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Du prélèvement à l’analyse…
Laboratoire Protec LEA : Microbiologie des Eaux et des Aliments
Du prélèvement à l’analyse
L’eau est prélevée selon un plan d’échantillonnage précis dans
des flacons stériles d’1 litre additionné de thiosulfate de sodium.
⇒ Pourquoi stérile ? Afin d’être exempt de toutes bactéries.
⇒ Pourquoi le thiosulfate de sodium ? Parce qu’il neutralise
l’effet des biocides oxydants tels que le chlore et le brome.
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Identification des échantillons :
Enregistrement informatique ⇒ L’échantillon est identifié
par un numéro et un code à barre afin de permettre une
traçabilité sûre.
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Du prélèvement à l’analyse
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Du prélèvement à l’analyse
Pile de boites de Pétri contenant du GVPC (Milieu spécifique
permettant la croissance des légionelles) - Photo.
4 à 7 boites sont nécessaires pour l’analyse des légionelles
selon la norme T90-431.
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Filtration des eaux propres : 1000ml (Ou 500ml pour les eaux
non filtrables).
Filtration sur membrane polycarbonate de 0,2µm.
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Du prélèvement à l’analyse
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Pour les eaux sales (Tours aéroréfrigérantes par
exemple) : Centrifugation de 500ml pendant 30 min
à 4100 tr/min.
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Analyse
Direct : 200µl de l’eau prélevée est déposée sur le milieu de culture. Une dilution
au 10ème est réalisée pour les eaux sales et non filtrables.
Concentré : Après filtration ou centrifugation, toutes les bactéries présentes dans
1L ou 500ml d’eau, le sont dans 5ml. On dépose 100µl de ce concentrat sur le
milieu de culture.
Traitements : Afin d’éliminer la flore interférente, une épreuve thermique (30
min à 50°C) et une épreuve acide (5min à pH 2,0) sont appliquées.
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Du prélèvement à l’analyse
Incubation
Les piles de boites ainsi ensemencées sont
incubées 8 à 10 jours à 36°C -/+ 2°C.
Les conditions ambiantes sont maitrisées car
l’homogénéité des incubateurs est testée
annuellement par le biais de cartographies en 9
points.
La température interne de l’enceinte est
contrôlée en continu par une sonde étalonnée.
Les alarmes températures sont gérées par notre
service métrologie.
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Colonies caractéristiques de Legionella - Photo.
Test de confirmation : Le repiquage sur 3 milieux
de culture différents permet de mettre en évidence
l’utilisation de la L cystéine.
Incubation 2 à 4 jours.
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Colonies caractéristiques de Legionella - Photo.
A l’issue de l’incubation et du test de
confirmation, les Legionella exigentes en L
cysteine n’ont poussé que sur un seul milieu.
Croissance sur un milieu ne contenant pas de L
cysteine : La souche n’est pas une Legionella.
Croissance uniquement sur le milieu contenant
de la L cysteine : La souche est une Legionella spp.
Identification au genre réalisée.
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Identification de l’espèce
Test d’agglutination ou Test au latex.
Des anticorps spécifiques de Legionella sont adsorbés à la surface de billes de
latex. La rencontre entre ses anticorps et les antigènes présents dans les souches
bactériennes forme une agglutination (Visible en haut de la photo).
Agglutination : Souche de Legionella pneumophila 1, ou 2-15 ou anisa.
Pour les identifications plus poussées : Centre de référence des légionelles.
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Du prélèvement à l’analyse
Alertes données par le laboratoire à l’issue du
repiquage (de 5 à 14 jours après ensemencement).
Rapport d’essai définitif sous accréditation à la
fin de l’incubation (8 à 10 jours + 2 à 4 jours en cas
de repiquage).
Souches de Legionella conservées 3 mois pour les
enquêtes épidémiologiques.
Déchets biologiques incinérés.
Merci de votre attention