Genetika v biotechnologiích

G E N E T I KA
APLIKOVANÁ V BIOTECHNOLOGIÍCH
JAN IPSER
Studijní opora pro posluchače navazujícího magisterského studia biologie v kombinované
formě na Přírodovědecké fakultě Univerzity J. E. Purkyně v Ústí nad Labem
ÚVODNÍ POZNÁMKA
Vážené studentky a studenti,
dostává se vám do rukou studijní opora k předmětu Genetika aplikovaná v
biotechnologiích. Je určena vám, frekventantům kombinované formy navazujícího
magisterského studia biologie, realizovaného na Přírodovědecké fakultě Univerzity J. E.
Purkyně v Ústí nad Labem.
Záměrem autora bylo poskytnout pro vám sylabus a základní informace k obsahové náplni
tohoto kurzu, doplněné odkazy na dostupnou odbornou literaturu a další, zejména internetové
zdroje k vašemu samostudiu.
Kurz Genetika aplikovaná v biotechnologiích je organizován ve formě konzultací, v jejichž
průběhu se seznámíte se základy genetiky mikroorganizmů, rostlin, živočichů a člověka,
přičemž
budou
akcentovány
molekulárně-genetické
biotechnologické, šlechtitelské, plemenářské
metody
a medicínské.
a
aplikační
aspekty
Principy moderních metod
buněčné a molekulární biologie byste si měli osvojit tak, abyste se v nich dostatečně dobře
orientovali a případně je byli schopni adekvátně a efektivně použít při vlastní experimentální
práci.
Pro zdárné zvládnutí tohoto kurzu se předpokládají základní znalosti z obecné genetiky,
mikrobiologie, buněčném a molekulární biologie, které jste získali v průběhu vašeho
předchozího studia v příslušných předmětech anebo jinou formou. Pro účely zopakování nebo
rozšíření učiva odkazuji na vhodnou literaturu.
Opora tedy není koncipována jako ucelený učební text. Může být chápána pouze jako
vodítko k probíraným tématickým celkům.
Dovoluji si upozornit, že elektronická verze studijní opory Genetika aplikovaná v
biotechnologiích je určena výhradně pro vaše osobní studijní účely a nesmí být dále
rozšiřována (kopírována).
Přeji vám hodně úspěchu ve studiu zvoleného oboru. V případe potřeby se neostýchejte
využít
všech
dalších
obvyklých
a
dostupných
forem
komunikace
(elektronické,telefonické, osobní) nad rámec uskutečněných konzultací.
Autor
s vyučujícím
SYLABUS
I. Genetika rostlin
Genetické důsledky různých způsobů rozmnožování rostlin. Genom rostlin (jaderný genom;
cytoplazmatické genomy – mitochondriální, chloroplastový; vzájemné vztahy; replikace,
transkripce, translace a regulace genové exprese; evoluce genomů rostlin). Genetika
fotosyntézy. Genetika fixace molekulového dusíku a nif geny. Mutace a metageneze u rostlin.
Speciální genetika rostlin (inkompatibilita, cytoplazmatická sterilita, rezistence, genetika
fotosyntézy, nif geny a fixace molekulového dusíku). Genové zdroje a původ kulturních
rostlin; centra původu. Genetické základy šlechtění (šlechtitelský materiál, typy šlechtění).
Genetika rostlinné somatické buňky. Explantátové kultury. Genové manipulace u rostlin.
II. Genetika živočichů a hospodářských zvířat.
Genetika živočišné buňky (genom jaderný a mitochondriální). Buněčné kultury. Mutace a
mutageneze v živočišných buňkách in vivo a in vitro. Oplození in vitro. Transgenoze,
transgenní zvířata. Základy plemenitby. Dědičnost kvantitativních znaků, heritabilita,
koeficient příbuznosti, selekční indexy, rodokmeny a plemenné knihy. Inseminace. Oplození
in vitro. Transgenoze, transgenní zvířata.
III. Genetika člověka
Genealogie, studium dvojčat, příbuzenské sňatky a incest. Genetické poradenství. Prenatální
genetická
diagnostika
(amniocentéza,
biochemické,
cytologické,
cytogenetické
a
molekulárně-genetické vyšetření). Molekulární patologie. Genová terapie.
IV. Genetika mikroorganizmů.
Genetika virů. Genetika bakterií. Genetika hub. Mikroorganizmy v biotechnologiích
(potravinářství, zemědělství, farmaceutický průmysl, ekologie a péče o životní prostředí).
Mikroorganizmy jako nástroje genového inženýrství.
V. Metody molekulární genetiky
Izolace, purifikace a kvantifikace nukleových kyselin. Hybridizace nukleových kyselin.
Amplifikace DNA. Profilování a sekvenování DNA. Molekulárně genetický polymorfizmus
(SNP, STR) a jeho využití v praxi: fingerprinting, RAPD, RFLP, profilování, identifikace
biologického materiálu.
Základní literatura:
Campbell, N. A., Reece, J. B.: Biologie. Computer Press, a. s. : Brno 2006
Hatina, J., Sykes, B.: Lékařská genetika. Academia : Praha 1999
Křeček, J.: Jedinec: gen – prostředí – vývoj. Academia : Praha 2007
Snustad, D. P., Simmons, M. J.: Genetika : Masarykova univerzity: Brno 2009
Šilhánová, L.: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia : Praha 2008
POZNÁMKY K JEDNOTLIVÝM TÉMATŮM
GENETIKA ROSTLIN
ROZMNOŽOVÁNÍ ROSTLIN
AMIXIS • nepohlaví; kořenové hlízy, oddenky, stonkové hlízy oddenkové a bazální, cibule,
cibulky;
• pupenové variace (=sporty) = mutace (spontánní v iniciálách pupenů) v určitém
sektoru pletiva nebo v určité buňce ~ stálost klonů při amixi není basolutní; pupenové variace
se využívají pro vyšlechtění nových odrůd ovocných stromů, okrasných dřevin a zelenin.
Takto lze množit (roubování, očkování) vysoce heterozygotní odrůdy, které by jinak
(rozmnožováním sexuálním) štěpily ve velký počet různých genotypů.
• vegetativní množení se ve šlechtitelství používá jako následná metoda pohlavního
rozmnožování k udržení heterozygotnosti, dále ke zvýšení podílu rostlin jednoho pohlaví
v populaci (př. samičí rostliny palmy datlové), nebo k odvození klonů bez patogenů
prostřednictvím technik explantátovýck kultur
AMFIMIXIS • pohlavní rozmnožování; gametofyt (→ gamety – 1n) + sporofyt (→
megasporangia → megaspory + mikrosporangia → mikrospory)
APOMIXIS • nepohlavní rozmnožování semeny, při kterém nový jedinec vzniká bez splynutí
gamet (tj. bez syngamie) a tedy nevyvíjí se ze zygoty.
• gametofytická apomixe (diploidní partenogeneze): neoplozená vaječná buňka
(2n) buňka vytváří embryo
adventivní embryonie: embrya a nové sporofyty vznikají ze somatických
vajíček (obvykle z nucellu nebo integumentů, tedy z buněk, které sousedí
bezprostředně se zárodečným vakem; vývoj embrya může být závislý na
stimulaci opálením (pseudogamie)
haploidní partenogeneze: haploidní (1n) zárodek vzniká buď z neoplozené
vaječné buňky (gynogeneze), anebo z mikrospory (adrogeneze)
• využití apomixe ve šlechtění: fixace heteroze, snadnější udržování
rodičovských linií, výběr a udržování apomiktických hybridů u vzdálené hybridizace, fixace
amfiploidního stavu mezidruhových hybridů, získání čistých homozygotních linií diploidizací
haploidů
ALOGAMIE
• mechanizmy zabezpečující cizosprášení
a) prostorové rozdělení pohlavních orgánů
b) dichogamie = časově asynchronní dozrávání prašníků a schopnosti blizny přijmout pyl
• 2 formy • protandrie – pyl dozrává dříve
protogymie – blizna dozrává dříve
c) uzpůsobení květu – př. blizna uložená uvnitř květu ve člunku (př. tolice vojtěška)
AUTOGAMIE
• implikace ve šlechtění: kastrace oboupohlavních květů (mechanická, chemická, genetická),
sběr pylu a opálení cizím pylem ~ izolace květtů a selektivní sběr plodů a semen
• genetika populací převážně autogamiích druhů rostlin – viz kurs Genetika
ROSTLINNÝ GENOM
• jaderný
cytoplazmatický • mitochondriální
• chloroplastový
CHLOROPLASTY
- kompletní translační systém; kooperace mezi jaderným a chloroplastovým geonomem při
biogenezi chloroplastů; některé chloroplastové bílkoviny (nebo jejich podjednotky) jsou
kódovány jaderným a některé chloroplastovým genomem. Značná část polypeptidů
chloroplastů je kódována jadernými geny a syntetizována na cytoplazmatických ribozomech;
peptidy jsou pak transportovány do chloroplastů posttranslačním mechanizmem. Vlastní
genetický systém chloroplastů je pro jejich chloroplastů esenciální; polypeptidy a molekuly
RNA kódované ctDNA fungují (pouze) uvnitř této organely. Syntéza, transport a sestavení
většiny peptidů chloroplastů se realizuje na světle i ve tmě (avšak světlo vykazuje stimulační
efekt na různých úrovních).
- ctDNA: kružnicová, cca 30 – 200 kopií ctDNA /chloroplast; obsahuje sekvence kódující
rRNA a tRNA, geny pro velkou podjednotku RUBISCO, geny pro podjednotky ATP-syntázy
a cytochrom f.
= chloroplastová genom je podobný prokaryotickému (chloroplastové geny neobsahují
introny, mRNA nebývá polyadenylována, senzitivita k chloramfenikolu jako inhibitoru
prokaryotické genové exprese, ribozómy 70S – blíže viz endosymbiotická teorie)
MITOCHONDRIE
• mtDNA kružnicovitá nebo lineární; cca 200 – 2 500 kb (< 1% celkové DNA)
• genom prokaryotického typu (ribozomy ~ 70S); odchylky od univerzálního genetického
kódu
• hlavní produkty: 3 podjednotkycytochrom-c-oxidázy, 2 podjednotky ATPáza citlivé
k oligomycinu, nekteré komponenty mitochondriálních ribozomů; souvislost mtDNA s CMS
SAMČÍ STERILITA
• GENOVÁ • většinou determinována jedním recesivním genem; kontrolována sporofytem
• udržování linií ms ms:
ms ms x Ms ms → Ms ms : ms ms
Rozlišení genotypů pomocí signálního genu v silné vazbě s genem samčí
sterility.
Zdroj: www.bioweb.genezis.eu/?cat=7&file=rastliny
• CYTOPLAZMATICKÁ • kontrolována výlučně plazmatickými faktory (mitochondie,
plastidy) ~ rostliny s plazmotypem s faktory (S) a s plazmotypem s faktory (N) neboli (F).
• pylová sterilita se přenáší pouze po mateřské linii (tzn. pylově
sterilní potomstvo se tvoří pouze na rostlinách pylově sterilních).
• udržování cytoplazmatické sterility:
• CYTOPLAZMATICKO – GENOVÁ • existují rostliny s plazmotypem S a N (resp. F);
plazmotypy spolupůsobí s jedním (nebo více) párem alel, z nichž jedna alela (většinou
recesivní, označovaná symbolem ms nebo rf) je plazmo-senzitivní a s plazmoptypem S dává
pylově sterilní rostliny. Dominantní alela Ms (= Rf) obnovuje s plazmotypem S fertilitu, tzn.
je to obnovitel (restorter) samčí pylové fertility ⇒ potomstvo pylově sterilní rostliny nemusí
být nutně rovněž sterilní.
• využití: genetická kastrace
obnovení fertility
výroba víceliniových hybridů
Zdroj: www.bioweb.genezis.eu/?cat=7&file=rastliny
INKOMPATIBILITA U ROSTLIN
• samičí i samčí gamety jsou funkční, ale z genetických příčin není možné oplození (srovnej:
sterilita – gamety nejsou funkční z genetických příčin)
• velmi rozšířený jev; hlavní funkce: (1) zabránění inbrídinku
(2) zajištění cizosprášení
• inkompatibilita • gametofytická • typ Nicotiana = inkompatibilita mezi 1n genomem
pylového zrna a 2n geonomem pletiva pestíku či čnělky
(kterou prorůstá pylová láčka)
• inkompatibilní systém haploid – haploid = subtyp typu
Nicotina, ale inkompatibilita nastává v zárodečném vaku
• sporofytická • reakce pylového zrna je podmíněna 2n genotypem pletiva
somatického, ve kterém pyl vzniká.
• inkompatibilita • homomorfní
• heteromorfní
-
vztahuje se pouze k morfologii květu
EXPLANTÁTOVÉ KULTURY
• živná média • pevná (solidní)
• tekutá (likvidní)
• kultivace • stacionární
• průtoková • chemostat
• turbidostat
• růst a růstová křivka
• explantát • kořen, stonek, list – 2n
• endosperm – 3n
• prašník, plodolist – 1n
← mikropropagace in vitro ~ regenerace → regenerant
• kalusová kultura: indukce orgánů (růstové faktory – NAA, IAA, GA3, BAP) → regenerant
• protopalstová kultura: buněčná suspenze
↓ celulóza, celobiáza, pektináza
protoplasty ← transgenoza; izoosmotické prostředí
↓ hybridizace (PEG, elektroporace)
hybridy (intraspecifické, interspecifické)
↓
regenerace ( kalus; orgány – nadzemní + podzemní)
↓
regenerant
• aplikace • šlechtění: vzdálená hybridizace, odvození čistých linií, mutační a rezistenční
šlechtění
• ochrana fytogenofondu
• genové manipulace, GMO
REZISTENCE PROTI PATOGENŮM
• oboustranný vztah mezi hostitelem a patogenem
Porovnání tzv. klasického šlechtění se šlechtěním založeným na genových manipulacích
Klasické metody (křížení)
rekombinuje velký počet
genů
ovlivněno mnoho znaků,
obvykle časově náročná
selekce
nízká predikční schopnost
introdukce velkého počtu
genů
Somatická hybridizace
rekombinuje mnoho genů
Rekombinantní DNA
rekombinují jednotlivé geny
ovlivněn menší počet znaků,
selekce časově méně náročná
a specifičtější
vyšší predikční schopnost
introdukce omezeného počtu
genů
ovlivněn pouze jeden nebo
několik jednotlivých znaků,
vysoce specifická selekce
vysoká predikční schopnost
introdukce jednoho určitého
genu
(nebo
několika
jednotlivých genů)
převážně šlechtění v rámci převážně šlechtění v rámci možný přenos genů mezi
druhu, příp. evolučně blízce druhu, ale
je možná i evolučně velmi vzdálenými
příbuzných
interspecifická
(vzdálená) („nepříbuznými“) taxony
hybridizace
KLASICKÉ (KONVENČNÍ) ŠLECHTĚNÍ
• omezeno na přirozené procesy, umožňující diverzifikaci rostlin (šlechtitelského materiálu) a
křížení (reprodukce) vnitrodruhové, resp. blízce příbuzných druhů
• častá sterilita (snížená fertilita) a snížená vitalita interspecifických (obecně vzdálených)
hybridů (← k tomu uvažte vztahy a důsledky, které z nich vyplývají: w = f · v; w = 1 – s).
