Caractérisation des génotypes du virus de l`hépatite B (VHB) par

Transcription

N° d’Ordre……………..BioGeMA
UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU
--------------UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE
LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
(LABIOGENE)
(UFR/SVT)
Mémoire Présenté
Par
: DIARRA Birama
Pour l’obtention du Master II
de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées
de l’Université de Ouagadougou
SUR LE THEME:
Caractérisation moléculaire des génotypes du virus de l’hépatite B
(VHB) chez les donneurs de sang du centre régional de
transfusion sanguine de Ouagadougou, Burkina Faso.
Soutenu le 12 Novembre 2013 devant le jury composé de :
Président : Alain BOUGOUMA, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou
Membres : Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou
Rokia SANOGO, Maitre de Conférences Agrégé, Université de Bamako
Virginio PIETRA, Chargé de Recherche, Université de Brescia, Italie
Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA
De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont
incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques.
Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le
domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans
l’aide à la justice par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de
recherche des Pays membres de l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux
pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en
génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le
manque de ressources financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ.
Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité ainsi que de l’utilisation des
résultats et produits des recherches que nous conduisons, une surenchère du coût des
examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre corollaire et non des
moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des cerveaux car
les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester.
Le master en Biologie Moléculaire et en génétique moléculaires appliquées (BioGeMA) a
pour but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires
par la mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut
niveau de compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie
moléculaires.
Le master BioGeMA est :
 Un Master à dimension sous-régionale
 Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie
moléculaires
 Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE
(Laboratoire de Biologie et de Génétique Moléculaires)
Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des
médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres
hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En
outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la
formation de chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la relève du corps
enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un
véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité.
Professeur Jacques SIMPORE
Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire
et de Génétique Moléculaire
UFR/SVT - École Doctorale Sciences et
Technologies
Université de Ouagadougou – Burkina Faso
Master 2 BioGeMA 2011-2012
DIARRA
Birama
Page I
DEDICACES
A mon père Zan et à ma mère Sounkoura MALE qui ont donné tout ce qu’ils pouvaient
pour que je sois là aujourd’hui. Soyez honorés pour tous vos efforts.
A ma femme Kadidiatou SYLLA et ma fille Sounkoura dite Batoma, mes plus grandes
joies de vivre, pour ces temps passés loin de vous alors que vous avez si besoin de moi. Je
vous dédie ce mémoire.
Au Professeur Rokia SANOGO, ce travail est le fruit de votre générosité et engagement
dans la formation des étudiants. Soyez honoré pour les efforts consentis.
A Docteur Cheikna ZONGO et famille pour votre accueil chaleureux, et votre soutien moral
et matériel. Je vous dédie ce mémoire.
A mes Frères, Sœurs, Parents et Amis pour votre soutien moral et vos encouragements tout au
long de mes études.
A tous ceux, qui, d’une manière ou d’une autre, ont contribué à l’aboutissement de ce travail.
DIARRA
Birama
Page II
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé dans le laboratoire de biologie moléculaire du Centre de Recherche
Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE). Nous exprimons notre profonde
gratitude :
Au Pr Jacques SIMPORE, Professeur titulaire, Coordonnateur du Master de Biologie et de
Génétique Moléculaires Appliquées (BioGeMA), Directeur du laboratoire du Centre Médical
Saint Camille (CMSC) à Ouagadougou, Directeur du Centre de Recherche Biomoléculaire
Pietro
ANNIGONI /Laboratoire
de
Biologie
Moléculaire
et
de
Génétique
(CERBA/LABIOGENE), Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin , pour avoir accepté
la direction de ce Master, pour le choix pertinent de ce thème, pour le support économique de
cette étude et pour son encadrement exceptionnel.
Aux honorables membres du jury pour avoir accepté de faire partie du jury malgré vos
multiples occupations. Soyez-en remercié.
Au Dr Cyrille BISSEYE, Enseignant au Master II BioGeMA, pour son encadrement
technique au laboratoire et son expertise dans la rédaction de ce mémoire.
Aux Docteurs DJIGMA Wendkuuni Florencia, Djénéba OUERMI et SAGNA Tani, pour
leurs disponibilités et conseils dans l’amélioration de la qualité de ce travail.
A Mr TAO Issoufou, pour sa disponibilité lors de la collecte de nos échantillons.
A la Première promotion du Master II de BioGeMA, en souvenir de nos moments certes
difficiles mais prometteurs, ma reconnaissance pour ces bons moments de marche commune.
La volonté et le sens patriotique qui nous animent me laissent croire à un lendemain meilleur
de la Biologie et Génétique Moléculaires Appliquées dans nos pays respectifs. Aussi, j’espère
que la bonne ambiance qui a caractérisé nos relations durant ces moments nous permettra de
tisser des relations professionnelles saines et fécondes. Brillante carrière professionnelle et
scientifique à tous!!!
Au corps professoral de l’UFR/SVT en général et celui du Master II de BioGeMA en
particulier, Vous avez contribué à notre formation en nous dispensant des enseignements de
hauts niveaux. Nous vous en serons toujours reconnaissants et en ferons bon usage.
A l’Union Economique et Monétaire Ouest Africaine (UEMOA) pour le soutien financier
du master BioGeMa à travers le programme PACER2.
DIARRA
Birama
Page III
RESUME
Introduction : L'infection persistante au virus de l’hépatite B (VHB) est un facteur de risque
au développement de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire (CHC). Les facteurs viraux,
tels que les génotypes et leur variant, se sont révélés être associés à la pathogenèse du
carcinome hépatocellulaire et à la réponse aux traitements. Peu d’études se sont intéressées
aux génotypes du VHB circulant au Burkina Faso. L’objectif de cette étude est la
caractérisation des génotypes du virus de l’hépatite B chez les donneurs de sang, positifs à
l’AgHBs par ELISA, du centre régional de transfusion sanguine de Ouagadougou, Burkina
Faso.
Méthodes : Cette étude menée au centre régional de transfusion sanguine de Ouagadougou
(CRTS) et au laboratoire du centre de recherche biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) a
concerné 200 donneurs de sang de premier don positifs à l’antigène de surface du VHB
(AgHBs). La PCR multiplex a été utilisée pour caractériser les génotypes du VHB. Les
génotypes caractérisés ont été confirmés par une PCR de pré-séquençage.
Résultats : L'étude a confirmé par PCR la présence effective de l'ADN viral du VHB
chez 41sur les 200 donneurs de sang. Les génotypes A, B, D et F du VHB étaient absents
chez les donneurs de sang.
Les prévalences des génotypes E et C étaient respectivement de 26,8% et 9,8%. La majorité
(63,4%) des donneurs de sang était porteurs d’infections mixtes E/C.
Conclusion : Dans cette étude nous confirmons non seulement la prédominance du génotype
E mais mettons aussi en évidence pour la première fois à notre connaissance l’existence du
génotype C du VHB au Burkina Faso. Le nouveau recombinant E/C pourrait éventuellement
être le premier sous génotype du virus de l’hépatite B en Afrique de l’ouest nommé E1.
Mots clés : VHB, PCR multiplex, Génotypage, Donneurs de sang, Burkina Faso.
DIARRA
Birama
Page IV
ABSTRACT
Introduction: Persistent infection with the hepatitis B virus (HBV) is a risk factor for the
development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The viral factors such as
genotype and varying them have found to be associated with the pathogenesis of
hepatocellular carcinoma. Few studies have examined the HBV genotypes circulating in
Burkina Faso. The objective of this study is the characterization of genotypes of hepatitis B
virus in blood donors positive for HBsAg by ELISA, regional blood transfusion center in
Ouagadougou, Burkina Faso.
Methods: This study regional blood transfusion center of Ouagadougou (CRTS) and
laboratory research center biomolecular Pietro Annigoni (CERBA) involved 200 blood
donors positive first donation to the HBV surface antigen (HBsAg). Multiplex PCR was used
to characterize the genotypes of HBV. Characterized the genotypes were confirmed by PCR
pre-sequencing.
Results: The study confirmed by PCR the actual presence of viral DNA HBV 41sur 200
blood donors. Genotypes A, B, D and F of HBV were absent in blood donors.
The prevalence of genotype E and C were 26.8% and 9.8% respectively. The majority
(63.4%) of blood donors was carrying mixed infections E/C.
Conclusion: In this study we confirm not only the prevalence of genotype E but also put in
evidence for the first time to our knowledge the existence of HBV genotype C in Burkina
Faso. The new recombinant E/C could possibly be the first in genotype of hepatitis B virus in
West Africa called E1.
Key words: HBV, multiplex-PCR, genotyping, blood donors, Burkina Faso.
DIARRA
Birama
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SOMMAIRE
Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA ----------------------------------------------------- I
DEDICACES ----------------------------------------------------------------------------------------------- II
REMERCIEMENTS ------------------------------------------------------------------------------------- III
RESUME --------------------------------------------------------------------------------------------------IV
ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------------------------------ V
SOMMAIRE ----------------------------------------------------------------------------------------------VI
LISTE DES FIGURES-----------------------------------------------------------------------------------IX
LISTE DES TABLEAUX -------------------------------------------------------------------------------- X
LISTE DES ABREVIATIONS -------------------------------------------------------------------------XI
INTRODUCTION ----------------------------------------------------------------------------------------- 1
1 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE --------------------------------------------------------------------- 3
1.1. Virus de l’hépatite B ------------------------------------------------------------------------------ 3
1.1.1. Historique ------------------------------------------------------------------------------------- 3
1.1.2. Les hepadnaviridae -------------------------------------------------------------------------- 3
1.1.3. Morphologie et structure génétique du VHB --------------------------------------------- 4
1.1.3.1. Structure des particules virales ------------------------------------------------------- 4
1.1.3.1.1. Les virions VHB (particules de Dane) ----------------------------------------- 4
1.1.3.1.2. Organisation du génome ---------------------------------------------------------- 5
1.1.4. Cycle de réplication du VHB --------------------------------------------------------------- 7
1.1.4.1. L’entrée virale --------------------------------------------------------------------------- 7
1.1.4.2. Transport des nucléocapsides VHB au noyau -------------------------------------- 8
1.1.4.3. Réparation et conversion du brin d’ADN-Rc en ADN-ccc ----------------------- 9
1.1.4.4. La transcription ------------------------------------------------------------------------- 9
1.1.4.5. La traduction --------------------------------------------------------------------------- 10
1.1.4.6. Réplication du génome viral --------------------------------------------------------- 10
1.1.4.7. Enveloppement des nucléocapsides et sécrétion virale -------------------------- 10
1.1.5. Mode de transmission du VHB ------------------------------------------------------------ 11
DIARRA
Birama
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1.1.5.1. Transmission sexuelle ----------------------------------------------------------------- 11
1.1.5.2. Transmission parentérale ------------------------------------------------------------- 11
1.1.5.3. Transmission horizontale ------------------------------------------------------------- 11
1.1.5.4. Transmission périnatale --------------------------------------------------------------- 11
1.1.6. Histoire naturelle de l’infection par VHB ------------------------------------------------ 12
1.1.6.1. Tropisme cellulaire -------------------------------------------------------------------- 12
1.1.6.2. Pathogenèse----------------------------------------------------------------------------- 12
1.1.6.3. Profils sérologiques-------------------------------------------------------------------- 12
1.1.6.4. L’hépatite B aiguë --------------------------------------------------------------------- 13
1.1.6.5. L’hépatite chronique ------------------------------------------------------------------ 14
1.1.7. Epidémiologie du VHB --------------------------------------------------------------------- 15
1.1.8. Diagnostic du HBV chez l’homme ------------------------------------------------------- 16
1.1.8.1. Recherche des marqueurs sérologiques : ------------------------------------------- 16
1.1.8.1.1. Antigènes viraux ------------------------------------------------------------------ 16
1.1.8.1.2. Les anticorps ---------------------------------------------------------------------- 16
1.1.8.2. Détection et quantification de l’ADN du VHB ------------------------------------ 16
