pathfinder™ rsv

PATHFINDER™ RSV
50 TESTS
79674
QUALITATIVE ENZYME IMMUNOASSAY (EIA) FOR THE DIRECT
DETECTION OF HUMAN RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS (RSV)
ANTIGEN IN NASAL WASH AND NASAL ASPIRATE SPECIMENS
IVD
For In Vitro Diagnostic Use
TABLE OF CONTENTS
1- INTENDED USE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3
2- SUMMARY AND EXPLANATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3
3- PRINCIPLES OF THE PROCEDURE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3
4- PRODUCT INFORMATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3
5- WARNINGS AND PRECAUTIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4
6- SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
7- PROCEDURE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
8- QUALITY CONTROL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
9- DETAILS OF CALIBRATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
10- RESULTS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
11- LIMITATIONS OF THE PROCEDURE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
12- EXPECTED VALUES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
13- SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
14- REFERENCES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
2
1- INTENDED USE
The PATHFINDERTM Direct Antigen Detection System for RSV is a qualitative enzyme immunoassay
(ELISA) for the direct detection of human respiratory syncytial virus (RSV) antigen in nasal wash and
nasal aspirate specimens.
2- SUMMARY AND EXPLANATION
Respiratory syncytial virus is a major cause of bronchiolitis and pneumonia in infants and children.
The most severe disease occurs during the first year of life (1). Epidemics due to this virus occur
nearly every year in the fall, winter, and spring (2,3). RSV causes significant respiratory illness in
healthy adults. However, the disease in adults tends to be milder than in young children (4).
Rapid diagnosis of RSV infection has gained in importance with the advent of effective therapy. It
allows formulation of a prognosis, initiation of treatment, and early action to control spread of the
disease. Traditional cell culture methods (5,6,7,8) can take up to 3 weeks, and are highly
dependent on the quality of specimen transport (8,14). Immunologic tests offer advantages of
rapidity, technical simplicity, and lower costs when compared with viral culture. Immunofluorescent
(5,6,7,9,10) and enzyme immunoassay (EIA) (11,12,13) methods have been shown to be effective
for the detection of RSV.
The PATHFINDER™ RSV Direct Antigen Detection System uses polyclonal and monoclonal antibodies
to detect RSV directly in patient specimens. This assay combines the specificity and reproducibility of
monoclonal antibodies with the speed and efficiency of an EIA. Qualitative results are available
within 90 minutes of beginning the assay. The PATHFINDER™ RSV Direct Antigen Detection System
can detect nonviable (culture negative) RSV. This test offers a reliable alternative to the timeconsuming cell culture and subjective, labor-intensive fluorescent techniques.
3- PRINCIPLES OF THE PROCEDURE
RSV antigens present in the specimen bind to polyclonal anti-RSV antibodies coated on the
tube. HRP-conjugated monoclonal antibodies directed against RSV attach to antigen captured
on the tube wall. A washing step removes unbound specimen and conjugate. Peroxidase
substrate added to the tube will generate a blue color if HRP-conjugated antibodies are
present. Visual or spectrophotometric evaluation of the specimen determines the presence or
absence of RSV.
A specimen displaying blue color or with an absorbance value greater than or equal to the
upper Gray Zone Cut-off Value is positive for RSV antigen. A specimen displaying no blue
color or with an absorbance value less than or equal to the lower Gray Zone Cut-off Value is
negative for RSV antigen.
4- PRODUCT INFORMATION
Store all kit reagents at +2-8°C. Avoid freezing reagents. Bring reagents to room temperature
(23 ± 3°C) before each use. Promptly return them to +2-8°C after use. All reagents are stable
to the expiration date stated on the label when stored as recommended. Do not substitute
reagents from other manufacturers or between different kit lot numbers. Do not use reagents
beyond expiration dates.
All reagents are intended for in vitro diagnostic use.
3
Labeling
R1
R2
R3
R4
Reagents
Presentation
RSV antibody Antibody Tubes : rabbit anti-RSV IgG-coated polystyrene
tubes
tubes
Conjugate
Conjugate : horseradish peroxidase conjugated murine
monoclonal antibodies in buffered saline, pH 7.4, protein
stabilizer.
