Diagnostic et recherche d`Erwinia amylovora Version 08 Date

Transcription

Agence fédérale
pour la Sécurité
de la Chaîne alimentaire
Administration des Laboratoires - LFSAGx
MET-LFSAGx-062
I-MET
Diagnostic et recherche d’Erwinia amylovora
Version
Date d’application
08
2014-01-14
Rédaction par :
Sandrine Léonard, Responsable section
Phytopathologie ; 2014-01-13
Révision par :
Alain Dubois, Responsable Qualité ; 2014-01-13
Autorisation de publication par :
Franck Defeijt, Manager LFSAGx ; 2014-01-13
Gestion et localisation de la
version valide :
M:\LFSAGx-QSE\A 3-Instructions\A30-Qualité
Destinataires :
Mots clefs :
Collaborateurs section Phytopathologie - LFSAGx
Erwinia amylovora, feu bactérien, symptomatique,
asymptomatique, prélèvement, PCR, sero-agglutination,
phytopathogénicité, milieu KB, milieu CCT, milieu Levan
LAB 21 I-MET-PHY-062-Eamylovora-v08 - 1/33
DIAGNOSTIC ET RECHERCHE D’ERWINIA AMYLOVORA
Aperçu des modifications*
Révision
par/date
15/04/09
1/06/10
SL-29/08/11
Motif de la révision
Partie du texte/portée de la
révision
Modification suite à l’audit BELAC de décembre
2008.
Modification fournisseur + ajout références des
annexes
Audits internes 13/10/10 et 24/06/11 + modifications
et clarifications reflétant mieux la pratique.
Suppression extraction ADN, précisions précautions
pour contaminations croisées, nouvelle préparation
mix PCR, choix des dilutions étalées, contrôles des
milieux, remplacement de macération par
enrichissement dans le schéma des latents, délai de
commencement de l’analyse augmenté, incubation
test phytopathogénicité, ajout de photos, révision des
tableaux de tampons et milieux, et diverses autres
petites précisions.
SL-15/01/13
Adaptations suite à la saison Erwinia 2012 et
correction faute de frappe d’une concentration.
SL13/01/2014
Modifications suite à la nouvelle version de norme
OEPP publiée en avril 2013, l’audit interne du
20/06/13 et les résultats du ring-test ILVO d’octobre
2012. Ainsi que quelques corrections mineures.
Point 9.7.1.1 : suppression de
la mesure de D.O. pour
l’extraction d’ADN. Point
9.7.1.2.2. Correction faute de
frappe sur la concentration en
MgCl2 et ajout congélation mix
PCR. Point 9.7.1.2.6. Mention
de l’électrophorèse facultative
pour la PCR. Electrophorèse :
adaptation des concentrations
de gel. Point 10.1 adaptation
du traitement des échantillons
latents si plusieurs espèces
végétales.
Simplification des flow-charts
(point 5 + impact sur l’entièreté
du document) + adaptation
enrichissement (points 9.2 et
10.2). Ajout d’un contrôle
négatif hebdomadaire (9.3).
Mises à jour mineures
également : précision version
de norme (point 3), adaptations
et ajout références réactifs et
tampons (point 8), précision sur
traitement exsudat (points 9.1
et 9.4), adaptation délai début
analyse (points 9.1 et 10.1),
précisions aspect colonies sur
KB (point 9.4.1), précision
référence bibliographique PCR
(point 10.7.1), précision
phytopathogénicité fruit
« mature » (point 10.7.2),
conservation échantillons
(points 9.1 et 10.1).
*
L’écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans.
Les modifications par rapport à la version précédente sont reprises en rouge.
Si à cause de l’ampleur des modifications, le texte n’est plus lisible en utilisant les marquages, les
adaptations ne sont pas marquées dans la nouvelle version.
Cela est mentionné dans l’historique du document.
TABLE DES MATIERES
1
Objectif .................................................................................................................................................... 5
2
Champ d’application .............................................................................................................................. 5
3
Documents légaux et normatifs............................................................................................................ 5
4
Définitions et abréviations .................................................................................................................... 6
5
Flow Charts ............................................................................................................................................. 8
5.1
5.2
PLANTES AVEC SYMPTÔMES .................................................................................................................... 8
PLANTES SANS SYMPTÔME ...................................................................................................................... 9
6
Sécurité et environnement .................................................................................................................. 10
7
Appareillage .......................................................................................................................................... 10
8
Réactifs, souches, tampons et milieux .............................................................................................. 11
8.1 RÉACTIFS .............................................................................................................................................11
8.2 SOUCHES .............................................................................................................................................13
8.3 TAMPONS .............................................................................................................................................14
8.4 MILIEUX................................................................................................................................................16
8.5 CONTRÔLE DES MILIEUX ........................................................................................................................18
8.5.1. Contrôle de la stérilité ....................................................................................................................18
8.5.2. Contrôle de la qualité .....................................................................................................................18
9
Echantillons symptomatiques ............................................................................................................ 18
9.1 PRÉLÈVEMENT ......................................................................................................................................18
9.2 DILUTION ..............................................................................................................................................19
9.3 ETALEMENT ..........................................................................................................................................20
9.3.1
Interprétation sur milieu King’s B (« KB ») .................................................................................20
9.4.2.
Interprétation sur milieu CCT .....................................................................................................20
9.4.3.
Test de fluorescence .................................................................................................................21
9.4 SÉRO-AGGLUTINATION ..........................................................................................................................22
9.5 ISOLEMENT SUR KB ET CCT (OPTIONNEL)..............................................................................................23
10 Echantillons asymptomatiques .......................................................................................................... 24
10.1
PRÉLÈVEMENT .................................................................................................................................24
10.2
MACÉRATION ENRICHISSEMENT ........................................................................................................24
10.3
DILUTION ET ÉTALEMENT...................................................................................................................24
10.4
INTERPRÉTATION SUR MILIEU CCT ....................................................................................................25
10.5
SÉRO-AGGLUTINATION ......................................................................................................................25
10.6
ISOLEMENT SUR KB ET CCT (OPTIONNEL) .........................................................................................25
10.7
PCR ET PHYTOPATHOGÉNICITÉ .........................................................................................................25
10.7.1 PCR ...........................................................................................................................................25
10.7.2 Test de phytopathogénicité........................................................................................................31
10.7.3 Conclusion suite aux deux tests ................................................................................................32
11 Cryoconservation des souches (optionnel) ...................................................................................... 32
11.1. PROCÉDURE .........................................................................................................................................32
11.2. NUMÉROTATION DES SOUCHES ..............................................................................................................33
11.3. GESTION DES SOUCHES .........................................................................................................................33
12 Calcul et rapportage............................................................................................................................. 33
13 Référence à des procédures afférentes, instructions, documents, formulaires ou listes ........... 33
1 Objectif
Cette instruction décrit la méthode utilisée pour la détection d’Erwinia amylovora dans des échantillons de
plantes avec symptômes (Erwinia diagnostique) et sans symptômes (Erwinia latente). Dans le premier cas,
il s’agit de montrer que les symptômes observés sont bien dus à Erwinia amylovora (forte présomption de
présence et donc forte probabilité d’un résultat positif). Les symptômes les plus caractéristiques sont un
brunissement (brun foncé à noir) des tiges, fleurs et feuilles, comme s’ils avaient été brûlés par le
feu. Des extrémités en crosses ainsi que des gouttes d’exsudats peuvent également être observées.
Dans le cas des échantillons non symptomatiques, il s’agit de montrer que l’échantillon est bien exempt
de la bactérie (faible présomption de présence et donc faible probabilité d’un résultat positif).
2 Champ d’application
Cette procédure est applicable aux échantillons végétaux (branches, rameaux, feuilles et fruits) des plantes
hôtes de la bactérie Erwinia amylovora.
3 Documents légaux et normatifs
Norme/Fil conducteur
EPPO 7/20 (2) : protocole de diagnostic pour
les organismes réglementés – Erwinia
amylovora
EPPO 3/40 : Erwinia amylovora : sampling
and test method
Protocol for the diagnosis of Erwinia
amylovora. Standard developed under EU
DIAGPRO project (SMT4-CT98-2252)
Erwinia amylovora – Diagnose van
bacterievuur en identificatie – Werkinstructie
– DOC W03B0*. ILVO PLANT-LNR
Clauses
Ensemble du texte.
Rapport de formation LNR du 25/06/08
Fiche technique PPV 303
4 Définitions et abréviations
Terme
KB
Test
de
agglutination
Origine de la définition
LFSAGx
séro-
Test de fluorescence
UV
TMA
CCT
Levan
PBS
Définition
Milieu B de King. Il s’agit d’un milieu de culture
bactérien peptoné historiquement utilisé pour
la croissance et la mise en évidence de la
du
genre
fluorescence
de
bactéries
Pseudomonas, mais qui convient également à
la culture d’autres microorganismes.
Test sérologique qui utilise un anticorps
spécifique afin d’identifier une colonie
bactérienne isolée.