1.2. Méthodes d’étude de la variabilité du génome du VHB ------------------------------------ 17
1.2.1. Séquençage et analyse phylogénétique --------------------------------------------------- 17
1.2.2. Analyse par polymorphisme de restriction----------------------------------------------- 17
1.2.3. Utilisation d’amorces spécifiques --------------------------------------------------------- 17
1.3. Diversité génétique du VHB -------------------------------------------------------------------- 18
1.3.1. Sérotypes HBs ------------------------------------------------------------------------------- 18
1.3.2. Génotype, sous génotype et épidémiologie moléculaire ------------------------------- 18
1.4. Traitement et Prévention ------------------------------------------------------------------------ 20
1.4.1. Les analogues de nucléos(t)ides ----------------------------------------------------------- 20
1.4.2. Les traitements « immuno-modulateurs »------------------------------------------------ 21
1.4.3. La vaccinothérapie -------------------------------------------------------------------------- 21
2. OBJECTIF DU MEMOIRE : ------------------------------------------------------------------------ 23
DIARRA
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Page VII
2.1. Objectif général ----------------------------------------------------------------------------------- 23
2.2. Objectifs spécifiques : --------------------------------------------------------------------------- 23
3. MATERIEL ET METHODES----------------------------------------------------------------------- 25
3.1. Cadre d’étude ------------------------------------------------------------------------------------- 25
3.2. Matériel -------------------------------------------------------------------------------------------- 25
3.2.1. Réactifs : -------------------------------------------------------------------------------------- 25
3.2.2. Appareillage: --------------------------------------------------------------------------------- 25
3.2.3. Autres matériel: ------------------------------------------------------------------------------ 26
3.3. Méthodes ------------------------------------------------------------------------------------------- 26
3.3.1. Type et Période d’étude -------------------------------------------------------------------- 26
3.3.2. Population d’étude--------------------------------------------------------------------------- 26
3.3.3. Détection du VHB -------------------------------------------------------------------------- 26
3.3.3.1. Extraction et quantification de l’ADN du VHB ----------------------------------- 26
3.3.3.2. La PCR multiplex ---------------------------------------------------------------------- 27
3.3.3.2.1. Caractérisation des génotypes par PCR multiplex --------------------------- 27
3.3.3.2.2. La PCR de pré-séquençage des génotypes ------------------------------------ 31
3.3. Analyse des données ---------------------------------------------------------------------------- 32
3.4. Considérations éthiques ------------------------------------------------------------------------- 32
4. RESULTATS ------------------------------------------------------------------------------------------ 34
4.1. Caractéristiques sociodémographiques des donneurs de sang. ---------------------------- 34
4.2. La fréquence des coinfections chez les donneurs de sang de l’étude --------------------- 34
4.3. Caractérisation des génotypes du VHB chez les donneurs de sang ----------------------- 35
4.4. La PRC de pré-séquençages des génotypes --------------------------------------------------- 36
5. DISCUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------ 39
6. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ------------------------------------------------------------- 44
7. Références ---------------------------------------------------------------------------------------------- 46
DIARRA
Birama
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LISTE DES FIGURES
Figure 1: Structure du virus de l’hépatite B ............................................................................... 4
Figure 2: Organisation du génome du VHB. .............................................................................. 5
Figure 3: Cycle de réplication du génome des hepadnavirus. .................................................... 8
Figure 4: Evolution des marqueurs sérologiques au cours de l’infection au VHB .................. 13
Figure 5: Thermocycleur Gene-Amp® PCR System 9700 ...................................................... 25
Figure 6: Photo du gel d’agarose 2% de quelques échantillons positifs aux génotypes C et E.
.................................................................................................................................................. 35
Figure 7: Photo du gel d’agarose 2% de quelques échantillons coinfectés aux génotypes C et
E. .............................................................................................................................................. 36
Figure 8: Photo du gel d'agarose 2% de la PCR de pré-séquençage des échantillons. ............ 36
DIARRA
Birama
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LISTE DES TABLEAUX
Tableau I: Les pairs d’amorces spécifiques à l’amplification des génotypes A-F du VHB. .. 29
Tableau II : Tailles des fragments et les génotypes correspondants ........................................ 30
Tableau III: La paire d’amorces du PCR de pré-séquençage ................................................... 31
Tableau IV: Caractéristiques sociodémographiques des donneurs de sang de Ouagadougou. 34
Tableau V: Répartition des génotypes des échantillons confirmés en fonction des
caractéristiques sociodémographiques des donneurs de sang. ................................................ 37
DIARRA
Birama
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LISTE DES ABREVIATIONS
aa
:
Acide aminé
ADN RC
:
ADN relâché circulaire
ADN
:
Acide désoxyribonucléique
ADNccc
:
covalently closed circular DNA(ADN circulaire fermé de façon covalente)
AgHBc
:
Antigène de la capside du HBV
AgHBe
:
Antigène e du HBV
AgHBs
:
Antigène de surface du HBV
ALAT
:
Alanine amino-transférase
Anti-HBc
:
Anticorps dirigé contre la protéine core du virus de l’hépatite B
Anti-HBe
:
Anticorps dirigé contre la protéine e du virus de l’hépatite B
Anti-HBs
:
Anticorps dirigé contre la protéine de surface du virus de l’hépatite B
ARN
:
Acide ribonucléique
ARNm
:
Acide ribonucléique messager
ARNpg
:
Acide ribonucléique pré-génomique
CHC
:
Carcinome hépatocellulaire
ChHBV
:
Chimpanzee Hepatitis B Virus (virus de l’hépatite B du Chimpanzé)
CTL
:
Lymphocyte T cytotoxique
DHBV
:
Duck Hepatitis B Virus (virus de l’hépatite B du canard)
DR1 et DR2
:
Direct repeat
GiHBV
:
Gibbon Hepatitis B (virus virus de l hépatite B du Gibbon)
GoHBV
:
Gorilla Heaptitis B virus (virus de l’hépatite B du Gorille)
HSp90
:
Heat shock protein 90 (Protéine de choc thermique 90)
IFN
:
Interféron
NLS
:
Nuclear localization signal
OMS
:
Organisation Mondiale de Santé
OuHBV
:
Orang-outan Hepatitis B virus (virus de l’hépatite B de l’Orang-outan)
RE
:
Réticulum endoplasmique
TLM
:
Translocation motif
UV
:
Ultra violet
VHB
:
Virus de l’Hépatite B
VHD
:
Virus de l’Hépatite Delta
VIH
:
Virus de l'immunodéficience humaine
WHBV
:
Woodchuck Hepatitis B Virus (virus de l’hépatite B de la marmotte)
WMHBV
:
Wooly Monkey Hepatitis B Virus (virus de l’hépatite B du singe laineux)
YMDD
:
Tyrosine-Méthionine-Aspartate-Aspartate
DIARRA
Birama
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INTRODUCTION
INTRODUCTION
INTRODUCTION
L'infection au virus de l’hépatite B (VHB) constitue un problème majeur de santé publique
dans le monde. On estime à 2 milliards le nombre d’individus infectés par le VHB dans le
monde et à plus de 240 millions le nombre de personnes chroniquement infectées (OMS,
2013), dont 65 millions en Afrique (Kramvis et Kew, 2007a). Près de 600 millions de
personnes meurent chaque année des conséquences aiguës ou chroniques de cette infection
(OMS, 2013). L'infection persistante par le VHB est un facteur de risque pour le
développement de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire (CHC). Les facteurs viraux,
tels que les génotypes et leur variant, se sont révélés être associés à la pathogenèse du CHC
(Zhou et al., 2012).
Le Burkina Faso (BF) est un pays à forte endémicité avec une prévalence de VHB supérieure
à 8% dans la population générale (Simpore et al., 2006). Chez les donneurs de sang, des
prévalences en AgHBs de 14,3% et 17% ont été observées respectivement dans les zones
rurale (Nouna) et urbaine (Ouagadougou). Celles en Ac anti HBc étaient de 69,6 % (Nouna)
et de 76,4 % (Ouagadougou) (Collenberg et al., 2006).
Les tests sérologiques de routine permettent généralement de poser le diagnostic d’hépatite
chronique et de surveiller l’évolution de la maladie. Cependant, certains patients atteints
d'hépatite B chronique présentent des profils sérologiques atypiques, mettant en défaut les
tests diagnostiques classiques. Notamment dans la banque de sang, les dons provenant de
donneurs en phase de séroconversion, de porteurs chroniques du VHB avec un niveau bas
d’AgHBs circulant ainsi que de donneurs infectés par certains mutants du VHB, ne peuvent
pas
être détectés par les tests AgHBs actuellement employés. L’utilisation des tests
moléculaires a conduit à la détection et au typage de l'ADN du VHB chez les personnes à
AgHBs négatif (VHB occulte) (Panigrahi et al., 2010).
Le génome du VHB est génétiquement variable. Des études phylogénétiques de différents
génomes viraux ont permis de classer le VHB en 10 génotypes (A-J) (Tatematsu et al., 2009)
(Ma et al., 2011). Le tableau clinique, la réponse au traitement, le pronostic à long terme ainsi
que le profil de séroconversion sont influencés par le génotype du VHB infectant le patient
(Lu et al., 2012; Ghosh et al., 2013).
Les génotypes du VHB ont une distribution géographique distincte et sont corrélés avec la
gravité des maladies hépatiques. Le génotype C est associé à des hépatites plus sévères que le
DIARRA
Birama
Page 1
génotype B (Kao et al., 2002). Le génotype D semble prédisposer à un risque élevé au
développement du CHC, et un taux de mortalité plus élevé après transplantation hépatique
que le génotype A (Lusida et al., 2009). En outre, les patients porteurs des génotypes C et D
ont un faible taux de réponse au traitement par interféron α (IFN-α) par rapport à ceux des
génotypes A et B. Par conséquent, le génotypage du VHB est d'une grande importance dans
l'orientation du traitement, l'amélioration du vaccin et le contrôle des maladies hépatiques (Ma
et al., 2011).
Des méthodes fiables et faciles pour différencier les génotypes et sous génotypes du VHB
sont une condition préalable à des tests d’épidémiologies moléculaires et des études cliniques.
Plusieurs méthodes ont été développées pour identifier les génotypes ou sous génotypes du
VHB (Bartholomeusz et Schaefer, 2004). La PCR-Multiplex semble convenir pour une
analyse à grande échelle (Kirschberg et al., 2004; Naito et al., 2001). Un système efficace et
peu couteux de PCR-Multiplex a été développé en utilisant une Taq polymérase commune.
Cette méthode est sensible et rapide dans l'identification des génotypes (A à F) du VHB et
adaptée pour la différenciation des sous génotypes B1, B2, C1 et C2 (Chen et al., 2007).
Peu d’études se sont intéressées aux génotypes du VHB circulant au Burkina Faso. Une étude
est donc nécessaire pour connaitre les génotypes circulants et d’identifier leur prévalence.
DIARRA
Birama
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REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. Virus de l’hépatite B
1.1.1. Historique
L’hépatite virale B est une inflammation du foie consécutive à l’infection par le virus de
l’hépatite B et s’accompagne parfois d’ictère (jaunisse). L’origine virale de l’hépatite B fut
évoqué pour la première fois en 1947 (Borensztejn, 1948).
En 1965, Baruch Blumberg a découvert l’antigène « Australia » (Blumberg et al., 1965).
Après plusieurs études, il publia un article montrant la relation entre cet antigène et l’hépatite
(Blumberg et al., 1967). Le nom d’antigène HBs fut, par la suite, adopté pour désigner cet
antigène. Dane et ses collaborateurs découvrirent en 1970 un troisième type de particules plus
dense, sphériques de 42 nm de diamètre au microscope électronique : « la particule de Dane ».
Ces particules constituaient la forme complète et infectieuse du virus de l’hépatite B (Dane et
al., 1970). Au début des années 1980 le génome du virus a été séquencé et les premiers
clonages réussis par Pierre Tiollais, a permis la production de masse des vaccins anti-hépatite
B par recombinaison génétique (Tiollais et al., 1981). Le VHB devient le chef de file d’une
nouvelle classe de virus, les Hepadnaviridae.
1.1.2. Les hepadnaviridae
La famille des hépadnavirus rassemble de petits virus à ADN hépatotrope, scindés en deux
genres les orthohepadnavirus qui infectent seulement les mammifères et les avihepadnavirus
qui infectent les oiseaux. Le représentant type de la famille des orthohepadnavirus est le
VHB qui infecte l’Homme et expérimentalement peut aussi infecter le chimpanzé (Dane et
al., 1970). Cette famille comprend également des virus trouvés chez les primates de l’ancien
monde (gorille, chimpanzé, gibbon, orang-outan) et du nouveau monde le singe laineux
(Grethe et al., 2000). Le DHBV (Duck Hepatitis B Virus) est le chef de file des
Avihepadnavirus qui inclut également le HHBV (Heron hepatitis B virus), le SGHV (snow
goose hepatitis virus) qui infectent respectivement le héron cendré Ardea cinerea et l'oie
Anser caerulescens, le STHBV (Stork Hepatitis B virus) infectant la cigogne et enfin le
CHBV (Crane Hepatitis B Virus) qui infecte la grue (Schaefer, 2007).
DIARRA
Birama
Page 3
1.1.3. Morphologie et structure génétique du VHB
1.1.3.1. Structure des particules virales
Les particules virales, visibles en microscopie électronique, se présentent sous trois formes
morphologiquement différentes dans le sérum des patients infectés. Les Particules Sous
Virales (PSV), sphériques (filamenteuses) et les virions infectieux VHB ou particules de Dane
sont constitués d’une enveloppe lipidique dans laquelle sont insérées les 3 protéines de
surface du virus : les petites (S ou S-AgHBs), moyennes (M ou M-AgHBs) et grandes (L ou