Preservative ≤ 0.01% Thimerosal
Sample diluent Sample diluent : Buffered saline, pH 7.5, with EDTA and
surfactant
Preservative ≤ 0.01% Thimerosal
Positive control Positive control : inactivated RSV (Long) in buffered saline,
pH 7.5, EDTA, and surfactant
Preservative ≤ 0.01% Thimerosal
1 x 50 tubes
1 x 5 ml
1 x 25 ml
1 x 3 ml
R5 Substrate Buffer Substrate Buffer : citrate buffer, pH 4.2, and hydrogen
peroxide
1 x 40 ml
R6 Chromogen TMB Chromogen : tetramethylbenzidine dissolved in dilute HCI
1 x 2.5 ml
R7 Assay Treatment Assay Treatment buffer : buffered saline, pH 10.3, with
buffer
EDTA. Preservative ≤ 0.01% Thimerosal
1 x 2.5 ml
RSV Antibody Tubes: Store the tubes in the bag. Do not open the tube bag until it reaches room
temperature (23±3°C). When ready to use, remove tubes needed for the assay. Return all
unused tubes in the bag and carefully close the bag.
Once opened, the tubes, stored as recommended and in absence of microbial contamination,
are stable for 3 months.
• PathfinderTM RSV positive control : 1 x 3 ml
79482
NOTE: Do not substitute reagents from other manufacturers or use reagents beyond
expiration date
Physical and Chemical Indications of Instability
A cloudy appearance of any liquid reagent may indicate microbial contamination.
5- WARNINGS AND PRECAUTIONS
1. For in vitro diagnostic use.
2. Patient samples and positive control may be routinely processed with minimum risk using the
procedure described. However, handle these products as potentially infectious according to
universal precautions and good clinical laboratory practices, regardless of their origin,
treatment, or prior certification. Use an appropriate disinfectant for decontamination. Store
and dispose of these materials and their containers in accordance with local regulations and
guidelines.
3. Reagents containing animal sourced biologicals may be routinely processed with minimum
risk. However, handle these products as potentially biohazardous according to universal
precautions and good laboratory procedures.
4. Avoid skin and mucous membrane contact with Chromogen and sulfuric acid. If contact
occurs, wash with water. Do not ingest.
5. Neutralize any liquid waste containing acid prior to decontamination.
4
6. This kit contains ≤ 0.01% thimerosal (≤ 0.005% mercury weight per volume). Mercury
compounds may be considered reproductive toxicants and environmental polluants by
government agencies at certain concentrations/quantities. Please handle appropriately and
dispose of according to local, regional, and national regulations.
6- SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
Collect a minimum of 150 µl nasal wash or nasal aspirate using the routine collection and
transport procedure for your laboratory. Nasal swabs are not considered as sensitive for
detection of RSV (5). Avoid using collection containers with preservatives, metal ions, or
detergents, all of which interfere with the assay. Do not use transport media containing sera. If
possible, obtain the nasal secretions during the acute phase of the illness when the greatest
amount of viral shedding occurs. As the illness progresses the viral shedding decreases, thus
decreasing the amount of detectable virus.
Store specimens for up to 24 hours at +2-8°C and protect from evaporation and
contamination. For longer storage or shipment, freeze specimens at -70°C or colder. Repeated
freezing and thawing will cause deterioration of the specimen. Ship specimens in compliance
with federal transportation regulations for etiologic agents (42 CRF 72).
Samples containing visibly high levels of blood should be avoided to ensure accuracy of
results.
7- PROCEDURE
A) Materials Provided
R1.
R2.
R3.
R4.
R5.
R6.
R7.
Anti-RSV Antibody Tubes
Anti-RSV HRP – Conjugated Monoclonal Antibodies
Sample Diluent
Positive Control
Substrate Buffer
Chromogen
Assay Treatment Buffer
B) Materials Required, But Not Provided
1. Deionized or distilled water for diluting sulfuric acid and washing tubes.
2. 1N Sulfuric Acid H2SO4 to stop reaction prior to spectrophotometric analysis. Use an
analytical reagent grade concentrated H2SO4 to make the 1N acid. To prepare 500 ml 1N
H2SO4, add 14 ml concentrated H2SO4 to 486 ml distilled or deionized water. Store in a
tightly covered glass container at room temperature (23 ± 3°C).