• přenos všech (nebo většiny) genů od rodičů na potomky, tedy i těch, které nejsou z hlediska
stanovených konkrétních šlechtitelských cílů žádoucí
• nutné zpravidla časově a materiálově náročné systémy zpětného křížení a selekce
požadovaných genotypů
• termíny: druh – populace - odrůda (varieta, rasa) – kultivar – čistá linie – rodina – klon
inzucht (inbrídink): koeficient příbuznosti
Populace – soubor jedinců určitého druhu se společným genový (gametovým) fondem
SOMATICKÁ HYBRIDIZACE (FÚZE PROTOPLASTŮ)
• izolace protoplastů (celulóza, celobiáza) – v kultivačním prostředí musí být zajištěny
izoosmotické poměry (není buněčná stěna) a zamezeno resyntéze (rekonstrukci) buněčné
stěny – kultivace v tekutém médiu (suspenze ptoroplastů)
• navození fúze (PEG)
• somatická fúze:
a) přenos neklonovaných větších částí genetické informace (částí geonomů, příp. celých
geonomů)
b) možná i mezi evolučně vzdálenými taxony, mezi nimiž existuje v přírodě reprodukční
bariéra
c) hybridní buněčná jádra obsahují genetický materiál fúzujících buněk (protoplastů)
d) restrukturace genomu (přestavby chromozomů, eliminace části genomu původních
fúzujících protoplastů, vznik nového karyotypu apos.) somatického hybrida
e) v některých případech (jsou-li fúzanti produkty fúze protoplastů téhož druhu nebo hybridy
blízce příbuzných taxonů) je možná jejich regenerace (totipotence):
protoplasty → fúze → somatický hybrid → buňka somatického hybrida (regenerace buněčné
stěny) → regenerace → regenerant: projev totipotence
• metodou fúze protoplastů lze rekombinovat genetický materiál partnerů, kteří se
za přirozených podmínek nemohou křížit (inkompatibilita) a přenést tak značnou část
neklonované genetické informace (genomu) mezi zástupci vzdáleně příbuzných taxonů. Ještě
před fúzí je možné inaktivovat část genomu některého partnera, čímž lze omezit přenos
celého genomu fúzujících partnerů a zvýšit pravděpodobnost přenosu požadovaných genů.
MOLEKULÁRNÍ ŠLECHTĚNÍ
• problémy:
a) relativně malý počet izolovaných a přesně definovaných genů
b) užitkové znaky jsou většinou znaky kvantitativní, tedy polygenně založené ~ participace
jednoho genu na determinaci a fenotypovém projevu znaku je (zpravidla) velmi malá ~
účinnost přenosu takového genu je z hlediska šlechtitelských cílů (výnos apod.) značně
limitovaná, protože přenos většího počtu jednotlivých polygenů je téměř nemožný. Obtížná je
už sama identifikace a detekce takovýchto genů (← uvědomme si vztahy: VP = VG + VE;
VG = VA + VD + VI; VE = VEt + VEp; h2 = VG / VP, resp. h2 = VA / VP)
• transgenní rostliny: ve svém genomu obsahují jeden nebo několik genů pocházejících
z jiných (nepříbuzných) druhů a vnesených do něho člověkem prostřednictvím metod
genových manipulací (rekombinantní DNA apod.)
a) introdukce rezistence vůči virům: rezistence je založena na inzerci a manifestaci části
virového genomu (př. projev proteinu obalu viru obvykle znemožňuje nebo omezuje infekci
rostliny příslušným virem)
b) rezistence vůči herbicidům a insekticidům
c) transgenní rostliny a fytoremediace: fytoextrakce, fytoakumulace (př. N. tabacum: gen
z kvasinek
pro
metalothionein
CUP
s histidinovou
kotvou
-
akumul,ace
Cd),
fytotransformace (transgeny pro metalothioneiny – vazba těžkých kovů; biotransformace,
bioprecipitace, biosorpce), fytovolatizace, fytostimulace, rhizofiltrace, fytostabilizace; využití
rostlin k zachycení, akumulace a eliminace kontaminantů životního prostředí.
Agrobacterium tumefaciens
• transformace
• vnáší své specifické geny lokalizované na části plazmidu Ti (příp. Ri) do rostlinného
genomu
• T-DNA (transferred DNA) = konstantní část plazmidů Ti (resp. Ri). T-DNA obohacuje
rostlinný genom
(1) o geny, které navozují nové biosyntetické dráhy auxinů a cytokininů, které způsobí
dediferenciaci rostlinných buněk a transformovaná pletiva pak vytvářejí nediferencované
nádory, tzv. crown-galls
(2) o geny pro syntézu nádorově specifických látek (tzv. opiny – ty jsou zdrojem C, N a
energie pro A. tumefaciens; existují 2 typy plazmidů i nádorů: oktopinový a nopalinový)
• používá se ke včleňování klonovaných genů do genomu rostlin
TRANSPOZONY
• transpozon = transponovatelný úsek DNA
• McClintocková (50. léta 20. st.): nestabilní mutace mohou být způsobeny inzercemi nebo
excizemi transponovatelných elementů do genu a z genu. Na systému kontrolních elementů u
kukuřice (aktivátor – disociátor, Ac – Ds) demonstrovale, že tyto elementy jsou krátké úseky
DNA, které se mohou v genomu přemísťovat (transponovat). Autonomí (regulátorové)
elementy jsou geneticky nestabilní, jsou schopné navodit excizi a transpozici vlastní
i
elementů neautonomních. Neautonomní (receptorové) elementy jsou v genomu stabilní
za nepřítomnosti autonomního elementu; transponují se pouze za jeho přítomnosti. Začlenění
transpozonu do lokusu některého genu na chromozomu může rezultovat ve vznik nestabilní
alely .
Zjistila, že jsou odpovědné za jisté mutace typu adice, delece nebo translokace. Některé
mutace byly nestabilní; to lze vysvětlit tak, že inzercí transpozonu do určitého genu vznikla
přímá mutace a jeho pozdější excizí se obnovil původní fenotyp (zpětná mutace). Příkladem
může být mutantní alela bz-m1, vzniklá vlivem transpozonu z dominantní alely Bz, která se
fenotypově projevuje odlišně (hnědě) zbarvenou aleuronovou vrstvou obilky. V buňkách,
ve kterých došlo k excizi transpozonu, se fenotypově projeví dominantní alela Bz.
Uskutečněné excize a transpozice transpozonů v buňkách různých částí obilky se v tomto
případě projeví jako odlišně zbarvené sektory obilky. Vysoká frekvence excize a transpozice
některých transpozonů (autonomních) má za následek genetickou nestabilitu příslušného
znaku, naopak
velmi nízká frekvence excize a transpozice jiných
(neautonomních) má
transpozonů
za následek relativně vysokou genetickou stabilitu příslušného
znaku.
• mohou se inzerovat do různých míst na chromozomech a způsobovat rozličné chromozomální
přestavby ~ transpozony jako vlastní mutageny. Například včlenění transpozonu do exonu může
vést k syntéze změněného genového produktu; včlenění transpozonu do intronu může mít za
následek chybné (odlišné) posttranskripční úpravy, které též mohou vést k syntéze
změněného genového produktu; mezera, vzniklá po excizi transpozonu, může být chybně
reparována; transpozon v místě inzerce může vést ke vzniku inekválního crossing-overu při
meióze a tak by bylo možné pokračovat dále. Současně lze připustit, že některé ze změn v
genomech, vyvolaných transpozony, se mohly významně uplatnit v evolučním procesu.
• transpozice = přemístění úseku DNA z donorového místa do recipientního v mezích
genomu jedné buňky, které není způsobeno mutací, ani meiotickou nebo mitotickou
rekombinací.
• klasifikace transpozonů:
a) retrotranspozony – obsahují reverzní transkriptázu, integrázu, na koncích mají LTR. Do
této skupiny se řadí i retrosekvence (= cDNA-geny), které však nemají reverzní
transkriptázu, integrázu, ani LTR; představují repliku určitého transkribovaného genu
(donorového místa) bez intronů. Je-li produkt exprese retosekvence identický (či téměř
identický) s produktem původního genu, označuje se taková retrosekvence jako retrogen;
není-li tomu tak, označuje se jako retropseudogen (např. Alu-sekvence).
b) retropozony – obsahují reverzní transkriptázu a integrázu, nikoli LTR.
c) P-elementy - vhodný nástroj přenosu genů. Do P - elementu je možné vpravit určitý
gen, takto upravený P - element (vektor) injikovat do zárodku v raném stadiu vývoje a
po jeho včlenění do genomu zárodku získat transgenního jedince.
d) Tn-elementy – obsahují gen pro transponázu a strukturní geny, které kódují enzymy
inaktivující antibiotika. Bakterie s Tn – elementy, umístěnými v bakteriálním chromozomu
nebo v plazmidech, jsou na příslušná antibiotika rezistentní. Na vysoké rychlosti šíření
rezistence bakterií na antibiotika se významně podílí přenos takovýchto plazmidů mezi
bakteriálními buňkami.
e) MITE (miniature inverted-repeat transposable elements) – velmi krátké repetitivní
sekvence. Např. u rýže má MITE následující uspořádání a jsou popsány případy, kdy inzerce
MITE do určitého genu vedla ke stabilní změně jeho fenotypového projevu ve smyslu mutace:
5´GGCCAGTCACAATGG......400 nukleotidů......CCATTGTGACTGGCC 3´
3´CCGGTCAGTGTTACC ......400 nukleotidů......GGTAACACTGACCGG 5´
Internetové zdroje:
http://daffodil.plantbio.uga.edu/~kelly/courseInfo/3210/review.pdf - Mobile Elements: Drivers
of Genome Evolution
http://daffodil.plantbio.uga.edu/~kelly/courseInfo/PBIO8820/Lippman_et_al_2003.pdf
Transposoon silencing.
-
MOLEKULÁRNÍ GENETIKA
NUKLEOVÉ KYSELINY
Izolace DNA a RNA. Purifikace a kvantifikace izolovaných nukleových kyselin. Hybridizace
nukleových kyselin. Molekulární (DNA) sondy. Rekombinantní DNA. Amplifikace DNA –
PCR (princip, typy PCR).
Izolace nukleových kyselin
Nukleové kyseliny lze izolovat z degradovaných (lyzovaných buněk):
1. homogenizace tkáně (pletiva, tkáňové kultury – mechanická homogenizace biologického
objektu zmrazeného tekutým dusíkem, vortexování se skleněnými kuličkami)
2. odstranění (degradace) buněčné stěny (bakterie, rostliny, houby)
3. rozvolnění buněk (proteináza K) a lýze buněk - hypotonace (živočišných buněk nebo
protoplastů)
4. degradace biomembrán a denaturace proteinů (natriumlausylsulfát, N-laurylsarkozin,
TritonX-100)
5. uvolnění buněčného obsahu do pufru s EDTA (~ chelatace: vyvázáním Ca2+ se inhibuje
aktivita nukleáz, jejichž kofaktore jsou tyto ionty)
1. organická (fenol-chloroformová) extrakce:
• směs fenol : chloroform : izoamylalkohol – fáze vodní (obsahuje NK) a chloroformová
(látky rozpustné v nepolárních rozpouštědlech), na rozhraní obou fází vrstvička proteinů; při
izolaci NK z buněk rostlin, hub a některých bakterií nutno ještě extrahovat polysacharidy
(extrakcí s CTAB /cetyltrimetylamoniumbromid/). Po extrakci se nukleové kyseliny vysrážejí
etanolem a poté rozpustí ve vodě; lze deponovat při teplotách kolem -40◌ْ C.
2. adsorpce na silikát
• adheze nukleových kyselin na silikátový povrch v přítomnosti chaotropních solí (NaI,
guanidin)
3. chelexová metoda
• Chelex 100 = chelatační styren-divinylbenzenová pryskyřice; polární chelexové částice
vyvazují polární buněčné komponenty, nukleové kyseliny zůstávají v roztoku mimo
chelexové částice, odkud se oddělí ultracentrifugací.
Štěpení nukleových kyselin
HYDROLÝZA (ŠTĚPENÍ) NK • NEENZYMOVÁ • ALKALICKÁ
• KYSELÁ
- v mírně kyselém prostředí
- v silně kyselém prostředí
• ENZYMOVÁ
• EXONUKLEÁZY
• ENDONUKLEÁZY
- α-enzym (α – endonukleáza)
- β-enzym (β – endonukleáza)
- restrikční
Alkalická hydrolýza
Alkalickou hydrolýzou mohou být štěpeny pouze (poly)ribonukleotidové řetězce (RNA),
protože k jejímu uskutečnění je nutná přítomnost OH-skupiny v poloze C2´. Tuto
podmínku splňuje ribóza, nikoli deoxyribóza a proto DNA je alkalirezistentní.
Alkalická hydrolýza probíhá v těchto krocích:
1) v hydrolyzovaném polyribonukleotidovém řetězci dochází k přesunu fosfodiesterové
vazby z polohy C5´ následujícího ribonukleotidu na C2´ téhož ribonukleotidu
2) tím se uvolní koncový ribonukleotid a vznikne cyklický 2´:3´-ribonukleotidfosfát
3) z cyklického 2´:3´-ribonukleotidfosfátu posléze vznikne směs 2´- a 3´-ribonukleotidfosfátů.
