ADN recombinant

Chapitre 10
L’isolement et la manipulation de gènes
Injection d’ADN étranger dans une
cellule animale
Comment amplifier un gène d’intérêt?
Amplification in vivo à l’aide du clonage d’ADN
L’ensemble formé par un vecteur
et un ou des fragments insérés
est appelé ADN recombinant. Le
mélange d’ADN recombinant est
ensuite utilisé pour transformer
des cellules bactériennes. En
général, il pénètre une seule
molécule de vecteur recombinant
par cellule bactérienne. Ces
cellules sont étalées et se
multiplient en formant des
colonies. Par conséquent, une
colonie contient une population
très importante d’inserts
identiques d’ADN, et on appelle
cette population un clone d’ADN.
La construction de l’ADN recombinant
1- Les types d’ADN donneur:
a) ADN génomique
b) ADN complémentaire (ADNc)
c) ADN obtenu par synthèse chimique
2- Couper l’ADN donneur et le vecteur à l’aide d’enzymes de restrictions
3- Relier les molécules d’ADN (ADN donneur-vecteur)
4- Amplifier chaque ADN recombinant à l’aide de la machinerie bactérienne
C’est la découverte et la caractérisation des enzymes de restriction qui a
permis le développement de la technologie de l’ADN recombinant. Les
enzymes de restriction sont produites par des bactéries et agissent
comme des ciseaux en coupant l’ADN au niveau de séquences cibles
spécifiques.
Exemple de coupure à l’aide d’EcoRI:
Les enzymes de restriction
•
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•
•
•
Enzymes qui clivent l’ADN
Reconnaissent des séquences nucléotidiques spécifiques
1ère enzyme découverte chez Haemophilus influenzae en 1970
Différentes enzymes sont disponibles commercialement
Nomenclature: BamHI
– B première lettre du genre bactérien (Bacillus)
– am lettres de l’espèce bactérienne (amyloliquefaciens)
– H représente la souche
bactérienne (H)
– I première enzyme
découverte chez cette
bactérie
Fabrication d’un plasmide d’ADN chimérique
Afin que des extrémités collantes
s’associent pour former une
population de molécules chimériques,
les squelettes sucre-phosphate
doivent être soudés ensemble par
l’utilisation de l’ADN ligase qui
crée des liaisons phosphodiesters.
Amplifier l’ADN recombinant
L’ADN recombinant ligaturé pénètre
dans une cellule bactérienne par
transformation. Après son entrée
dans la cellule hôte, le vecteur
plasmidique est capable de se
répliquer car les plasmides
possèdent habituellement une
origine de réplication. La colonie
résultante de bactéries contiendra
des milliards de copies de l’insert
d’ADN donneur de départ. Cet
ensemble de copies amplifiées du
fragment unique d’ADN donneur
constitue un clone d’ADN.
Choisir un vecteur de clonage
1- Les plasmides: Petites molécules circulaires
d’ADN capables de répliquer leur ADN
indépendamment du chromosome bactérien.
Servent à cloner des fragments d’au plus 30 kb.
2- Les vecteurs viraux: Offrent de nombreux
avantages pour le clonage et les applications
des gènes clonés qui en découlent. Comme
l’efficacité d’infection des virus est élevé, le
gène cloné peut être introduit dans une cellule
à une fréquence élevée. Servent à cloner des
fragments de tailles définies.
3- Les cosmides: Vecteurs hybrides de phages
lambda et de plasmides. Leur ADN peut se
répliquer dans la cellule comme celui d’un
plasmide et être empaqueté comme celui d’un
phage. Servent à cloner des fragments d’au
plus 45 kb.
4- Les vecteurs à large capacité: Permettent le
clonage de larges fragments (maximum de 300 kb pour les BAC et de 400 kb pour les YAC).
BAC: «Bacterial artificial chromosome» ; et YAC: «Yeast artificial chromosome».
5- Les vecteurs d’expression: Permettent le clonage mais aussi l’expression.
Choisir un vecteur de clonage -suite
Différents scénarios pour l’entrée des
molécules recombinantes dans la cellule
bactérienne
Un clonage dans le phage lambda
Fabrication d’une banque d’ADN
Une banque d’ADN constitue l’ensemble des
clones obtenu à partir d’un seul échantillon
d’ADN. Il existe trois types de banques
d’ADN:
1- Banque génomique: Banque couvrant
l’ensemble du génome.
