Diagnostic de Ralstonia solanacearum et Clavibacter

Agence fédérale
pour la Sécurité
de la Chaîne alimentaire
LFSAGx
MET-LFSAGX-081
MET-LFSAGX-082
I-MET
Diagnostic de Ralstonia solanacearum et Clavibacter
michiganensis sepedonicus sur tubercule de pomme de
terre et boutures de Pélargonium
Version
Date d’application
04
2013-08-20
Rédaction par :
Sandrine Léonard, Responsable section
Phytopathologie ; 2013-07-18
Révision par :
Alain Dubois, Responsable Qualité LFSAGx ; 2013-08-19
Autorisation de publication par :
Franck Defeijt, Manager laboratoire LFSAGx ; 2013-08-19
Gestion et localisation de la
version valide :
M:\LFSAGx-QSE\A 3-Instructions\A30-Qualité
Destinataires :
Mots clefs :
COLLABORATEURS SECTION PHYTOPATHOLOGIE LFSAGX
Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis
sepedonicus, diagnostic.
LAB 21 I-MET-PHY-081-082-v04 - 1/10
DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS
SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET
BOUTURES DE PÉLARGONIUM
Aperçu des modifications*
Révision
par/date
SL-09/12/09
SL-16/08/11
SL-24/05/13
SL-17/07/13
*
Motif de la révision
Partie du
texte/portée de la
révision
Document original : «Diagnostic
de
Ralstonia
solanacearum
et
Clavibacter
michiganensis
sepedonicus sur tubercule de pomme de terre».
Audit interne 24/06/11 et mise à jour en lien avec les Mise à jour des
pratiques actuelles.
schémas d’analyse
des annexes 1 et 2
et adaptation
conséquente du
texte du point 5.
Suppression de la
ligne faisant
référence à une
annexe 3 non
présente. Ajout de
précisions sur la
gestion du matériel
contaminé. Ajout du
contact avec le
laboratoire national
de référence.
Ajout de la matrice boutures pour R. solanacearum
Titre, Objectif,
Documents légaux,
Principe,
Caractéristiques de
performance,
Consignes de
sécurité, Références
à d’autres
documents, Schéma
annexe 2.
Audit interne du 20/06/13 : correction des schémas
d’analyses Clavibacter et Ralstonia.
Annexes 1 et 2 :
surpression de la
réitération de la
PCR en cas de
résultat positif.
L’écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans.
Les modifications par rapport à la version précédente sont reprises en rouge.
LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 2/10
DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS
SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET
BOUTURES DE PÉLARGONIUM
TABLE DES MATIERES
1
OBJECTIF .......................................................................................................................... 4
2
CHAMP D’APPLICATION ................................................................................................. 4
3
DOCUMENTS LÉGAUX ET NORMATIFS ........................................................................ 4
4
DÉFINITIONS ET ABRÉVIATIONS ................................................................................... 5
5
PRINCIPE........................................................................................................................... 6
6
CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE ................................................................... 6
7
CONSIGNES DE SÉCURITÉ ET MESURES SPÉCIFIQUES ........................................... 6
8
RÉACTIFS.......................................................................................................................... 7
9
APPAREILLAGE ............................................................................................................... 7
10
MÉTHODE .................................................................................................................... 7
11
CONTRÔLES DE LA QUALITÉ .................................................................................. 7
12
CALCUL ET RAPPORTAGE ....................................................................................... 8
13
RÉFÉRENCE À DES PROCÉDURES AFFÉRENTES, INSTRUCTIONS,
DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES ........................................................................... 8
LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 3/10
DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS
SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET
BOUTURES DE PÉLARGONIUM
1 Objectif
Cette méthode a pour objectif la détection des bactéries phytopathogènes de quarantaine
Ralstonia solanacearum et Clavibacter michiganensis sepedonicus sur tubercule de pomme
de terre infecté et bouture de Pélargonium (cette dernière uniquement pour R.
solanacearum) de manière latente ou symptomatique.
2 Champ d’application
Cette méthode est applicable aux tubercules de pomme de terre et aux boutures de
Pélargonium.