L-AgHBs) protéines d’enveloppe du VHB. La protéine S est le constituant principal de
l’enveloppe des 3 types de particules et un marqueur important de l’infection par VHB
(Gilbert et al., 2005).
1.1.3.1.1. Les virions VHB (particules de Dane)
Les virions VHB (figure 1) ont un diamètre de 42 nm et une symétrie icosaédrique, imposée
par la nucléocapside de 27 nm qu’ils renferment. L’enveloppe lipoprotéique des virions VHB
est riche en protéine L-AgHBs (environ 20 % des protéines d’enveloppe totale) (Gilbert et al.,
2005). Une étude a démontré la présence de cholestérol dans cette enveloppe (Bremer et al.,
2009). Au cœur de chaque virion, protégé par l’enveloppe virale, on retrouve la nucléocapside
composée de 240 protéines de capside ou AgHBc qui renferme le génome VHB lié de
manière covalente à la polymérase virale, ainsi que des protéines chaperonnes et des kinases
cellulaires (Dryden et al., 2006)
Figure 1: Structure du virus de l’hépatite B (Source : http://toutsavoir-ist.fr/hepatite-b)
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1.1.3.1.2. Organisation du génome
Le virus de l’hépatite B est l’un des plus petits génomes décrits avec un ADN circulaire
relâché d’environ 3200 paires de base (pb) partiellement double brin appelé ADN-RC (figure
2). Il est constitué d’un long brin codant de polarité négative [brin(-)] d’environ 3200 pb qui
possède une courte redondance terminale de 8 à 9 nucléotides sur ces deux extrémités 5’ et 3’
appelée « r ». Ces structures redondantes sont essentielles à la réplication virale. La
polymérase virale est liée de façon covalente à l’extrémité 5’ du brin (–) par une liaison
phospho-tyrosine. Le brin complémentaire de polarité positive non codant brin (+) est de
longueur variable et possède une courte séquence d’ARN à son extrémité 5’ (figure 2).
L’extrémité 5’ du brin (+) chevauche les deux extrémités du brin (-). La complémentarité de
200 pb entre les régions 5’ des deux brins définit la « région cohésive » qui permet la
circularisation du génome. Cette région contient deux séquences directement répétées DR1 et
DR2 (Direct repeat) qui jouent un rôle crucial dans la réplication du virus (Locarnini, 2004).
Figure 2: Organisation du génome du VHB (Beck et Nassal, 2007).
Légende : La partie double brin, circulaire RCDNA est indiqué par des traits noirs épais, avec P liée de manière
covalente à l'extrémité 5 'de l’ADN (-), l'ARN et l'amorce (ligne en zigzag) à l'extrémité 5' du ADN (+). La partie
en pointillés symbolise les longueurs hétérogènes des brins (+). DR1 et DR2 sont les répétitions directes. Le
cercle extérieur symbolise l’ARNpg terminale redondante avec ɛ proche de l’extrémité 5’, et la queue poly-A à
l’extrémité 3’. L'ARNm pré-core est presque identique, sauf qu'elle commence un peu en amont. Les positions
relatives des cadres ouverts de lecture pour noyau (C), P, préS / S, et X sont représentées à l'intérieur. TP,
domaine protéique Terminal.
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Le génome du VHB code pour les protéines structurales constituant l’enveloppe (3 protéines
de surfaces) et la capside (la protéine core, la protéine pré-core ou AgHBe), une ADN
polymérase qui possède une fonction de reverse transcriptase, un transactivateur
transcriptionnel (protéine X) (Becket Nassal, 2007).
1.1.3.1.2.1. La polymérase
Le cadre ouvert de lecture codant pour la protéine P, ou polymérase virale, couvre près de
80% du génome des hépadnavirus. Les particules virales ne contiennent qu’une seule protéine
P par particule (Locarnini, 2004). La polymérase possède 3 domaines fonctionnels impliqués
dans la réplication:
-
l’extrémité N-terminale ou TP (Terminal Protein) permet la liaison covalente de la
protéine avec l’extrémité 5’ du brin (-) d’ADN (Locarnini, 2004).
-
la région ADN polymérase/transcriptase inverse contient un motif peptidique
Tyrosine-Méthionine-Aspartate-Aspartate (YMDD) important pour l’activité de
transcription inverse (Schildgen et al., 2010) ;
-
le domaine RNAse H est responsable de la dégradation de l’ARN pré-génomique lors
de la synthèse du brin (-) de l’ADN viral (Locarnini, 2004).
1.1.3.1.2.2. Les protéines d’enveloppe
L’enveloppe des particules virales contient 3 types de protéines de surface codés à partir d’un
même cadre ouvert de lecture possédant 3 codons d’initiation de la traduction. La protéine
majoritaire (S) de 226 aa et 24 kDa est constituée exclusivement de la région S, commune aux
3 protéines de surface. Elle assure leur ancrage dans la bicouche lipidique de l’enveloppe
virale ou dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE), où elles sont synthétisées. La
protéine moyenne (M) de 30 kDa possède 55 aa N-terminaux supplémentaires, correspondant
à la région Pré-S2. Enfin, la grande protéine (L) de 39 kDa comporte en plus des régions S et
Pré-S2, une région Pré-S1 de 108 aa à son extrémité N-terminale (génotype D). Elles
possèdent toutes un site potentiel de N-glycosylation situé au niveau de leur domaine commun
(Locarnini, 2004).
1.1.3.1.2.3. Les protéines HBc et HBe
L’antigène du core (AgHBc) est la protéine structurale majeure de la capside. Elle possède
une extrémité C-terminale basique permettant sa liaison à l’ADN viral. De plus, l’initiation de
la traduction en 5’ de la séquence pré-C, située en amont du gène C et dans le même cadre de
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lecture, aboutit à la synthèse d’une protéine pré-C. La présence de cette séquence
supplémentaire en position N-terminale de la protéine HBc, correspondant à un peptide
signal, dirige la protéine vers le RE. Au cours de ce processus, la protéine perd son extrémité
C-terminale basique. Finalement, c’est une protéine de 16 kDa, nommée antigène HBe, que
l’on retrouve dans le sérum des malades (Locarnini, 2004).
1.1.3.1.2.4. La protéine X (HBx)
C’est une protéine de 154 aa et de 17 kDa découverte en 1985 grâce à l’identification
d’anticorps dirigés contre des épitopes de celle-ci (Bouchardet Schneider, 2004). C’est un
régulateur multifonctionnel qui module la transcription, la transduction du signal, le cycle
cellulaire, les voies de dégradation des protéines, l’apoptose et la stabilité génétique en
interagissant directement ou indirectement avec des facteurs cellulaires (Tang et al., 2006).
Elle permet d’augmenter l’expression des gènes du VHB ainsi que la réplication virale en
agissant comme un coactivateur transcriptionnel des facteurs de transcription cellulaire. Ainsi,
son inactivation grâce à des méthodes utilisant des ARNs interférents diminue la transcription
et la réplication du VHB. De ce fait, le développement d’antiviraux ciblant la protéine X
pourrait en théorie permettre de limiter la réplication virale et de diminuer le développement
de CHC associés au VHB (Bouchard et Schneider, 2004; Yang et Cho, 2013).
1.1.4. Cycle de réplication du VHB
Sa principale originalité réside dans le fait que le VHB, qui est un virus à ADN, n’utilise pas
un mécanisme semi-conservatif mais une étape de transcription inverse (figure 3) à partir de
l’ARNpg (ARN pré-génomique) pour répliquer son génome (Beck et Nassal, 2007).
1.1.4.1. L’entrée virale
La première étape pour l’infection par le VHB est l’attachement de la particule infectieuse à
une structure exposée accessible à la surface des hépatocytes de l’hôte. Ce premier contact est
souvent décrit comme réversible, de faible affinité et rapide. L’attachement initial et la
reconnaissance du récepteur spécifique contribuent à la spécificité de l’hôte et au tropisme
cellulaire. Il nécessite cependant le domaine Pré-S1 de la grande protéine (L) de surface. La
myristylation de cette protéine serait essentielle à l’infectivité des particules virales (Glebe et
Urban, 2007). Grâce à cette interaction, les virions seraient internalisés lentement (jusqu’à 16
heures) dans les hépatocytes par endocytose pH indépendant (Chojnacki et al., 2005). Une
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autre étude suggère un rôle crucial des motifs de translocation (TLM) dans la voie de
l’endocytose (Stoeckl et al., 2006).
Figure 3: Cycle de réplication du génome des hepadnavirus (Beck et Nassal, 2007).
Légende : Virion enveloppé infecte la cellule, libère dans le cytoplasme l’ADN-RC contenant nucléocapside. (1)
ADN-RC est transporté vers le noyau, pour former ADNccc. (2) La transcription de ADNccc par l'ARN
polymérase Ⅱ produit l’ARNpg. (3) L’ARNpg est encapsidé, conjointement avec la protéine P, et une
transcription inverse à l'intérieur de la nucléocapside. La synthèse de l'ADN(+) à partir de la matrice ADN(-)
engendre une nouvelle ADN-RC. De nouveaux cycles cation intracellulaire conduisent à l’amplification
ADNccc, ou alternativement, les nucléocapsides contenant ADN-RC sont enveloppés et libérés comme virions.
PM, la membrane plasmique (Beck et Nassal, 2007).
1.1.4.2. Transport des nucléocapsides VHB au noyau
Les nucléocapsides, relargués dans le cytoplasme des hépatocytes empruntent le réseau de
microtubules (MT) pour atteindre le centre organisateur des microtubules ou microtubule
organizing center (MOTC) à proximité du noyau et des pores nucléaires. Une fraction des
protéines de capsides expose à la surface des nucléocapsides le domaine C-terminal portant le
NLS (Séquence de Localisation Nucléaire) (Rabe et al., 2006; Roseman et al., 2005).
Cette séquence NLS interagit avec les importines α (Imp α) pour former un complexe
nucléocapside VHB-imp α puis l’importine β (Imp β) lie ce complexe ce qui favoriserait le
contact avec le pore nucléaire et entraînerait sa translocation dans le pore nucléaire (Kann et
al., 2007). Après dissociation des importines α et β, les nucléocapsides VHB se désassemblent
en dimères d’AgHBc à l’intérieur du pore et libèrent le génome viral dans le noyau cellulaire
(Rabe et al., 2009). Les protéines de capside diffusent dans le noyau et se réassemblent en
capsides vides lorsqu’elles atteignent une concentration critique (Kann et al., 2007).
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1.1.4.3. Réparation et conversion du brin d’ADN-Rc en ADN-ccc
Dans les hépatocytes infectés, l’ADN-RC est immédiatement transformé en une forme
circulaire double brin stable et persistante appelé ADNccc ou « covalently closed circular
DNA » par les enzymes cellulaires. L’ADNccc prend la forme d’un minichromosome viral qui
sert de matrice pour la transcription des gènes viraux. La conversion de l’ADN-RC en
ADNccc résulte de la complétion du brin (+) par la polymérase virale, de la dégradation de
l’oligoribonucléotide fixé en 5’ du brin (+) et de la ligation des extrémités du brin (+). La
polymérase virale lié au brin (–) de façon covalente est ensuite éliminée tout comme la partie
redondante située sur le brin (-). Enfin, le surenroulement nécessaire à la formation finale de
l’ADNccc est assuré par les histones et les protéines de la capside (Nassal, 2008).
1.1.4.4. La transcription
La transcription des ARN viraux messagers et de l’ARN pré-génomique est réalisée par
l’ARN polymérase II cellulaire à partir de l’ADNccc. Tous les transcrits VHB sont coiffés en
5’ et polyadénylés en 3’ à une position commune. La polyadénylation est dirigée par un signal
unique non-canonique situé dans l’ORF préC/C. La transcription des gènes VHB est contrôlée
par 4 promoteurs viraux et deux régions « enhancers ».
Il a été observé que cette étape de
transcription était régulée aussi par des phénomènes épigénétiques tels que le statut
d’acétylation des histones H3 et H4 liés à l’ADNccc et par le recrutement des
acétyltransférases cellulaires (p300 et CBP), et des désacétylases cellulaires (HDACI)
(Levrero et al., 2009).
Le promoteur C localisé dans l’ORF X dirige la synthèse des ARNm pré-C et pré-génomique
(pg) de 3,5 kb. La polyadénylation des ARNm préC et ARNpg n’a lieu qu’au deuxième
passage de la polymérase cellulaire au niveau du signal de polyadénylation (Kayet Zoulim,
2007; Nassal, 2008). Par conséquent, l’ARNpg contient l’ensemble de l’information
génétique virale, ainsi qu’une région redondante terminale de 120 nt contenant une deuxième
copie de la séquence DR1 (Direct repeat 1), le signal d’encapsidation ε en épingle à cheveux,
et la queue polyA. L’ARNpg est encapsidé avec la polymérase virale, des kinases cellulaires
et des protéines chaperonnent (hsp90, hsp60 et p23) pour permettre le repliement correct de la
polymérase virale et son interaction avec les protéines de capside Le promoteur S1 dirige la
synthèse de l’ARNm préS1 de 2,4 kb qui code la protéine d’enveloppe L-AgHBs. Les
transcrits sous génomiques de 0,7 kb sont sous le contrôle du promoteur X et permettent la
synthèse de la protéine X (Beck et Nassal, 2007).
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1.1.4.5. La traduction
Tous les transcrits VHB coiffés et polyadénylés recrutent les facteurs eucaryotes d’initiation
de la traduction (eIF) indispensables à la liaison des ribosomes aux extrémités 5’ des ARNm
VHB. La traduction active de la protéine préC à partir d’un AUG en amont du signal
d’encapsidation ε de la région 5’ de l’ARNm préC empêche l’interaction de la polymérase et ε
et par conséquent l’encapsidation de l’ARNm préC. Les ARNm sont traduits dans le
cytoplasme au niveau du RE en différents produits viraux capables de s’assembler en de
nouvelles particules virales. Une partie de l’encapsidation se ferait par réassemblage des
dimères d’AgHBc obtenus après la dissolution à l’entrée du noyau. Au sein de la capside, la
polymérase possède différentes activités enzymatiques pour convertir l’ARNpg en ADN RC
(Rabe et al., 2009).
1.1.4.6. Réplication du génome viral
La synthèse du brin (-) s’opère par formation d’une liaison covalente entre le résidu tyrosine
du domaine TP de la polymérase virale et une courte amorce désoxyribonucléotique. Cette
amorce est synthétisée par la polymérase virale elle-même, en complément d’une séquence de
4 bases UUAC situées au sommet de la boucle de la structure ε. Ce complexe polyméraseamorce, contenant aussi des protéines cellulaires (Hsp90, Hsp60 (Heat shock protein) et p23),
est ensuite transféré au niveau de la séquence DR1 située en 3’ de l’ARNpg, qui contient une
séquence d’ARN homologue à celle de la région ε. Ce transfert est régulé par plusieurs
éléments en cis de l’ARNpg (Beck et Nassal, 2007; Nassal, 2008).
A partir de ce moment, la synthèse du brin (-) débute, et l’ARNpg est simultanément dégradé