Test consistant à exposer des boites de Petri
devant une source de rayons ultraviolets à 366
nanomètres. Erwinia amylovora ne fluoresce
pas lors d’une exposition aux rayons UV, sur
milieux KB et Levan, contrairement à d’autres
bactéries – telles que des Pseudomonas –
susceptibles de se développer conjointement à
E. amylovora dans les conditions des tests
réalisés selon la présente instruction. Il s’agit
d’un test rapide mettant en évidence le fait que
des colonies isolées ne sont pas E. amylovora.
Tampon de macération antioxydant.
Milieu de culture spécifiquement mis au point
pour la détection d’Erwinia amylovora
(Ishimaru and Klos, 1984, Phytopathology vol.
74 No. 11 1984). Ce milieu contient
notamment des sucres, du cristal violet, un
agent surfactant et des inhibiteurs (thallium et
antibiotique).
Milieu de culture riche en sucrose sur lequel
les souches bactériennes produisant du levan
- un polysaccharide métabolisé à partir du
sucrose - sont facilement reconnaissables à
l’aspect gluant des colonies.
« Phosphate Buffered Saline » c’est-à-dire
tampon phosphate salin, une solution
physiologique contenant du phosphate de
sodium et de potassium ainsi que des sels de
chlorure correspondants.
Abréviation
IF
Origine
LFSAGx
CFU
ml
g
mM
h
min
Ech
T°
S. I.
S. I.
S. I.
S. I.
LFSAGx
LFSAGx
LFSAGx
PCR
G
S. I.
Signification
Immunofluorescence
Colony Forming Unit, c’est-à-dire une cellule
bactérienne active ou capable de se multiplier.
millilitre
gramme
millimolaire
heure
minute
Echantillon
Température
« Polymerase Chain Reaction » c’est-à-dire
réaction en chaîne par polymérase, technique
de biologie moléculaire qui consiste à générer
un grand nombre de copies d’un fragment
d’ADN ciblé à l’aide d’une enzyme de
réplication de l’ADN ou ADN polymérase.
Constante gravitationnelle (G ≈ 6,674×10
11
2
2
N m / kg
5 Flow Charts
5.1
Plantes avec symptômes
5.2
Plantes sans symptôme
6 Sécurité et environnement
Les conditions de travail particulières sont reprises dans le manuel de biosécurité. Notons qu’une
attention doit être portée aux risques de contaminations croisées ; dans cette optique, la disposition des
appareillages dans les locaux est en corrélation avec les zones d’activités (réfrigérateur pour le
stockage des échantillons à proximité immédiate des tables d’analyse des échantillons, réfrigérateur
pour le stockage des réactifs pour l’analyse de l’ADN à proximité immédiate des boxes de préparation
de l’ADN, etc.). De plus, le petit matériel consommable permet de limiter les contaminations, tout
particulièrement le modèle de microtubes dotés de couvercles indépendants utilisés pour la PCR. Enfin,
le petit matériel permanent, principalement les portoirs à microtubes, est décontaminé
systématiquement après chaque série d’analyse par exposition sous UV. Soulignons qu’en cas de
contamination croisée, une analyse critique de la situation doit être faite et enregistrée sous forme de
rapport.
7 Appareillage
Matériel courant de laboratoire.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie.
Thermocycleur, appareil d’électrophorèse et visualiseur de gel.
Centrifugeuse.
.
8 Réactifs, souches, tampons et milieux
8.1
Réactifs
Nom
Kit express
Erwinia
amylovora
(Neogen).
Composant
1) Anticorps polyclonal
dirigé contre Erwinia
amylovora.
2) Contrôle positif.
3) Contrôle négatif.
Firme et réf.
Quantité
Préparation
Conservation
Utilisation
CHECK IT Agri &
Food Test,
1077-13 ou
1077-14.
50 tests ou
100 tests.
Sans objet.
A 4 +/- 3 °C, date de
péremption indiquée
sur les bouteilles.
Séro-agglutination
sur colonies
suspectes.
100 tests.
Reçu sous forme lyophilisée,
à resuspendre en eau milliQ.
Pour détails voir point
9.7.1.2.
A -20 +/- 3 °C, date
de péremption
indiquée sur les
tubes. Sous forme
lyophilisée, garanti
stable 2 ans.
Composant du mix
PCR pour PCR sur
colonies suspectes.
A -20 +/- 3 °C. Pas
de date de
péremption.
Composant du mix
PCR pour PCR sur
colonies suspectes.
1) Erwinia amylovora
PCR Premix.
2) Contrôle positif.
3) Contrôle négatif.
Loewe Biochemica
GmbH,
08005/100.
AJ75.
AJ76.
PEANT1.
PEANT2.
Amorces d’ADN
spécifiques de
Erwinia amylovora.
Invitrogen Life
Technologies
A faire synthétiser
sur mesure,
10336022/S0831A07
10336022/S0831A08
10336022/S0831A09
10336022/S0831A10.
±25 nmole.
Reçu sous forme lyophilisée,
à resuspendre en eau milliQ.
Pour détails voir point
9.7.1.2.
DMSO Cell
culture
grade
(AppliChem).
Dimethyl Sulfoxide.
VWR,
A3672.0050.
50 ml.
Sans objet.
A température
ambiante.
Composant du mix
PCR pour PCR sur
colonies suspectes.
HotStarTaq
DNA
Polymerase.
1) ADN polymérase
Taq.
2) Tampon 10x.
3) MgCl2 25mM.
4) Qsolution.
QIAGEN BENELUX,
203203.
250 unités (5
unités/µl).
Sans objet.
A -20 +/- 3 °C, date
de péremption
indiquée sur les
tubes.
Composant du mix
PCR pour PCR sur
colonies suspectes.
Erwinia
amylovora
nested PCR
set.
10mM dNTP
Mix PCR
Grade.
Mélange des 4
désoxyribonucléotides
dATP, dCTP, dGTP et
dTTP.
1) Enzyme de
restriction SmaI
coupant l’ADN au
niveau de toute
séquence
CCCGGG.
2) Tampon 10x
REACT 4.
Invitrogen Life
Technologies,
18427-013.
100 µl d’une
solution à 10
mM.
Sans objet.
A -20 +/- 3 °C, date
de péremption
indiquée sur les
tubes.
Composant du mix
PCR pour PCR sur
colonies suspectes.
Confirmation de
l’identité de
l’amplicon PCR par
restriction de celuici.
Invitrogen Life
Technologies,
15228-018.
1000 unités
(10 unités/µl).
Sans objet.
A -20 +/- 3 °C, date
de péremption
indiquée sur les
tubes.
GelRed
Nucleic Acid Colorant visible sous UV
Stain
se fixant sur l’ADN.
(Biotium).
VWR,
730-2958.
500 µl (
solution
10.000x
concentrée
en eau).
Diluer 10.000x dans le gel
d’agarose avant
polymérisation.
A température
ambiante et à l’abri
de la lumière.
Mise en évidence de
l’ADN soumis à
électrophorèse en
gel d’agarose.
Mélange de 16 groupes
de fragments d’ADN
correspondant chacun à
une taille de référence
TrackIt 50bp comprise entre 50 et 800
DNA Ladder. nucléotides, par
incréments de 50
nucléotides, dans un
tampon de migration
coloré.
Invitrogen Life
Technologies,
10488-043.
100 tests.
Sans objet. Déposer 5 µl
dans un puits du gel.
A température
ambiante ou à 4 +/3 °C.
Marqueur de poids
moléculaire pour
électrophorèse en
gel d’agarose.
SmaI.
8.2
Souches
Nom
LMG 2024
LMG 5076
Composant
Erwinia amylovora
isolée au RoyaumeUni par R. Lelliott sur
poirier commun et
intégrée en 1971
comme souche de
référence dans la
Collection Nationale
des Bactéries
Pathogènes de
Plantes (NCPPB)
sous le nom NCPPB
683.
Pseudomonas
syringae pv.
papulans isolée au
canada par B.
Dhavantari sur
pommier et intégrée
en 1983 dans la
Collection
Internationale des
Micro-organismes de
Plantes de NouvelleZélande (ICMP) sous
le nom ICMP 4048.
Firme et réf.
LMG/BCCM,
LMG2024.
LMG/BCCM,
LMG 5076.
Quantité
Préparation
Conservation
Utilisation
1 capsule.
La bactérie est reçue sous
forme d’extrait de culture
lyophilisée, à remettre en
suspension en PBS ou eau
peptonée tamponnée puis
étaler sur milieu de culture
Nutrient Agar ou Levan.
Incuber 24 à 48 h. Afin d’isoler
des colonies il peut être
nécessaire de procéder à des
repiquages consécutifs.
Sous forme
lyophilisée : à
température
ambiante. Sous
forme de
resuspension :
en glycérol 30%, à
-80 +/- 4 °C.
Souche de référence
pour les contrôles
positifs.