Kyselá hydrolýza
A. v mírně kyselém prostředí
Při hodnotě pH ~ 3 se štěpí β-glykozidové vazby purinových (deoxy)ribonukleotidů a
vzniká tak apurinový poly(deoxy)ribonukleotid.
Je-li
k hydrolýze
použit
hydrazin,
vznikne
obdobným
selektivním
štěpením
glykozidových vazeb apyrimidinový poly(deoxy)ribonukleotid.
B. v silně kyselém prostředí
Pro uskutečnění tohoto typu kyselé hydrolýzy se používá prostředí 6M HCl působící
při teplotě 175 °C. Za těchto podmínek se
a) nukleové kyseliny (RNA, DNA), resp. poly(deoxy)ribonukleotidové řetězce štěpí
na jednotlivé stavební komponenty a
b) cytozin se deaminuje na uracyl. Tato skutečnost musí být zohledněna při stanovení
poměru bazí v hydrolyzované nukleové kyselině, resp. polynukleotidovém řetězci.
GENOVÉ MANIPULACE
• založeny na přenosu
a) izolovaných genů (úseků DNA) technologií rekombinantní DNA
b) chromozomů a/nebo celých genomů fúzí buněk
Klonování
= pořizování kopií DNA in vitro
Mechanizmy klonování; nástroje klonování (vektory, konstrukty, linkery, adaptory, markery,
selekční prostředí).
Vektory:
• plazmidy, bakteriofágy, fasmidy (=fagmidy), kosmidy; umělé chromozomy bakteriální
(BAC = bacterial arteficial chromosome) a kvasinkové (YAC = trast arteficial chromosome).
Molekulární sonda
• úsek nukleové kyseliny (odpovídající např. určitému genu nebo jeho části) sloužící
k vyhledání komplementární sekvence ve zkoumaném vzorku
• je-li známa genetická informace (úsek DNA) determinující určitý znak, lze vyiizolovat
anebo syntetizovat komplementární DNA (deoxyribonukleotidový řetězec) a použít ji jako
sondu k detekci takové hledané genetické informace; detekce je založena na principu
hybridizace nukleových kyselin.
Hybridizace nukleových kyselin
• komplementární úseky jednotlivých (deoxy)ribonukleotidových řetězců (ssRNA, ssDNA)
vytvářejí dvouřetězcové útvary (dsDNA, dsRNA)
• hybridy: DNA – DNA, RNA – RNA, DNA – RNA
Přirozená rekombinace molekul DNA
• mechanizmus rekombinace = crossing – over
• rekombinace • meiotická – výměna nesesterských chromatid; rys gametogeneze; rozšíření
genetické variability
• mitotická (somatická) – výměna sesterských chromatid (SCE), harlekýnské
chromozomy
• konjugace – bakterie; kmeny F+, F-, Hfr; konjugativní plazmid; stav plazmidu
(autonomní, integrovaný)
• transdukce – bakterie; transdukující (temperovaný) fág; lytická a lyzogenní
infekce; fág - profág (virus - provirus)
• transformace
• transpozice – transpozony; mutace x transpozice; mutageny x transpozony
Technologie rekombinantní DNA
• metody (postupy), kterými lze získat nové varianty DNA, které v organizmech přirozenou
cestou nevznikají, resp. se nevyskytují a pravděpodobnost jejich vzniku (výskytu) je prakticky
nulová
• využívají se při přípravě GMO
cDNA
• kopírovaná molekula DNA
• získává se prostřednictvím reverzní transkripce molekuly mRNA (pro určitou bílkovinu)
reverzní transkriptáza
mRNA -------------------------→ cDNA
a) reverzní transkriptáza katalyzuje syntézu řetězce DNA podle vlákna mRNA (funguje jako
templát)
b) v reakční enzymatické směsi je syntetizován řetězec DNA komplementární k již
nesyntetizovanému řetězci DNA podle mRNA jako matrice a současně je degradováno toto
původní vlákno mRNA
c) spojením obou řetězců DNA vzniká cDNA
• cDNA neobsahuje intronové sekvence ⇒
a) je (zpravidla) kratší než původní gen
b) při zavádění (inzerci) cDNA do recipientní buňky není třeba současně vnášet (nebo jinak
zajišťovat) mechanizmu pro odstranění intronů
Enzymy
• nukleázy
a) exonukleázy
Exonukleázy jsou enzymy, které katalyzují hydrolýzu fosfodiesterových vazeb
poly(deoxy)ribonukleotidových řetězců buď od jejich 3´-konce, nebo od jejich 5´-konce.
Podle toho se rozlišují 3´-exonukleázy a 5´-exonukleázy.
b) endonukleázy
Endonukleázy jsou enzymy, které katalyzují štěpení fosfodiesterových vazeb v určitých
místech uvnitř poly(deoxy)ribonukleotidových řetězců za vzniku oligo(deoxy)ribonukleotidů.
Endonukleázy jsou specifické
a)
vůči
pentóze
polynukleotidu
-
rozlišují
ribunukleázy
(RNázy)
deoxyribonukleázy (DNázy)
b) vůči místu fosfodiesterové vazby, ve kterém je štěpena – rozlišují se
• a-enzymy (neboli α-endonukleázy), které štěpí fosfodiesterové vazby blíže k C3´
za uvolnění nukelozid-5´-fosfátů (např. fosfodiesteráza z hadího jedu – je účinná
na RNA i DNA)
• b-enzymy (neboli β-endonukleázy), které štěpí fosfodiesterové vazby blíže k C5´
za uvolnění nukelozid-3´-fosfátů (např. fosfodiesteráza z hovězí sleziny; pankreatická
RNáza – štěpí v RNA b-vazby, pokud se na a-vazbu daného ribonukleotidu napojuje
pyrimidinový nukleotid; plísňová RNáza T1 – štěpí b-vazbu, pokud se na a-vazbu
daného ribonukleotidu napojuje purinový nukleotid)
c) vůči sekvenci nukleotidů v oblasti, která je štěpena - restrikční endonukleázy štěpí
dsDNA osově symetrické sekvence nukleotidů.
• polymerázy • DNA polymerázy – Taq polymeráza (Thermus aquaticus)
• RNA polymerázy
• restriktázy (restrikční endonukleázy)
a
Restrikční endonukleázy typu II: rozpoznávají obrácené repetice (inverted repeats);
na koncích štěpené molekuly vznikají komplementární jednovláknové kohezní úseky
(overhangs), které se za vhodných (fyziologických) podmínek mohou znovu spojit
vodíkovými vazbami mezi komplementárními bazemi; př. EcoRI
Zdroj: http://biologie.upol.cz/metody/Stipani%20DNA.htm
• reverzní transkriptáza
• ligázy • DNA-ligáza • katalyzuje syntézu fosfodiesterové vazby mezi hydroxylovou (OH-)
skupinou na C3´ molekuly jednoho a fosfátem na C5´ následujícího deoxyribonukleotidu
• při genových manipulacích se často používá DNA-ligáza fága T4,
která je schopna ligovat molekuly s kohezními i tupými konci.
KLONOVÁNÍ - SYSTÉM E. coli
• vektorem v tomto systému jsou plazmidy (atbr, těžké kovy, tvorba toxinů a bakteriocinů).
Některé plazmidy jsou konjugativní (tzn. že přecházejí z bakterie do bakterie). Vhodné jsou
menší plazmidy <= snáze se vnášejí do buňky, se sekvenují, mají často cílové místo jen pro
jeden RE.
• včlenění DNA nesmí narušit replikaci plazmidu; vzhledem k tomu, že pro replikaci in vitro
je zapotřebí jen malá část plazmidu, jsou možné rozsáhlé konstrukce.
• nejvíce se používají plazmidy s rezistencí na 2 ATB z důvodu snadné selekce
transformovaných buněk (← účinnost transformace, tj. vnesení plazmidu do bakteriální
buňky, je nízká, cca
1 z 104 – 106 buněk). Takovým plazmidem je plazmid pBR322
(tetracyklinr, ampicilinr) ← cizorodá DNA se vnese do jednoho z genů pro atbr, čímž je tento
gen rozrušen a tím se ztrácí rezistence na toto ATB, ale zůstává zachována rezistence pro
druhé ATB.
• druhou skupinu vektorů v systému E. coli tvoří fágy nebo jejich upravené deriváty:
a) charóny = cca 1/3 fága λ (~ 49 kbp) se dá nahradit cizí DNA, aniž by se tím narušila
schopnost jeho replikace (reprodukce)
b) cosmidy = plazmidy, do nichž byla vložena krátká sekvence DNA z fága λ označovaná
jako cos; DNA, která obsahuje tuto sekvenci, může být in vivo i in vitro
nasoukána do prekurzoru fágových hlaviček (pokud je její velikost 37 – 52 kbp) a připojení
fágových ocásků k naplněným hlavičkám je možné in vitro (je nutné pro infekci bakterií fágy)
– takto vytvořené pseudoviriony pak injikují svou DNA do bakterií s +/- 100%-ní účinností.
- mohou zavést podstatně delší fragment cizorodé DNA do hostitele
- jsou preferovány při tvorbě genových bank (knihoven) = soubor
bakteriálních klonů,ve kterých je ve formě klonovaných fragmentů obsažen celý genom
určitého organizmu. Z banky (knihovny) se žádaný klon (tj. klon obsahující příslušný
cizorodý gen) selektuje obvykle pomocí radioaktivně značených sond technikou hybridizace
(← sonda se připraví z mRNA pro příslušný protein reverzní transkripcí přepisem na cDNA).
K odlišení klonu pro určitý gen stačí několik desítek bp souvislé sekvence komplementární
k hledanému genu. Technicky se to provádí takto:
a) bakterie z genové banky (knihovny) se vysejí na plotny
b) bakterie se přenesou na nitrocelulózové filtry
c) kolonie se lyzují a DNA se fixuje na filtr
d) DNA se (alkáliemi) denaturuje a tím se zpřístupní pro detekci pomocí RA cDNA nebo
mRNA sondy
e) vazba sondy k příslušné kolonii se vizualizuje (např. autoradiograficky)
f) příslušný klon se izoluje z paralelní repliky
Přitom mohou nastat některé potíže (troubleshootings):
1. bakteriální buňky nejsou schopné provést sestřih a proto cizí gen musí být do
bakteriální buňky vnesen v souvislé sekvenci a proto je třeba ho rekonstruovat zpětným
přepisem z mRNA na cDNA a doplněním druhého vlákna DNA:
DNA (- řetězec) xxxxxxxxxxxx
mRNA
yyyyyyyyyyyy
DNA (+ řetězec) zzzzzzzzzzzzzz
zpětná
------------→ yyyyyyyyyyyy
transkripce xxxxxxxxxxxx DNA (- řetězec)
↓ replikace
zzzzzzzzzzzzz DNA (+ řetězec)
2. často nelze získat mRNA – v takových případech se využije aminokyselinové složení
proteinu → z něho se odvodí sled nukleotidů části genu + synteticky se připraví tato
sekvence, která slouží jako primer → reverzní transkriptáza přepíše na cDNA v jeho
přítomnosti informaci z těch molekul mRNA, které obsahují sekvenci komplementární
k primeru.
3. bakterie mají vlastní promotory pro zahájení vlastní transkripce a tzv. ShineDalgarnovy sekvence pro zahájení translace mRNA. Chybějí-li tyto signální sekvence,
exprese genu nenastane =>
a) cizí gen se musí včlenit do některého exprimovaného genu vektorové DNA ~> získá se tzv.
fúzní protein (= žádaná bílkovina ve formě chiméry; z ní se pak odštěpí nepotřebné sekvence
na N- nebo C- konci).
b) ke klonovanému genu se připojí příslušné bakteriální signály
4. posttranslační úpravy – informace pro tyto úpravy není obsažena v klonovaném genu a
v bakteriální buňce k nim nedochází
5. bakterie obsahuje proteázy, které mohou vytvořený peptid destruovat (zlikvidovat) nebo
změnit tak, že pozbude biologickou aktivitu <=> výhoda bakteriálních mutantů neschopných
takové enzymy tvořit
6. tvorba a hromadění produktu vneseného genu neposkytuje bakteriální buňce žádnou
selekční výhodu, avšak buňka spotřebovává mnoho energie ~>~> bakteriální buňky mohou
pozbýt schopnosti dobrého růstu
7. signální sekvence na N-konci vytvořeného peptidu, které umožňují transport polypeptidu
eukaryotní buňky. Eukaryotní sekvence není jako taková rozpoznána bakteriální buňkou ~> a
proto vzniklý polypeptid není vylučován, signální sekvence není odštěpena a tím nevzniká
funkční bílkovina → řešení problému:
a) izolace produktu z buněk a odstranění signálních sekvencí
b) nahrazení eukaryotního signálního peptidu sekvencí kódující bakteriální signální peptid.
Z bodů (1) – (7) vyplývá snaha nahradit bakterie eukaryotními buňkami (např.
ve kvasinkách se podařilo připravit vakcínu proti hepatitidě B – kvasinky tvoří povrchový
antigen HBV, ale i protein, který vytváří částice podobné těm, které se nacházejí v krvi nosičů
HBV).
Schéma postupu použitého při klonování ovce Dolly:
Internetové zdroje:
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/cloning.shtml - Cloning fact
Sheet
http://en.wikipedia.org/wiki/Cloning - Klonování:vymezení pojmu
http://learn.genetics.utah.edu/units/cloning/ - Cloning in Focus
http://www.religioustolerance.org/cloning.htm - Klonování a náboženství (etika).
http://learn.genetics.utah.edu/units/cloning/cloningornot/ - Test na klonování (s ilustracemi a
animací).
http://library.thinkquest.org/24355/data/questionnairenav.html - Test z klonování (písemný).
http://learn.genetics.utah.edu/units/cloning/clickandclone/ - Interaktivní klonování myši.
http://www.dnalc.org/cloning.html - Animace klonování s výkladem.
http://www.vuhs.org/apbio/clone/dolly.htm - Animace postupu klonování.
http://library.thinkquest.org/24355/data/createnav.html - Interaktivní animace klonování
s legendou.
http://library.thinkquest.org/24355/data/profilesnav.html - Willadsenova technika klonování.
http://library.thinkquest.org/24355/data/techniquesnav.html - Animace Roslinovy metody.
http://library.thinkquest.org/24355/data/techniquesnav.html - Animace techniky Honolulu.
http://library.thinkquest.org/24355/data/techniquesnav.html - Animace techniky
rekombinantních DNA.
http://library.thinkquest.org/24355/data/techniquesnav.html - Animace PCR.
http://www.vuhs.org/apbio/clone/intro.htm - Introduction to Cloning.
http://learn.genetics.utah.edu/units/cloning/cloningrisks/ - Rizika klonování.