par l’activité RNAse H de la polymérase virale à l’exception de 15 à 18 nucléotides de
l’extrémité 5’ protégée par la coiffe. Cet oligonucléotide d’ARN coiffé, contenant les 11
nucléotides de la séquence DR1 de la région 5’ va être transloqué au niveau de la région DR2
du brin (-) et va servir d’amorce pour la synthèse du brin (+). La forte homologie de séquence
existant entre DR1 et DR2 permet l’appariement de l’oligonucléotide sur la séquence DR2
située en 5’ du brin (-) (Beck et Nassal, 2007; Nassal, 2008).
1.1.4.7. Enveloppement des nucléocapsides et sécrétion virale
Les nucléocapsides contenant l’ADN RC peuvent avoir deux devenirs : soit elles interagissent
avec les protéines d’enveloppe insérées dans la membrane du RE, pour conduire à la
formation de virions infectieux et à leur sécrétion par exocytose (Watanabe et al., 2007), soit
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elles vont être redirigées vers le noyau de l’hépatocyte afin de maintenir ou d’amplifier le
pool d’ADNccc nucléaire (Niedre-Otomere et al., 2013).
1.1.5. Mode de transmission du VHB
Les modes de transmission sont identiques à ceux du virus de l’immunodéficience humaine
(VIH), mais le virus de l’hépatite B est 50 à 100 fois plus infectieux. A la différence du VIH,
le VHB peut survivre à l’extérieur du corps pendant au moins sept jours. Durant ce laps de
temps, il reste capable d’occasionner une infection s’il pénètre dans le corps d’une personne
non protégée par le vaccin (OMS, 2012).
1.1.5.1. Transmission sexuelle
Le risque de contamination par voie sexuelle peut varier de 30 à 80%. Il augmente avec le
nombre de partenaires sexuels, les années d’activité sexuelle, les autres infections
sexuellement transmissibles (IST), et le type de rapports notamment les rapports anaux
réceptifs. Ce mode de contamination est surtout observé en zone de faible endémie où la
contamination survient principalement à l’âge adulte (Liaw et Chu, 2009).
1.1.5.2. Transmission parentérale
Ce mode de transmission peut toucher le personnel soignant, lors d’accidents d’exposition au
sang, et les usagés des drogues injectables. Les « piercings » et les tatouages pratiqués sans
respect des règles de stérilisation du matériel utilisé, peuvent constituer un mode de
transmission d’individu à individu.
1.1.5.3. Transmission horizontale
La transmission du VHB entre enfants est très fréquente et principalement décrite en Afrique
noire. La dissémination intrafamiliale du virus est le plus souvent aggravée par les mauvaises
conditions d’hygiène et la promiscuité importante. Dans les régions d’endémie intermédiaire,
la transmission est surtout horizontale (le grand enfant, l'adolescent et l'adulte jeune). Elle
résulte le plus souvent du contact de lésions cutanées ou muqueuses avec du sang contaminé,
ou le partage d’objets souillés (Liaw et Chu, 2009).
1.1.5.4. Transmission périnatale
La transmission périnatale de mère atteinte d’une infection chronique à son nouveau-né se
produit au moment de la naissance. Le risque est plus élevé chez les enfants nés de mère ayant
un AgHBe positif : l’incidence de l’infection est de 90% alors qu’elle est de 10 à 20 % pour
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les enfants nés de mère AgHBe négatif. La prévalence de l’AgHBe chez les mères porteuses
d’AgHBs est plus importante en Asie (40%) qu’en Afrique (15%) (Van Herck et al., 2008).
1.1.6. Histoire naturelle de l’infection par VHB
1.1.6.1. Tropisme cellulaire
Le VHB est un virus essentiellement hépatotrope. L’hépatocyte est le principal site de
réplication pour l’ensemble de la famille des Hepadnaviridae. En effet, l’ADN viral et les
antigènes viraux sont retrouvés d’une façon prédominante dans les cellules hépatiques qui
contiennent toutes les formes réplicatives de l’ADN viral (Fattovich et al., 2008; MulrooneyCousins et Michalak, 2007).
1.1.6.2. Pathogenèse
L’infection par le VHB est à l’origine d’atteintes hépatiques aiguës ou chroniques qui peuvent
évoluer vers la cirrhose et le CHC. Le virus n’est pas directement cytopathogène, c’est la
réponse immune qui induit les lésions hépatiques chez les patients. Au cours de l’infection par
le VHB, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) induisent l’apoptose des hépatocytes infectés
et activent en parallèle une série de réactions inflammatoires dues à la production du facteur
de nécrose tumoral (TNF), des radicaux libres, ou des protéases. Ces réactions exacerbent la
mort hépatocellulaire et aboutissent à l’apparition de foyers d’inflammation nécrotiques dans
le foie. Les lésions hépatiques s’accompagnent d’une régénération active des hépatocytes. Ces
deux processus multiplient par 100 le risque de cancer du foie chez les patients infectés
(Ganem et Prince, 2004).
1.1.6.3. Profils sérologiques
Le diagnostic d’une hépatite aigue est fondé sur la présence dans le sang de l’AgHBs et des
Ac anti-HBc de type IgM dans un contexte cytolytique hépatique. L’AgHBs est le premier
marqueur détecté dans le sérum, il apparait pendant la période d’incubation, en moyenne de
deux semaines à trois mois après le contage (figure 4). Cette phase d’incubation correspond à
la fenêtre immunologique silencieuse dont la durée est estimée à 56 jours et pendant laquelle
le VHB est indétectable par les tests sérologiques classiques.
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Les Ac anti-HBc totaux apparaissent 2 à 4 semaines après l’AgHBs, pendant la phase aigue
de la maladie. L’AgHBe apparait peu de temps après l’AgHBs puis disparait rapidement (sa
persistance au-delà de 3 semaines serait un indicateur de passage à la chronicité) (figure 4).
Lors de la phase aigue de l’hépatite, environ 1013 virions sont produits par jour et la charge
virale peut atteindre 1010 copies de génome/ml de sérum. La recherche de ces deux marqueurs
de multiplication virale n’est pas utile au cours de l’hépatite aigue.
Figure 4: Evolution des marqueurs sérologiques au cours de l’infection au VHB
(http://t2.gstatic.com/images)
1.1.6.4. L’hépatite B aiguë
L’intensité des symptômes d’une infection aiguë varie d’un individu à l’autre. Dans 75% des
cas d’exposition au VHB, l’infection aiguë est asymptomatique et n’est pas, par conséquent,
diagnostiquée. Dans les autres cas, les patients atteints ont une jaunisse et des symptômes tels
que des malaises, une anorexie, etc. Le taux des alanine-amino-transaminases (ALAT) est
également très élevé (20 à 100 fois supérieure à la normale) (Fattovich et al., 2008).
Après la contamination, l’incubation est longue et peut durer de 30 à 120 jours. Après cette
période, des manifestions pseudo-grippales (fièvre, frissons, céphalées, myalgies, douleurs
articulaires) et, dans la moitié des cas, de troubles digestifs peuvent être observés. Le
diagnostic de l’infection aiguë repose sur la présence de l’AgHBs avec anti-HBc. L’évolution
verra la disparition de l’AgHBs et l’apparition de l’anti-HBs après un délai variable (Fattovich
et al., 2008). Parmi ces hépatites aiguës on distingue différentes formes :
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-
Hépatite asymptomatique : on distingue des formes anictériques dans 70 à 80% des
cas. La symptomatologie est directement liée à l’âge, et l’infection est le plus souvent
asymptomatique chez le jeune enfant.
-
Hépatite fulminante : hépatites fulminantes ou subfulminantes (0,1% des cas), avec
nécrose hépatique massive qui s’accompagne d’un ictère à bilirubine conjuguée, d’une
atrophie hépatique avec des transaminases très élevées et syndrome hémorragique dû,
en partie, au défaut de synthèse des facteurs de coagulation fabriqués par le foie, ou
des phénomènes de coagulation intra-vasculaire. La mortalité globale est de l’ordre de
80% en l’absence de greffe hépatique (Fattovich et al., 2008).
1.1.6.5. L’hépatite chronique
L’histoire naturelle de l’hépatite B chronique est un processus dynamique et complexe qui
présente une évolution variable dépendant des paramètres viraux et la réponse immunitaire de
l’hôte. Alors que 90 % des nouveau-nés infectés et 30 % des enfants développent une hépatite
chronique B, seulement 5 % des individus infectés à l’âge adulte deviennent porteur
chronique. Ceci illustre le rôle essentiel du système immunitaire du patient. L’infection
chronique par le VHB présente cinq phases distinctes : la phase de tolérance immunitaire, la
phase de clairance immunitaire, la phase de portage inactif, l’hépatite B chronique AgHBe
négative et la phase AgHBs négative (Hoofnagle et al., 2007; Shi et Shi, 2009).
La phase de tolérance immunitaire est caractérisée par la présence de l’AgHBe, par une
importante réplication virale (ADN VHB) et des lésions hépatiques minimes (transaminases
normales). Cette phase est plus fréquente et plus longue chez les patients infectés pendant la
période périnatale ou la première année de vie. Pendant cette phase, la contagiosité est élevée
(Fattovich et al., 2008).
La phase de clairance immunitaire est définit par la présence de l’AgHBe, la diminution de la
réplication virale, l’augmentation de la réponse immunitaire avec augmentation des
transaminases et des lésions inflammatoires. Le taux de séroconversion AgHBs-Ac Anti-HBs
augmente. Cette phase est plus fréquente chez les patients infectés à l’âge adulte. La durée de
cette phase ainsi que la sévérité des lésons hépatiques qu’elle engendre sont corrélées avec le
risque de progression vers la cirrhose et le CHC (Chan et al., 2011; Ikeda et al., 2009).
La phase de portage inactif de l’AgHBs suit la séroconversion AgHBe en Ac Anti-HBe. Elle
se caractérise par un taux d’ADN viral très faible ou indétectable, des transaminases
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normales. L’évolution est bonne avec un très faible risque de cirrhose et de CHC (Fattovich et
al., 2008).
1.1.7. Epidémiologie du VHB
L’hépatite B est une maladie infectieuse grave, extrêmement contagieuse, qui provoquerait
plus de 600 000 décès par an dans le monde. On estime à 2 milliards le nombre de personnes
touchées par cette maladie, dont plus de 450 millions sont des porteurs chroniques capables de
transmettre le virus pendant des années (OMS, 2013). Entre 15 et 40 % de ces derniers
développent des complications hépatiques de type cirrhose ou hépatocarcinome. Ce dernier
constitue le cinquième cancer le plus fréquent dans le monde (Zhou et al., 2012).
Au Burkina Faso les prévalences de l’AgHBs chez les donneurs de sang de premier don en
zones rurale et urbaine étaient respectivement de 13,0% et 16,2% à Ouagadougou, 10,9% et
11,5% à Bobo Dioulasso, 17,9% et 19,8% à Fada N’gourma et de 13% et 19% à koudougou
(Nagalo et al., 2011a).
Le virus présent dans de nombreux fluides corporels tels que le sang (108 à 109 virions/ ml), la
salive (105 à 107/ml), le sperme et sécrétions vaginales (106 à 107/ml) et à un titre plus faible
dans le lait maternel, les urines et la sueur des individus infectés (Lavanchy, 2004); est
facilement transmis par contact avec ces fluides et est 50 à 100 fois plus infectieux que le
virus de l’immunodéficience humaine (HIV). Cette contagiosité est également liée à la
résistance du virus dans le milieu extérieur et à sa capacité de garder son pouvoir infectieux
pendant plus de 7 jours à température ambiante (Van Herck et al., 2008). L’infection par le
VHB peut être classée en trois zones :
-
Les zones de forte endémie, telles que l'Afrique sub-saharienne, l'Asie du Sud-est et le
bassin amazonien, où 7 à 20% de la population sont des porteurs de l'AgHBs.
-
Les zones de moyenne endémie qui sont l’Europe du Sud et de l’Est, le bassin
méditerranéen, le Moyen-Orient, une partie de l'Amérique Centrale et de l'Amérique
du Sud ont une prévalence de 2 à 5% de porteurs chroniques de l’AgHBs.
-
Les zones de faible endémie, telles que l'Amérique du Nord, l'Europe occidentale et du
Nord, l’Australie et la Nouvelle Zélande où le taux de porteurs chroniques du VHB est
inférieur à 2%. Dans ces régions, le pourcentage de porteurs chroniques peut
cependant être plus élevé parmi les populations dites à risques, notamment les
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toxicomanes, les homosexuels, les sujets à partenaires multiples, les professionnels de
la santé (OMS, 2013).
La morbidité et la mortalité liées à l’infection par le VHB sont principalement dues à
l’infection chronique. En 2012, environ 600.000 décès étaient liés à l’hépatite B dans le
monde (OMS, 2013).
1.1.8. Diagnostic du HBV chez l’homme
1.1.8.1. Recherche des marqueurs sérologiques :
1.1.8.1.1. Antigènes viraux
En pratique, les AgHBs et AgHBe sont mis en évidence dans le sérum par des techniques
immuno-enzymatiques chez les sujets porteurs du virus. L'élément essentiel du diagnostic
d'une infection par le VHB en cours repose sur la mise en évidence dans le sérum de l'AgHBs.
L’AgHBe est recherché dans le bilan d’une hépatite chronique (Bottero et al., 2013).
1.1.8.1.2. Les anticorps
Le diagnostic sérologique permet la recherche et éventuellement la quantification des
anticorps dirigés contre les différents antigènes viraux : anticorps anti-HBs, anticorps antiHBc totaux et de type IgM, anti-HBe (Bottero et al., 2013).
1.1.8.2. Détection et quantification de l’ADN du VHB
L’ADN du VHB peut être détecté et éventuellement quantifié dans le sérum, soit par des
techniques d’hybridation au moyen de sondes spécifiques, soit par amplification génique. Les
techniques d’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) du génome viral sont les
plus sensibles et permettent également après séquençage de révéler des variants ou mutants.
La quantification permet de suivre l'évolution de la charge virale. Différentes techniques sont
actuellement proposées (Valsamakis, 2007):
-
L’ADN branché : Quantitex HBV DNA assay (bDNA), Laboratoires Bayer (seuil de
détection 3,3x103 copies/mL) ;
-
La PCR : Cobas AmplicorTM HBV MONITOR Test, Roche Diagnostics (2x102
copies/ml) ;
-
Les PCR en temps réel : Real Time
TM
HBV PCR Kit, Laboratoires Abbott (4 IU/ml)
et Real Time PCR System Cobas TaqMan 48, Roche Diagnostics (35 copies/ml).
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1.2. Méthodes d’étude de la variabilité du génome du VHB
Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour différencier les génotypes du VHB, le choix de
la technique dépendant de l’objectif des études menées.
1.2.1. Séquençage et analyse phylogénétique
Actuellement, le séquençage du génome entier du VHB et l’analyse phylogénétique