1 capsule.
La bactérie est reçue sous
forme d’extrait de culture
lyophilisée, à remettre en
suspension en PBS ou eau
peptonée tamponnée puis
étaler sur milieu de culture
Nutrient Agar ou Levan.
Incuber 24 à 48 h. Afin d’isoler
des colonies il peut être
nécessaire de procéder à des
repiquages consécutifs.
Sous forme
lyophilisée : à
température
ambiante. Sous
forme de
resuspension :
en glycérol 30%, à
-80 +/- 4 °C.
Test de la qualité des
milieux KB et Levan
préparés au
laboratoire (impact de
la concentration en
fer sur la
fluorescence).
8.3
Tampons
Nom
Composant
NaCl
PBS 10 mM
(phosphate buffer
saline pH 7.2).
KCl
Na2HPO4.12H2O
KH2PO4
Polyvynipyrrolidone
(PVP-10)
Mannitol
Tampon de
macération
antioxydant (TMA).
Acide ascorbique
Reduce glutathione
Firme + réf
VWR,
27810.295 (1
kg).
VWR,
26764.232
(250 g).
VWR,
28028.232
(250 g).
VWR,
26931.230
(250 g).
VWR,
295794F (500
g).
VWR,
25313.294 (1
kg).
VWR,
20150.184
(100 g).
SIGMA
ALDRICH,
G4251-100G
(100 g).
Quantité
Préparation
Conservation
Porter à 1 litre avec de
l’eau distillée et
autoclaver 15-20 min.
Conserver à
température
ambiante.
Peut être utilisé
pendant 6 mois
après
préparation.
Porter à 1 litre avec
PBS 10 mM, ajuster à
pH 7.2 et stériliser par
filtration.
Conserver à
température
ambiante. Peut
être conservé 6
mois après
fabrication.
Utilisation
8g
0,2 g
2,9 g
Tampon de base pour diverses
préparations et dilution.
Remarque : possibilité de
commande de PBS préparé : Tritium
PBS Dulbecco 100 ml P199.65.0100
(ou équivalent). Validité : voir
certificat.
0,2 g
20 g
10 g
1,76 g
Préparation de l’échantillon,
enrichissement.
Remarque : possibilité de
commande chez Tritium PB antioxy
P210.65.0100 (ou équivalent).
Validité : voir certificat.
3g
UltraPure DNA
Typing Grade 50x
TAE Buffer.
Tampon bleu de
chargement 10x.
10x Blue juice Gel
loading buffer
Tampon de
cryoconservation.
Mélange de Tris,
Na2EDTA et acide
acétique glacial.
Invitrogen
Life
Technologies,
24710-030.
Bleu de
VWR,
bromophenol 1,25 %
720-1041 (25
(0,25 g dans 20 ml
g).
de TAE 1X).
EDTA 0,5 M pH 8
SIGMA
(4,39 g dans 30 ml
ALDRICH,
d’eau distillée, mettre E9884-500
à pH avec NaOH).
(500 g).
Voir ciTAE 1x
dessus.
VWR,
Glycérol pour la
444482V
biologie moléculaire.
(100 ml).
Sucrose 65%, TrisLife
HCl 10mM, EDTA
Technologies
10mM, bleu
10816-015
bromophénol 0,3%.
Voir ciPBS 10 mM
dessus.
VWR,
Glycérol (87 %)
24385.295 (1
l).
1 litre
Diluer 50x en eau
distillée lors de
l’utilisation.
T° ambiante.
Electrophorèse : préparation de gel
d’agarose et migration.
Diluer 10x lors de
l’utilisation.
T° ambiante.
A ajouter à tout échantillon avant
chargement sur gel d’agarose.
Ajouter 1/10 de volume
à chaque échantillon à
déposer sur gel
4 +/- 3 °C.
Electrophorèse: tampon de
chargement des échantillons
Bien agiter, autoclaver
15 min à 121 °C.
6 mois à T°
ambiante.
500 µl / échantillon.
Quantité pour 100 échantillons.
T° ambiante.
Gel pour électrophorèse des
produits de PCR ou de restriction.
T° ambiante.
Diverses préparations et dilutions.
2 ml
500 µl
2,5 ml
5 ml (=
6,305 g)
3 x 1 ml
30 ml
20 ml
Agarose pour
l’électrophorèse
analytique des acides
nucléiques (MERCK).
Agarose en poudre.
VWR,
1.01236.0500
500 g
Préparation à 1,5% ou
2% par dissolution de
la poudre dans du
tampon TAE 1x par
chauffage au four à
micro-ondes puis
moulage sur support à
gel.
Eau milliQ.
Eau stérile ultrapure.
Tritium,
S700.65.0100
100 ml
Sans objet.
8.4
Milieux
Nom
Composant
Saccharose.
Sorbitol.
Niaproof.
Milieu CCT.
Crystal violet (0.1 %
dans éthanol).
Nutrient agar.
Thallium nitrate (1%
w/v dans eau).
Cycloheximide
(toxique).
Firme et réf.
VWR, 27480.294 (1
kg)
VWR,
28210.298 (1 kg).
SIGMA ALDRICH,
N1404.
SIGMA ALDRICH,
229288-25G (25 g).
Oxoid,
CM0003
(1 kg).
SIGMA ALDRICH,
204609-10G (10 g).
SIGMA ALDRICH,
(Fluka)
Solution 0,1 %.
Quantité
Préparation
Conservation
Utilisation
100 g
10 g
1,2 ml (d’une
solution 25 %
en eau
distillée).
1. Ajuster à 1 l avec de l’eau
distillée, ajuster à pH 7,0–7,2.
Stériliser par autoclavage 1520 min.
2 ml
23 g
2 ml
7 ml
2. Stériliser par filtration (0,45
µm) et ajouter à la solution
précédente stérilisée lorsque la
T° est ± 45 °C.
Minimum 1 mois en
Etalement et culture
boites de pPetri à 4
à partir de macérat.
+/- 3 °C ou dans la
Remarque :
bouteille utilisée pour
possibilité de
l’autoclavage. Dans
commande de milieu
ce dernier cas, le
CCT en boîtes de
milieu est reliquéfié
Petri prêtes à l’emploi
dans un bain-marie à
chez Tritium :
100°C pendant 45
C005.02. Validité :
min.
voir certificat.
Proteose peptone
n°3.
Glycérol.
K2HPO4.
Milieu
King’s B
(KB).
MgSO4.7H2O.
Agar.
Cycloheximide
(toxique).
Yeast extract.
Bacto Peptone.
Milieu
Levan.
NaCl.
Saccharose.
Agar.
Fisher Bioblock,
211693
(500g).
VWR,
24385.295
(1 l).
VWR,
26931.230
(250g).
VWR,
25165.260
(500g).
Oxoid,
Agar Bacteriological
n°1
LP0011
(1 kg).
SIGMA ALDRICH,
(Fluka)
Solution 0,1%.
BIO-RAD,
64343
(500 g).
BD Difco,
211693
(500 g).
VWR,
27810.295
(1 kg).
VWR,
27480.294
(1 kg).
Oxoid,
LP0011
(1 kg).
20 g
10 ml
1,5 g
1,5 g
Porter à 1 l avec de l’eau
distillée, ajuster à pH 7,0-7,2
Stériliser par autoclavage 1520 min.
15 g
7 ml
2g
5g
5g
50 g
20 g
Etalement et culture
Minimum 1 mois en
à partir de macérat.
boites de Petri à 4 +/Vérification de la
3 °C ou dans la
fluorescence.
Remarque :
possibilité de
ce dernier cas, le
commande de milieu
milieu est reliquéfié KB+cycloheximide en
dans un bain-marie à boîtes de Petri prêtes
100°C pendant 45
à l’emploi chez
min.
Tritium : K201.02.
Validité : voir
certificat.
Ajouter à la solution
précédente stérilisée lorsque la
T° est à 45 °+/-5°C.
Repiquage de
colonies pour
Minimum 1 mois en
isolement.
boites de Petri à 4 +/Vérification de la
3 °C ou dans la
fluorescence.
Porter à 1 l avec de l’eau
Remarque :
distillée, ajuster à pH 7,0-7,2
possibilité de
Stériliser par autoclavage à 15ce dernier cas, le
commande de milieu
20 min.
milieu est reliquéfié
Levan en boîtes de
dans un bain-marie à
Petri prêtes à l’emploi
100°C pendant 45
chez Tritium :
min.
L550.02. Validité :
voir certificat.
8.5
Contrôle des milieux
Les boîtes de milieu CCT, et KB et Levan achetées auprès de la firme Tritium sont
préalablement contrôlées par la firme et fournies avec un certificat de qualité, lequel est
classé au secrétariat du LFSAGx en annexe de la facture. Des contrôles sont réalisés à 3
niveaux :
• Propriétés physiques : le pH.
• Contrôle de stérilité : 48 h à 30°C.