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/cloning.html - MedLine Plus: cloning (řada odkazů na
odborné práce).
http://www.liebertonline.com/doi/pdfplus/10.1089/clo.2006.8.189?cookieSet=1 - Klonování a
svalová dystrofie: myší model.
http://library.thinkquest.org/24355/data/techniquesnav.html - Techniky MB+G (klonování
aj.).
http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e34/34a.htm - Genetic Engineering.
http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e34/1.htm - Principle of Action.
http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e34/2.htm - Genetic Manipulations.
http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e34/34.htm#ti – Interactions of Plants and
Plasmids – Genetic Engineering.
REGULACE GENOVÉ EXPRESE
• genetická informace se exprimuje prostřednictvím transkripce a translace. V buňkách
prokaryot i eukaryot jsou tyto procesy, včetně posttranskripčních a posttranslačních úprav,
regulovány. Regulace genové exprese je nezbytná pro normální fungování genomu. Uplatňuje
se např. v diferenciačních procesech při zapínání a vypínání určitých genů nebo genových
oblastí v průběhu ontogeneze; selhání těchto regulačních procesů může mít závažné negativní
až fatální důsledky (vrozené vývojové vady, poruchy imunity, maligní transformace, letalita
apod.). Mechanismy regulace genové exprese umožňují organizmu adekvátně reagovat na
některé změny vnějšího prostředí a jejich biologické účinky v organizmu; spolupodílejí se tak
na procesech morfogeneze a fyziologické adaptace.
• při regulaci transkripce se významně uplatňují regulační proteiny. Molekula regulačního
proteinu obvykle obsahuje specifické vazebné místo, kterým se naváže na určitou regulační
oblast DNA (např. na promotor), kde plní funkci regulátoru, tzn. účastní se regulace
příslušného děje (např. transkripce). Regulační protein může po vazbě na specifickou
regulační oblast DNA příslušný regulovaný proces stimulovat (např. navodí podmínky pro
činnost RNA-polymerázy) nebo inhibovat (např. navodí podmínky, za kterých činnost RNApolymerázy není možná); v prvním případě jsou regulační proteiny označovány jako
pozitivní, ve druhém případě jako negativní. Mnohdy je regulační funkce regulačního
proteinu podmíněna (nebo ovlivněna) navázáním efektoru na vazebné místo pro efektor
nacházející se na molekule regulačního proteinu. Následkem navázání efektoru
na regulační
protein může být konformační změna, která teprve buď umožní vazbu regulačního proteinu
na specifickou regulační oblast DNA (např. promotor) a realizaci jeho regulační funkce,
anebo naopak znemožní vazbu regulačního proteinu na specifickou regulační oblast DNA
(např. promotor) a realizaci jeho regulační funkce. V uvedených příkladech se jedná o
alosterické efektory, které mohou být pozitivní, jestliže v důsledku konformačních změn po
vazbě na regulační protein vedou k jeho navázání na příslušnou regulační oblast, anebo
negativní, jestliže v důsledku konformačních změn po vazbě na regulační protein vedou
k inhibici jeho vazby na příslušnou regulační oblast.
• některé formy regulace genové exprese se realizují na úrovni operonu. V této souvislosti je
významnou regulační oblastí operonu operátor. Za vhodných podmínek se na operátor váže
represor, který je možno definovat jako negativní protein kódovaný regulačním genem.
Následkem této vazby je změna prostorového uspořádání, která RNA-polymeráze znemožní
buď napojit se na promotor, anebo se z promotoru posunout dále ke strukturním genům
operonu; v obou případech se nerealizuje transkripce v rozsahu celého operonu, tj. všech
jemu příslušejících strukturních genů.
• s molekulami represorů mohou interagovat molekuly dalších dvou skupin látek s regulační
funkcí: induktory a korepresory. Vazbou induktoru na represor se projeví alosterický efekt,
jehož důsledkem je inaktivace represoru, tzn. neschopnost represoru navázat se na operátor;
jestliže tedy vazba represoru
na operátor rezultuje v zastavení transkripce operonu, potom
vazba induktoru na represor rezultuje v uvolnění represoru z operátoru a obnovu transkripce.
Je zřejmé, že induktor plní funkci negativního alosterického efektoru.
Vazbou korepresoru na represor se v důsledku alosterického efektu aktivuje represor; to
znamená, že represor nabyde konformace, v níž se může vázat na operátor a inhibovat
transkripci operonu. V takovýchto případech je tedy represor sám o sobě neaktivní, nemůže se
bez spojení s korepresorem navázat na operátor a reprimovat transkripci příslušného operonu.
Z uvedeného je zřejmé, že existují dva základní typy represorů:
(1) represory, které jsou aktivní samy o sobě a stávají se inaktivními reakcí s induktorem (jsou
inaktivovatelné induktorem),
(2) represory,
které jsou samy o sobě inaktivní a stávají se aktivními až reakcí
s korepresorem (jsou aktivovatelné korepresorem).
V souvislosti s tím rozlišujeme jednak regulaci operonu negativní, při níž dochází
k zastavení transkripce v důsledku navázání aktivního represoru na operátor, jednak regulaci
operonu pozitivní, při níž dochází k transkripci v důsledku uvolnění represoru z operátoru.
• Enzymová indukce se týká pouze tzv. inducibilních enzymů, jejichž biosyntéza je závislá
(na rozdíl od tzv. konstitutivních enzymů) na přítomnosti induktoru. Induktor je specifická
látka (např. substrát), která vede k produkci určitého enzymu. Jako příklad inducibilního
enzymu lze uvést β – galaktozidázu Escherichia coli, jejímž induktorem je laktóza. Bakterie
syntetizují tento enzym v hojném množství pouze v přítomnosti laktózy jako jediného zdroje
uhlíku v živném médiu; naopak, není-li laktóza v médiu přítomna jako jediný zdroj uhlíku a
je jím jiná látka, např. glukóza, je využívána ona a syntéza β – galaktozidázy ustává (resp. je
udržována na minimální bazální úrovni).
• Enzymová represe je založena na principu potlačení biosyntézy jednoho enzymu nebo více
enzymů některým z metabolitů (zpravidla konečným produktem) biosyntetické dráhy, v níž
se sám tento enzym (tyto enzymy) katalyticky uplatňuje (uplatňují). Represe v tomto
případě odráží kvantitativní zastoupení příslušného metabolitu, který funguje jako
korepresor. Zvýší-li se koncentrace korepresoru nad určitou hraniční mez, dochází
k enzymové represi; sníží-li se koncentrace korepresoru v důsledku jeho intracelulární
utilizace pod tuto hraniční mez, obnovuje se funkce příslušné biosyntetické dráhy.
• Katabolické represe -při katabolické represi je určitým substrátem potlačena biosyntéza
určitého enzymu i v přítomnosti induktoru. Tento typ regulace genové exprese můžeme
demonstrovat na již zmiňovaném případu indukce β – galaktozidázy v buňkách Escherichia
coli v přítomnosti laktózy
jako induktoru, je-li jediným zdrojem uhlíku; jestliže dalším
zdrojem uhlíku v živném médiu bude v dostatečné koncentraci glukóza, která je
metabolizována přednostně, resp. katabolity glukózy, bude syntéza β – galaktozidázy
reprimována. V mechanizmu katabolické represe se uplatňuje tzv. katabolický aktivační
protein (CAP), který zvyšuje afinitu promotoru k RNA-polymeráze poté, co se jako součást
komplexu s cAMP naváže v přítomnosti induktoru do oblasti promotoru. CAP v tomto
procesu plní funkci pozitivního regulačního proteinu, cAMP pozitivního alosterického
efektoru. V uvedeném příkladu katabolické represe syntézy β – galaktozidázy v přítomnosti
glukózy jako druhého substrátu (vedle laktózy) v živném médiu E. coli katabolity glukózy
inhibují syntézu cAMP, kterého se pak nedostává k vytvoření komplexu CAP – cAMP;
omezená dostupnost a tím i omezená možnost navázání komplexu CAP – cAMP do oblasti
promotoru vede k snížení až znemožnění vazby RNA-polymerázy na promotor a tomu
odpovídající inhibici až zástavě transkripce.
Enzymová indukce, enzymová represe a katabolická represe patří mezi formy regulace
genové exprese rozšířené a dobře známé zejména u bakterií.
• Atenuace - jiný způsob regulace transkripce u prokaryot je. Uplatňuje se
při ní tzv.
atenuátor, což je specifická oblast vedoucí sekvence DNA, jejíž určitý úsek funguje jako
předčasný terminátor transkripce některých operonů. Vyskytuje se např. v tryptofanovém
operonu E. coli.
• Striktní regulace - regulace exprese genů kódujících rRNA a tRNA u prokaryot je závislá
na dostupnosti aminokyselin z vnějšího prostředí. Za podmínek, kdy je syntéza tRNA a rRNA
pro nedostatek aminokyselin již zastavena, může syntéza mRNA ještě pokračovat.
• Protismyslová RNA (= antisense RNA) – u prokaryot účinný způsob regulace genové
exprese. Antisepse-RNA je transkript RNA komplementární k jiné molekule (nebo k části
molekuly) RNA, s níž se spojuje a tím inhibuje její funkci. Například u Escherichia coli
existuje protismyslová (antisense) RNA komplementární k mRNA, která je přepisem genu
pro transponázu; vznik hybridní molekuly RNA (mRNA x komplementární antisense RNA)
zabraňuje translaci této mRNA a tím inhibuje syntézu transponázy.
• V buňkách eukaryot existuje celá řada dalších způsobů regulace genové exprese. Vzhledem
k tomu, že molekulární mechanizmy jejich působení jsou tématy jiných předmětů (zejména
molekulární a buněčné biologie), nebudeme se jimi zde podrobně zabývat. Pouze
připomeneme některé z nich. Aktivátory iniciace transkripce umožňují zvýšit účinnost
transkripce nad bazální hodnotu tím, že se váží se základními transkripčními faktory při
formování preiniciačního komplexu a přispívají k jeho větší stabilitě. Některé aktivátory při
interakci se základními transkripčními faktory nepůsobí přímo, ale prostřednictvím dalších
proteinových molekul, tzv. koaktivátorů.
• účinnost transkripce pozitivně ovlivňují specifické regulační oblasti na DNA tzv. zesilovače
transkripce. Zesilovač transkripce interaguje prostřednictvím transkripčních faktorů s
promotorem, přičemž výsledkem této interakce je uvedení RNA-polymerázy do aktivního
stavu, v němž může zahájit transkripci. Naopak negativně ovlivňují účinnost transkripce tzv.
tlumiče transkripce, které většinou rovněž působí prostřednictvím interakce s některými
transkripčními faktory.
• v průběhu ontogenetického vývoje se uplatňuje specifická aktivace genů, která se v zásadě
děje dvěma základními způsoby: buď je určitý gen v uvažované tkáni aktivován k transkripci
biosyntézou specifického transkripčního faktoru v dané tkáni (a pro ni charakteristického),
anebo je ve tkáni aktivován specifický transkripční faktor, který následně stimuluje
transkripci v buňkách této tkáně.
• Alternativní sestřih probíhající v různých tkáních odlišně je mechanismem zajišťujícím
variabilitu finálních produktů transkripce strukturních genů a konsekventně i produktů
translace mezi jednotlivými tkáněmi v rámci diferencovaného mnohobuněčného organizmu.
Je zřejmé, že na alternativním sestřihu participují tkáňově specifické transkripční faktory.
• Homeotické geny zahrnují zvláštní a velice složitou skupinu regulačních mechanismů,
které se uplatňují při morfogenetických procesech v přesně časově uspořádaných a
lokalizovaných posloupnostech.
• Hormony – mnohé, pro které existují intracelulární (cytoplazmatické nebo jaderné)
receptory fungující jako transkripční faktory (např. steroidní hormony), ovlivňují expresi
genetické informace. Po vazbě hormonu na takový receptor dochází k navázání komplexu
receptor – hormon na hormonový responzivní element (HRE), lokalizovaný na promotoru,
popř. zesilovači transkripce.
Některé další hormony se váží na receptory umístěné v cytoplazmatické membráně (např.
inzulin, glukagon, FSH, ACTH, LH); vznik takové vazby vede k aktivaci G-proteinů a
následné sérii reakcí zprostředkujících přenos signálu z receptoru prostřednictvím druhého
přenašeče (posla) až na cílové molekuly, které se uplatňují v reakci buňky na signál
indukovaný hormonem.
• na ještě mnohem komplexnější úrovni je genová exprese ovlivněna regulací buněčného
cyklu. Podobně můžeme do regulace genové exprese zahrnout procesy spojené s funkcemi
imunitního systému (ať už se jedná o tzv. imunitu zprostředkovanou buňkami nebo o tzv.
protilátkovou imunitu), procesy související s maligní transformací, aktivitami protoonkogenů
a onkogenů.