3 Documents légaux et normatifs
Norme/Fil conducteur
Clauses
Pour R. solanacearum :
Bulletin OEPP 2004 34, 173-178 PM 7/21(1):
de
diagnostic
pour
les
Protocoles
organismes
réglementés :
Ralstonia
solanacearum.
Point “Isolation”, page 174.
Journal officiel de l’Union européenne L
206/36 : Directive 2006/63/CE de la
Commission du 14 juillet 2006 modifiant les
annexes II à VII de la directive 98/57/CE du
Conseil concernant la lutte contre Ralstonia
solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
Pour C. m. sepedonicus :
Section III, point 1 et 2.
Section IV, points A.4.1., A.6., B.4.
Appendice 2.b.
Appendice 4.
Appendice 6.3.
Annexes III et VII.
Bulletin OEPP 2006 36, 99-109 PM 7/59(1):
Diagnostic : Clavibacter michiganensis
subsp. sepedonicus.
Journal officiel de l’Union européenne L
182/1-43 : Directive 2006/56/CE de la
Commission du 12 juin 2006 modifiant les
annexes de la directive 93/85/CEE du
Conseil concernant la lutte contre le
flétrissement bactérien de la pomme de
terre.
Point « Screening for latent infection », page
102: les 3 premiers paragraphes.
Point “IF Test”, page 103.
Point 3.1.
Point 6.
Point 9.2.
Appendices 2., 3., 5.b., 6.1.
Annexes II et V.
LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 4/10
DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS
SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET
BOUTURES DE PÉLARGONIUM
4 Définitions et abréviations
Terme
Ralstonia
Origine de la définition
LFSAGx
Clavibacter
LFSAGx
Talon de pomme de
terre
Définition
Dans la présente procédure, le terme
s’applique à Ralstonia solanacearum :
bactérie gram-négative phytopathogène de
quarantaine causant notamment la pourriture
brune de la pomme de terre.
Dans la présente procédure, le terme
s’applique à Clavibacter michiganensis
sous-espèce sepedonicus : bactérie grampositive phytopathogène de quarantaine
causant la pourriture annulaire de la pomme
de terre.
Zone circulaire d’environ 5-10 millimètres de
diamètre présentant un léger relief visible en
surface du tubercule, correspondant au canal
vasculaire, à l’endroit où le tubercule était relié
à la plante pendant la culture. Le talon est
prélevé sur le tubercule à une profondeur
d’environ 5-10 millimètres, selon un volume
conique.
Séro-agglutination
LFSAGx
Milieu de culture semispécifique
LFSAGx
Milieu de culture non
spécifique
LFSAGx
Pathogénicité sur
plantes
LFSAGx
Test visuel de mise en évidence des bactéries
d’intérêt au moyen d’un sérum spécifique : un
test positif donne lieu à la formation de
complexes antigène-anticorps s’agglutinant
entre eux et détectables à l’œil nu.
Milieu nutritif gélosé contenant des substances
inhibitrices de la croissance de certains (mais
pas tous) micro-organismes susceptibles d’être
extraits de l’échantillon étudié conjointement à la
bactérie d’intérêt.
Milieu nutritif gélosé ne contenant pas de
substances inhibitrices de la croissance des
micro-organismes.
Tests consistant à inoculer une bactérie d’intérêt
à une plante hôte afin d’observer le
développement de la maladie causée par cette
bactérie.
LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 5/10
DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS
SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET
BOUTURES DE PÉLARGONIUM
Abréviation
Origine
PCR
IF
LFSAGx
LNR
AFSCA
Signification
« Polymerase Chain Reaction » pour Réaction
en chaîne de la polymérase, consistant en la
multiplication d’une séquence d’ADN ciblée de
manière à la rendre détectable. La réaction se
fait au moyen d’une enzyme Taq polymérase,
d’amorces, de nucléotides, d’un tampon et d’un
thermocycleur.
Immunofluorescence. Test consistant à mettre
en évidence les bactéries de manière visuelle,
via microscopie à fluorescence, au moyen d’un
marquage avec des anticorps couplés à un
fluorochrome.