3. Test tube racks capable of holding 12 x 75 mm tubes.
4. Pipettes with disposable tips capable of accurately delivering 100 µl, 300 µl, and 500 µl.
5. Disposable serological pipettes, 10 ml.
6. Disposable 12 x 75 mm glass test tubes.
7. Clean glass tube for preparing working substrate solution (see procedure step 9).
8. Plastic film.
9. Apparatus for washing the tubes which includes rinsing and aspirating devices and
appropriate flasks and tubing for trapping the liquid waste (see Diagram 1).
a) Rinsing devices: plastic wash bottle,
b) Aspirating devices: Aspirator tip and vacuum pump.
10.Vortex mixer.
5
11.Spectrophotometer with variable wave lengths within the visible light range and a linear
range of 0–2.0 absorbance units for reading absorbance at 450 nm.
12.Sodium hypochlorite (bleach) for decontamination.
13.Timer capable of timing 15 and 60 minutes.
DIAGRAM 1
Aspirating Equipment
Vacuum
Pump
Aspiration
Pipette
Vacuum
Trap
Procedure Comments
1. Bring all reagents and specimens to room temperature (23 ± 3°C) before use.
2. Incubations at temperatures or times other than those specified may give erroneous results.
3. When adding reagents, avoid delays or interruptions. Do not allow the tubes to dry once
the assay has been started.
4. CAUTION: Do not pipette by mouth.
5. Always pipette with the pipet tip near the bottom of the tube. Do not deliver reagents down
the wall of the tube. Do not touch the pipet tip to the reaction solution.
6. Change pipet tips between samples.
7. Reusable glassware must be washed and thoroughly rinsed free of all detergents. Use
deionized or distilled water.
8. All reagents have been optimized for detection of RSV. Dilution or adulteration of reagents
may result in loss of sensitivity.
C) PROCEDURE
Mix all reagents well before use
1. Label one Antibody Tube for the negative control and one Antibody Tube for the positive
control. Label one antibody tube for each patient specimen
NOTE : A positive and negative control (Sample Diluent) must be run with each assay.
2. Add 1 drop Assay Treatment Buffer to each tube.
3. Add 100 µl HRP-Conjugated Monoclonal Antibody to each tube.
4. Add 300 µl Sample Diluent to the negative control tube; add 300 µl Positive Control to the
positive control tube.
5. Add each patient specimen to the appropriately labeled tube according to the following
instructions:
If the specimen is received in SERUM-FREE transport medium, vortex thoroughly and add
300 µl to the appropriate tube. If the specimen is not in transport medium, dilute with an
equal volume of Pathfinder TM Sample Diluent. Add 300 µl diluted specimen to the
appropriate tube.
Dilution of the specimen more than recommended may result in loss of sensitivity.
6
6. Mix tubes gently and incubate at room temperature (23 ± 3°C) for 60 ± 10 minutes.
7. Carefully aspirate samples from tube.
8. Wash each tube 6 times with 2–4 ml of deionized or distilled water per wash. Remove
excess moisture from the tubes after final wash by inverting the tubes and blotting the rim on
paper towels or by thorough aspiration of the tubes. Inadequate washing or washing with
impure water may cause erroneous results.
9. Prepare the working color reagent.
CAUTION: Do not allow any metal or oxidizing agent to contact chromogen or working color
reagent.
A) Required amount of Substrate Buffer = 0.5 ml Buffer per assay tube.
Required amount of Chromogen = 1 drop Chromogen per ml of Substrate Buffer.
Example: For 6 assay tubes
• The required amount of Substrate Buffer = 3.0 ml ;
• The required amount of Chromogen = 3 drops.
Add the required amount of Substrate Buffer and Chromogen to a clean glass or plastic tube.
B) Cover the tube with plastic film and mix contents by inverting tube several times. Use substrate
solution within 30 minutes. Minimize exposure to light. Spontaneous blue color generation may
be indicative of reagent contamination. The working color reagent must remain colorless before
use.
10.Add 0.5 ml working color reagent to each tube. Mix the tubes gently, and incubate at room
temperature (23±3°C) for 15 minutes, minimizing exposure to strong light. Do not allow color
reaction to exceed 15 minutes.
11.Read the tubes visually or with a spectrophotometer to determine the test results.
Visual Determination
Do not stop reaction by adding acid.
At the end of the incubation period, the negative control tube should be colorless. The positive
control should be deep blue. Specimens displaying blue color are positive for RSV antigen.
Specimens displaying no blue color are negative for RSV antigen.
Note : Visual results for weakly positive specimens should be processed and read per the
following Spectrophotometric Determination method.