constituent la méthode de référence pour le génotypage des souches de VHB. Toutefois, la
comparaison des séquences obtenues sur le génome entier et dans la région du gène S a
montré que les séquences dans la région S permettaient également d’identifier précisément les
génotypes de A à H. Une région intéressante pour le génotypage est la région du gène P
chevauchant le gène S, dont l’amplification puis le séquençage permet l’identification du
génotype dans le cadre de lecture du gène S et la détection simultanée des mutations de
résistance au traitement dans le cadre de lecture du gène P (Yeh et al., 2004).
1.2.2. Analyse par polymorphisme de restriction
L’analyse par polymorphisme de restriction (restriction fragment length polymorphism :
RFLP) repose sur la différence de taille d’amplicons du gène S après digestion enzymatique.
Une étude a comparé les séquences du gène S et a identifié des sites de restriction spécifiques
de chaque génotype. Après une étape d’amplification, les séquences sont digérées par
plusieurs endonucléases (HphI, NciI, AlwI, EarI et NlaIV) et les fragments obtenus sont
séparés par électrophorèse. La taille des différents fragments est caractéristique de chaque
génotype. Toute mutation portant sur la région analysée peut entraîner la suppression ou, la
création d’un site de restriction et fausser les résultats du génotypage (Wu et al., 2012).
1.2.3. Utilisation d’amorces spécifiques
La méthode développée par Naito et al. (Naito et al., 2001) repose sur l’existence d’une
divergence intergroupe de la séquence nucléotidique au niveau d’une région conservée des
gènes préS1/S. L’ADN du VHB est amplifié par PCR nichée : alors que les amorces utilisées
lors de la première PCR permettent l’amplification de tous les génotypes de A à F, les
amorces de la seconde PCR sont spécifiques de chacun. L’identification des génotypes est
fondée sur la différence de taille des amplicons. Kirschberg et al. ont développé une PCR
multiplex, qui permet d’amplifier spécifiquement chacun des six génotypes en une seule étape
(Kirschberg et al., 2004).
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1.3. Diversité génétique du VHB
La polymérase est une enzyme qui ne possède pas d’activité exonucléase 3' et qui ne corrige
donc pas les erreurs de lecture. Il existe au moins une mutation tous les 104 à 105 nucléotides.
Chez un patient avec une infection chronique, avec le temps des mutations s’accumulent et
plusieurs souches virales peuvent coexister (quasi-espèces) (Weber et al., 2005).
1.3.1. Sérotypes HBs
Le déterminant « a » de l’AgHBs est conservé parmi tous les génotypes du VHB et parmi les
orthohepadnavirus (Le Bouvier, 1971). Des mutations naturelles ont été décrites comme les
mutations G145R la plus fréquente (Zanetti et al., 1988), P120S/T,T123N/S, M133I, y134N,
K141E, S143L et D144A (Mele et al., 2001). Ces mutations peuvent affecter la conformation
du déterminant « a » ce qui affecte sa reconnaissance par les anti-AgHBs et ainsi permet
l’échappement à la réponse immunitaire et aux kits de détections de l’AgHBs (Tian et al.,
2007). Le déterminant « a » est associé à deux autres déterminants sous deux formes
mutuellement exclusives d/y (Le Bouvier, 1971) et w/r (Bancroft et al., 1972) dont les
positions déterminent les sérotypes d’AgHBs.
1.3.2. Génotype, sous génotype et épidémiologie moléculaire
Durant la dernière décennie, la classification selon les sérotypes a progressivement été
remplacée par celle des génotypes. Cependant, les sérotypes sont corrélés aux génotypes bien
qu’ils puissent être trouvés avec plusieurs génotypes. Les études phylogénétiques menées à
partir des séquences nucléotidiques de différents génomes viraux ont permis de classer
provisoirement le VHB en 10 génotypes allant de A à J (Tatematsu et al., 2009). Les
génotypes du VHB sont définis par une divergence d’au moins 8 % de la séquence
nucléotidique du génome entier et d’au moins 4,1 % dans le gène S (Norder et al., 2004). Les
principaux génotypes ont été divisés en sous génotype à partir d’analyses phylogénétiques et
ils sont définis par la divergence comprise entre 4,1 % et 8 % de leur séquence nucléotidique
complète (Schaefer, 2005). La distribution géographique et épidémiologique des génotypes du
VHB est continuellement recherchée dans différentes parties du monde. A partir des
différentes données accumulées, il a été observé que chaque génotype/sous génotype a une
distribution géographique spécifique. Ainsi :
Le génotype A est ubiquitaire mais prédomine en Europe du Nord-ouest, en Amérique du
Nord et en Afrique Centrale. Le génotype A est le seul génotype prédominant en Afrique de
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l’Est où la prévalence des autres génotypes est inférieure à 5% (Kurbanov et al., 2010). Il a
été divisé en 6 sous génotypes allant de 1 à 6. Le sous génotype A1 est prédominant en
Afrique, Asie et en Indonésie (Kramvis et Kew, 2007b), A2 est prévalent en Europe du Nord
Ouest (McMahon, 2009) et A3–A6 sont trouvés en Afrique centrale et en Afrique de l’Ouest
(Kramvis et Kew, 2007a; Pourkarim et al., 2010).
Les génotypes B et C sont principalement trouvés en Asie et dans les îles du pacifique et sont
divisés en 8 sous génotypes chacun. B1 et C2 sont prévalent au Japon, en Corée et au Nord
de la Chine, C2 est trouvé en Alaska, alors que B2 et C1 sont prévalent au Sud de la Chine,
Taiwan et Asie du Sud Est (McMahon, 2009) B3–B5 et B7-B8 comme C3–C8 sont
prédominants dans le pacifique, B6 est prévalent en Alaska, au Nord du Canada et au
Groenland (Chan et al., 2011; Lusida et al., 2008; Mulyanto et al., 2009).
Le génotype D subdivisé en 7 sous génotypes est endémique mais très fréquent sur le
pourtour du bassin méditerranéen et au Moyen-Orient. Il est le seul génotype prédominant en
Asie de l’Ouest. D1 est fortement prévalent en Asie central, dans le pourtour du bassin
méditerranéen mais aussi en Inde et en Afrique de l’Est (Banerjee et al., 2006). D2 est
prévalent en Europe de l’Est incluant la Russie et la région de la Baltique, D3 est distribué en
Russie, au Nord de l’Inde, au Pakistan et est fréquemment retrouvé chez les toxicomanes à
travers le monde (Tallo et al., 2008). D5 a été caractérisé à l’Est de l’Inde (Chandra et al.,
2009). D4 et D6 sont endémiques en Océanie et en Indonésie respectivement (Lusida et al.,
2008). D7 a été isolé en Tunisie (Meldal et al., 2009). D8 a été caractérisé au Niger (Abdou
Chekaraou et al., 2010). Le sous génotype D9, un nouveau recombinant D/C, a été retrouvé
en Inde orientale (Ghosh et al., 2013).
L’Afrique de l’ouest est le foyer principal du génotype E (Norder et al., 2004).
Le génotype F est prédominant en Amérique Latine et Centrale, F1 a été trouvé en Alaska, à
Mexico, en Amérique central et a été disséminé au Pérou et en Argentine, alors que F2–F4
sont prévalent en Amérique du Sud (Devesa et al., 2008).
Le génotype G a été identifié aux Etats-Unis et en France (Stuyver et al., 2000). C’est le seul
génotype qui semble ne pas être associé à un foyer principal.
Le génotype H a été décrit chez les Amérindiens en Amérique Centrale et aux USA (ArauzRuiz et al., 2002). Un neuvième génotype provisoire I a été identifié en Asie et au Vietnam
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(Olinger et al., 2008). Récemment le dixième génotype provisoire J a été signalé au Japon
(Tatematsu et al., 2009).
Cependant, de nombreux génotypes hybrides ont été observés dans certaines régions du
monde : A/C au Vietnam, C/D au Tibet, A/D en Afrique ou B/C en Asie. Des recherches
supplémentaires sont donc nécessaires afin de déterminer si les échanges entre génotypes sont
la conséquence d’une recombinaison génétique directe entre deux souches virales ou si elles
sont la conséquence d’une adaptation rapide du VHB à un environnement génétique et
immunologique particulier associé à certaines populations humaines (Schaefer, 2007).
1.4. Traitement et Prévention
Les hépatites aiguës ne représentent généralement pas un problème grave. En revanche, pour
les patients qui développent une infection chronique, il faut diminuer les troubles hépatiques,
en réduisant la charge virale. Des stratégies antivirales ont été élaborées selon trois voies : les
analogues de nucléos(t)ides, les immuno-modulateurs et la vaccinothérapie.
1.4.1. Les analogues de nucléos(t)ides
La thérapie par des analogues de nucléos(t)des des adultes atteints d’hépatite B chronique
réduirait le risque de complication à long terme. Les analogues de nucléos(t)ides
appartiennent à 3 classes: les L-nucléosides (lamivudine, telbivudine et emtricitabine), les
analogues de la déoxyguanosine (entécavir) et les nucléosides acycliques phosphanates
(adéfovir et tenofovir). Parmi ces traitements antiviraux, le corps médical a d’abord porté
beaucoup d’intérêt à la Lamivudine (Zeffix®), issue des recherches contre le HIV où elle est
connue sous le nom d’Epivir. L’entécavir n’induit que très peu de résistance, même après 4
ans de traitement et a une activité antivirale plus importante que la lamivudine (Kumada et al.,
2013; Zhang et al., 2011a).
L’adévofir est capable d’inhiber la réplication virale chez les patients atteints d’hépatite
chronique et d’induire une importante séroconversion de l’AgHBe (Hadziyannis et al., 2005).
Le Ténofovir permet de réduire la multiplication virale. Il a été utilisé aussi chez les patients
coinfectés VIH/VHB qui recevaient déjà un traitement par la Lamivudine ou l’Emtricitabine
dans le cadre de leur trithérapie antirétrovirale hautement active (HAART) (Kumada et al.,
2013).
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1.4.2. Les traitements « immuno-modulateurs »
Afin de limiter la propagation virale, la stimulation de la réponse immunitaire via différentes
cytokines a été envisagée. A ce jour plusieurs molécules ont été testées avec plus ou moins
succès. L’interféron-α constitue aujourd’hui la base du traitement de première intention. Il
ralentit ou arrête la fibrose, favorise une moindre fréquence de survenue de la cirrhose et peut
entraîner une séroconversion de l’AgHBe (Liang et al., 2011; Zhijian et al., 2010). Une étude
récente vient de montrer que l'hétérogénéité dans la région promotrice du gène de l'IL-10 joue
un rôle important dans la détermination de la réponse initiale de l'hépatite B chronique à
l'IFN-thérapie (Wang et al., 2011).
1.4.3. La vaccinothérapie
L’intérêt de la vaccinothérapie associée à un traitement antiviral est suggéré par certaines
études mais son effet reste inconstant. Une meilleure connaissance des réponses T antivirales
devrait permettre de mieux sélectionner les patients pouvant bénéficier de ces traitements. Les
différentes expérimentations visant à induire une rupture de tolérance immunitaire par le biais
d'une vaccinothérapie spécifique sont prometteuses et indiquent que cette approche pourrait
être efficace (Zhang et al., 2011b).
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OBJECTIF DU MEMOIRE
2. OBJECTIF DU MEMOIRE :
2.1. Objectif général
Caractériser les génotypes du virus de l’hépatite B chez les donneurs de sang du centre
régional de transfusion sanguine de Ouagadougou (CRST-O), Burkina Faso.
2.2. Objectifs spécifiques :
 Sélectionner les donneurs de premier don dont la sérologie au VHB est positive ;
 Confirmer par PCR la présence effective du VHB chez ces donneurs ;
 Caractériser les génotypes du VHB par PCR ;
 Confirmer les génotypes par une PCR de pré-séquençage.
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MATERIEL ET METHODES
3. MATERIEL ET METHODES
3.1. Cadre d’étude
L’étude s’est déroulée à Ouagadougou (Burkina Faso):
 Au laboratoire du Centre Régional de Transfusion Sanguine de Ouagadougou (CRTSO). C’est l’un des centres chargés de la collecte du sang, la qualification, la
préparation des produits sanguins, la conservation et la distribution aux formations
sanitaires (publiques comme privées) habilitées à pratiquer la transfusion sanguine ;
 Au centre de recherche biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) qui abrite le
laboratoire de biologie et de génétique (LABIOGENE) de l’Université de
Ouagadougou. C’est également un centre de recherche qui a comme objectif principal,
de promouvoir le développement de la santé au Burkina Faso et en Afrique par la
formation de jeunes médecins, pharmaciens et biologistes. Il possède un plateau
technique moderne pour les recherches fondamentales, pharmacologiques, de biologie
et génétique moléculaires.
3.2. Matériel
3.2.1. Réactifs :
 Réactifs pour la détermination des génotypes du VHB par PCR classique :
-
Kit d’extraction de l’ADN: QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Allemagne).
-
Kit d’amplification : qui comprend la Taq ADN polymérase 5U/µl, le MgCl2 50mM,
Buffer 10X, les dNTPs 2mM, et les amorces 10 µl.
3.2.2. Appareillage:
 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA)
Figure 5: Thermocycleur Gene-Amp® PCR System 9700
(Applied Biosystems)
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3.2.3. Autres matériel:
 Micropipettes, Vortex, cône ou embout à filtre, incubateur, centrifugeuse, micro-onde,
cuve à électrophorèse et appareil geneFlash pour la photo du gel.
3.3. Méthodes
3.3.1. Type et Période d’étude
Il s’agit d’une étude prospective qui s’est déroulée sur une période de huit mois, de 06
Février au 06 Septembre 2012.
3.3.2. Population d’étude
Au total 200 donneurs de sang à AgHBs (+) ont été retenus pour l’étude. Il s’agit d’une
population de premier don, âgée d’au moins 18 ans, de toutes professions et catégories
sociales confondues. Les sangs ont été prélevés dans le laboratoire du CRTS-O sur des tubes
imprégnés d’EDTA dans la section sérologie. Après centrifugation à 4 000g pendant 5mn les
sérums ont été collectés dans des tubes Eppendorf et conservés à -20°C.
Les données sociodémographiques des donneurs tels que le sexe, l’âge, la provenance ; et les
sérologies anti-VIH et VHC ont été répertoriés.
 Critères d’inclusion à l’étude
Tous les donneurs de sang de premier don positifs à l’AgHBs ont été inclus dans cette étude.
 Critères de non inclusion
Les donneurs séronégatifs à l’AgHBs étaient exclus dans cette étude.
3.3.3. Détection du VHB
3.3.3.1. Extraction et quantification de l’ADN du VHB
L’extraction a été faite à l’aide du QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Allemagne) en suivant le protocole fourni par le fabriquant. On a procédé comme suit :