• Propriétés de croissance : la croissance des bactéries Pseudomonas aeruginosa et
Aspergillus niger est testée sur KB et CCT. Seule, P. aeruginosa doit se développer
sur KB, et aucune des deux bactéries ne doit se développer sur CCT. Pour P.
aeruginosa, l’aspect et la fluorescence des colonies sur KB est en plus observée ; la
fluorescence doit être positive.
Il est à noter que la croissance d’Erwinia amylovora n’est pas testée par la firme mais doit
être positive sur les 3 2 milieux. Cela est contrôlé à l’aide de la souche de référence
(LMG2024) pour chaque nouveau lot, via incubation 48-72 h à 25 +/- 3 °C. Ce contrôle
n’est pas obligatoire si la majorité (>50%) des échantillons de routine sont positifs
(attention toutefois : si au moment d’un changement de lot, tous les échantillons de
routine deviennent subitement négatifs, faire un contrôle avec la souche de référence
avant de rendre les résultats !).
Dans le cas où les milieux sont préparés au laboratoire, les contrôles suivants doivent
être réalisés :
8.5.1. Contrôle de la stérilité
Après coulage des boites, 1 boite au hasard est mise à incuber 72 h +/- 6 h à 25 +/- 3 °C. Si
aucune colonie ne s’est développée, le lot est accepté.
Les heures d’incubation et le résultat de la lecture sont repris sur la fiche de préparation des
milieux ou sur la fiche de contrôle des milieux.
8.5.2. Contrôle de la qualité
Une boite de chaque nouveau lot est ensemencée avec une souche de Erwinia amylovora
(souche de référence LMG2024). Une souche de Pseudomonas syringae pv. Papulans (LMG
5076) est également ensemencée afin de s’assurer que la concentration en fer n’est pas
anormalement élevée dans le milieu (sinon inhibition de la fluorescence).
La boite est mise à incuber 48-72 h à 25 +/- 3 °C.
Des bactéries doivent s’y développer et un test rapide (séro-agglutination pour E.
amylovora/fluorescence via une lampe UV positive pour P. syringae) doit être positif pour que
le lot soit accepté.
9 Echantillons symptomatiques
9.1
Prélèvement
Remarque préliminaire : si l’analyse ne peut être réalisée lors de la réception des
échantillons, ceux-ci sont placés à 4°C pour une durée maximale de 5 8 jours ouvrables.
Sélectionner des parties de la plante qui montrent les symptômes les plus frais. Si possible
avec de l’exsudat. Sur chaque organe à analyser, sélectionner le bord des lésions, c’est-àdire la limite entre le tissu nécrosé et le tissu sain.
Prélever en priorité l’exsudat et la tige. L’exsudat est analysé séparément de la tige. S’il
n’y a pas de trace d’exsudat ou que la tige ne montre pas de symptômes, les autres
organes peuvent être prélevés.
Prélever quelques morceaux (2 à 5 morceaux de 5 à 15 mm) de tissus et/ou une gouttelette
d’exsudat frais. La liste ci-dessous reprend les organes à prélever, par ordre de priorité.
1) Exsudat: traiter à part dans 3-4 ml de TMA s’il est frais, prélever une gouttelette et, s’il n’y
a pas de gouttelette bien délimitée, tremper la pointe du scalpel ou une anse dans le
suintement ; s’il est séché prélever au moins un morceau de 1 à 10 mm avec le scalpel.
2) Tiges : prélever un morceau de tige symptomatique (incluant les feuilles) à la frontière
entre les tissus nécrosés et sains.
3) Fleurs : en prendre une ou plusieurs avec le pédoncule.
4) Feuilles : prélever une ou plusieurs feuilles avec le pétiole. Prendre des feuilles
comportant des veines nécrosées, mais pas de feuilles totalement nécrosées.
5) Fruits : prélever un ou plusieurs fruits.
6) Branches : enlever l’écorce avec un scalpel stérile et prélever un morceau de tissu
montrant une décoloration subcorticale symptomatique.
•
A l’aide du scalpel, couper en petits morceaux le matériel prélevé et le placer dans une
(petite) boite de Petri contenant environ 3-4 ml de tampon de macération antioxydant.
Pour l’exsudat, agiter dans le tampon la pointe du scalpel ou l’anse ayant servi à prélever
l’exsudat sur l’échantillon.
• Laisser macérer entre 30 min et 2 h à t° ambiante. Pour l’exsudat frais, le temps de
macération peut être réduit à 5 min.
• Prélever 1 ml de l’extrait dans 1 tube Eppendorf stérile et le stocker à 4°C pour une
éventuelle analyse ultérieure.
• Utiliser l’extrait restant pour analyse.
Après prélèvement, le reste de l’échantillon est replacé dans son sac d’origine puis dans un
second sac neuf, le tout est scellé et gardé à 4 +/- 3 °C pendant au moins 1 mois à compter
de la fin de l’analyse.
9.2 Enrichissement
L’enrichissement est uniquement nécessaire pour les échantillons dont la population
bactérienne attendue est très faible (pas de tissus sains, symptômes âgés, mauvaise
conservation de l’échantillon).
•
•
•
•
9.2
Placer dans l’étuve à 25 ± 3 °C.
Laisser incuber pendant 72 h +/- 6 h.
Prélever 1 ml de l’extrait dans 1 tube Eppendorf stérile et le stocker à 4° °C pour une
éventuelle analyse ultérieure.
Utiliser l’extrait restant pour analyse.
Dilution
Préparer deux dilutions décimales de l’extrait comme suit : prélever 50 µl de macérat (enrichi
-1
ou non) et l’ajouter à 450 µl de PBS (voir liste des réactifs), pour obtenir la dilution 10 .
-1
Prélever ensuite 50 µl de la dilution 10 et l’ajouter à 450 µl de PBS, pour obtenir la dilution
-2
10 .
Différentes dilutions de lLa souche de référence LMG2024, est suspendue en PBS, sont et
étalées comme contrôle positif, une fois par semaine (avec la première série d’échantillons de
la semaine). Ce contrôle n’est pas obligatoire si la majorité (>50%) des échantillons de
routine sont positifs. Un contrôle négatif, à savoir du tampon de macération antioxydant pur,
est également étalé une fois par semaine.
9.3
•
•
•
•
Etalement
0
-2
Prélever à l’aide d’une pipette 50 µl d’extrait non dilué ( = 10 ) et 50 µl de la dilution 10
et déposer sur les milieux KB et CCT.
Etaler à l’aide d’un rateau.
Incuber les boites à 25 ± 3 °C pendant 24 à 72h selon l’état de développement.
Si le développement bactérien est insuffisant après 24 ou 48h laisser les boites 24 h
supplémentaires à l’étuve. Si, par contre, on observe trop de colonies, il faut préparer et
-5
-6
étaler des dilutions plus fortes (10 , 10 , etc.) de l’extrait (stocké entretemps au
réfrigérateur, voir point 9.1.) faire un isolement (point 9.5).
9.3.1
Interprétation sur milieu King’s B (« KB »)
Les colonies d’Erwinia amylovora sur KB apparaissent après 24 h et sont d’aspect blanc
crémeux, circulaires, avec une tendance à s’étaler, non fluorescentes. Il existe également des
souches d’E. amylovora dont les colonies apparaissent rosées, fluides et de forme irrégulière
(figure 1).
Figure 1 : Extrait végétal contenant Erwinia amylovora étalé sur milieu KB et incubé environ
48h. Photo de gauche : Les colonies de E. amylovora d’aspect blanc crémeux et circulaire.
(sont pointés par les flèches). Photo de droite : colonies de E. amylovora d’aspect rosé et
fluide.
9.4.2. Interprétation sur milieu CCT
Le milieu CCT est semi-sélectif : il inhibe la plupart des Pseudomonas, mais pas Pantoea
agglomerans, par exemple, parmi les bactéries généralement retrouvées conjointement à E.
amylovora sur les échantillons végétaux.
Les colonies de Erwinia amylovora sur le milieu CCT apparaissent après 24 à 48 h et sont
d’aspect translucide violet pâle, circulaires, de très convexes à bombées, lisses et mucoïdes
(production de polysaccharide) (figure 2). Par comparaison au milieu KB, la croissance est
légèrement moins rapide.
Figure 2 : Extrait végétal contenant Erwinia amylovora étalé sur milieu CCT et incubé environ
48h. Photo de gauche : vue perpendiculaire au plan de la boîte, montrant l’aspect translucide.
Photo de droite : vue des colonies de profil, montrant l’aspect bombé et la couleur violet pâle.
Des exemples de colonies de E. amylovora sont pointés par les flèches.
9.4.3. Test de fluorescence
Les boites de Petri (milieu KB ou milieu Levan (voir point 9.6.1.)) sont placées devant une
lampe UV (366 nm). Les colonies bactériennes fluorescentes sont immédiatement
détectables (figure 3). Les colonies qui présentent la morphologie typique de E. amylovora et
qui ne sont pas fluorescentes sont suspectées d’être E. amylovora et doivent être soumises à
des tests supplémentaires pour confirmation.