Laboratoire National de Référence pour les
maladies des plantes, section bactériologie,
ILVO-PLANT, situé à Merelbeke en Belgique.
5 Principe
La méthode s’appuie sur les étapes suivantes :
- Prélèvement du talon des tubercules ou d’un segment à la base des tiges de boutures.
- Extraction et concentration des bactéries.
- Screenings via PCR (pour R. solanacearum et C. m. sepedonicus) et isolement sur milieu de
culture (pour R. solanacearum uniquement).
-
Si suspicion au(x) screening(s)
Selon les cas (bactérie(s) et screening(s) concerné(s) ; voir schémas en annexe) plusieurs
actions possibles et non incompatibles : réitération de test de screening, tests
supplémentaires comme screening immunofluorescence (pour C. m. sepedonicus) et PCR sur
colonies (pour R. solanacearum), confirmation de contamination au LNR.
6 Caractéristiques de performance
3
La méthode permet de détecter un minimum de 5 10 CFU/ml récupérées par extraction à partir d’un
échantillon de 200 tubercules de pommes de terre ou d’un échantillon de 25 à 100 boutures de
Pélargonium.
Pour les détails, voir le dossier de validation.
7 Consignes de sécurité et mesures spécifiques
Les manipulations impliquant les bactéries actives sont réalisées dans des locaux de niveau de
biosécurité L2Q dont l’accès est contrôlé, et le personnel est équipé de blouses de travail et de
lunettes de sécurité, et dispose en outre de produits désinfectants. La manipulation des bactéries
après extraction à partir des tubercules ou des boutures se fait sous hottes à flux laminaires. Tout
LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 6/10
DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS
SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET
BOUTURES DE PÉLARGONIUM
matériel consommable ayant été en contact direct avec les bactéries ou l’ADN bactérien est jeté dans
un container jaune pour enlèvement et incinération par une firme agréée ou décontaminé par
autoclavage (eau de rinçage des tubercules uniquement). Tout matériel non-consommable ayant été
contaminé par des bactéries ou de l’ADN est décontaminé au moyen d’un désinfectant adéquat ou
exposé aux UV’s.
8 Réactifs
Consulter les Instructions listées au point 13.
9 Appareillage
Etuves, hottes à flux laminaires, réfrigérateurs, congélateur, spectrophotomètre, bain thermostatique,
thermocycleur, microscope à fluorescence et autre matériel courant de laboratoire.
10 Méthode
Voir les schémas en Annexe 1 et 2.
Pour la confirmation de la présence de Ralstonia ou Clavibacter au LNR, procéder comme
suit :
1) Prendre contact avec le LNR pour les informer du problème et planifier l’envoi du matériel
à expertiser.
2) Préparer l’envoi selon l’instruction « Echange de matériel biologique entre le LFSAGx et
les laboratoires externes ». ATTENTION : il s’agit de matériel de quarantaine dont le
transport est soumis à législation !
3) Dès réception du matériel, le LNR réalise l’expertise qui consiste principalement en un
biotest sur plante (aubergine et/ou tomate). D’autres analyses sont réalisées
conjointement comme par exemple de la PCR avec différentes amorces spécifiques, de
l’isolement en culture, de l’IF. Cette expertise peut prendre jusqu’à 40 jours.
4) Dès connaissance des résultats, le LNR les communique au LFSAGx. Si le résultat est
non conforme, une notification est faite par le LFSAGx selon la procédure en vigueur à la
DG Laboratoires.
11 Contrôles de la qualité
Consulter les Instructions listées au point 13.
LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 7/10
DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS
SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET
BOUTURES DE PÉLARGONIUM
12 Calcul et rapportage
Calcul : pas d’application.
Rapportage :
- Résultats intermédiaires : bactérie suspectée ou bactérie non détectée.
- Résultats finaux : bactérie présente ou bactérie absente.
13 Référence à des procédures afférentes, instructions,
documents, formulaires ou listes
-
-
Instruction LAB_21_I-MET-PHY-081-082-Extr : “Extraction et concentration de Clavibacter
michiganensis sepedonicus et Ralstonia solanacearum à partir de tubercules de pomme de
terre”.