Vingt (20) µl de Protéinase K ont été mis dans des tubes eppendorf de 1,5 ml ; ensuite
200 µl d’échantillon (sérum) ; puis 200 µl de tampon de lyse (AL). Les tubes ont été
vortexés puis incubés à 56°C pendant 10 minutes et centrifugés à 8 000 rpm pendant
30 secondes.
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
Deux cent (200) µl d'éthanol absolu ont été ajoutés dans chaque tube. Les tubes ont
ainsi été vortexés pendant 15 secondes et centrifugés à 8 000 rpm pendant 30
secondes.

Les contenus des tubes eppendorf ont été transférés dans les colonnes QIAamp Mini
spin appropriées et centrifugés à 8000 rpm pendant 1 minute.

Celles-ci ont été placées dans des nouveaux tubes collecteurs de 2 ml ; et les anciens
tubes contenant le filtrat précédent ont été jetés.

Cinq cent (500) µl de la première solution de lavage ont été ajoutés dans les colonnes,
qui à leur tour ont été centrifugées à 8 000 rpm pendant 1 minute.

Ensuite les colonnes ont été placées dans des nouveaux tubes collecteurs. Cinq cent
(500) µl de la deuxième solution de lavage ont été ajoutés dans les colonnes, qui ont
été centrifugées de nouveau à 14 000 rpm pendant 3 minutes.

Les colonnes ont ensuite été placées dans des nouveaux tubes collecteurs et
centrifugées à 14 000 rpm pendant 1 minute.

Elles ont ensuite été placées dans des tubes eppendorf de 1,5 ml appropriés puis 75µl
de tampon d’élution ont été ajoutés dans chaque colonne.

L’ensemble a été incubé à la température ambiante (15-25°C) pendant 1 minute, puis
centrifugé à 8000 rpm pendant 1 minute.