Figure 3 : Test de fluorescence sous lampe UV. A gauche sur l’image : d’un étalement de
macérat Erwinia amylovora sur KB Levan, : les colonies fluorescentes sont des contaminants
(Pseudomonas), E. amylovora est à rechercher parmi les autres colonies non fluorescentes.
non fluorescente sous UV. A droite de l’image : étalement d’une souche de Pseudomonas sur
Levan, fluorescente sous UV. La différence entre souche fluorescente et souche non
fluorescente est très nette.
9.4
Séro-agglutination
Pour chaque échantillon, toutes les colonies suspectes sur CCT et KB doivent être testées en
séro-agglutination jusqu’à ce qu’au moins 1 colonie réagisse positivement ou que toutes les
colonies suspectes aient été testées.
Un anticorps polyclonal dirigé contre E. amylovora est utilisé, fourni dans le Kit express –
Neogen (ADGEN).
•
Etape préliminaire : les réactifs, conservés au réfrigérateur, sont placés à T°
ambiante 10 min avant utilisation.
• Préparation de la suspension bactérienne pour le test :
- A partir d’une culture liquide : utilisée telle quelle.
- A partir d’une culture sur boite : prélever une colonie et la suspendre dans 450 µl de tampon
PBS*. Une alternative est de travailler directement avec une colonie non resuspendue (voir
ci-dessous).
- A partir d’un tissu infecté : laisser macérer un petit morceau (de l’ordre de 5-10 mm) de tissu
dans 450 µl de tampon PBS.
*Remarque : la suspension de colonie en PBS est vivement recommandée, contrairement à
l’utilisation de colonie pure, afin de limiter le risque de faux positif.
•
•
•
•
•
Préparation du support pour le test : lame en verre (lame de diagnostic avec puits
délimités par impression au Teflon) ou carton fourni avec le kit. Prévoir par série 1
puits pour le contrôle négatif fourni dans le kit, 2 1 puits pour les contrôles positifs
(contrôle positif fourni dans le kit et ou souche de référence LMG2024 ou autre
souche, préalablement confirmée comme E. amylovora), et un puits pour chacun des
échantillons.
Déposer 10 µl du réactif contenant l’anticorps (capuchon bleu) dans chaque puits.
Ajouter 10 µl de contrôle négatif dans le puits prévu et bien mélanger à l’aide du cône
en plastique de la pipette (minimum 5 aller-retours).
Ajouter 10 µl des suspensions bactériennes à tester dans les puits prévus et bien
mélanger à l’aide du cône en plastique de la pipette (minimum 5 aller-retours). Ou
effleurer une colonie avec une anse stérile de sorte à prélever une quantité minime
de bactéries, puis déposer les bactéries dans la goutte de réactif en homogénéisant
délicatement via des mouvements circulaires de la anse pendant 5 secondes.
Ajouter 10 µl des contrôles positifs dans les puits prévus et bien mélanger à l’aide du
cône en plastique de la pipette (minimum 5 aller-retours).
Le résultat est lu dans un délai de 60 secondes à 3 minutes après le mélange. Il est
déclaré positif si l’agglutination est franche et que les contrôles (négatifs et positifs)
sont bons (figure 4).
Figure 4 : Séro-agglutination sur Erwinia amylovora. A gauche de l’image : agglutination
négative. A droite de l’image : agglutination positive.

Pour tout échantillon symptomatique, si au moins 1 colonie suspecte séroagglutine, la présence d’E. amylovora est considérée comme étant confirmée,
et une notification doit être faite.

9.5
Pour tout échantillon symptomatique, s’il n’y a pas de colonies suspectes en
culture ou si les colonies suspectes ne séro-agglutinent pas, on considère que
la présence d’E. amylovora n’a pas pu être démontrée dans l’échantillon
considéré. On stoppe l’analyse avec comme conclusion « absence ».
Isolement sur KB et CCT (optionnel)
En cas de doute sur l’identité d’une colonie, par exemple parce que la flore présente sur la
boîte recouvre partiellement la colonie, ou parce que l’agglutination n’est pas franche, la
colonie suspecte doit être isolée sur une nouvelle boîte de culture :
•
•
•
•
Prélever la colonie suspecte avec une anse, en évitant si possible le contact de la
anse avec des contaminants éventuels.
Etaler la colonie sur une boîte de milieu KB et/ou CCT. Si les contaminants sont
abondants, préférer le CCT.
Incuber la boite à 25 ± 3 °C pendant 24 à 72h.
Analyser comme décrit aux points 9.4.1. à 9.5.
Pour chaque échantillon, parmi les colonies reconnues comme E. amylovora sur base des
tests précédents (morphologie sur KB et CCT, fluorescence négative, séro-agglutination), 3
sont choisies (si possible, sinon moins de 3) et sont étalées à l’aide d’une anse sur du milieu
Levan (par souci d’économie, plusieurs colonies peuvent être isolées sur une seule boite
divisée en différentes zones). Ceci permet d’augmenter la quantité de cellules disponibles, et
constitue un test supplémentaire d’identification de E. amylovora, de par la morphologie
caractéristique sur milieu Levan.
Le boites sont mises à incuber à 25 ± 3 °C pendant 24 à 72 h selon l’état de développement.
9.5.1.
Interprétation sur milieu Levan
Après 24 h, les colonies d’E. amylovora sont déjà visibles et d’apparence blanchejaunâtre, circulaire, bombé. Après 48 h, l’aspect est lisse et nettement mucoïde
(production de polysaccharide) (figure 5).
Figure 5 : Etalement de Erwinia amylovora sur milieu Levan, après environ 48h d’incubation.
L’aspect mucoïde est net.
La non-fluorescence doit être vérifiée à l’aide d’une lampe UV, comme décrit au point
9.4.3.
10 Echantillons asymptomatiques
10.1 Prélèvement
Remarque préliminaire : si l’analyse ne peut être réalisée lors de la réception des échantillons
frais, ceux-ci sont placés à 4°C pour une durée maximale de 5 8 jours ouvrables.
Le prélèvement doit être effectué sur des rameaux secs ; s’il y a lieu, placer l’échantillon dans
un bac en plastique troué et le laisser sécher à température ambiante 24 h (et désinfecter le
bac après).
L’échantillon devrait idéalement être composé de 100 rameaux sains. Il peut s’agir d’une
seule espèce végétale ou de plusieurs; dans ce dernier cas, les rameaux sont triés par
espèce dans des petits contenants distincts au sein du sac de l’échantillon (dans l’unique but
de faciliter le prélèvement); dans tous les cas, et quelle que soit la proportion de chaque
espèce, le nombre total de rameaux est de 100.
Si c’est le cas :
• prélever deux bourgeons par rameau, l’un au milieu et l’autre au sommet.
• placer ces bourgeons par groupe de 50, aléatoirement (si plusieurs espèces végétales,
on peut mélanger), dans 4 fioles en plastique.
Autre cas :
• moins de rameaux que prévu : prélever plus de deux bourgeons par rameau, de façon à
arriver à 4*50 bourgeons.
• plus de rameaux que prévu : ne prélever que sur 100 rameaux.
• présence de un ou plusieurs rameaux avec symptômes : traiter ceux-ci à part selon la
première partie de l’instruction (échantillons symptomatiques).
• Dans tous les autres cas, contacter le contrôleur pour se mettre d’accord sur les
conditions de l’analyse.
Après prélèvement, les bourgeons peuvent être conservés à sec à 4°C pendant
maximum 72 heures si l’analyse ne peut être poursuivie dans l’immédiat.
10.2 Macération Enrichissement
•
•
Ajouter 25 ml de TMA dans chaque récipient.
Laisser macérer 2 h à température ambiante sous agitation et étaler. Si l’étalement
est impossible dans l’immédiat, laisser une nuit au réfrigérateur.
10.3 Dilution et étalement
•
•
-1
-2
Effectuer deux dilutions décimales du macérat (10 , 10 ) en PBS.
Etaler 50 µl du macérat non dilué ainsi que 50 µl de chacune des deux dilutions sur CCT
(donc prévoir 3 boîtes de CCT par macérat ; et comme il y a normalement 4 macérats par
échantillon prévoir au total (4x3) = 12 boîtes de CCT par échantillon) et étaler à l’aide d’un
rateau.
• Incuber 72 h à 25 ± 3 °C. Remarque : si les colonies sont déjà bien développés après 48
h, l’incubation peut être stoppée.
La souche de référence LMG2024, suspendue en PBS, est aussi étalée comme contrôle
positif, une fois par semaine (avec la première série d’échantillons de la semaine). Un
contrôle négatif, à savoir du tampon de macération antioxydant pur, est également étalé une
fois par semaine ; ce contrôle n’est pas obligatoire si la majorité (>50%) des échantillons de
routine sont négatifs.