Spectrophotometric Determination
A) Add 1 ml 1N H2SO4 to each tube in the same order and approximately at the same time interval
that the working color reagent was added to each tube. Vortex the tubes. Remove air bubbles
before reading absorbance. After the addition of acid to each tube, the final reaction material is
stable for up to 8 hours if protected from light.
B) Blank the spectrophotometer with deionized or distilled water at 450 nm.
C) Read the absorbance of the negative control (Sample Diluent), positive control and specimen
tubes at 450 nm. To distinguish positive samples from negative samples, calculate the Cutoff
Value and the Gray Zone, as described in the “Results” Section.
A value greater than or equal to 0.06 absorbance units for the negative control (sample diluent)
indicates possible reagent contamination or inadequate washing.
7
8- QUALITY CONTROL
A positive and negative control must be run with each assay.
Negative Control (Sample Diluent)
• Visual : the Negative Control should be colorless.
• Spectrophotometric : the absorbance value should be less than 0.06 units.
Positive Control
• Visual : the Positive Control should be deep blue.
• Spectrophotometric : the absorbance value should be greater than 0.6 units.
If controls do not react as expected, results are invalid.
9- DETAILS OF CALIBRATION
Spectophotometric Method Only
1. Calculate the Cut-off Value by adding 0.075 to the negative control (Sample Diluent)
absorbance unit value.
Example:
Negative control value
0.017
+ 0.075
Cut-off Value
= 0.092
2. Calculate the Gray Zone. The Gray Zone equals ± 10% of the Cut-off Value (or 0.90 to
1.10 times the Cut-off Value).
Example:
Cut-off Value = 0.092
Gray Zone = 0.083 to 0.101
Cut-off Value x (0.90) = (0.092) x (0.90) = 0.083
Cut-off Value x (1.10) = (0.092) x (1.10) = 0.101
10- RESULTS
a) Visual
Specimens displaying blue color are positive for RSV antigen. Specimens displaying no blue
color are negative for RSV antigen. The negative control should be colorless. The positive
control should be deep blue.
b) Spectophotometric
Specimens with absorbance values less than or equal to the lower Gray Zone Cut-off Value are
negative for RSV antigen.
A specimen with an absorbance value within the Gray Zone is questionable. The laboratory should
repeat the test. If the repeated result, using either the same specimen or a new specimen, shows an
absorbance value within the Gray Zone, the results should be reported as indeterminant.
Specimens with absorbance values greater than or equal to the upper Gray Zone Cut-off Value
are positive for RSV antigen.
Strongly positive specimens may form dark particles of precipitate in the tube.
11- LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
1. Infection with other respiratory pathogens may be present simultaneously with RSV infection,
therefore, additional testing may be indicated in parallel with the PATHFINDER™ RSV. Refer
to the “Specific Performance Characteristics” section for the bacterial and viral crossreactivity studies.
8
2. A negative test result does not exclude the possibility of RSV infection. Small quantities of
virus, obtaining sample too late in infection, or inadequate and improper sampling
techniques may cause a false negative result.
3. This test can detect nonviable (culture negative) RSV.
4. Results of this test should be interpreted in conjunction with information available from the
clinical evaluation of the patient and other diagnostic procedures.
5. The results of this test are qualitative and should be considered as either positive or negative
for the presence of RSV.
12- EXPECTED VALUES
Expected values will vary depending on patient population tested, geographic location, and
time of year. Infection with respiratory syncytial virus can occur in all age groups. Disease is
most common in infants 6 weeks to 6 months of age with a peak at 2 months (1). The most
common clinical diagnoses in these infants include bronchitis, bronchiolitis and pneumonia.
RSV infection in adults is common, but tends to be less severe than in infants. Symptoms can
include rhinorrhea, pharyngitis, cough, headache, fatigue and fever (4). Elderly patients with
RSV infection may develop bronchopneumonia, which may be severe or fatal (17) .
13- SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Accuracy
Two independent investigators tested 241 respiratory specimens from patients ranging in age from
newborn to 93 years of age for respiratory syncytial virus by culture, immunofluorescence (IF),
PATHFINDER™ RSV, and Competitor A’s RSV EIA. The independent study sites were university
hospitals in the East and West of the USA. All of the specimens run by EIA were evaluated visually
and spectrophotometrically.