Schéma regulace genové exprese
Zdroj: http://old.mendelu.cz/~agro/af/genetika/vsg2/regul5/regulace.htm
Schéma regulace genové exprese u prokaryot
Zdroj: http://old.mendelu.cz/~agro/af/genetika/vsg2/regul5/regulace.htm
Zdroj: http://old.mendelu.cz/~agro/af/genetika/vsg2/regul5/regulace.htm
Zdroj: http://old.mendelu.cz/~agro/af/genetika/vsg2/regul5/regulace.htm
Zdroj: http://old.mendelu.cz/~agro/af/genetika/vsg2/regul5/regulace.htm
Internetové zdroja:
http://old.mendelu.cz/~agro/af/genetika/vsg2/regul5/regulace.htm - Regulace exprese genů
molekulární úrovni.
na
TRANSGENOZA A GMO
http://biologie.upol.cz/download/Vyhlaska.doc
- Vyhláška 209/2004 Sb. o bližších
podmínkách nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty.
http://biologie.upol.cz/download/Vyhlaska.pdf - Vyhláška 209/2004 Sb. o bližších
podmínkách nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty.
http://biologie.upol.cz/download/Zakon.doc - Zákon 78/2004 Sb. o nakládání s geneticky
modifikovanými organismy a genetickými produkty.
http://biologie.upol.cz/download/Zakon.pdf - Zákon 78/2004 Sb. o nakládání s geneticky
modifikovanými organismy a genetickými produkty.
http://www.greenfacts.org/en/gmo/ - Genetically Modified Crops.
http://www.biology.webz.cz/brambor.php – GMO (brambory)
http://www.biology.webz.cz/uu.php – GMO
http://www.biology.webz.cz/brambor.php – GMO:brambory
http://www.biology.webz.cz/GMO1.php – GMO 1: Hmyzuvzdorné transgenní odrůdy
http://www.biology.webz.cz/GMO2.php – GMO 2: Integrovaná regulace škůdců.
http://www.biology.webz.cz/GMO3.php – GMO 3: Chmel a mšice chmelová.
http://www.biology.webz.cz/GMOuv.php – GMO: Riziková témata.
http://www.greenfacts.org/en/gmo/ - Genetically Modified Crops (overview;výborné, použít).
GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ
• = záměrné rekonstruování organizmů na genové úrovni za účelem dosažení předem
stanovených cílů.
• základní technika = rekombinace DNA in vitro bez ohledu na jejich taxonomickou
příslušnost
- spočívá ve spojení fragmentů zvolené DNA s vektorovou DNA, o které
se ví, že se pomnoží v buňkách, do níž mají být cizorodé geny vneseny. Vektory obsahující
cizorodé geny se označují jako rekombinantní vektory.
• vektory – u prokaryot slouží k přenosu DNA plazmidy a fágy
- u eukaryot se pro klonování DNA v savčích buňkách používají konstrukty
odvozené od virů
Charakteristika jednotlivých typů vektorů podle velikosti inzertu
vektor
plazmid
cosmid
BAC(bacterial artificial chromosome)
YAC (trast arteficial chromosome)
velikost inzertu [kbp]
2 - 10
4
70 - 300
> 300
• molekulové (genové) klonování = reprodukce cizorodého segmentu DNA v novém hostiteli
~ tvorba neomezeného množství kopií
• restrikční enzymy = bakteriální druhově přísně sekvenčně specifické enzymy umožňující
bakteriím rozeznat a rozrušit cizí DNA
- jsou přísně sekvenčně specifické; vykazují endonukleázovou aktivitu;
atakují cílové sekvence o délce 4 – 8 bp; cílová sekvence o n bp se vyskytuje průměrně 1x
v nahodilé sekvenci DNA o délce 4n => RE štěpící cílovou sekvenci o délce 6 bp rozštěpí
DNA na fragmenty o průměrné velikosti 46 = 4 096 bp ~ velikosti genů.
- bakterie chrání vlastní DNA před vlastními RE metylace určitých bází
v cílových sekvencích, katalyzovaná metylázou rozpoznávající stejné sekvence jako příslušná
RE
• ligázy – kovalentně spojují fragmenty DNA s lepivými konci (např. lipáza z E. coli) nebo
s tupými konci (např. lipáza fága T4)
• adaptor = spojka, tvořená krátkým syntetickým dvouvláknovým oligonukleotidem, který
nese cílové sekvence pro jeden nebo více RE.
- připojí se ligací tupých konců k sekvencím genu → pak se restrikčním enzymem
vytvoří v adaptoru jednovláknové kohezní konce, čímž se struktura připraví pro spojení
s vektorovou DNA, která byla ošetřena stejným restrikčním enzymem.
- umožňují opatřit jakoukoli DNA lepivými konci, které jsou charakteristické
pro danou restriktázu (restrikční endonukleázu).
- hlavní význam: umožňují z klonované DNA vyštěpit klonovaný gen o přesně
definované poloze (o přesně definovaném místě).
• nick translation (= přenos přerušení) – dovoluje značení DNA pomocí 32P DTP tím, že za
vjodných podmínek DNApolyI degraduje svou nukleázovou aktivitou vlákno DNA ve směru
5´ → 3´a současně svou polymerázovou aktivitou katalyzuje syntézu degradovaného řetězce.
• S1-nukleáza – izolována z Aspergillus oryzae; exonukleázová aktivita je preferenčně
na jednovláknové řetězce; je schopna odstranit všechny ss struktury ←→ slouží k odlišení ss
a ds struktur.
• nukleáza fága λ – působí přednostně na ds struktury; zahajuje štípání na 5´-konci za tvorby
5´-(d)NMP.
• revertáza – součást virionů retrovirů
- vzhledem k diskontinuitnímu uspořádání eukaryotních genů je třeba zpětným
přepisem z mRNA rekonstruovat jejich souvislé protějšky a poté (po odstranění matrice
/tj. mRNA/ působením alkálií) pomocí restriktázy katalyzovat syntézu druhého řetězce.
- zpětných transkriptů z mRNA se používá pro sekvenování a jako sond
pro hybridizaci.
• genová banka (knihovna) = soubor bakteriálních klonů,ve kterých je obsažen celý genom
určitého organizmu ve formě klonovaných fragmentů
Genové inženýrství u metazoí:
• k zavedení cizorodých genů do savčích buněk se používá transfekce nebo virových vektorů:
• transfekce = získávání nových genetických znaků přímým zavedením cizorodé DNA
do buňky (obdoba transformace u bakterií).
- nízká účinnost ~> použití prostředků, které průnik DNA do buňky zvyšují:
koprecipitace s kalciumfosfátem, polykationtové substance typu DEAE-dextran či
poly-L-ornitin; přídavek chloroquinu tlumí degradaci DNA v lyzozomech, PEG zajistí, že
s buňkami splynou protoplasty z bakterií nesoucích vhodné plazmidy, nebo erytrocyty či
lipozomy se zavzatou cizorodou DNA, lipofekce zprostředkovaná částicemi katonických
tuků, které reagují s DNA a splývají s buňkami bez PEG, mikroinjekce DNA do buňky,
vpravení DNA do buňky metodou elektroporace (← buňka se vystaví krátkému elektrickému
šoku a napěí několika kV ~> vzniknou póry, jimiž DNA pronikne do buňky → vzniklé otvory
se rychle zacelí).
- kotransfekcí genu pro žádaný produkt + selektovaný marker lze získat klony,
produkující produkty obou genů. Často se jako selektovatelný marker požívají
a) geny pro aminoglykozidfosfotransferázu, která inaktivuje ATB geneticin (G418)
b) virové geny kódující thymidinkinázu či dihydrofolátreduktázu
c) geny pro XGPRT a jiné produkty, jež činí buňky nezávislé na určitých prekurzorech
- exprese genu se zjišťuje většinou biochemicky nebo imunologicky
• virové vektory
• neživé = ty, které nejsou schopny po provedené manipulaci samostatné reprodukce
(SV40 ← rekombinant se může pomnožit v transformovaných buňkách, které konstitutivně
vytvářejí chybějící virovou funkci, např. buňky myšího původu COS; tyto buňky obsahují
genom viru SV40, který postrádá místo počátku replikace virové DNA a nemůže se proto
replikovat, ale tvoří časný virový protein označovaný jako antigen T. Po infekci virem SV40,
ve kterém byl gen pro antigen T nahrazen jiným genem – např. pro hemaglutinin chřipkového
viru – ale je zachováno místo počátku replikace, se vytvoří množství neinfekčních
rekombinantních části SV40; když se takovým virem infikují opičí buňky, vytvoří se v nich
množství hemaglutininu chřipkového viru).
- jsou jimi nejčastěji retroviry (jako vektory) ← jsou vysoce účinné v transferu
cizího genu do cílového hostitele. Retrovirové vektory jsou analogy defektních virů, v nichž
se nahradí geny plně kompletního proviru geny cizorodými; zpravidla je 1 ze začleněných
genů snadno detekovatelným markerem. K pomnožení takových defektních virů se používá
speciálních buněčných linií získaných transfekcí buněk provirem retroviru, který byl zbaven
části NK nutné pro enkapsidaci virové RNA – taková linie není schopna produkovat infekční
virus, ale vytvoří virové bílkoviny, jež umožní pomnožení rekombinantního vektoru.
• živé – používají se středně velké viry (adenoviry, herpes viry, poxviry)
- jde o náhradu neesenciálních virových genů (nebo jednoho genu) cizorodým
genetickým materiálem. Do poxvirů lze vpravit 20 – 25 středně velkých genů ↔ to vytváří
vhodné podmínky pro vývoj polyvalentních vakcín.
Nejčastěji se používá virus vakcinie ← výhody: signální sekvence viru vakcinie jsou
specifické a řízené pouze virovými regulačními proteiny + geny tohoto viru jsou bez intronů.
Při rekombinacích se používá plazmidů konstruovaných tak, aby obsahovaly promotor a
neesenciální gen viru vakcinie, do něhož se vkládá cizorodý gen zbavený intronů;
po transfekci buněk infikovaných virem vakcinie dojde k homologiní rekombinaci mezi
rozštěpeným genem viru vakcinie (který je v plazmidu) a homologiním genem replikujícího
se viru vakcinie; rekombinací se tento gen inaktivuje. Byl-li zvolen gen pro thymidinkinázu
viru
vakcinie,
vzniklý
rekombinant
je
TK¯ a
jako
takový
je
rezistentní
k 5-bromo-2-deoxyuridinu a lze ho tak snadno zjistit a detekovat.
Tkáňové (buněčné) kultury
• nejsou problémy spojené s expresí genů a postsyntetickými úpravami
• vnesené geny nepodléhají (často) represi, které jsou vystaveny v organizmu (např. myší
fibroblasty po zavedení globinových genů produkují globin, který jinak netvoří).
• pozitivem je i to, že sekretorické proteiny se vylučují do média TK ~> usnadněná izolace a
purifikace produktů
• nevýhody • vysoké náklady
• proti užití geneticky zmanipulovaných savčích buněk jako producentů vakcín a
farmakologicky významných látek pro účely humánní medicíny je možná přítomnost
onkogenních faktorů, které by mohly přejít do preparátu
Internetové zdroje:
http://www.biochemie.upol.cz/stranky/vyuka/bam/04.ppt#1 – Klonování a genové inženýrství
http://www.zbio.gnotobio.cz/2007/Molekularni_biologie/molbiol_04.doc
Metody
molekulární biologie.
http://biol.lf1.cuni.cz/prez_zimni/MolGenII_v2008.pdf - Molekulární genetika: molekulární
diagnostika.
http://biologie.upol.cz/metody/Trideni%20molekul%20nukleovych%20kyselin.htm – Třídění
molekul nukleových kyselin.
http://biologie.upol.cz/metody/Izolace%20nukleovych%20kyselin.htm – Izolace nukleových
kyselin.
http://biologie.upol.cz/metody/Stipani%20DNA.htm – Štípání DNA.
http://biologie.upol.cz/metody/Klonovani%20DNA.htm – Klonování DNA.
http://biologie.upol.cz/metody/Amplifikace%20pomoci%20PCR.htm – Amplifikace DNA
pomocí PCR.
http://biologie.upol.cz/metody/Synteza%20oligonukleotidu.htm – Syntéza oligonukleotidů.
http://biologie.upol.cz/metody/Slovnik/Animace%20syntezy%20oligo.ppt – Animace syntézy
oligonukleotidů.
http://biologie.upol.cz/metody/Sekvenovani%20DNA.htm – Sekvenování DNA.
http://biologie.upol.cz/metody/Pouziti%20sond.htm - Použití sond.
http://biologie.upol.cz/metody/Ovlivneni%20DNA%20teplem.htm – Ovlivnění DNA teplem.
http://www.eamos.cz/amos/bc/externi/bc_154/Markery2.doc - Molekulární markery.
http://is.muni.cz/elportal/estud/lf/js06/bltm0111p/p19_III._Stem_Cells.pdf
Vývojová
biologie: kmenové buňky.
http://is.muni.cz/elportal/estud/lf/js06/bltm0111p/p22_Kmenove_bunky_nadoru-06.pdf
Kmenové buňky nádorů.
http://is.muni.cz/elportal/estud/lf/js06/bltm0111p/p23_Mutace-06-web.pdf
reparace.
-
Mutace
a
MIMOJADERNÁ DĚDIČNOST
http://biol.lf1.cuni.cz/ucebnice/nemendelovska_dedicnost.htm - Mimojaderná dědičnost (člověk)
http://www.mitomap.org/ - MITOMAP (a human mitochondrial geonome databáze).
http://www.mitomap.org/ - Mitochondrie člověka
http://www.mitomap.org/mitoseq.html - Revised Cambridge reference sequence of the human
mitochondrial DNA.
http://www.mitomap.org/euk_mitos.html - Complete mitochodnrial DNA sequence.
http://www.mitomap.org/human_mito_code.html - Human mitochondrial genetic code.
http://oldwww.fns.uniba.sk/~kbi/kovlab/questions.htm#1 – mtDNA.
http://www.hhmi.org/research/scholars/nosek.html - Molecular Architecture, Replication, and
Dynamics of Linear Chromosomes in Mitochondria.
http://encarta.msn.com/text_761582165__1/Mitochondria.html - Mitochondria.
http://oldwww.fns.uniba.sk/~kbi/kovlab/questions.htm#1 – mtDNA.
http://www.hhmi.org/research/scholars/nosek.html - Molecular Architecture, Replication, and
Dynamics of Linear Chromosomes in Mitochondria.
Největší část genetické informace eukarytických buněk je obsažena v buněčném jádru,
kde jejich genofory jsou jednotlivé chromozomy. V buňkách prokaryot, které nemají
vytvořeno buněčné jádro v
morfologickém smyslu,
je analogem eukaryontického
chromozomu prokaryotický chromozom, uložený v cytoplazmě. Minoritní část genetické
informace je obsažena v cytoplazmatických strukturách, tedy mimo buněčné jádro, v podobě
molekul DNA mitochondrií, chloroplastů a plazmidů. Pro cytoplazmatický (mimojaderný)
genetický materiál jako celek se používá označení plazmon.
