine Radical-SAM avec le centre Fe-S RS et en Cterminal le domaine TRAM en magenta.
2
Chimie et Biologie des Métaux
L
E
T
T
R
E
S
C
I
E
N
T
I
F
I
Q
U
E
Vers des inhibiteurs chimiques de l’angiogenèse
L’angiogenèse, qui définit le processus de croissance de nouveaux vaisseaux sanguins, est une nouvelle cible thérapeutique qui a donné lieu au développement et à la mise sur le marché pharmaceutique à partir de 2005 de plusieurs médicaments. Ceux-ci sont utilisés en thérapie ciblée de plusieurs types de cancer et de rétinopathies vasculaires (DMLA, rétinopathie du diabétique). Cependant, malgré l’efficacité de ces nouveaux composés (Bevacizumab, Sorafenib, Sunitinib, Pazopanib, Vandetanib, …), des phénomènes de résistance apparaissent chez les
patients traités par ces médicaments, ce qui implique la nécessité de trouver des molécules de deuxième génération
ciblant le même processus mais par des mécanismes distincts.
C’est dans cet esprit que l’équipe Angiogenèse du
laboratoire Biologie du Cancer et de l’Infection a
déposé un brevet, puis son extension internationale, tous les deux portés par le CNRS, pour protéger des molécules chimiques à activité anti-angiogénique et anti-tumorale ayant des applications
potentielles pour le traitement des cancers, des
rétinopathies vasculaires ou du psoriasis. En collaboration avec la plateforme de Criblage pour des
Molécules BioActives de l’iRTSV (CMBA), un test
cellulaire d’angiogenèse a été miniaturisé puis
robotisé. Une chimiothèque de l’Université Joseph
Fourier de Grenoble composée de 1360 molécules
originales, non accessibles à l’industrie, a ensuite
été criblée. Une famille de molécules actives a été
ainsi identifiée et les chimistes des Départements
de Pharmacochimie Moléculaire et de Chimie
Moléculaire de l’UJF l’UJF (Drs Demeunynck et
Constant) ont synthétisé une trentaine d’analogues
qui ont permis de définir des relations structure-
activité. La molécule la plus active a été ensuite
testée par l’équipe Angiogenèse pour ses capacités
anti-angiogéniques et anti-tumorales sur des modèles in vivo de tumorigenèse chez la souris. La
molécule s’est avérée efficace et non-toxique. La
recherche du mécanisme d’action moléculaire de
ce composé est en cours.
A
L’identification de la cible moléculaire de ce
composé anti-angiogénique devrait permettre de
trouver ensuite un partenaire industriel pour le
développement futur de cette molécule d’intérêt
thérapeutique.
Contact : Jean-Jacques Feige
BCI
Laboratoire Biologie du Cancer et de l'Infection
UMR_S 1036 - CEA - Inserm - UJF
B
Référence
A. Bourgeonnement de sphéroïdes en présence d’un
inducteur d’angiogenèse, le FGF-2.
B. Inhibition du bourgeonnement des sphéroïdes induit
par le FGF-2, en présence de la molécule COB223.
Feige JJ, Castan A, Quelard D, Demeunynck
M, Constant JF and Barette C. Composés
anti-angiogéniques,
compositions
pharmaceutiques les comprenant, et leur
utilisation. Dépôt de brevet national INPI n°
11/00277 (31 janvier 2011) par le CNRS.
Extension internationale n° PCT/IB2012/050452
déposée le 31 janvier 2012 par le CNRS.
Analyse du protéome du lysosome
Les lysosomes sont des compartiments intracellulaires assimilables à une « déchetterie » cellulaire. Leur fonction
première est la dégradation de particules ou macromolécules d’origine extracellulaire, après internalisation par la
voie endocytaire, ou d’origine intracellulaire. La dégradation intralysosomale conduit à la production de molécules
simples qui sont ensuite exportées dans le cytoplasme de la cellule et recyclées dans les multiples voies de biosynthèse. Des défauts en enzymes de dégradation, en protéines de transport ou dans des acteurs de la biogenèse lysosomale sont responsables de maladies métaboliques héréditaires, caractérisées par l’accumulation intralysosomale
de substrats non dégradés ou de produits non évacués. Ces maladies, dont une cinquantaine environ est identifiée, sont souvent polyhandicapantes et nombre d’entre elles conduisent au décès prématuré des patients à des âges allant de la petite enfance à l’âge adulte.
Afin d’identifier de nouvelles protéines pouvant
être impliquées dans ces maladies, des chercheurs
de l’équipe Étude de la Dynamique des Protéomes
(EDyP) ont réalisé une analyse protéomique des
lysosomes. À la suite d’études portant sur les protéines lysosomales solubles [1, 2], ils publient l’analyse du répertoire des protéines présentes dans la
membrane qui entoure les lysosomes [3]. En effet,
du fait des difficultés techniques inhérentes à
l’analyse des protéines membranaires, ce souscompartiment reste mal connu malgré son rôle
essentiel dans les échanges avec le cytoplasme,
nécessaires au maintien de l'équilibre fonctionnel
intracellulaire et au recyclage des molécules issues
de la dégradation intralysosomale.
Dans cette nouvelle étude, plus de 2 000 protéines
ont pu être identifiées à partir de fractions enrichies en lysosomes de foie de rat. Une analyse
statistique fondée sur la comparaison des protéomes issus des fractions enrichies ou appauvries en
lysosomes a permis de sélectionner une centaine
de nouvelles protéines lysosomales potentielles.