Specimens were collected for this study during an epidemic outbreak of RSV. The specimens were
cultured for respiratory viruses and smears were made for immunofluorescent staining. The
remainder of the specimen was frozen at –70°C for evaluation by EIA at a later date. In one center,
the immunofluorescence was performed on the smears at the time the specimen was received. In the
other, the smears were frozen at –70°C and were stained at the time of the EIA study. Specimens
which were EIA positive and culture negative were confirmed by the IF results or by blocking assay
(15,16). The blocking assay was performed by incubating the specimen for 1 hour at room
temperature (23 ± 3°C) with and without polyclonal antiserum to RSV. The antiserum would inhibit
the reaction of a true positive specimen. The EIA was then performed on these specimens. A
specimen was considered blocked and thus a true positive if the signal in the tube with blocking
antibody was decreased by at least 50% compared to the tube without blocking antibody.
A specimen was considered a true positive if it was positive by culture or could be confirmed as
positive by two other methods: EIA and blocking or EIA and IF. A specimen was considered a true
negative if it was negative by culture and a positive EIA signal could not be confirmed by either IF or
blocking.
Note: Low amounts of RSV antigen occasionally show a discrepancy between the visual and
spectrophotometric results. Since spectrophotometry is an objective method, it is slightly more
accurate than a visual determination. (See Tables 1 and 2).
9
Table 1
Comparison of PATHFINDER™ RSV with Culture.
SPECTROPHOTOMETRIC
CONFIRMED
Positive
PATHFINDER™ RSV
119
1
Negative
8
111
VISUAL
CONFIRMED
Positive
PATHFINDER™ RSV
Negative
Positive
Negative
Positive
118
4
Negative
11
108
Spectrophotometric
Overall agreement = (TP* + TN) / Total number of samples = (119 + 111) / 239** = 96.2 %
Sensitivity = TP / (TP + FN) = 119 / (119 + 8) = 93.7 %
Specificity = TN / (TN + FP) = 111 / (111 + 1) = 99.1 %
* TP = true positive, TN = true negative, FP = false positive, FN = false negative.
Visual
Overall agreement = (TP* + TN) / Total number of samples) = (118 + 108) / 241 = 93.8 %
Sensitivity = TP / (TP + FN) = 118 / (118 + 11) = 91.5 %
Specificity = TN / (TN + FP) = 108 / (108 + 4) = 96.4 %
* TP = true positive, TN = true negative, FP = false positive, FN = false negative.
**Two specimens were indeterminate by spectrophotometric evaluation and are not included
in this data.
Table 2
Comparison of PATHFINDER™ RSV with Competitor A’s RSV EIA
SPECTROPHOTOMETRIC
COMPETITOR A EIA
Positive
PATHFINDER™ RSV
117
4
Negative
10
107
VISUAL
COMPETITOR A EIA
Positive
PATHFINDER™ RSV
10
Negative
Positive
Negative
Positive
117
5
Negative
16
103
Spectrophotometric
Of the 238* specimens tested, 94.1% agreement (224/238) was observed between
PATHFINDER™ and Competitor A’s EIA. After all discrepant results were resolved, PATHFINDER™
RSV showed a sensitivity of 94.5% and a specificity of 99.1% by spectrophotometric interpretation.
* Three samples were indeterminate by PATHFINDER™ spectrophotometric evaluation and are not
included in this data. One sample was indeterminate by Competitor A’s evaluation and is not
included in this data.
Visual
Of the 241 specimens tested visually, 91.3% agreement (220/241) was observed between
PATHFINDER™ and Competitor A’s EIA. After all discrepant results were resolved,
PATHFINDER™ RSV showed a sensitivity of 92.9% and a specificity of 96.5% by visual
interpretation.
PRECISION
Intra-assay Variability
15 replicates of the positive control, 15 replicates of a 1:20 dilution of the positive control, and
20 replicates of the negative control were tested in one assay to determine the intra-assay
reproducibility. The mean of the optical absorbances was calculated to determine the intra-assay
variability.
Table 3
Sample
Mean (OD 450 nm)
SD
% C.V.
Positive
1.471
0.045
3.1
Low Positive
0.114
0.008
7
Negative
0.006
0.003
50
Inter-assay Variability:
The positive control, a 1:20 dilution of the positive control, and the negative control were
assayed in 9 different assays with 10 replicates per assay from one kit lot to determine
interassay reproducibility. The mean of the optical absorbances from each assay was
calculated to determine the inter-assay variability.
Table 4
Sample
Mean (OD 450 nm)
SD
% C.V.