TOUTES LES ETAPES SUIVANTES SONT IDENTIQUES A CELLES DECRITES POUR
LES ECHANTILLONS SYMPTOMATIQUES (voir à partir du point 9.4.2)
Etant donné que seul le milieu CCT est utilisé pour les étalement, et non le KB comme dans
le cas des échantillons symptômatiques, le test de fluorescence ne peut être fait à cette
étape. Ceci étant, si une incertitude se pose quant au caractère typique de la morphologie
d’une colonie, il est directement procédé au test de séro-agglutination pour orienter le
diagnostic.
10.4 Interprétation sur milieu CCT
Voir point 9.4.2
Notons que le test de fluorescence n’est pas fait pour les échantillons latents car on ne
travaille qu’avec milieu CCT, incompatible avec ce test de fluorescence.
10.5 Séro-agglutination
Voir point 9.5.
Attention: en cas de séro-agglutination positive pour un échantillon latent, des tests
supplémentaires (voir ci-dessous) doivent être réalisés avant toute notification, contrairement
aux échantillons symptomatiques !
10.6 Isolement sur KB et CCT (optionnel)
Voir point 9.6.
10.7 PCR et phytopathogénicité
Les colonies isolées à partir d’un échantillon latent sur Levan et reconnues comme E.
amylovora doivent être soumises à un test PCR et à un test de phytopathogénicité, pour
confirmation (si plusieurs colonies isolées pour un échantillon donné sont positives, en choisir
1 pour ces deux tests).
10.7.1 PCR
Le but du test est de démontrer la présence d’une séquence d’ADN génomique donnée
spécifique de E. amylovora, présente sur le plasmide pEA29, selon Llop et al., 2000
(appendice 11 de la norme OEPP). Le test se déroule en 3 grandes étapes : extraction
(libération) de l’ADN des bactéries par lyse, amplification (nested-PCR), confirmation par
restriction enzymatique.
10.7.1.1.Extraction de l’ADN
Pour libérer l’ADN présent dans les cellules, une lyse des bactéries est effectuée par choc
thermique :
•
Resuspendre une colonie bactérienne de minimum 2 mm de diamètre (à partir d’un
isolement sur milieu Levan) dans 450 µl de PBS.
• Faire bouillir le tube 4 min et le refroidir ensuite rapidement en le plaçant 10 min sur un lit
de glace pilée ou au réfrigérateur, de sorte à créer un choc thermique. Les tubes peuvent
également être placés au congélateur quelques minutes, voire plusieurs jours si l’on ne
souhaite pas poursuivre l’analyse immédiatement.
10.7.1.2. Amplification par Nested-PCR
10.7.1.2.1. PREPARATION DES REACTIFS (ETAPE PRELIMINAIRE SI ON ENTAME
UN NOUVEAU PRODUIT)
Deux possibilités: soit on travaille avec le kit de la firme Loewe, soit on travaille avec des
réactifs achetés séparément. La qualité des résultats est équivalente, le choix doit être guidé
par la disponibilité des produits et le budget (le kit est plus cher que les réactifs achetés
séparément), ainsi que la vitesse de préparation (plus rapide avec le kit).
Préparation préliminaire en cas de travail avec le kit Loewe
Resuspendre les réactifs lyophilisés comme suit :
• ajouter 10 µl d’eau milliQ stérile dans le tube contrôle positif.
• ajouter 50 µl d’eau milliQ stérile dans le tube contrôle négatif.
• ajouter 500 µl d’eau milliQ stérile dans le tube premix, laisser sur glace 30 +/ 10 min
et aliquoter par fraction de 100 µl. Le premix contient 2 couples d’amorces (2 internes
et 2 externes) et les dNTPs.
• conserver les réactifs à –20°+/- 1°C.
Préparation préliminaire en cas de travail avec les réactifs achetés séparément
Les 4 amorces lyophilisées (AJ75, AJ76, PEANT1, PEANT2) doivent être resuspendues en
eau milliQ stérile à 25 pmoles/µl pour obtenir la solution-mère, ç-à-d. qu’il faut mettre une
proportion de 1000 µl d’eau pour 25 nmoles.
 Les tubes d’amorces achetés chez Invitrogen contiennent approximativement 25 nmoles, mais rarement
exactement cette quantité ; il faut donc par une règle de trois calculer la quantité exacte d’eau à utiliser
pour la resuspension, sur base de la quantité contenue telle que notée sur chaque tube. Exemple : il est
noté « 27,2 nmole » sur le tube : ajouter 1088 µl d’eau milliQ.
Pour resuspendre l’ADN induire quelques aller-retours de l’eau via la micropipette, puis
laisser reposer 30 +/- 10 min sur glace le temps de la réhydratation de l’ADN.
La solution-mère doit ensuite être diluée en solution-fille pour utilisation à l’étape de
préparation du mix :
• AJ75 : déposer 0,4 µl de solution-mère dans 99,6 µl d’eau milliQ pour obtenir 100µl
d’une solution-fille à 0,1 pmole/µl.
• AJ76 : idem AJ75.
• PEANT1 : déposer 40 µl de solution-mère dans 60 µl d’eau milliQ pour obtenir 100 µl
d’une solution-fille à 10 pmoles/µl.
• PEANT2 : idem PEANT1.
• Conserver le tout à –20°+/- 1°C. Quand les stocks de solution-fille sont épuisés, en
préparer à nouveau à partir des stocks mère.
10.7.1.2.2. PREPARATION DU MIX PCR (SOUS LE BOX RESERVE)
Un mix global est préparé, contenant les éléments suivants : d’une part eau milliQ, tampon de
Taq, DMSO (réduit les structures secondaires de l’ADN donc augmente la spécificité de la
réaction) et polymérase Taq, d’autre part soit le Premix Erwinia, soit les 4 amorces, des
dNTPs et du MgCl2 (co-facteur de la polymérase). Ce mix sera ensuite réparti dans les
différents microtubes contenants les échantillons à tester.
Remarque : prévoir un temps de décongélation préalable des réactifs (au minimum 30 min
sur glace). Seuls l’eau, le DMSO et la polymérase Taq ne nécessitent pas de décongélation.
•
Pour calculer la quantité totale de mix à préparer, multiplier les valeurs ci-dessous
par le nombre de microtubes souhaités (y compris les contrôles). Préparer 10 % de
quantité en plus, pour être assuré d’en avoir suffisamment.
•
Concrètement, ajouter les différents constituants du mix en suivant l’ordre indiqué
dans le tableau.
Composants du mix PCR et leur quantité à considérer par tube :
Si travail avec kit Loewe
Réactif
Concentration Quantité [µl] Remarque
1) Eau
31,5
N.a.
milliQ, stérile
2) Tampon
5
10 X
3) DMSO
2
100 %
4) Premix Erwinia
10
5) Polymérase Taq
0,5
5 U/µl
Remarque : le Premix contient un couple d’amorces internes (PEANT1 et 2) à 10 pmoles/µl,
un couple d’amorces externes (AJ75 et 76) à 0,1 pmole/µl et des dNTPs à 10mM.
Si travail avec réactifs achetés séparément
Réactif
Concentration Quantité [µl]
1) Eau
31,76
N.a.
2) Tampon
5
10 X
3) DMSO
2
100 %
4) dNTPs
1
10 mM
5) MgCl2
6
25 mM
6) AJ75
0,32
0,1 pmole/µl
7) AJ76
0,32
0,1 pmole/µl
8) PEANT1
1
10 pmoles/µl
9) PEANT2
1
10 pmoles/µl
10) Polymérase Taq
0,6
5 U/µl
•
Remarque
milliQ, stérile
Solution-fille
Solution-fille
Solution-fille
Solution-fille
Une fois préparé, répartir le mix dans les microtubes à raison de 49 µl/microtube.
Pendant toute la durée de la préparation, travailler avec les tubes posés sur de la glace ou
fixés sur un bloc froid pour limiter la dégradation de l’ADN.
A cette étape, le mix peut être congelé à –20°+/- 1°C pour conservation pendant plusieurs
semaines avant de procéder à l’ajout de l’échantillon et la PCR. Le jour de l’utilisation,
décongeler le mix à température ambiante jusqu’à liquéfaction avant l’ajout d’ADN.
10.7.1.2.3. AJOUT DE L’ECHANTILLON (SOUS UN AUTRE BOX RESERVE)
Ajouter 1 µl d’échantillon ou de contrôle par microtube.
En pratique, manipuler d’abord les contrôles négatifs, ensuite les échantillons
présomptivement négatifs, puis les échantillons présomptivement positifs et enfin les
contrôles positifs, afin de minimiser les risques de faux positifs.