Cytoplazmatická dědičnost se vyznačuje některými specifiky, která ji odlišují od
dědičnosti jaderné:
(1) matroklinní dědičnost je takový způsob dědičnosti, při kterém je fenotypový projev
hybrida shodný s fenotypovým projevem mateřského jedince. Vede k tomu, že výsledky
reciprokých křížení nejsou identické. Jako příklad lze uvést cytoplazmaticky podmíněnou
pylovou sterilitu u některých druhů rostlin (např. kukuřice) nebo dědění znaků,
determinovaných mitochondriálními geny, pouze v mateřské linii.
(2) somatické štěpení je důsledkem nerovnoměrné distribuce mitochondrií, chloroplastů i
plazmidů do jednotlivých buněk při buněčném dělení (na rozdíl od striktně rovnoměrné
distribuce chromozomů). Proto množství mimojaderné genetické informace varíruje mezi
buňkami v závislosti na počtu cytoplazmatických faktorů dědičnosti v jednotlivých buňkách.
Příkladem může být panašování u rostlin jako projev chloroplastové dědičnosti. U některých
druhů rostlin jsou známy případy matroklinní dědičnosti neschopnosti syntézy chlorofylu. U
typu dědičnosti, označovaného jako albomaculatus, nejsou recesivní alely cl předávány
zygotě pylem. Proto při křížení samičí bílé (bezchlorofylové) rostliny se samčí zelenou
rostlinou budou v potomstvu všechny rostliny bílé (bezchlorofylové). Tento typ dědičnosti se
vyskytuje např. u druhů rodu Nicotiana, Petunia, Zea. Při reciprokém křížení budou v
potomstvu všechny rostliny zelené. U typu dědičnosti, označované jako paralbomaculatus,
přecházejí recesivní alely pylovým zrnem do zygoty. Proto se při křížení bílé
(bezchlorofylové) samičí rostliny se zelenou samčí rostlinou v potomstvu objeví rostliny bílé i
zelené, avšak převažovat budou rostliny bílé (bezchlorofylové). Naopak při reciprokém
křížení mezi potomky budou převažovat rostliny zelené nad bílými. Typ paralbomaculatus se
vyskytuje např. u rodu Pelargonium.
(3) plazmon obsahuje jen nepatrný zlomek všech genů v buňce. Plazmonové geny zpravidla
kódují bílkoviny, které jsou specifické pro normální fungování příslušné organely
(mitochondrie, chloroplastu), případně nejsou pro buňku nepostradatelné (plazmidy).
Autonomie procesů souvisejících s expresí genetické informace mitochondrií a chloroplastů
není absolutní, protože v
řadě případů existuje interakce mezi jadernými a
cytoplazmatickými geny, resp. závislost exprese cytoplazmatických genů na expresi
genetické informace obsažené v jaderném genomu. Příkladem může být schopnost nálevníků
Paramecium aurelia vylučovat paramecin. Jedinci genotypu KK a někteří jedinci genotypu
Kk obsahují v cytoplazmě tzv. částice κ sestávající z proteinové oblasti (tělísko R) a virové
částice. Toxin (paramecin) působí na jedince genotypu kk, kteří částice κ neobsahují a jsou
vůči tomuto toxinu senzitivní. Trvá-li konjugace mezi jedincem genotypu KK a jedincem
genotypu kk dostatečně dlouhou dobu, vzniklí hybridi genotypu Kk budou obsahovat částice
κ a budou produkovat toxin, ke kterému sami budou odolní. Naopak, bude-li konjugace mezi
jedinci uvedených genotypů trvat krátkou dobu, během níž nebudou moci být přeneseny
cytoplazmatické
částice κ z cytoplazmy donora (KK) do cytoplazmy recipienta (kk),
nebudou heterozygotní potomci Kk obsahovat částice κ. V důsledku toho tito heterozygoti
nebudou produkovat paramecin a budou vůči němu senzitivní; to znamená, že se budou
fenotypově projevovat jako jedinci genotypu kk, kteří částice κ nikdy neobsahují a jsou proto
vždy senzitivní vůči paramecinu.
(4) některé mimojaderné determinanty jsou infekční. Mezi ně patří například bakteriální
epizomy a někteří intracelulární symbionti.
(5) mimojaderné geny nelze mapovat do genetických map jaderných genů, avšak je
možné stanovit pořadí genů a vzdálenosti mezi nimi na příslušném genoforu (tj. plazmidové,
mitochondriální či chloroplastové DNA).
Některé znaky, podmíněné cytoplazmatickými determinantami dědičnosti, se významně
uplatňují v praxi. Například cytoplazmatická sterilita se využívá
při šlechtění rostlin.
Tato sterilita je podmíněna cytoplazmatickými geny (mitochondriálními, plastidovými), které
se přenášejí na potomstvo prostřednictvím cytoplazmy vaječné buňky, takže pylově sterilní
potomstvo se tvoří pouze na rostlinách pylově sterilních. K udržování sterility slouží křížení
samičí rostliny s plazmotypem S (cytoplazmatická sterilita) se samčí rostlinou
s
plazmotypem F (normální cytoplazma).
Samčí pylová sterilita (CMS) je podmíněna interakcí genů cytoplazmatických
s geny
jadernými. Plazmotypy S a F spolupůsobí s jedním nebo více jadernými geny. Některá alela
(nebo některé alely) těchto jaderných genů poskytuje
s plazmotypem S pylově
sterilní rostliny; většinou se jedná o alelu recesivní, označovanou symbolem ms nebo rf.
Dominantní alela Ms (resp. Rf)
této souvislosti proto hovoříme
s plazmotypem S vede k obnově fertility; v
o některých genech jako o obnovitelích (restorter)
samčí pylové fertility. Na CSM lze nahlížet jako na formu genetické kastrace a jako na
významný prostředek udržování vhodných (zejména hybridních) genotypů.
SCHÉMA
MITOCHONDRIÁLNÍHO GENOMU
•
SCHÉMA CHLOROPLASTOVÉHO GENOMU
TRANSKRIPCE MITOCHONDRIÁLNÍ A CHLOROPLASTOVÉ DNA
Genofory v těchto buněčných organelách jsou tvořeny kružnicovými dvouřetězcovými
molekulami DNA (podobně jako u bakterií), které nesou strukturní geny i geny pro funkční
RNA. Geny mitochondrií i chloroplastů jsou rozmístěné ve více transkripčních jednotkách na
obou řetězcích DNA. Mechanismus jejich transkripce je (zřejmě) obdobný jako u prokaryot;
rovněž strukturou promotorů a některými vlastnostmi RNA-polymeráz jsou jim blízké.
Podobnost organizace mitochondriálního a chloroplastového genomu v mnoha aspektech s
organizací prokaryotického (bakteriálního) genomu byla ostatně východiskem pro
formulování dnes poměrně široce akceptované endosymbiotické hypotézy.
EDITACE MITOCHONDRIÁLNÍ RNA
Specifickým rysem tohoto typu posttranskripční úpravy (na rozdíl od předchozích tří výše
uvedených) je, že se při ní mění původní obsah genetické informace. V důsledku toho
primární struktura editované RNA není zcela komplementární k
primární struktuře
matričního řetězce transkribovaného příslušného strukturního genu. Jinými slovy, v případě
translace editované mRNA je syntetizován polypeptidový řetězec o aminokyselinovém
složení odlišném
od aminokyselinového složení polypeptidového řetězce, který by byl
syntetizován při translaci needitované mRNA. Editace není jevem nahodilým, ale přesně
řízeným a regulovaným. Jsou známy menší molekuly RNA (řádově o několika desítkách
ribonukleotidů), označované jako řídící RNA (gRNA). Molekula gRNA určitým svým
úsekem hybridizuje s komplementárním úsekem mRNA (označovaným jako kotva) a odtud
editaci řídí. V současné době je známo, že se editace může uskutečnit mechanismem
substituce, inzerce nebo delece bází v polyribonukleotidovém řetězci. Strukturní geny,
jejichž genetická informace podléhá editaci, se označují jako kryptogeny.
TRANSLACE V MITOCHONDRIÍCH
Templátem pro translaci v mitochondriích je mRNA transkribovaná z mtDNA. Ribozomy
mitochondrií jsou považovány za ribozomy prokaryotického typu. Rovněž translace na
mitochondriálních ribozomech probíhá obdobně jako u prokaryot, včetně řazení
formylmetioninu jako iniciační aminokyseliny. Autonomie translace (jakožto i některých
dalších molekulárně-biologických procesů) v mitochondriích není úplná, naopak, je v určitém
rozsahu závislá na produktech cytoplazmatických dějů, především na některých proteinech,
nepostradatelných pro realizaci translace (např. aa~tRNA-syntetázy, proteinové komponenty
ribozomů, iniciační a elongační faktory). Charakteristickou zvláštností genetických procesů v
mitochondriích je existence určitých odchylek od standardního genetického kódu a schopnost
mitochondriálních tRNA tento pozměněný genetický kód číst.
TRANSLACE V CHLOROPLASTECH
Rovněž v
chloroplastech jsou zastoupeny ribozomy prokaryotického typu (70S,
podjednotky 30S a 50S) a průběh translace je v obecné rovině shodný s průběhem translace
u prokaryot, včetně formylmetioninu jako iniciační aminokyseliny. Typické pro translaci
v chloroplastech je uplatnění pravidla o kolísavém párování bází ve značném rozsahu.
Autonomie translace i některých dalších molekulárně biologických procesů v chloroplastech
je omezená podobně jako u mitochondrií, avšak genetický kód je standardní.
GENETIKA BUŇKY
Organizace chromozomu
Zdroj: http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/proceuc/chromosome.jpg
PŘÍKLADY POUŽITÍ METODY FISH
Značení interfázních chromozomů
Legenda: Metafázní buňka byla hybridizována se sondou specifickou pro centromerickou
oblast chromozomu X a pro oblast p22.3 v terminálním úseku krátkého raménka chromozomu
X (červený signál). Na uvedeném karyotypu je červený signál pro oblast p22.3 přítomen
pouze na jednom z obou chromozomů X, tzn. že druhý chromozom je pro tuto oblast
aberantní.
FISH _- R -BANDING
KARYOTYPY ČLOVĚKA - FISH
(mnohobarevná hybridizace in situ – mFISH)
Obr. č. 5: Karyotypy připravené metodou FISH.
a) normální karyotyp muže 46 XY,
b) buňka nemocného s chronickou myeloidní leukemií a komplexní přestavbou karyotypu
Princip metody FISH
Zdroj: http://www.gennet.cz/img/fish_2.jpg nebo http://www.gennet.cz/asist_reprodukce/diagnostika.htm
Internetové zdroj:
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/chooser.shtml - Human
genome - Chromosomes viewer (Genes and Genetic Disorders).
GENETIKA ČLOVĚKA
Dědičné choroby
Příčina: mutace · genová x chromozomální aberace x genomová · aneuploidie
· polyploidie
↑
↑
↑
delece
chromozómová (G1)
porucha mitózy či meiózy
adice
chromatinová (S, G2)
(-zomie)
substituce
mozaika
chimérizmus
Četnost mutací:
a) přímé stanovení:
suma kurantních novorozenců
M = -------------------------------------------2 · suma všech novorozenců
b) nepřímé stanovení: dominantní mutace
M = 0,5 · x · (1 – f)
x = četnost mutantů / 1 generace
recesivní mutace
M = x · (1 – f)
vázané na chromozom X
M = 1/3 · [x´ · (1 – f)]
x´= četnost mutantů / 1 generace mužů
MOZAIKA
1. funkční – lyonizace = náhodní inaktivace jednoho X chromozomu u ženského pohlaví
2. morfologická ← non-disjunkce = neoddělení chromatid (metafáze/anafáze)
← anaphase lag = opožděný přesun chromozomu (v anafázi)
- a) somatická
b) gametická
Příklad:
SYNDROM STEIN-LEVENTHALŮV – většinou XX/XXX, XX/XXp- amenorrhoea a sterilita podmíněná
(oboustranně) polycystickými ovarii
CHIMÉRIZMUS
1. zygotický – a) vajíčko (2n) oplodněno 2 spermiemi
b) vajíčko (1n) oplodněno 1 spermií + polocyt oplodněn 1 spermií
c) 2 současně vzniklé zygoty splynou za vzniku 1 zárodku (plodu)
2. postzygotický – erytrocytární chiméry ⇐ zkřížená placentární cirkulace mezi DZD
(obě tvoří po porodu krvinky 0 i A, ale žádné Ab α)
- lymfocytární chiméry: dvojčata, po intrauterinní transfúzi
KLINEFELTERŮV SYNDROM
· polyzomie u mužů: 47, XXY; 48, XXXY; 49, XXXXY
· hormonální nedostatečnost, gynekomastie; vysoký vzrůst, úzká ramena, široká pánev,
ženský typ ukládání tuku, málo vlasů, ↓ vousů (nebo žádné), malá bezbolestná varlata,
zmenšená prostata, oligospermie až azoospermie)
SYNDROM NADPOČETNÉHO CHROMOZOMU Y
· 47, XYY; 48, XYYY; 1 : 1 500 mužů
· někdy poruchy chování (zvýšená agresivita ~ asociální až antisociální zaměření), projevy
většinou až v pubertě, vysoká postava (> 180 cm), lehká psychická retardace
TURNERŮV SYNDROM
· 45, X0; 1 : 3 000
· ženská vizáž, štíhlá, vysoká postava; ↓ fertilita, dysgeneze gonád; maskulinizace
DOWNŮV SYNDROM
· 47, XX (XY), 21+; 1 : 800 (a více); cca 70% potraceno
· patogeneze vnitřních orgánů (hl. mozek, srdce), dermatoglyfické změny; mongoloidní
postavení očí, široký, mohutný jazyk (~ nedovírání úst), posazení uší, změny kapilicia;
mentální retardace.