2- Banque d’ADN complémentaire ou ADNc:
Banque constituée d’ADNc, qui ne
représentent pas nécessairement la totalité
des ARNm. Il s’agit plutôt d’une banque
fabriquée à partir uniquement des régions
transcrites du génome.
3- Banque d’expression: Banque dans
laquelle le vecteur porte des signaux
transcriptionnels permettant à n’importe
quel insert cloné de produire un ARNm et en
dernier lieu, une protéine.
Trouver des clones spécifiques à l’aide de sondes
Le criblage d’une banque
d’ADN est réalisé en utilisant
une sonde spécifique qui
trouvera et signalera le clone
que l’on cherche à identifier. On
peut soit utiliser une sonde
d’ADN ou une sonde qui
reconnaît les protéines si un
vecteur d’expression est utilisé
et si le produit spécifique d’un
gène (protéine) a au préalable
été isolé sous forme pure,
permettant le développement
d’anticorps.
Criblage d’une banque d’ADN phagique
Le criblage destiné à identifier des acides nucléiques spécifiques
Les techniques de transferts de
Southern et Northern peuvent
également être utilisée pour
déterminer si 1) un individu est
porteur du gène ou plus
précisément de l’allèle qui aura
au préalable été cloné ou 2)
déterminer si le gène en question
est exprimé sous certaines
conditions à l’étude.
La complémentation fonctionnelle
On peut détecter des clones spécifiques dans une banque bactérienne
(plasmidique) ou phagique grâce à leur capacité à restaurer la fonction
éliminée par la mutation récessive dans un organisme. Cette procédure
s’appelle la complémentation fonctionnelle ou le sauvetage de mutants.
Construire une banque bactérienne ou phagique contenant
des inserts d’ADN donneur recombinant de type sauvage a+
Transformer les cellules d’une lignée cellulaire
mutante a- en utilisant l’ADN de clones individuels de la banque
Identifier les clones de la banque qui produisent des cellules
transformées avec le phénotype dominant a+
Récupérer le gène a+ à partir du clone phagique ou bactérien positif
Amplification in vitro à l’aide de la réaction de polymérase en chaîne
Si on connaît la séquence de certaines parties
du gène ou d’un fragment intéressant, on
peut l’amplifier en conditions in vitro dans un tube,
tout cela sans clonage. Cette procédure s’appelle
la réaction de polymérase en chaîne (PCR ou
polymerase chain reaction en anglais).
Étapes de la réaction:
1) Dénaturation (95°C)
étape qui dénature les deux fragments d’ADN
2) Hybridation (température variable)
étape où les amorces s’hybrident à leurs
séquences complémentaires
3) Élongation (72°C)
Extension des amorces par l’ADN polymérase
Applications de la technologie de l’ADN recombinant
Le fait de disposer d’un gène isolé sous la forme d’un clone (ou obtenu par PCR)
ouvre diverses perspectives expérimentales:
1- On peut déterminer la séquence d’ADN de ce gène en utilisant la technique
de séquençage.
2- On peut muter le gène cloné et le réintroduire dans son hôte d’origine afin
d’étudier les propriétés fonctionnelles de ce gène.
3- On peut l’utiliser comme sonde pour la cartographie ou le diagnostic génétique.
4- On peut introduire le gène cloné dans un nouvel hôte afin de créer un
organisme transgénique (ou génétiquement modifié) que l’on n’aurait pas pu
obtenir facilement à la suite de procédures standards de croisement.
Déterminer une séquence d’ADN
La séquence nucléotidique d’un gène représente l’aboutissement de la
caractérisation de sa structure génétique. Pour séquencer un ADN, il faut
pouvoir en obtenir des fragments définis. Il y a donc une forte interdépendance
entre la technologie du clonage et celle du séquençage.
Le principe du séquençage
La technique de séquençage la
plus utilisée actuellement a été
développée par Fred Sanger.
Elle est basée sur une synthèse
d’ADN en présence de
didésoxynucléotides, qui à
l’inverse de désoxynucléotides
normaux, sont dépourvus de
groupement hydroxyle en 3’.
Séquenceurs automatisés
Ces appareils ont permis d’intensifier les séquençages d’ADN et même d’obtenir
la séquence de génomes complets en employant à grande échelle des protocoles
de séquençages robustes à haut débit.