10.7.1.2.4. LES CONTROLES QUALITE
Dans chaque série, les 3 contrôles suivants doivent être inclus :
Abréviation
C-R
Nom
Contrôle négatif de la
resuspension
C-mix
Contrôle négatif du
Composition
49 µl Mix PCR + 1 µl
PBS utilisé pour la
resuspension des
colonies
50µl Mix PCR
Utilité
Contrôler l’absence
de contamination du
tampon de
resuspension
Contrôle de l’absence
mix
C+
Contrôle positif
49 µl Mix PCR + 1 µl
d’un extrait reconnu
positif (par exemple
6
une resuspension 10
CFU/ml de la souche
de référence ou le C+
du kit Loewe)
de contamination des
réactifs du mix
Contrôle de
l’amplification
10.7.1.2.5. AMPLIFICATION
Les conditions de l’amplification sont les suivantes :
N°
T°
étape [°C]
1
94
2
94
3
72
4
94
5
94
6
56
7
72
8
72
9
4
Temps Nbre
[sec]
répétitions
240
30
25
60
240
1
30
30
40
45
600
1
1
∞
Description
Activation Taq et dénaturation
Séparation des brins
Fixation des amorces et élongation
Dénaturation
Séparation des brins
Fixation des amorces
Elongation
Elongation finale
Conservation
10.7.1.2.6. ELECTROPHORESE (OPTIONNELLE)
Le dépôt sur gel du produit de l’amplification PCR n’est à faire que suite à des
résultats de restriction enzymatique (voir ci-dessous 9.7.1.3) douteux.
•
Préparer et couler un gel d’agarose 1,5 % à 2,0% dans du TAE.
o Pour la petite cuve (mini-subcell), ajouter 70 ml de TAE à 1,2 ± 2,0 g
d’agarose / Pour la grande cuve (Subcell GT), ajouter 280 ml de TAE à 4,9 ±
0,7 g d’agarose.
o Chauffer 1 à plusieurs min à 900 W au micro-onde. jusqu’à ébullition, puis
mélanger. Répéter l’opération jusqu’à complète dissolution de l’agarose
(aspect parfaitement translucide sans morceaux).
o Laisser refroidir le gel jusqu’à 60°C (pouvoir prendre le récipient en main).
Cela est nécessaire car le support pour moulage du gel risque d’être
endommagé à des températures supérieures.
o Ajouter 7 µl de GelRed 10000X pour un gel de 70 ml / 28 µl de GelRed
10000x pour un gel de 280 ml.
o Couler le gel dans le support (vérifier l’horizontalité bidimensionnelle) et
ajouter le peigne.
o Laisser polymériser environ 30 minutes. En polymérisant le gel s’opacifie et
devient blanc-bleuâtre.
o Desceller le support et le placer avec le gel dans la cuve (placer les puits du
côté de la cathode (l’électrode noir +).
o Verser du TAE jusqu’à immersion du gel (5 mm).
• Déposer 1,5 µl de bleu de chargement dans des tubes neufs et y ajouter 13,5 µl de
produit d’amplification PCR.
• Charger le marqueur de poids moléculaire (Trackit™ 50 bp DNA Ladder) et les
échantillons dans les puits du gel d’agarose.
(Attention : éviter les bulles d’air dans le tips car en remontant elles risquent de projeter
l’échantillon en dehors du puits)
• Procéder à la migration sur au moins 9 cm à max 150 V.
10.7.1.2.7. ANALYSE DES RESULTATS
•
•
•
•
•
•
•
•
Sortir le gel de la cuve et de son support et le déposer sur la tablette UV du
transilluminateur.
Allumer l’appareil et ouvrir sur l’ordinateur relié le logiciel Quantity One.
Cliquer sur File - GELdoc XR pour faire apparaître le gel à l’écran.
Faire les réglages optiques (zoom, position du gel, netteté) en épi-white (lumière
classique).
Eteindre la lumière et activer les UV (trans UV).
Optimiser les réglages (netteté, intensité lumineuse. Attention : éviter une sursaturation,
qui amènerait un biais lors de l’analyse de l’image!) et appuyer sur Freeze pour fixer
l’image.
Enregistrer l’image.
Pour le traitement de l’image, suivre la procédure suivante :
o Dans le menu, choisir Image – Transform…et cliquer sur Autoscale. Cette action
règle automatiquement la luminosité et le contraste.
o Dans le menu, choisir Lane – Autoframe lane. Indiquer le nombre de pistes
manuellement si nécessaire.
o Dans le menu, choisir Band – detect bands. Vérifier que les paramètres par défauts
sont bien les suivants : Sensitivity 10.000, Lane width 2.5, Minimum density 0, Noise
filter 4, Shoulder sensitivity 1, Size scale 5. Cliquer sur le bouton de détection
automatique des bandes.
o Vérifier que les 6 premières bandes du marqueur au minimum ont été correctement
détectées, sinon ajuster manuellement (via l’option suppression/ajout de bande).
o Dans le menu, choisir Image – Transform…et déplacer le curseur « High » vers la
gauche, jusqu’à la limite de la base du graphique noir. Cette action améliore la
visibilité des bandes de faible intensité.
o Dans le menu, choisir Band – detect bands. Supprimer manuellement les marques de
détection de bandes erronées (ex. bulle, poussière dans le gel, hors-zones par
rapport au marqueur, etc.), et ajouter manuellement des marques de détection là où il
semble y avoir des bandes non détectées automatiquement. S’aider de l’option du
menu Lane – Plot lane, c’est-à-dire un graphique affichant la quantité de pixels dans
chaque piste, sur toute la longueur.
o Choisir dans le menu Match – Standart – Trackit. Dans la fenêtre qui s’affiche cliquer
sur 11 puis sur l’image cliquer sur la bande du marqueur présentant la plus forte
intensité (bande correspondant à 350 pb).
o Dans le menu, choisir Band – Band attributes. Dans la fenêtre qui s’affiche cocher
«Mol. Wt. ». La taille de toutes les bandes détectées s’affiche alors sur l’image.
Enregistrer l’image et l’imprimer.
o Supprimer manuellement toutes les marques de détection de bandes inférieures à
300 ou supérieures à 500** paires de bases (bp).
o Dans le menu, choisir Lane – lane background. Cliquer sur 1 piste de l’image. Dans
la fenêtre, dans le cadre « Selected lane », cocher « lane on » pour pouvoir ajuster la
taille du rolling disk. Par défaut, cette taille est de zéro ; l’augmenter progressivement
(cela revient à diminuer le bruit de fond) en modifiant le nombre inscrit, et cela tout en
suivant visuellement les modifications se faisant en parallèle sur le graphique
représentant la quantité de pixels tout le long de la piste. A mesure que la taille du
rolling disk augmente, une ligne se détache du profil dentelé du graphique et s’en
éloigne, en devenant de plus en plus linéaire. Le but est de positionner cette ligne de
sorte à ce qu’elle relie les points les plus bas de tous les pics de la piste, tout en étant
linéaire entre les points reliés. A toute bande sur le gel doit correspondre un pic. Un
« pic » est considéré comme tel si la ligne représentant chacun de ses montants ne
compte pas plus de 10 cassures. Lorsque la taille du rolling disk est ajoutée, cocher
la case « show lane trace with background substracted ».
o Dans le menu, choisir Band – Band attributes. Cocher ensuite “Peak density”. La
densité des pics correspondants aux bandes détectées sur l’image est alors affichée.
Enregistrer l’image et l’imprimer.
o
Dans le menu Reports, choisir All lane report. Cocher les cases « Mol. Wt. » et
« peak density », et enregistrer et imprimer le rapport ; pour cela l’exporter sur le
disque au moyen de l’icône en bas de la fenêtre représentant une grille.
Sont suspectés (à confirmer par restriction; voir point 9.7.1.3.) positifs les échantillons
correspondants aux pistes dans lesquelles a été détectée 1 bande de taille
comprise entre 300 et 500 bp avec une densité de pic égale ou supérieure à 50, et
cela à condition que les contrôles positifs et négatifs soient corrects. Les échantillons
pour lesquels aucune bande de taille et intensité attendue sont considérés comme
négatifs.
Si une amplification est détectée dans un contrôle négatif et/ou une absence
d’amplification dans un contrôle positif, la PCR doit être recommencée en incluant des
contrôles supplémentaires afin d’identifier la source du problème et y remédier.
**La taille attendue pour le contrôle positif du kit Loewe est de 391 bp, mais une variation est
possible pour les échantillons de routine. En effet, une légère instabilité (à quelques dizaines
de bp près) de la taille de la séquence génomique ciblée dans ce test a déjà été observé
inter- et intra-souches. (Llop et al. 2000, Development of a Highly Sensitive Nested-PCR
Procedure Using a Single Closed Tube for Detection of Erwinia amylovora in Asymptomatic
Plant Material, Applied and Environmental Microbiology, May 2000, p.2071-2078 ; Schnabel
et al. 1998, Instability of a pEA29 marker in Erwinia amylovora previously used for strain
classification, Plant Dis. 82:1334-1336). De plus, une légère imprécision peut exister au
niveau du calcul de la taille des bandes par le logiciel Quantity One, si toutes les bandes du
marqueur de poids moléculaire ne sont pas détectées. Une marge de sécurité est donc prise
via cette fourchette de taille de 200 bp (300-500 bp).