Positive
1.511
0.095
6.3
Low Positive
0.118
0.011
9.3
Negative
0.010
0.009
90
CROSS-REACTIVITY
Study 1
PATHFINDER™ RSV was tested with organisms that may cause similar clinical presentations or
that may be normal respiratory flora. The assay was performed as directed in the package
insert substituting the organisms for the patient sample. Each assay was run with 300 µl
suspensions containing 0.1 optical density unit (at 620 nm) of each organism in buffered
saline except Mycoplasma pneumoniae, which was tested at a concentration of 5 mg wet cell
weight per µl, and Chlamydia trachomatis, which was tested at a concentration of 1x108
elementary bodies per µl. In addition, the organisms were also tested for interference in the
11
detection of RSV by combining 12 µl of Positive Control (Long) with 300 µl of each suspension.
The results in Table 5 show that no cross-reactivity or interference occurred with the organisms.
This is evidenced by no positive absorbance in the assay by the bacteria alone and the
absence of a greater than 50% drop in signal by the bacteria and RSV compared to the
Positive Control.
Table 5
Microorganisms Tested For Cross-Reactivity
Microorganism
Strain
Absorbance
(organism alone)
Absorbance
(organism+RSV)
Streptococcus Group A
12344
0.010
2.108
Staphylococcus aureus, Cowan
12598
0.014
1.982
Staphylococcus aureus
9996
0.022
1.984
Staphylococcus epidermis
12228
0.009
1.989
Escherichia coli
25922
0.024
2.002
Candida albicans
14053
0.034
1.997
Mycoplasma pneumoniae
P11428
0.006
1.435
L2
0.013
1.593
-
0.012
1.964
Long
1.512
1.512
Chlamydia trachomatis
Negative Control
(Sample Diluent)
Positive Control
Study 2
The viruses listed in Table 6 were tested for cross-reactivity in the PATHFINDER™ RSV . This study
used 300 µl suspensions containing 1 x 105 TCID 50 per ml in Sample Diluent for each of the viruses
except the influenza viruses and Herpes Simplex Type 2. Influenza A was tested at 1 x 108 plaque
forming units per ml and Influenza B was tested at 1 x 107 plaque forming units per ml. HSV Type 2
was tested at 6.8 x 107 plaque forming units per ml. Viral interference in the detection of RSV was
also tested by combining 12 µl of Positive Control (Long) with 300 µl of each suspension. No crossreactivity or interference occurred in the PATHFINDER™ RSV with these viruses. This is evidenced by
no positive absorbance in the assay by the viruses alone and the absence of a greater than 50%
drop in signal by the viruses and RSV compared to the Positive Control.
Table 6
Viruses Tested For Cross-Reactivity
Virus
Virus Strain
Absorbance
(Virus alone)
Absorbance
(Virus+RSV)
HGP
Thompson
MRH
211
1734
6072
106F
611CV35
0.016
0.006
0.004
0.007
0.014
0.012
0.033
0.005
1.114
1.339
1.270
1.514
1.303
1.367
1.378
1.464
Rhinovirus
Type
Type
Type
Type
Type
Type
Type
Type
12
2
6
8
9
15
19
30
59
Virus
Virus Strain
Absorbance
(Virus alone)
Absorbance
(Virus+RSV)
Type A-9
Type B-3
Type B-4
PB Bozek
Nancy
JVB Berschoten
0.008
0.009
0.002
1.636
1.394
1.586
Type 8
Type 11
Type 19
Bryson
Gregory
Burke
0.005
0.006
0.007
1.435
1.517
1.571
C35
Greer
C243
0.017
0.003
0.017
1.692
1.339
1.692
Adenoid6
Rl67
0.011
0.006
1.264
1.447
AD169
0.007
1.583
Maclntyre
MS
0.031
0.003
1.714
1.436
Coxsackie
Echovirus
Parainfluenza
Type 1
Type 2
Type 3
Adenovirus
Type 2
Type 4
Cytomegalovirus
Herpes Simplex
Type 1
Type 2
Varicella Zoster
OKA
0.010
1.475
Influenza A
WSN
0.007
1.516
Influenza B
B/Lee/40
0.008
1.554
Negative Control
(Sample Diluent)
N/A
0.007
1.402
Positive Control
Long
1.827
1.827
14- REFERENCES
1. PARROTT, R.H., KIM, H.W., ARROBIO, J.O., HODES, D.S., MURPHY, B.R., BRANDT, C.D.,
CAMARGO, E., CHANOCK, R.M. 1973. Epidemiology of respiratory syncytial virus infection
in Washington D.C. II. Infection and disease with respect to age, immunologic status, race,
and sex. Am J Epidemiol. 98. 289-300.