Ces deux dernières étapes ont été répétées une fois. L’ADN a été ainsi élué des
colonnes et conservé à -20°C avant la PCR.
3.3.3.2. La PCR multiplex
 Principe
La PCR-Multiplex utilise le principe général de la PCR classique avec pour différence, une
utilisation d’au moins trois paires d’amorces par PCR. Il s’agit d’utiliser des multiples paires
d’amorces pour amplifier simultanément un grand nombre de séquences par PCR (les
amplicons étant usuellement différenciés par leur taille).
3.3.3.2.1. Caractérisation des génotypes par PCR multiplex
 Mode opératoire
La PCR a été réalisée en utilisant la méthode décrite par Chen et al., (2007) avec les
modifications suivantes : Deux PCR-Multiplex dans les mêmes conditions avec deux Mix. Le
Mix 1 permettra de caractériser les génotypes A à C et le Mix 2 les génotypes D à F.
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Les deux PCR-Multiplex ont été réalisées avec un appareil GeneAmp PCR System 9700
(Applied Biosystems, USA), dans un volume total de 25 µl qui contenait 0,5 µl de la Taq
ADN polymérase 2,5 U, 1 µl de MgCl2 2 mM, 2,5 µl dNTPs 0,2 mM, 2,5 µl de Buffer 1X,
1µl de chaque amorce (Tableau I) sens et anti-sens 0,4 µl (6 µl), 11,5 µl d’eau stérilisée et
5µl d’ADN.
Programme d’amplification de génotypage
1- 95°C pendant 15 minutes
94°C pendant 60 secondes
2- 58°C pendant 60 secondes
35 Cycles
3- 72°C pendant 10 minutes.
Les produits PCR ont été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose 2% et visualisés
sous lumière UV à 312 nm.
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Tableau I: Les pairs d’amorces spécifiques à l’amplification des génotypes A-F du VHB.
Séquences d’ADN (de 5’-3’)
Génotypes
Positions
Taille (pb)
AAACTACTGTTGTTAGACGACGRGACC
A
CTGGATTGTTTGARTTGGCTCCG
B
CCAAACTCTTCAAGATCCCAGAGTCA
ACARGTTGGTGAGTGACTGGAGATTT
C
CTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGT
CAGGGGTCCTAGGAATCCTGATGTKG
CAGACGCCAACAAGGTAGGAGCT
D
GAGTGTYTCTCAAAGGTGGAGACAGM
ATACCCTATGGAAGGCGGGCATCT
E
CCCATTCGAGAGGGACCGTCCA
TATCTGTGGGTATCCATTTGAATACYTC
F
CGAGCGAAACARGCTGCWAG
S: sens, AS: anti-sens, R: G ou A, K: T ou G, M: A ou C, W: A ou T, Y: C ou T.
pb : paire de base.
 Préparation du TBE 1X (solution tampon Tris/Borate/EDTA) à partir du TBE 20X :
tampon de course.
Pour ce faire, 50 ml de TBE 20X ont été mélangés avec 950 ml de l’eau distillée, la solution
obtenue (TBE 1X) a été homogénéisée.
 Préparation du gel d’agarose 2%

Quatre (4) grammes d’agarose ont été dissous dans 200 ml de TBE 1X.

Une cuisson de la solution obtenue a été réalisée à l’aide d’un micro onde (SEVERIN
700) à 460 W pendant 2 minutes.
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
Ensuite seize (16) μl de Bromure d’Ethilidium (10 mg/ml) ont été ajoutés au gel puis
mélangé.

Le gel a été délicatement coulé dans le support transparent contenant les peignes, puis
séché à la température du laboratoire.
 Electrophorèse et Révélation sous la lumière Ultra Violette (UV)

Le support transparent contenant le gel a été déposé dans la cuve à électrophorèse
contenant du tampon de migration.

Les échantillons ont été déposés sur le gel tout en s’assurant que le tampon de
migration préalablement versé dans la cuve couvre de quelques millimètres le gel.

Pour ce faire, 5 μl du bleu de charge ont été mélangés avec 5 μl d’ADNc amplifié par
échantillon et déposés dans des puits appropriés sur le gel.