MORRISŮV SYNDROM (SYNDROM TESTIKULÁRNÍ FEMINIZACE)
· 46, XY; recesivní, vazba na X
· ženy bez pubického ochlupení, amenorrhoea, sterilita,, slepá vagina, chybí děloha, varlata
nesestouplá (v dutině břišní, tříselním kanálu nebo stydkých pyscích)
· neschopnost konverze testosteronu na dihydrostestosteron, neúčinnost evokačního působení
fetálního varlete na genitální trakt
· v pubertě produkce androgenů a estrogenů – pro nevnímavost na působení androgenů se
uplatní pouze estrogeny ⇒ feminizující účinek
· parciální STF: nadměrně velký klitoris
XX MUŽI
· vazba na pohlaví
· zavalitá postava, absence terminálních buněk ve varlatech
PATAUŮV SYNDROM
· 47, XX (XY), 13+; 1 : 60 00
· rozštěpy (nesrůstá horní ret a patro), anoftalmie a hluchota či deformace očí a uší, těžká
mentální retardace; patogeneze orgánů (dextrapozice srdce, zvětšené srdce), chronická
pneumonie
EDWARDSŮV SYNDROM
· 47, XX (XY), 18+; též 46, XX (XY) t18/18 nebo t18/? 1 : 5 000 (někde 1 : 3 – 4 000)
· mentální i tělesná retardace; hlava s úzkým frontálním a širokým horizontálním rozměrem,
široký nos, malá trojúhelníkovitá ústa, rozštěpy, nízko položené a deformované uši, „plovací
blány“ mezi prsty, dítě neschopné fixovat názor (vzhled) patogeneze vnitřních orgánů
(anomálie srdce, ledvin, penisu aj.); časté tříselné a pupeční kýly
SYNDROM KOČIČÍHO KŘIKU (cri-du-chat)
· 46, XX (XY), 5p-; někdy translokace B/D
· obličej = měsíc v úplňku (mikrocefalie, mikrognatie, epikantus), kočičí mňoukání (anomálie
hrtanu, epiglotis, úzké hlasivkové vazy), nízká por. hmotnost, celková hypotonie, mentální
retardace; dožívají i dospělosti
PORUCHY SEXUÁLNÍ DIFERENCIACE
· Hermafroditismus verus – alternans:
1 strana vaječník, 2. strana varle
bilateralis: oboustranně ovotestis
unilateralis: jednostranně ovotestis + ovarium nebo
ovotestis + testis
· Pseudohermafroditismus – masculinus: XY, varlata, intersexuální genitál
- femininus: XX, ovaria, intersexuální genitál
· Hypofunkce testis – příčina: poruchy varlete (primární hypogonadismus)
nedostatek gonadotropinů hypofýzy (sekund. hypogon.)
· Hypofunkce ovarií – příčiny: ↑ gonadotropiny (primární hypogonadismus)
↓ gonadotropiny (sekundární hypogonadismus)
· Puberta praecox – zvětšení prsů před 8. + kubické a axilární ochlupení před 9. rokem +
menstruace před 10. rokem; zvětšený klitoris anebo penis; vousy
- p. p. vera – je spermatogeneze i oogeneze
p. p. konstitucionální – anovulační mense ~ fertilita (jen) potenciální
- recesivní, vázaná na X
· Pseudopubertas praecox – není spermatogeneze ani ovulace
· Albrightův syndrom – puberta praecox, polyostotická fibrózní dysplázie (četné
fraktury), nepravidelné pigmentační skvrny, v moči ↑ estrogeny
DUŠEVNÍ CHOROBY
· Oligofrenie
· Debilita – příčiny: biologické – genetické
60%; edukace možná ve zvláštních školách
- negenetické 10% - intrauterinní (karence živin, anoxie)
- porodní (anoxie, mozkové krvácení)
sociokulturní – 30%; emocionální deprivace, frustrace, nejistota
· Imbecilita - příčiny: biologické – genetické
- negenetické
25%; školní edukace není možná
25%
- kombinované 50%
· Idiocie - příčiny: biologické – genetické; školní edukace není možná
· Schizofrenie – konkordance MZD 60%, DZD 10%
· Manio-depresivní psychózy – konkordance 93% MZD, 23% DZD
choroba
IQ
debilitas
imbecilitas
idiotie
69 - 50
49 - 20
< 20
mentální věk
v dospělosti (roky)
7 - 10
3–6
0-2
FENOGENETIKA
Studuje způsoby (mechanizmy) manifestace genů
PENETRANCE = četnost určité vlohy v populaci (bez ohledu na intenzitu projevu); %
~ chybění nebo přítomnost znaku oproti genetickému předpokladu
- někdy závislá na věku (př. diabetes melitus); nevaríruje u aa znaků
= poměr počtu nemocných dětí ku všem dětem (v postižené rodině)
- výpočet P při dominantní dědičnosti:
počet nemocných dětí v postižené rodině
Pd = 2 ·
-------------------------------------------------------------------------------------------
celkový počet dětí v postižené rodině
Vzorec platí za předpokladu, že byla rodina zachycena na základě
nemocného rodiče. Při záchytu rodiny na základě nemocného dítěte je
třeba postupovat podle vzorce pro výpočet P při recesivní dědičnosti
· metoda jistých nosičů: děd → rodič → vnuk
↑
jistý nosič
V souboru rodokmenů je P dána poměrem postižených a zdravých jistých
v druhé generaci.
· MZD: odhad P na základě sledování příslušného znaku u MZD
-
výpočet P při recesivní dědičnosti:
počet nemocných dětí v postižené rodině - počet probandů
Pr = 4 ·
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
celkový počet dětí v postižené rodině – počet probandů
EXPRESIVITA
= variabilita manifestace téhož znaku u různých osob
!!!Penetrance a expresivita = výraz působení ostatních orgánů (tj. celého genotypu) a
prostředí (vnitřního + zevního)!!!
DVOJČATA
· MZD x DZD (vícerčata)
· rasová závislost DZD: negroidní
- 2 – 3%
kavkazoidní - 1,2 %
mongoloidní - 0,6 %
Četnost MZD celosvětově (kromě Japonska) stejná (cca 0,3%).
· Studium dvojčat · význam: stanovit podíl dědičnosti a prostředí při vzniku urč. znaku
určit typ dědičnosti: monogenní / polygenní
orgány pro transplantaci
· konkordance
x
diskordance
Stejné vlivy prostředí → shoda (konkordance) u MZD,
→ neshoda (diskordance) u DZ
Různé vlivy prostředí – význam při studiu MZD
· podíl dědičnosti u znaku kvalitativního
konkordance MZ - konkordance DZ
H = -------------------------------------------------------------100 - konkordance DZ
· podíl dědičnosti u znaku kvantitativního
variance DZ - variance MZ
H = -------------------------------------------------------------variance DZ
· dědičnost monogenní: konkordance MZ / DZ = 2 : 1
dědičnost monogenní: konkordance MZ / DZ > 4 : 1
GENEALOGIE
Index familiární koncentrace
familiární incidence choroby
K = -------------------------------------incidence choroby v populaci
K = 2 – 20 ~ vysoká pravděpodobnost geneticky podmíněné choroby
Populační veličina !!!
Analýzou pouze 1 rodokmenu lze nanejvýš vyloučit určitý typ dědičnosti!!!
PŘÍBUZENSKÉ SŇATKY, INBRÍDINK
INCEST
x
INBRÍDINKK x PŘÍBUZENSKÝ SŇATEK
Koeficient příbuznosti (r) = kolik genů mají 2 osoby společných
Koeficient inbrídinku (F) = pravděpodobnost, že určitý jedinec bude homozygotní pro 2
identické (stejné) alely, pocházející z jedné alely jeho předka
F = r/2
F = (1/2)n
n = počet stupňů ke společnému předku
F = (1/2)n1 + n2 + 1 · (1 – FA)
Očekávaná četnost příbuzenských sňatků rodičů dětí, postižených určitou recesivně dědičnou
chorobou:
k = c / (16 · q) + (15 / 16) c
(Dahlberg)
k = četnost sňatků bratranec x sestřenice u rodičů postižených dětí
c = četnost sňatků bratranec x sestřenice v dané populaci
q = genová četnost recesivní alely v dané populaci
PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKA
Amniocentéza
Amniografie
Sonografie
Genetické poradenství - genealogie
cytogenetika
molekulární cytogenetika
molekulární genetika
populační genetika
dermatoglyfika
- indikace interrupce z genetických příčin (důvodů)q
Internetové zdroje:
http://biol.lf1.cuni.cz/ucebnice/komparativni_genomika.htm - Komparativní genomika.
http://www.dnavision.be/pharmacogenomics.php - Pharmacogenomics.
http://www.genome.gov/11508738 - Chemical genomics.
http://biol.lf1.cuni.cz/extensions/Genomika_v_Medicine/prezentace/prezentace.htm
Genomika v medicíně (Videotutoriál lékařská genetika a bioinformatika 1; Lékařská genetika
a bioinformatika 2 (Přf UK); Interakce genů a prostředí 1; Interakce genů a prostředí 2;
Interakce genů a prostředí 3; Epigenetika a onemocnění; Úvod do proteomiky;
Experimentální a funkční genomika v medicíně; Základy bioinformatiky).
POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
Polymerázová řetězová reakce je metoda amplifikace fragmentu DNA in vitro. Fragment
DNA, získaný obvykle za použití vhodné restriktázy, se vloží do reakční směsi, jejímiž
hlavními složkami jsou specifické primery, dNTP a
DNA-polymeráza v iontově
vyváženém reakčním prostředí (pufru). Reakce probíhá v termocykleru při cyklicky se
měnících teplotách. Na začátku každého cyklu se nejprve amplifikovaná DNA denaturuje při
teplotě kolem 95° C. Poté
při nižší teplotě (kolem 60° C) dochází k anelaci, tj. ke
komplementárnímu připojení primerů ke konci každého řetězce denaturované DNA. V další
fázi cyklu
při teplotě kolem 70° C dochází k extenzi, tj. syntéze (prodlužování)
nukleotidového řetězce; tato syntéza začíná od 3´- konce primeru připojením
5´- konce
dNTP komplementárního k nukleotidu řetězce DNA, na který je tento primer navázán a
pokračuje za katalytické aktivity DNA-polymerázy po celé délce amplifikovaného fragmentu.
Po dokončení extenze se celý cyklus denaturace → anelace → extenze zpravidla mnohokrát
opakuje. Po poslední extenzi dochází k terminaci PCR. Prostřednictvím PCR lze namnožit
fragmenty DNA na požadované množství volbou počtu cyklů (n). Počet amplifikovaných
fragmentů je teoreticky roven 2n, tzn. zvyšuje se exponenciálně s počtem cyklů. Je patrné, že
PCR skýtá možnost namnožit požadovaný úsek DNA bez použití vektorů, což je velkou
předností této metody.
Existuje několik modifikací a typů PCR.
RT-PCR je variantou PCR, jíž předchází reverzní transkripce izolované RNA a získaná
cDNA se použije jako matrice. K amplifikaci lze tedy jako výchozí materiál použít i RNA.
NESTED PCR je dvoustupňová amplifikace, vhodná zejména za situace, kdy je
k dispozici pouze nepatrné počáteční množství DNA. Při této modifikaci PCR se používají
dva typy primerů: vnější a vnitřní. Vnitřní primery jsou lokalizovány uvnitř oblasti (úseku)
vymezené vnějšími primery. V prvním stupni se amplifikuje úsek DNA pomocí vnějších
primerů. Ve druhém stupni se získaný amplifikát použije k amplifikaci kratšího úseku za
použití vnitřních primerů.
ALELOVĚ SPECIFICKÁ PCR je vhodná k detekci mutace, která nevytváří nové nebo
neruší určité stávající restrikční místo. Při tomto typu PCR se používají tři primery: jeden
tvoří zvolenou normální hranici amplifikovaného úseku DNA, druhý je komplementární k
standardní (nemutované) sekvenci a třetí je komplementární k
mutantní sekvenci.
Detegovaná mutace tvoří hranici amplifikovaného úseku a je zakryta příslušným primerem.
Jestliže se mutace typu substituce nachází na 3´- konci
primeru, potom primer
komplementární k standardní sekvenci bude hybridizovat pouze se standardní sekvencí,
kdežto primer komplementární k mutantní sekvenci bude hybridizovat pouze s mutantní
sekvencí.
PCR
IN
SITU je variantou PCR, při které se vlastní reakce realizuje
v permeabilizovaných buňkách přímo na cytologických nebo histologických preparátech.
Produkty reakce lze detegovat některou z metod používaných při ISH (tzv. nepřímá PCR in
situ) nebo některou z metod detekce značených komponent (primerů, amplifikovaných
fragmentů) PCR (tzv. přímá PCR in situ).
http://library.thinkquest.org/24355/data/techniquesnav.html - Animace PCR.
http://www.biochemie.upol.cz/stranky/vyuka/bam/06.ppt#1 – Techniky PCR.
SCHÉMA POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE (PCR)
Zdroj: http://www.mcb.uct.ac.za/manual/pcroptim.htm
Zdroj: http://www.mcb.uct.ac.za/manual/pcroptim.htm
Komplementarita mezi primery a uvnitř primerů může způsobit problémy při PCR:
Komplementarita dvou primerů (tj. mezi dvěma primery):
Maximální rozsah komplementarity: 4 bp, volná energie = -1,6 kcal.mol-1
5´-ACGTCCAAGAGGAAGCG-3´
3´-ACTTACGACTTTCGAATGTAA-5´
Autokomplementarita (tj. komplementarita uvnitř primeru):
Maximální zjištěný rozsah komplementarity: 6 bp, volná energie = - 0,30 kcal.mol-1
5´-ACGTCCAAGAGGAAGCGCCTCTT-3´
↓
G
⁄
\
A……….C
A…G
G≡C
G≡C
A=T
G≡C
A=T
A=T
5´-ACGTCC
3´
Zdroj: http://www.mcb.uct.ac.za/manual/pcroptim.htm
LIGÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (LCR)
Tato metoda je založena na podobném principu jako PCR. Na začátku LCR se fragment DNA
denaturuje při teplotě kolem 95°C. Poté se při nižší teplotě s každým jednotlivým uvolněným
řetězcem fragmentu DNA komplementárně spojí dva oligonukleotidy, jejichž konce leží těsně
u sebe a proto mohou být spojeny účinkem ligázy. Cykly denaturace a ligace se mnohokrát
opakují. Oproti PCR se místo primerů používají oligonukleotidy a místo amplifikace řetězců
fragmentu DNA se amplifikují ligované oligonukleotidy komplementární k určitým cílovým
sekvencím fragmentu DNA.
SEKVENOVÁNÍ DNA
Sekvenování molekul DNA (nebo jejich fragmentů) je proces, při kterém se stanovuje
pořadí jednotlivých nuleotidů v polydeoxyribonukleotidových řetězcích, tj. primární struktura.
Dnešní automatizované systémy sekvenování vycházejí
v zásadě ze dvou základních
metod: Sangerovy nebo Maxam – Gilbertovy.