2. KIM, H.W., ARROBIO, J.O., BRANDT, C.D., JEFFRIES, B.C., PYLES, G., REID, J.L.,
CHANOCK, R.M., PARROTT, R.H. 1973. Epidemiology of respiratory syncytial virus
infection in Washington D.C. I. Importance of the Virus in Different Respiratory Tract Disease
Syndromes and Temporal Distribution of Infection. Am J Epidemiol. 98, 216-225.
3. MUFSON, M.A., LEVINE, H.D., WASIT, R.E., MOCEGA-GONZALEZ, H.E., KRAUSE, H.E.
1973. Epidemiology of respiratory syncytial virus infection among infants and children in
Chicago. Am J Epidemiol. 98, 88-95.
4. HALL, W.J., HALL, C.B., SPEERS, D.M. 1978. Respiratory syncytial virus infections in adults:
clinical, virologic, and serial pulmonary function studies. Ann Int Med. 88, 203-205.
5. MCLNTOSH, K., CLARK, J.C. 1985. Parainfluenza and respiratory syncytial viruses. In
Manual of Clinical Microbiology Fourth Edition, 763-768, Edited by Lennette E.H., Balons
A., Hauser W.J., Shadony H.J. Washington, D.C. American Society for Microbiology,
13
6. LAUER, B.A. 1982. Comparison of virus culturing and immunofluorescence for rapid detection of
respiratory syncytial virus in nasopharyngeal secretions: sensitivity and specificity. J Clin
Microbiol. 16, 411-412.
7. MINNICH, L., RAY, C.G. 1980. Comparison of direct immunofluorescent staining of clinical
specimens for respiratory virus antigens with conventional isolation techniques. J Clin Microbiol.
12, 391-394.
8. HALL, C.B., DOUGLAS JR., R.G. 1975. Clinically useful method for the isolation of
respiratory syncytial virus. J Infec Dis. 131, 1-5.
9. BELL, D.M., WALSH, E.E., HRUSKA, J.F., SCHNABEL, K.C., HALL, C.B. 1983. Rapid
detection of respiratory syncytial virus with a monoclonal antibody. J Clin Microbiol. 17,
1099-1101.
10.KAO, C., MCLNTOSH, K., FERNIE, B., TALIS, A., PIERIK, L., ANDERSON, L. 1984. Monoclonal
antibodies for the rapid diagnosis of respiratory syncytial virus infection by immunofluorescence.
Diag Microbiol Infect Diseas. 2, 199-206.
11.HENDRY, R.M., FERNIE, B.F., ANDERSON, L.J., GODFREY, E., MCLNTOSH, K. 1985.
Monoclonal capture antibody ELISA for respiratory syncytial virus: detection of individual viral
antigens and determination of monoclonal antibody specificities. J Immunol Methods. 77, 247258.
12. HENDRY, R.M., MCLNTOSH, K. 1982. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of
respiratory syncytial virus infection: development and description. J Clin Microbiol. 16, 324-328.
13. SARKKINEN, H.K., HALONEN, P.E., ARSTILA, P.P., SALMI, A.A. 1981. Detection of respiratory
syncytial, parainfluenza type 2, and adenovirus antigens by radioimmunoassay and enzyme
immunoassay on nasopharyngeal specimens from children with acute respiratory disease. J Clin
Microbiol. 13, 258-265.
14. HAMBLING, M.H. 1964. Survival of the respiratory syncytial virus during storage under various
conditions. Brit J Exp Pathol. 45, 647- 655.
15. HORNSLETH, A., BRENOE, E., FRIIS, B., KNUDSEN, F.U., ULDALL, P. 1981. Detection of
respiratory syncytial virus in nasopharyngeal secretions by inhibition of enzyme-linked
immunosorbent assay. J Clin Microbiol. 14, 510-515.
16. MCLNTOSH, K., HENDRY, R.M., FAHNESTOCK, M.L., PIERIK, L.T. 1982. Enzyme-linked
immunosorbent assay for detection of respiratory syncytial virus infection: application to clinical
samples. J Clin Microbiol. 16, 329-333.
17. GARVIE, D.C., GRAY, J. 1980. Outbreak of respiratory syncytial virus infection in the elderly. Brit
Med J. 281, 1253-1254.