Trois (3) μl du marqueur de poids moléculaire (Ladder) ont été déposés dans le
premier puits.
On procède à une course d’électrophorèse à 120 V pendant 45 minutes. Le gel a été révélé
sous UV à 312 nm puis photographié grâce à un appareil « GENE FLASH ».
 Interprétation des résultats
La PCR a été considérée positive si l’échantillon présentait une bande correspondant à la
taille du fragment d’ADN attendu. Elle était négative en absence de bande. Les tailles des
fragments et leurs génotypes correspondants sont représentés dans le tableau II ci-dessous.
Tableau II : Tailles des fragments et les génotypes correspondants
Génotypes
Tailles des fragments (pb)
A
644
B
331
C
242
D
189
E
130
F
487
Pb: paire de base.
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3.3.3.2.2. La PCR de pré-séquençage des génotypes
Pour confirmer la spécificité de la PCR multiplex, une région Prés-S de 1 104 pb du génome
du VHB a été amplifiée. La paire d’amorces utilisée (Tableau III) a été conçue dans une
région hautement conservée pour tous les génotypes du VHB.
Tableau III: La paire d’amorces du PCR de pré-séquençage
Séquences d’ADN (de 5’-3’)
Positions
TTTGCGGGTCACCATATTCTTGG
2815– 2837
Séquençage
Taille (pb)
CGAACCACTGAACAAATGGCACTAG
Pb : paire de base.
 PCR de pré-séquençage
Une PCR de pré-séquençage des échantillons possédant des génotypes a été réalisée avec le
même thermocycleur dans un volume réactionnel de 50 µl qui contenait 0,5 µl de Taq ADN
polymérase 2,5 U/µl (Applied Biosystems, USA), 5 µl de Buffer 1X, 0,75 µl d’amorces sens
et anti-sens, 2 µl de MgCl2 2 mM, 5 µl de dNTP 0,2 mM, 31 µl d’eau stérile et 5 µl d’ADN.
Programme d’amplification de la PCR de pré-séquençage
1- 58°C pendant 60 secondes
35 Cycles
2- 72°C pendant 10 minutes.
Les produits PCR ont été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose 2%, et visualisés
sous lumière UV à 312 nm.
 Interprétation des résultats
Elle a été faite sur la base de taille du fragment d’ADN (bande) sur le gel d’agarose 2% après
électrophorèse des produits PCR à 1104 pb.
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3.3. Analyse des données
Les données ont été analysées à l’aide du logiciel SPSS (Statistical Package for Social
Sciences) 17.0 et Epi Info version 6. Le test de Chi carré a été utilisé pour comparaisons. La
différence a été statistiquement significative pour p < 0,05.
3.4. Considérations éthiques
Cette étude a été réalisée en tenant compte du consentement libre et éclairé des donneurs et
l’autorisation du comité d’éthique du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni
(CERBA/LABIOGENE) et du comité national d’éthique du Burkina Faso. Le respect de la
confidentialité et l’anonymat par rapport aux informations fournies était de mise.
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RESULTATS
4. RESULTATS
L’étude a concerné 200 donneurs volontaires de premier don tous positifs au VHB par
ELISA. La présence effective du VHB a été confirmée par PCR chez ces donneurs. Les
génotypes du VHB ont été caractérisés dans 1es échantillons présentant l’ADN viral et
confirmé par PCR de pré-séquençage.
4.1. Caractéristiques sociodémographiques des donneurs de sang.
L’âge des donneurs était compris entre 18 et 50 ans. La tranche d’âge majoritaire était de 20 à
29 ans comprenant 118 (59,0%) donneurs (tableau IV). La population d’étude était composée
de 170 (85%) hommes et de 30 (15%) femmes soit un sex ratio de 5.
La majorité des donneurs de sang a été recrutés en zone urbaine (83,0%) (Tableau IV).
Tableau IV: Caractéristiques sociodémographiques des donneurs de sang de Ouagadougou.
Caractéristiques
Donneurs N
(%)
Hommes
170
(85,0%)
Femmes
30
(15,0%)
˂ 20
35
(17,5%)
20-29
118
(59,0%)
30-39
33
(16,5%)
≥ 40
14
(7,0%)
Rural
35
(17,0%)
Urbain
165
(83,0%)
Sexe
Age (Année)
Provenance
N : Nombre de donneurs.
4.2. La fréquence des coinfections chez les donneurs de sang de l’étude
La séroprévalence du VIH et VHC était de 2,0% chacun chez les donneurs de sang. Les
doubles infections rencontrées étaient VHB/VHC 4 (2,0%) et VHB/VIH 4 (2,0%),
essentiellement urbaines 6 (75,0%) et majoritairement composées d’hommes 7 (87,5%). Il
n’y a pas de différence significative entre les doubles infections rencontrées pour p ˂ 0,721.
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Birama
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4.3. Caractérisation des génotypes du VHB chez les donneurs de sang
L’étude recherchait six génotypes (A à F) du VHB. Elle a confirmé la présence effective du
VHB par PCR chez 41 sur 200 donneurs de sang. Cette population d’étude était composée de
36 (87,9%) hommes et de 5 (12,1%) femmes (Tableau V). Les génotypes A, B, D, et F étaient
absent chez les donneurs de cette étude (Tableau V). Les génotypes E 11 (26,8%) et C 4
(9,8%) ont été caractérisés dans certains échantillons respectivement à 242 pb et 130 pb sur
gel d’agarose 2% (Figure 6). Une infection mixe aux génotypes E/C 26 (63,4%) a été
caractérisée dans certains échantillons (Figure 7). Une PCR individuelle suivie d’une PCR de
pré-séquençage, ont été réalisées pour confirmer les génotypes obtenus et la spécificité de la
méthode utilisée.
300 pd
200 pb
100 pb
Figure 6: Photo du gel d’agarose 2% de quelques échantillons positifs aux génotypes C et E.
Les fragments d’ADN attendu sont de 130 paires de base (pb) pour le génotype E et 242 pb pour le C.
M : Marqueur du poids moléculaire de 1 kb, C+ : Contrôle positif du génotype C et E+ celui du
génotype E du VHB.
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Figure 7: Photo du gel d’agarose 2% de quelques échantillons coinfectés aux génotypes C et E.
Les fragments d’ADN attendu sont de 130 paires de base (pb) pour le génotype E et 242 pb pour le C.
Ici ces deux fragments sont représentés par des contrôles positifs. E+ : Contrôle positif du génotype E
du VHB et C+ celui du génotype C.
4.4. La PRC de pré-séquençages des génotypes
Une PCR de pré-séquençage a été réalisée sur les 200 échantillons pour confirmer la
sensibilité du génotypage. Les échantillons (41) positifs aux différents génotypes ont été
confirmés par l’amplification de la région Prés-S de 1 104 pb du génome du VHB (Figure 8).
L’infection mixe aux génotypes E/C était prédominante avec 26/41 (63,4%) des échantillons
suivie de génotype E 11/41 (26,8%) et C 4/41 (9,8%). La différence entre ces génotypes est
significative avec p ˂ 0,001 (Tableau V). Il n’y’avait pas de différence statistiquement
significative entre les prévalences des génotypes C, E et E/C en fonction du sexe, de l’âge et
de provenance avec respectivement p ˂ 1,000 ; p ˂ 0,960 et p ˂ 0,965. Les génotypes A, B, D
et F étaient absent chez les donneurs de sang de cette étude.
1650 pb
1000 pb
Figure 8: Photo du gel d'agarose 2% de la PCR de pré-séquençage des échantillons.
Les fragments d’ADN attendu sont de 1104 pb ; C- et C+= Contrôle négatif et positif ; M= marqueur
de poids moléculaire de 1Kb.
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Tableau V: Répartition des génotypes des échantillons confirmés en fonction des caractéristiques sociodémographiques des donneurs de sang.
Génotypes
Classes d’âges (Années)
Sexe
Hommes
Femmes
Provenances
˂ 20
20-29
30-39
≥ 40
Rural
Urbain
A
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
B
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
C
2 (5,6%)
2 (40,0%)
1 (8,3%)
1 (50,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
4 (12,9%)
D
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
E
10 (27,8%)
1 (20,0%)
3 (25,0%)
8 (29,6%) 0 (0,0%)
0 (0,0%)
3 (30,0%)
8 (25,8%)
F
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
2 (40,0%)
8 (66,7%)
17 (41,5%)
1 (50,0%)
0 (0,0%)
7 (70,0%)
19 (61,3%)
E/C
Total
24 (66,7%)
41
2 (7,4%)
41
DIARRA Birama
41
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DISCUSSION
5. DISCUSSION
Dans la présente étude qui s’est déroulée du 06 Février au 06 Septembre 2012, sur 200
donneurs de sang positifs à l’AgHBs, la tranche d’âge majoritaire était de 20-29 ans. La
population d’étude était essentiellement composée d’hommes 170 (85%), majoritairement
urbaine (83,0%). Ces résultats corroborent avec ceux rapportés par Nagalo et al., (2011a) chez
les donneurs de sang de premier don au Burkina Faso. La différence de sexe observée dans
notre étude s’expliquerait en grande partie par les contre indications du don de sang chez les
femmes enceintes, allaitantes ou en menstruation. La forte participation des citadins au don de
sang s’expliquerait par des raisons socioculturelles, la proximité du CRTS-O, mais aussi la
sensibilisation. Par contre la faible participation rurale peut s’expliquer par le fait que le
CRTS-O ne va pas vers ses populations. Le sex ratio(5) de notre étude est similaire à celui de
Nagalo et al. (2011a). Il est cependant inférieur à celui de Florent et al. (2012) du Cameroun
qui était de 14. Ce qui explique une meilleure implication des femmes au don de sang dans
notre étude.
La séroprévalence du VIH (1,0%) chez les donneurs de sang de premier don dans cette étude
était similaire en zones rurale et urbaine. Celle ci est superposable avec celle rapportée par
Nagalo et al., (2012) chez les mêmes types de donneurs dans les quatre centres de transfusion
sanguine du Burkina Faso; et inférieure à celles rapportées par Diendéré et al. (2011) chez les
prisonniers au Burkina Faso (5%), et de Florent et al. (2012) chez les donneurs de sang au
Cameroun (4,44%). La séroprévalence du VHC est de 2,0% dans notre étude. Ce taux est
inférieur à ceux rapportés par Nagalo et al., (2012) au Burkina Faso en général (6,3%), de
Koudougou en particulier (8,69%) (Nagalo et al., 2011a) ; et de Zeba et al. (2012) chez les
donneurs de sang à Ouagadougou (4,4%). Elle est supérieure à celle de Florent et al. (2012)
au Cameroun (1,44%) et de Murphy et al., (2010) aux Etats Unis (0,072%). Ces différences
peuvent s’expliquer probablement par la diversité des donneurs, les groupes de population et
les différences dans les méthodes d'échantillonnage, la sensibilité du test utilisé. Les facteurs
favorisants ces infections n’ont pas été recherchés dans la
présente étude. Cependant
certaines pratiques à risque de contamination telles que les scarifications ethniques, l’excision,
le tatouage cutané et des gencives ; sont courantes dans la société.
Les séroprévalences des coinfections VHB/VHC et VHB/VIH rapportées dans cette étude
étaient similaires (2,0%). La séroprévalence de la coinfection VHB/VHC est semblable à celle
de Zeba et al. (2012) à Ouagadougou (2,2%). Elle est largement inférieure à celle de Halima
DIARRA Birama
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et al. (2010) en Tunisie (43%) ; et supérieure à celle de Nagalo et al. (2011a) à Koudougou
(1,39%). Ces différences peuvent s’expliquer par la diversité de population d’étude. Une
coïnfection par le VHB/VHC est possible en raison de modes communs de transmission (Liu
et Hou, 2006). Une coïnfection par VHB/VHC est responsable de multiples dommages
hépatique allant de troubles histologiques mineurs, à la cirrhose et au carcinome
hépatocellulaire (CHC). L'interaction entre les deux virus en termes d'activité de réplication
et de la contribution de chaque virus dans la genèse des dommages hépatiques restent encore
mal connue. Cependant certaines études ont montré une susceptibilité de cette coïnfection à
réduire le niveau de réplication du VHB suggérant un effet suppressif du VHC sur le VHB
(Halima et al., 2010; Emara et Radwan, 2011) ; alors que d'autres études n'ont trouvé aucune
différence significative (Bellecave et al., 2009) ou même trouvé que le VHB supprime la
réplication du VHC (Pan et al., 2007).
En raison des modes de transmission communs, la coinfection par le VHB et le VIH est aussi
fréquente. La séroprévalence de la coinfection VHB/VIH (2,0%) dans cette étude était
largement inférieure à celles rapportées par Nagalo et al., (2011b) chez les donneurs de sang
du CRTS de Ouagadougou (56,3%) ; et par Ilboudo et al. (2010) chez les femmes enceintes
séropositives au VIH (12,2%). Par contre elle est supérieure à celle de Simporé et al. (2006)
chez les femmes enceintes séropositives au VIH (0,005%), Ces différences pourraient
s’expliquer par les groupes de population et les différences dans les méthodes
d'échantillonnage. Des études cliniques qui ont évalué l'impact du VHB sur la progression du
VIH avant la disponibilité générale d'une thérapie antirétrovirale hautement active (HAART),
ont montré des résultats contradictoires. En effet Landrum et al., (2010) ont rapporté qu’une
préservation immunologique grâce à l'utilisation accrue de la HAART serait susceptible de
réduire le risque d’une infection chronique par le VHB chez les sujets VIH positifs (Landrum
et al., 2010). Une étude récente vient de montrer que la coinfection (VHB chronique/VIH) a
un impact significatif chez les sujets VIH positifs car le risque d’évolution vers le stade SIDA
ou le décès, suite au conséquence (cancer du foie) du VHB, est presque le double (Chun et al.,
2012).
En transfusion sanguine, le risque de qualifier une poche infectée au VHB provient
exclusivement des dons d’individus en période fenêtre où la présence des antigènes du virus
est indétectable (Nagalo et al., 2011a). L’élimination de certains dons positifs ou « douteux »
à l’AgHBs par ELISA peut aussi entraîner une perte énorme de donneurs donc un manque à
gagné important en produit sanguin. Les techniques de biologie moléculaire, longtemps
DIARRA Birama
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réservées au domaine de la recherche en Afrique subsaharienne, contribuent qualitativement à
l’amélioration du dépistage en transfusion sanguine. Leur utilisation a été démontrée dans la
réduction de la période fenêtre. Nombreuses sont les variantes de la PCR qui ont prouvées
leur efficacité partout dans le monde, du dépistage génomique viral en passant par les
méthodes multiplex pour un diagnostic en une seule étape des génotypes du VHB.
Cette étude a détecté par PCR, l’ADN du virus de l’hépatite B chez 41 sur 200 donneurs de
sang. Ce résultat confirme l’hypothèse que la PCR est plus sensible que la sérologie et permet
donc de réduire la fenêtre sérologique en éliminant les faux positifs de celle-ci (Weber et al.,
2005). Ce résultat concorde avec celui de Nagalo et al., (2011b). La charge virale de l’hépatite
B n’a pas été évaluée dans notre étude. Cependant d’autres études ont montré des résultats
discordants. En effet, Xu et al., (2009) ont montré que la charge virale de l’hépatite B était
plus élevée chez les patients atteints CHC que les non CHC, alors que Asim et al., (2010)
n’ont pas trouvé une différence significative . Plusieurs études ont aussi suggéré une
augmentation du risque de carcinome hépatocellulaire avec une charge virale élevée de
l’hépatite B (> 106 copies / ml, 104-107 copies / ml ou > 105 copies / ml) (Ito et al., 2010 ;
Zhou et al., 2012).
A cet effet, un système de génotypage du VHB relativement simple, rapide, économique, avec
une grande sensibilité et spécificité a été établie sur la base de méthodes développées par
Naito et al., (2001) et Chen et al., (2007). Cette méthode est appropriée pour les enquêtes
épidémiologiques à grande échelle et des examens cliniques du VHB. Par rapport aux
méthodes de Kirschberg et al., (2004) ; Naito et al., (2001), cette PCR multiplex semble être
plus adéquate à la caractérisation des génotypes du VHB dans des pays en voie de
développement comme Burkina Faso compte tenu de sa forte endémicité en Afrique de
l’Ouest (Mulders et al., 2004). La sensibilité de cette méthode a été confirmée par la
négativation d’une PCR de prés-séquençage réalisée sur tous les échantillons négatifs au
génotype.
Dans la présente étude les génotypes A, B, D et F étaient absent. Ces résultats corroborent
avec la littérature qui stipule que le génotype A est ubiquitaire et prédomine en Europe du
Nord-ouest, en Amérique du Nord et en Afrique centrale (Kurbanov et al., 2010) ; le génotype
B principalement trouvé en Asie et dans les iles du pacifique (Chan et al., 2011) ; le génotype
D endémique mais très fréquent sur le pourtour du bassin méditerranéen et au Moyen-Orient
DIARRA Birama
Page 41
(Ghosh et al., 2013) ; et le génotype F prédominant en Amérique Latine et Centrale (Devesa
et al., 2008).
Par contre les génotypes C (9,8%) et E (26,8%) du VHB ont été caractérisés et confirmés par
une PCR individuelle. Cette prédominance du génotype E sur C confirme l’hypothèse qu’il
est endémique en Afrique de l’ouest (Mulders et al., 2004; Olinger et al., 2006). Ce résultat
corrobore avec celui de Komas et al., (2013) en République de centre Afrique. La prévalence
du génotype C dans cette étude est supérieure à celles de Panigrahi et al., (2010) en Inde
(3,3%), de Hassan et al., (2011) en Egypte (8%) ; et largement inférieure à celle de Ma et al.,
(2011) en Shenyang, Chine (50%). Ces différences peuvent probablement s’expliquer par la
diversité des populations d’étude et l’endémicité du génotype. Contrairement à d’autre étude
(Norder et al., 2004) qui a montré une faible diversité génétique du génotype E en Afrique de
l’ouest, cette étude a trouvé une prédominance de l’infection mixe aux génotypes E/C 26
(63,4%) chez les donneurs de sang de premier don du CRTS-O. Ce recombinant E/C pourrait
éventuellement être le premier sous génotype du virus de l’hépatite B en Afrique occidentale
que nous allons nommer E1. A notre connaissance, ce genre de recombinaison E/C du VHB
n’a pas été signalé jusqu’ici en Afrique de l’ouest.
Les génotypes obtenus ont été confirmés par une PCR de pré-séquençage. La différence entre
ces génotypes était significative avec p ˂ 0,001. Par contre nous n’avons pas trouvé de
différences significatives entre les prévalences des génotypes C, E et E/C en fonction du sexe,
l’âge et de provenance avec respectivement p ˂ 1,000 ; p ˂ 0,960 et p ˂ 0,965. Cela peut
s’expliquer par la petite taille de l’échantillon.
D’un point de vue clinique, il semblerait que la nature du génotype puisse influencer la
sévérité de la maladie et la réponse aux traitements. Il existe peu d’informations sur la
clinique du génotype E en Afrique en général. Dans ce contexte, il est nécessaire de mener
d'autres études sur des cohortes plus importantes pour déterminer la prévalence globale et la
signification clinique de cette nouvelle souche E1 caractérisée.
DIARRA Birama
Page 42
CONCLUSION
ET
PERSPECTIVES
6. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Notre étude a confirmé la présence effective de l’ADN viral du VHB chez 41 sur 200
donneurs de sang par PCR. Après le génotypage, les génotypes A, B, D et F étaient absents
chez nos donneurs de sang. Cependant, l’étude a caractérisé les génotypes E, C et une
infection mixte aux génotypes E/C. Les prévalences des génotypes E et C étaient
respectivement de 26,8% et 9,8%, et celle de l’infection mixe E/C était de 63,4%.
Dans cette étude nous confirmons non seulement la prédominance du génotype E mais
mettons en évidence pour la première fois à notre connaissance l’existence du génotype C du
VHB au Burkina Faso. Le nouveau recombinant E/C pourrait éventuellement être le premier
sous génotype du virus de l’hépatite B en Afrique de l’Ouest nommé E1. Les génotypes
caractérisés ont été confirmés par une PCR de pré- séquençage.
Il est donc nécessaire de mener d'autres études sur des cohortes plus importantes pour
déterminer la prévalence globale et la signification clinique de cette nouvelle souche E1
caractérisée.
Les résultats fournis par cette étude permettent d’envisager les perspectives suivantes :
 Confirmation des génotypes obtenus par séquençage et analyse phylogénique ;
 Elargissement de l’étude à une population représentative du Burkina Faso ;
 Caractérisation des souches clinique du virus de l’hépatite B chez les patients atteints
d’hépatite chronique ou de carcinome hépatocellulaire à fin d’enduire les aspects
cliniques liés aux génotypes correspondants ;
 Etudier l’implication du VHB dans la progression du VIH chez les patients coinfectés
sous traitement.
DIARRA Birama
Page 44
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