Ajout des 4 ddNTP marqués par un fluorophore différent
Électrophorégramme obtenu suite au
séquençage automatisé
Exprimer des gènes eucaryotes dans des bactéries
Les bactéries transgéniques, contenant un transgène, peuvent être utilisées
comme « usine » de synthèse de protéines eucaryotes utiles, qui autrement
seraient difficiles à obtenir. Il existe plusieurs systèmes de ce type pour
produire en masse des protéines étrangères.
L’un de ces systèmes utilise l’ARN polymérase
du phage T7 dont l’action s’exerce sur un
promoteur de T7. Vers la fin de l’infection, le
phage T7 synthétise de grandes quantités de
produits de gène à partir de plusieurs sites
appelés promoteurs tardifs. Les gènes des
chromosomes de l’hôte n’étant pas synthétisés
à ce moment-là, ces produits sont les seules
protéines synthétisées. Pour tirer profit de ce
système, le gène de l’ARN polymérase de T7
est manipulé de façon à être transcrit sous le
contrôle d’un promoteur lac, à partir duquel la transcription est normalement inhibée par le
répresseur lac, une protéine exerçant une régulation négative. Toutefois, si on ajoute de
l’IPTG, un analogue du lactose, le répresseur est inactivé et de grandes quantités de l’ARN
polymérase de T7 sont synthétisées. Dans le second composant du système, le gène choisi
est inséré à côté du promoteur tardif de T7. L’ARN polymérase de T7 transcrit alors ce gène
en quantité élevée.
La technologie de l’ADN recombinant chez les eucaryotes
Les techniques de manipulation,
clonage et expression des gènes
ont d’abord été développées chez
les bactéries, mais elles sont
désormais utilisées en routine
chez de nombreux modèles
eucaryotes. Le baculovirus des
insectes est un vecteur largement
employé pour les protéines
eucaryotes. Des gènes sont
insérés dans celui-ci et exprimés
à des fréquences élevés dans
des cellules d’insectes en culture.
Suivre l’introduction d’un gène
Lorsque de l’ADN étranger (provenant de la même espèce ou non) est introduit
dans une cellule eucaryote, il peut soit remplacer un gène résidant, soit subir
une insertion ectopique. Une fois introduit, il peut être difficile de détecter l’activité
d’un gène donné. Ce problème peut être résolu en mettant sous le contrôle d’un
même promoteur le gène en question et un autre gène, un gène rapporteur, dont le
produit est facilement décelable. Le gène rapporteur signalera les endroits et les
moments auxquels le gène étudié est actif.
Le génie génétique chez les végétaux
Le plasmide Ti: Les principaux vecteurs utilisés de façon routinière pour produire
des plantes transgéniques sont dérivés de la bactérie du sol Agrobacterium
tumefaciens. Cette bactérie provoque une maladie appelée galle du collet au
cours de laquelle la plante infectée produit des excroissances incontrôlées,
généralement à la base du collet de la plante. Le responsable de la formation
de tumeurs est un grand ADN plasmidique circulaire de 200 kb, le plasmide
Ti inducteur de tumeurs.
Le génie génétique chez les végétaux
Le génie génétique chez les animaux
On peut maintenant cloner et manipuler des gènes
de champignons, végétaux et animaux dans des
bactéries, puis les réintroduire dans la cellule
eucaryote, où ils s’intègrent
généralement dans l’ADN
chromosomique. Ces
recherches ont ouverts
la voie à la thérapie
génique, soit une approche
où un gène fonctionnel est
introduit pour remplacer ce
même gène mais qui est
déficient chez un receveur.
On en distingue deux types,
soient la thérapie génique
germinale et la thérapie
génique somatique.
Utilisation de la génétique moléculaire pour détecter
directement les allèles responsables des maladies
Lorsque l’on peut attribuer une maladie génétique
au changement d’un nucléotide spécifique, des
sondes oligonucléotidiques synthétiques
permettent d’identifier ces changement. Une
sonde, qui contient la séquence de type sauvage,
peut être utilisée lors d’une analyse par transfert
de Southern, pour déterminer si l’ADN contient
la séquence de type sauvage ou mutante. La PCR
constitue également un autre outil qui permet de
mener à bien ce diagnostic grâce à l’utilisation
d’amorces spécifiques qui encadrent le site, puis
isolation de cet ADN amplifié et séquençage.
Quelques maladies génétiques courantes