SANGEROVA
METODA je založena na modifikované polymerázové reakci. Reakční
směsi jsou čtyři; ve všech je obsažena ssDNA (denaturovaná dsDNA) s funkcí matrice, DNApolymeráza bez nukleázové aktivity (např. Klenowův fragment), primery, směs dNTP a jeden
– ovšem v každé směsi jiný -
2´,3´-dideoxyribonukleotidtrifosfát (ddNTP). Protože v
molekule ddNTP je v poloze C3´místo skupiny OH atom vodíku, nemůže mezi 3´- koncem
ddNTP a 5´- koncem následujícího dNTP vzniknout fosfodiesterová vazba a syntéza řetězce
se ukončí vždy v místě inkorporace ddNTP. V důsledku toho se nasyntetizuje určité spektrum
různě dlouhých komplementárních řetězců, zakončených
na 3´ - konci vždy tím
ddNTP, který byl v dané variantě reakční směsi použit. Produkty polymerázové reakce se
rozdělí elektroforeticky v sekvenačním gelu (tj. v polyakrylamidovém gelu s rozlišovací
dělicí schopností jedné báze a obsahujícím močovinu jako denaturační činidlo). Sekvence
nukleotidů v analyzované DNA se stanoví analýzou vizualizovaných elektroforetogramů:
sekvence, přečtená ve směru od čela ke startu, je sekvencí 5´→ 3´ komplementární k
matričnímu řetězci.
MAXAM – GILBERTOVA METODA je založena na specifické chemické degradaci
řetězce DNA (resp. jeho fragmentu), který byl na konci označen. Jedno vlákno DNA (resp.
jeho fragment) je ve čtyřech variantách vystaveno chemickému činidlu, které specificky
narušuje vazby u určitého nukleotidu: (1) v místě guaninu a adeninu, přičemž v místě
guaninu častěji (G > A), (2) v místě adeninu a guaninu, přičemž v místě adeninu častěji než
v místě guaninu (A > G), (3) stejně často v místě tyminu a cytozinu (C = T) a (4) pouze
v místě cytozinu. Po uskutečněné reakci se produkty rozdělí v sekvenačním gelu s rozlišovací
schopností jedné báze (jako u metody Sangerovy) a sekvence nukleotidů analyzovaného
řetězce DNA se odečte na vizualizovaném elektroforetogramu.
Obě metody sekvenování nukleových kyselin v původní verzi, tj. přibližně tak, jak byly
stručně popsány, byly v období jejich vzniku a počátků zavádění
(70. – 80. léta 20.
století) velkým pokrokem v sekvenování. Používání moderních, dnes již často plně
automatizovaných přístrojů (termocyklerů, sekvenátorů, genetických analyzátorů) celý
pracovní proces od izolace nukleových kyselin až po počítačové zpracování a vyhodnocení
analytických dat významně urychluje a zpřesňuje.
SCHÉMA SANGEROVY METODY
Zdroj: http://is.muni.cz/elportal/estud/lf/js06/bltm0111p/p26_Bioinformatika-verze2006.pdf
APPENDIX – PŘEVZATÉ OBRAZY A SCHÉMATA
http://images.google.cz/imgres?imgurl=http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/imag
es/LigaseAnimation6.gif&imgrefurl=http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/C
hap10.html&usg=__wwiEwBYGLZJb1lMtfO471XhC_f8=&h=297&w=483&sz=53&hl=cs&
start=9&itbs=1&tbnid=tijq0J5fs5hZM:&tbnh=79&tbnw=129&prev=/images%3Fq%3DDNA%2Bfragments%26gbv%3
D2%26hl%3Dcs%26sa%3DG – Mikrobiology (internet text).
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif Microbiology.
Animation of the ligation process. When the sticky ends of two DNA fragments come together and hydrogen
bond through the A-T and G-C pairing, the enzyme LIGASE will form covalent bonds between the two
fragments. Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 3. The ligase reaction. The sticky ends of two DNA strands line up according to their
base pair hydrogen bonding. The cut sites are indicated by the blue arrows. The ligase binds
to the hydrogen-bonded DNA strands and forms covalent bonds between the two DNA ends
(red bonds), thus joining them. Similarly, if the blunt ends of DNA come together the ligase
can form covalent bonds between them.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 4. Cloning. For another figure illustrating cloning click here and view Fig. 11a. Click here and here for
others. Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 5. Amplification of Cloned DNA or its Product. The use of gene cloning to amplify the cloned DNA
and/or to produce lots of the cloned gene's product.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 7. DNA Fingerprinting. Clearly the DNA from the scene-of-the-crime is not that of O.J., as the
fragment patterns (the DNA fingerprint) are different. Had they been the same what would that of said about the
innocence or guilt of O.J.?
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 6. DNA Fingerprinting. In this FIGURE there are two genes with the palindrome sites for two different
restriction enzymes MARKED AS GREEN OR RED BARS. The number and size of the DNA fragments that
would result if the DNA containing these two genes were cut with the respective restriction enzymes are shown.
To determine if you understand what is going on assume that you cut these two genes with BOTH restriction
enzymes at the same time. How many bands would you get on an agarose gel? Label the bands from largest to
smallest with #1 being the LARGEST. Draw how an agarose gel containing these bands would look. For the
answer click here. Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
DNA fingerprinting – animation.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 8. Hybridization probe. A short piece of DNA of known sequence (black bases) has a REPORTER
substance attached to it. This reporter is usually a radioactive element like phosphorous-32 or an enzyme that
induces light production from a substrate molecule and is indicated in this figure by the light bulb. If the probe
sequence finds a complementary base sequence on the bound target or sample DNA, it will hydrogen-bond to it.
When the excess, unbound probe is washed away the location of the bound probe and its complementary DNA
can be detected by the REPORTER on the probe.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 9. Effect of Temperature on Hybridization. In this figure a short piece of DNA, called the PROBE
(Pink Star) is mixed with two different long DNA strands. One of these long strands contains a sequence of base
pair that exactly matches that of the probe, whereas the other differs with respect to a single base pair (yellow
oval). At 55oC the probe binds to BOTH long DNA molecules, however at 65oC the probe does not bind to the
long DNA molecule with a single base pair mismatch. The probe is unable to bind to either long DNA molecule
at 90oC. What do you think might be the results at a temperature of 60oC?
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 10. The hybridization procedure. The DNA samples are cut with R.E. and the fragments separated on a
gel (left). The gel is placed on top of a DNA-binding protein and the DNA-fragments are washed directly onto
the membrane where they stick. A short piece of DNA (the PROBE), to which a reporter molecule is attached, is
heated with the bound DNA overnight. During this time the probe will bind to any complementary DNA
attached to the membrane. All the unbound probe is subsequently washed away. The reporter is visualized so the
location of the sample DNA fragments complementary to the probe DNA can be seen.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Summary animation of the first step in hybridization; transfer of DNA from agarose gel to membrane. For a
professional animation of Southern Blotting that requires Shockwave/32MB memory/Pentium processor click
hear and load the appropriate file.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Summary animation of hybridization procedure (Southern Blot); probing of DNA bound to membrane.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
The original gel, shown
in the middle, produces a smear of genomic DNA fragments (see #Fig. 13). Within those
1000's of fragments are the fragments shown on the left gel cut from a section of the two
original DNA molecules shown in the upper left. When the smear of fragments, fixed to a
membrane, are hybridized with the probe (DNA with attached reporter [green star], Fig. 8),
the probe will HYBRIDIZE (bind) only to those fragments containing sequences of DNA that
complement sequences present in the probe; i.e., those regions DIRECTLY BELOW the
probe DNA. The location (pink ovals) of such complementary membrane-bound-fragments
are shown on the gel at the
Figure 11. Results of Probing the Separated Fragments of Two DNA Samples.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 12. Homework project. For answers click here.
In Fig. 12 three different PROBES (A, B, & C) are hybridized against the separated membrane-bound-DNA
fragments shown on the right (from 3 duplicate gels). As an exercise determine WHICH BANDS each of the
three probes will hybridize (bind) to and light up; that is, draw three duplicate gels, 1, 2, & 3 and circle the
band(s) in gel 1 that probe A will bind to; in gels 2 & 3 do the same with probes B & C respectively.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 13. Experimental Gels. These are three experimental gels showing the outcome of a hybridization
procedure. Gel A shows the banding pattern seen when genomic DNA, digested with a restriction enzyme, is
separated on an agarose gel. The smears in lanes 1 to 9 represent 1,000s of individual DNA fragments produced
by the restriction enzyme digestion. The banding seen in these lanes is due to the high concentration of certain
genes. Gels B & C show examples of banding patterns obtained when genomic DNA smears, bound to a
membrane, are hybridized with specific probes. The probes only bind, or hybridized to, a few of the 1,000s of
fragments that contained base sequences COMPLEMENTARY to those on the probe. Attached to the probes is
substance which produces LIGHT when treated with certain chemicals and this light is detected with
photographic film, in effect taking a picture of each of the locations where the probes bind to a complementary
DNA fragment on the membrane. click here and then click on "Hybridization" for some other cartoons of
Southern Blotting and illustrations of other molecular biology techniques. Click here for another illustration of
hybridization. Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 14. The Blue Dress
Figure 14 illustrates how the stain from Monica's blue dress was tested to determine if it contained the
President's DNA. The DNA from the stain was extracted, digested with one or more restriction enzymes,
amplified by the PCR technique and separated on gels. The separated fragments were transferred to DNAbinding membranes and hybridized with various human-DNA probes. The pattern of the DNA fragments (bands)
in the various samples that "light up" were then compared for similarities and differences. Recently it was
reported that whatever a person handles retains some of that person's DNA. For example, if you pick up a glass
or a cup or a shirt or touch a door knob you or lick a stamp you leave some of your DNA behind which can be
used to identify you. Even wiping off your "fingerprints" may not remove the DNA totally.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 15. The polymerase chain reaction. For another figure illustrating the PCR click here and view the "PCR"
link. Click here and here for brief discussions of PCR.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Summary animation of PCR. For a professional animation that requires Shockwave/32MB memory/Pentium
processor click here and load the appropriate file.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 16. This figure represents another perspective of the PCR reaction. Of particular note is the use of
the PCR to AMPLIFY SPECIFIC DNA SEGMENTS dependent on the PRIMERS EMPLOYED. By
choosing primers with unique sequences one BRACKETS a known length (gene[s])of a DNA molecule. The
bracketed segment is indicated by the dashed lines. The red and blue primers, by their COMPLEMENTARY
BINDING to base pair-sequences on the two respective parental DNA strands insure that ONLY the portion of
DNA between them will be amplified. Five cycles of replication are shown, except that the last cycle is
incomplete. Note that the number of DNA molecules increases EXPONENTIALLY with each cycle of
replication. Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Figure 17. Anti-inflammatory effect of Tumor Necrosis Factor (TNF) therapy on rheumatoid arthritis. In
the top figure TNF puts out a strong signal to the immune cell to produce inflammatory material. In the bottom
figure soluble TNF-receptor binds the TNF before it can activate the inflammatory response.
Zdroj: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif -
Human genomic libraries can be constructed using restriction nucleases and ligase. A
genomic library comprises a set of bacteria, each carrying a different small fragment of
human DNA. For simplicity, cloning of just a few representative fragments (colored) is
shown. Zdroj: http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/ecb/genomic_library.php
Determining the location of specific DNA fragments in a gel by a Southern blot
Zdroj: http://219.221.200.61/ywwy/zbsw(E)/edetail2.htm
Schéma diferenciální centrifugace
Postupná purifikace organel (step-by-step procedure for the purification of organelles)
Sedimentation
Coefficients
and
Densities
of
Organdies,
Macromolecules,
and
Viruses.
A parucl's sedimentation coefficient, expressed in Svedberg units (S), indicates how rapidly it sediments when
subjected to a centrifugal force A partide's density (expressed in g/cm3) determines how far it will move during
equilibrium density centrifugation.
Zdroj: http://219.221.200.61/ywwy/zbsw(E)/edetail2.htm
Mikrospektrofotometrie – průtoková cytometrie
Stanovení obsahu proteinů a nukleových kyselin v buňkách
Fluorescence-activated cell sorter (FACS).
A concentrated suspension of cells is allowed to react with a fluorescent antibody or a dye that binds to a particle
or molecule such as DNA. The suspension is then mixed with a buffer (the sheath fluid), the cells are passed
single-file through a laser light beam, and the fluorescent light emitted by each cell is measured. The light
scattered by each cell can be measured at the same time as the fluorescence; from measurements of the scattered
light, the size and shape of the cell can be determined. The suspension is then forced through a nozzle. which
forms tiny droplets containing at most a single cell At the time of formation, each droplet is given an electric
charge proportional to the amount of fluorescence of its cell. Droplets with no charge and with different electric
charges (due to different amounts of bound dye) are each separated by an electric field and collected. It takes
only milliseconds to sort each droplet, so up to 10 million cells per hour can pass through the machine In this
way, cells that have desired properties can be separated and then grown (Adapted from D. R Parks ard L. A Iferzenberg, 1982, Meth. CeU Bios 28:283)
Zdroj: http://219.221.200.61/ywwy/zbsw(E)/edetail2.htm
Fúze buněk a hybridizace
Fusion of cultured animal cells.
(a) Unfused growing mouse cells with a single nucleus per cell. (b) Fused mouse cells with 2—5 nuclei per cell.
Fusion was induced by treatment with polyethylene glycol (45 percent) for 1 minute. The number of nuclei per
fused cell (heterokaryon) is determined by the polyethylene glycol concentration and the time of exposure. By
adjustment of these factors, the number of heterokaryons containing only two nuclei can be maximized. [From
R. L. Davidson and R S. Gerald, 1976, Som. Cell Genet. 2:165.]
Zdroj: http://219.221.200.61/ywwy/zbsw(E)/edetail2.htm
Monoclone antibody
Cesar Milstein and Georges Kohler1975, in Cambridge developing: The hybridomas techniques.
HAT selective medium: (hypoxanthin,aminopterin,and thymidine). The cell with HGPRT growing;
The cell lacking HGPRT don’t growing.
Zdroj: http://219.221.200.61/ywwy/zbsw(E)/edetail2.htm
Transgenní ovce
Zdroj: http://219.221.200.61/ywwy/zbsw(E)/edetail1.htm