Parmi ces dernières, une cinquantaine présentant
les caractéristiques de transporteurs transmembranaires sont particulièrement intéressantes du
fait qu’elles pourraient être directement associées à
l’étiologie de pathologies lysosomales. Ainsi, l’un
des candidats transporteurs lysosomaux, la protéine PQLC2, également identifiée par une approche génétique chez la levure, a fait l’objet d’une
étude fonctionnelle poussée [4]. Cette étude a permis d’expliquer l’efficacité du traitement médicamenteux fourni aux patients atteints d’une maladie lysosomale appelée cystinose.
Cette analyse protéomique qui propose une liste
de nouvelles protéines lysosomales potentielles,
ouvre la voie à des études ciblées pouvant déboucher sur des problématiques de santé. Par
ailleurs, ces approches d’analyse à haut débit
vont maintenant être mises en œuvre pour étudier la dynamique de la voie endocytaire complète (« vidéoprotéome »), dans le cadre d’une
collaboration entre l’équipe Dynamique des Organelles et Plasticité Cellulaire et l’équipe EDyP.
Biologie du Cancer et de l'Infection - Biologie à Grande Échelle
Contact : Agnès Journet
BGE
Laboratoire Biologie à Grande Échelle
UMR_S 1038 - CEA - Inserm - UJF
Références
Journet et al. Proteomic analysis of human
lysosomes: Application to monocytic and breast
cancer cells. Proteomics, 2002, 2(8): 1026-1040
[2] Journet et al. Towards a human repertoire of
monocytic lysosomal proteins. Electrophoresis,
2000, 21(16): 3411-3419
[3] Chapel A, Kieffer-Jaquinod S, Sagne C,
Verdon Q, Ivaldi C, Mellal M, Thirion J, Jadot
M, Bruley C, Garin J, Gasnier B and Journet A.
An extended proteome map of the lysosomal
membrane reveals novel potential transporters.
Molecular and Cellular Proteomics, 2013
[4] Jézégou et al. Heptahelical protein PQLC2 is
a lysosomal cationic amino acid exporter
underlying the action of cysteamine in
cystinosis therapy. Proceedings of the National
Academy of Sciences, 2012, 109(50): E3434-3443
[1]
La cystinose est une affection liée à un défaut de
transport de cystine (un acide aminé composé de
deux unités cystéine liées par un pont disulfure) hors
des lysosomes entraînant une accumulation lysosomiale de cet acide aminé dans différents organes.
3
En bref
Flexi-meccano
Près de 40% des protéines présentes dans
une cellule sont prédites comme étant partiellement ou complètement désordonnées.
Ces protéines sont impliquées dans des processus biochimiques aussi essentiels que la
reconnaissance moléculaire, la transduction
de signal ou dans des maladies neurodégénératives. Ce désordre semble souvent être essentiel à l’accomplissement de leur fonction
et la compréhension de ces protéines est devenu un enjeu scientifique.
Afin d’élucider le fonctionnement de ces protéines
désordonnées, le groupe Flexibilité et Dynamique des
Protéines par RMN (FDP) de l'Institut de Biologie
Structurale et le GIPSE de l’iRTSV ont développé
« Flexible-meccano ». Ce logiciel permet de prédire
la valeur de paramètres mesurables par Résonance
Magnétique Nucléaire sur ces protéines, puis de
les comparer aux données expérimentales mesurées sur la protéine étudiée.
L’algorithme de Flexible-meccano mis au point par
le groupe FDP, permet, sur la base de la séquence
en acides aminés, de générer des ensembles de
structures représentatives de l'état désordonné de
la protéine et de calculer les paramètres RMN
correspondants. Des interfaces graphiques, développées par le GIPSE, permettent aux utilisateurs
de comparer les valeurs calculées de ces paramètres RMN avec les valeurs expérimentales.
Flexible-meccano est disponible pour l'ensemble
de la communauté. Flexible-meccano est téléchargeable sur le site de l’IBS.
Référence
Ozenne V, Bauer F, Salmon L, Huang JR,
Jensen MR, Segard S, Bernado P, Charavay C
and Blackledge M. Flexible-meccano: A tool for
the generation of explicit ensemble descriptions
of intrinsically disordered proteins and their
associated
experimental
observables.
Bioinformatics, 2012, 28(11): 1463-1470
Les laboratoires de l’iRTSV
Directeur de la publication
Dr. Jérôme Garin
BCI
CBM
UMR_S 1036
CEA/Inserm/UJF
UMR 5249
CEA/CNRS/UJF
Biologie du Cancer
et de l'Infection
Chimie et Biologie
des Métaux
BGE
PCV
UMR_S 1038
CEA/Inserm/UJF
UMR 5168
CEA/CNRS/UJF/Inra
Biologie à Grande
Échelle
Physiologie Cellulaire & Végétale
GPC
Groupe Physiopathologie du Cytosquelette
iRTSV et UMR_S 836
UJF/Inserm/CEA/CHU
Éditeur et format électronique
Pascal Martinez — [email protected]
Comité de rédaction
Mohamed Atta, Jean-Jacques Feige, Agnès Journet,
Manuel Théry.
Institut de Recherches en Technologies et
Sciences pour le Vivant
http://www-dsv.cea.fr/irtsv
http://www-dsv.cea.fr/irtsv/lettres
CEA Grenoble
17 rue des Martyrs
38 054 Grenoble cedex 09
Responsable : Jérôme Garin
Tel. : 04 38 78 45 01
Fax : 04 38 78 51 55
© CEA [2013]. Tous droits réservés. Toute reproduction totale ou partielle sur quelque support que ce soit ou utilisation du contenu de ce document est interdite sans l’autorisation écrite préalable du CEA
4
Contacts : [email protected]