Instruction LAB_21_I-MET-PHY-081-082-PCR : « PCR en tant que screening pour le
diagnostic de Clavibacter michiganensis sepedonicus et Ralstonia solanacearum ».
Instruction LAB_21_I-MET-PHY-081-082-IF : « Immunofluorescence en tant que screening
pour le diagnostic de Clavibacter michiganensis sepedonicus».
Instruction LAB_21_I-MET-PHY-081-082-Isol : « Isolement de Ralstonia solanacearum par
culture in vitro et identification par PCR sur colonies ».
Fiche de suivi de l’analyse des échantillons de pomme de terre LAB_21_F-PHY-081-082-01 –
SuiviRalsto-Clavi.
Instruction « Echange de matériel biologique entre le LFSAGx et les laboratoires externes ».
Fiche de suivi de l’analyse des échantillons de Pélargonium LAB_21_F-PHY-081-082-03 –
SuiviRalsto-Boutures.
Annexes
Annexe 1 : schéma du mode opératoire pour Clavibacter michiganensis sepedonicus.
Annexe 2 : schéma du mode opératoire pour Ralstonia solanacearum.
LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 8/10
DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS
SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET
BOUTURES DE PÉLARGONIUM
Annexe 1 : Schéma d’analyse pour le diagnostic de Clavibacter michiganensis sepedonicus.
Echantillon: 200 tubercules de pomme de terre
Lavage (optionnel)
Symptômes/
pourriture ?
Examen visuel
OUI
>200 ?
OUI
NON
≠ 200 ?
NON
Prévoir remarque
pour DG contrôle
OUI
Créer un bis
avec les
tubercules
atteints
Dénombrement
NON
Prélèvement des talons
Suivre les
instructions de la
DG contrôle si
présentes sinon
sélectionner 200
au hasard
Symptômes/
pourriture ?
OUI
Créer un bis
avec les
tubercules
atteints
NON
Extraction et concentration des bactéries
Extraction d’ADN
et Screening PCR
Echantillon
CONFORME
NON
PCR positive ?
OUI
Refaire
PCR
NON
PCR
positive ?
OUI
Faire
screening IF
NON
IF positif ?
NON
OUI
Présence de la
bactérie confirmée
?
Confirmation au LNR
(envoi macérat + lame IF)
OUI
Echantillon NON
CONFORME
LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 9/10
DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS
SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET
BOUTURES DE PÉLARGONIUM
Annexe 2 : Schéma d’analyse pour le diagnostic de Ralstonia solanacearum.
Echantillon: 200 tubercules de pomme de terre
ou 25 à 100 boutures de Pélargonium
Lavage (optionnel)
>nombre
prévu ?
OUI
OUI
NON
Prévoir remarque
pour DG contrôle
≠
nombre
prévu ?
OUI
Symptômes/
pourriture ?
Examen visuel
NON
Dénombrement
Créer un bis
avec les
tubercules/
boutures
atteint(e)s
NON
Prélèvement des talons/
segments de tige
Suivre les
instructions de la
DG contrôle si
présentes sinon
sélectionner 200
tubercules ou 100
boutures au
hasard
Symptômes/
pourriture ?
OUI
Créer un bis
avec les
tubercules/
boutures
atteint(e)s
NON
Extraction et concentration des bactéries
Screening Etalement sur
SMSA
Extraction d’ADN
et Screening PCR
Observation de la
morphologie des
colonies
PCR positive ?
Séro-agglutination
(guide)
OUI
OUI
NON
Colonies
typiques ?
NON
Echantillon
non suspect
au screening
Etalement
Echantillon
non suspect
au screening
PCR
Echantillon
CONFORME
NON
Refaire
PCR
PCR
positive ?
NON
OUI
Ré-étalement
sur SMSA
Colonies
typiques ?
OUI
OUI
Confirmation au LNR
(envoi macérat + culture
sur YPGA)
Repiquage sur
YPGA et PCR sur
colonies
PCR
positive ?
NON
NON
Présence de la
bactérie confirmée
?
OUI
Echantillon NON
CONFORME
Echantillon
suspect au
screening
PCR
Echantillon
suspect au
screening
Etalement
LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 10/10