10.7.1.3. Confirmation par restriction enzymatique
Afin de confirmer que la séquence ciblée correspond bien à celle qui a été amplifiée, une
restriction enzymatique est réalisée pour tous les échantillons. L’enzyme SmaI reconnaît et
coupe une mini-séquence de 6 nucléotides (CCCGGG) présente dans l’amplicon d’intérêt.
L’amplicon, dont la taille est proche de 400 bp, est scindé en 2 fragments ayant des tailles
proches de 150 et 250 bp, respectivement.
10.7.1.3.1. RESTRICTION
•
•
•
•
Préparer sur glace un mix de restriction eau milliQ-tampon-enzyme selon les proportions
suivantes : pour 10 réactions : 107 µl eau + 12 µl de tampon 10x + 1 µl de SmaI (ne pas
faire varier cette quantité tant qu’on ne dépasse pas 50 échantillons. Au-delà de ce
nombre, augmenter proportionnellement la quantité d’enzyme).
Répartir 12 µl de mix dans des tubes neufs.
Ajouter 8 µl de produit PCR.
Placer 75 ± 15 min à 25 ± 3 °C.
10.7.1.3.2. ELECTROPHORESE
•
•
•
Ajouter dans chaque tube contenant le mélange de restriction 2 µl de tampon bleu de
chargement.
Charger dans un gel 1,5 % à 2%. Pour la petite cuve prévoir un volume de gel de 70 ml
(2 ± 0,2 g agarose + 70 ml TAE), et pour la grande cuve 280 ml (4,9 ± 0,7 g agarose +
280 ml TAE).
Procéder à la migration sur au moins 9 cm à max 110 V pour la petite cuve et 150 V pour
la grande cuve.
10.7.1.3.3. ANALYSE DES RESULTATS
Procéder comme décrit au point 9.7.1.2.7., sauf pour les limites de taille des bandes : ici on
prend la fourchette de taille 100-350 bp (et non 300-500 bp). La restriction enzymatique
scinde tout amplicon obtenu à partir de E. amylovora en deux fragments de respectivement
150 et 250 bp environ. Une variabilité de taille entre différentes souches de la bactérie est
possible pour le grand fragment, tandis que le petit fragment présente une taille constante.
Ainsi, la variabilité de taille observée au niveau de l’amplicon de PCR (voir point 9.7.1.2.7)
doit être reflétée après restriction enzymatique au niveau du grand fragment.
Sont considérés comme positifs les échantillons présentant 2 bandes, l’une ayant une
taille comprise entre 100 et 200 bp***, l’autre entre 200 et 350 bp, sans limite d’intensité
de pic.
***Pour des raisons techniques, un léger biais peut occasionnellement se produire au niveau
de l’estimation des tailles de bandes par le logiciel (par exemple lorsque le gel est posé
légèrement de travers sur le support, lorsque plusieurs bandes du marqueur ne sont pas
nettes, etc.). Si les tailles des bandes observées se trouvent en dehors de la fourchette
100-350 bp, on pourra toutefois considérer les échantillons comme positifs à au moins
une de ces deux conditions :
- Les bandes des contrôles positifs dépassent également et avec le même ordre de
grandeur les limites de taille imposées.
- L’analyse concerne une série d’échantillons distincts, dont des contrôles positifs, et
une régularité des profils de restriction est constatée à l’échelle de la série (2 bandes
dont 1 plus petite de taille constante). Autrement dit le biais touche toute la série ou
une partie de la série de manière régulière.
10.7.2 Test de phytopathogénicité
Ce test est effectué prioritairement sur fruits immatures poires puis pommes ou sur
poires matures des variétés Conférence ou Doyenné selon les disponibilités au cours
de l’année.
•
Préparation de la suspension bactérienne à inoculer :
- A partir d’une culture liquide : utilisée telle quelle.
- A partir d’une culture sur boite : prélever une colonie et la suspendre dans 450 µl de tampon
PBS.
- A partir d’un tissu infecté : laisser macérer un petit morceau de tissu dans 450 µl de tampon
PBS.
•
•
•
•
•
Préparation du fruit pour le test : découper une tranche de fruit et la déposer dans le
couvercle d’une boite de Petri sur un papier absorbant imbibé d’eau (ne pas noyer la
boite).
Inoculation : prélever 20 à 50 µl (en proportion de la taille de la poire) de suspension
bactérienne et déposer sur la tranche de fruit.
Bien étaler sur toute la surface avec le cône en plastique de la pipette ou avec une anse.
Remettre le fond de la boite sur le couvercle.
Incuber de 24 à 72 h ± 6 h à 25°C. Attention au risque de pourrissement des fruits,
proportionnel au temps d’incubation !
Inclure comme contrôle négatif dans le test une tranche de fruit inoculée avec du tampon
PBS seul, et comme contrôle positif une tranche de fruit inoculée avec la souche de
référence.
Lecture du résultat : un test positif est facilement reconnaissable à une poire attaquée
(chair en liquéfaction), jaunâtre à brunâtre, montrant un suintement ou des gouttes
d’exsudat (Figure 6).
A
B
C
D
Figure 6 : Tests de phytopathogénicité avec Erwinia amylovora sur tranches de pomme et
poire après 48 à 72 h d’incubation à 25 ± 3 °C. A : test positif sur jeune poire (de jardin privé,
V. Remacle) ; de l’exsudat transpire massivement en surface de la tranche du fruit. B : test
positif sur jeune pomme (de jardin privé, V. Remacle) ; quelques gouttes blanches d’exsudat
sont bien visibles en surface de la tranche. C : test négatif sur tranche de poire mature
(Durondeau). D : test positif sur tranche de poire mature (Durondeau) ; la chair est attaquée,
jaunâtre et suintante.
10.7.3 Conclusion suite aux deux tests
Lorsque les résultats d’analyse sont disponibles pour la PCR et la phytopathogénicité, la
conclusion est donnée comme suit :



En cas de résultat positif pour au moins 1 des les 2 tests, la présence d’E.
amylovora est considérée comme étant confirmée, et une notification doit être
faite.
En cas de résultat négatif pour les 2 tests, on considère que la présence d’E.
amylovora n’a pas pu être démontrée dans l’échantillon considéré. On stoppe
l’analyse avec comme conclusion « absence ».
Si seul, l’un des 2 tests est positif, un test supplémentaire de séro-agglutination
doit être réalisé sur l’isolement concerné, en suivant la procédure décrite au
point 9.5. ; en cas de résultat positif, E. amylovora est considérée comme étant
présente et une notification doit être faite, et en cas de résultat négatif, on
considère E. amylovora comme non détectée.
11 Cryoconservation des souches (optionnel)
Pour la cryoconservation, on partira toujours d’un isolement secondaire (voire tertiaire si on a
des doutes quant à l’homogénéité des colonies sur le secondaire).
11.1. Procédure
•
•
•
Préparer 2 tubes de conservation contenant 1 ml de tampon de conservation par
souche.
Ajouter 5 ml de PBS 10 mM à un isolement (secondaire ou tertiaire) sur milieu KB.
Suspendre les colonies dans le tampon à l’aide d’un rateau.
•
•
Prélever 1 ml de la suspension et l’ajouter dans un tube de conservation (3 tubes par
souche).
Fermer le tube et lui ajouter son code couleur.
Mauve : souche d’Erwinia amylovora provenant de collection de référence (« LMG » par ex.).
Rouge : souche d’Erwinia amylovora isolée au LFSAGx.
Vert : souche d’autres espèces d’Erwinia ou d’autres genres utilisés comme contrôles
négatifs ou dans les tests de spécificité.
Blanc : divers.
11.2. Numérotation des souches
Souches de référence : numéro de la collection précédé du code du laboratoire d’origine
(ex. LMG 1994) (idem pour des souches provenant de laboratoires externes mais pas de
collections officielles).
Souches internes : l’abréviation ‘LFSAGx’ est suivie de l’année puis d’un numéro d’ordre.
11.3. Gestion des souches
Un registre reprend les souches de référence et un autre les souches internes.
Dans ces registres sont repris : numéro de la souche, référence au matériel d’origine, date
d’isolement, position dans le congélateur (n° étagère, n° boite et position dans la boite) ainsi
que les dates et remarques concernant les utilisations ultérieures.
12 Calcul et rapportage
Calcul : pas d’application.
13 Référence à des procédures afférentes, instructions,
documents, formulaires ou listes
-
LAB 21 F-PHY-062-01 - Fiche de suivi des échantillons symptomatiques.
LAB 21 F-PHY-062-02 - Fiche de suivi des échantillons latents.
LAB 21 F-PHY-062-04 - Fiche de suivi des restrictions enzymatiques.
LAB 21 F-PHY-062-05 - Fiche de contrôle des milieux.

Diagnostic et recherche d`Erwinia amylovora Version 08 Date

Transcription

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