BIO-RAD warrants these products to perform as described in the labeling and literature
supplied. BIO-RAD disclaims any implied warranty of merchantability or fitness for any other
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aforesaid express warranty.
14
PATHFINDER™ RSV
50 TESTS
79674
DETECTION DIRECTE DES ANTIGENES DU VIRUS RESPIRATOIRE
SYNCYTIAL (RSV) DANS LES LIQUIDES DE LAVAGE OU
D’ASPIRATION NASALE PAR METHODE IMMUNOENZYMATIQUE
IVD
TABLE DES MATIERES
1- OBJECTIF DU TEST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
2- RESUME ET EXPLICATIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
3- PRINCIPE DE LA METHODE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
4- INFORMATIONS SUR LE PRODUIT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
5- MISES EN GARDE ET PRECAUTIONS D’EMPLOI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
6- PRELEVEMENT ET PREPARATION DE L’ECHANTILLON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
7- PROCEDURE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
8- CONTROLE QUALITE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
9- DETAILS DE L’ETALONNAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
10- RÉSULTATS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
11- LIMITES DE LA PROCEDURE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
12- VALEURS ATTENDUES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
13- CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE SPECIFIQUES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
14- REFERENCES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
16
1- OBJECTIF DU TEST
PATHFINDERTM RSV est un test immunoenzymatique (ELISA) qualitatif pour la détection directe du
virus respiratoire syncytial (RSV) dans les liquides de lavage ou d’aspiration nasale.
2- RÉSUMÉ ET EXPLICATIONS
Le virus respiratoire syncytial est une des causes principales de bronchiolite et de pneumonie chez le
nourrisson et l’enfant. L’affection est la plus sévère au cours de la première année (1). Les épidémies
dues à ce virus surviennent pratiquement chaque année en automne, hiver et printemps (2,3). Le
RSV est responsable d’une affection respiratoire importante chez l’adulte sain. Cependant,
l’affection chez l’adulte tend à être moins forte que chez le jeune enfant (4).
Un diagnostic rapide d’une infection à RSV a d’autant plus d’importance aujourd’hui que l’on a mis
au point un traitement efficace. Il permet de poser un diagnostic, de débuter le traitement et de
contrôler précocement la propagation de l’affection. Les méthodes de culture cellulaire traditionnelles
(5, 6, 7, 8) peuvent prendre jusqu’à 3 semaines et dépendent fortement de la qualité du transport
de l’échantillon (8, 14). Les tests immunologiques ont l’avantage d’être rapides, techniquement
simples et d’un coût moins élevé que les cultures à isolement de virus. Les méthodes
d’immunofluorescence (5, 6, 7, 9, 10) et de dosage immunoenzymatique (EIA) (11, 12, 13) ont
montré leur efficacité dans la détection du RSV .
Le PATHFINDERTM RSV utilise des anticorps polyclonaux et monoclonaux pour la détection du RSV
directement dans des échantillons de patients. Cette méthode de dosage allie la spécificité et la
reproductibilité des anticorps monoclonaux à la rapidité et l’efficacité d’un EIA. Des résultats
qualitatifs sont disponibles en 90 minutes après le début du dosage. Le PATHFINDERTM RSV peut
détecter le RSV non viable (culture négative). Cette méthode d’analyse représente une alternative
fiable par rapport aux cultures cellulaires qui nécessitent beaucoup de temps et aux techniques de
fluorescences subjectives qui demandent beaucoup de travail.
3- PRINCIPE DE LA MÉTHODE
Les antigènes RSV présents dans l’échantillon se fixent aux anticorps polyclonaux anti-RSV capté sur
le fond du tube. Les anticorps monoclonaux conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) dirigés
contre le RSV se fixent à l’antigène lui-même fixé sur la paroi du tube. Une étape de lavage permet
l’élimination de l’échantillon et du conjugué non fixés. Le substrat de peroxydase ajouté au tube
entraînera une coloration bleue si des anticorps conjugués à la HRP sont présents. Un examen visuel
par spectrophotométrie de l’échantillon détermine la présence ou l’absence de RSV.
Un échantillon présentant une coloration bleue ou dont la valeur d’absorbance est supérieure
ou égale à la Valeur Seuil supérieure de la Zone d’Incertitude est positif en antigène RSV . Un
échantillon ne montrant aucune coloration bleue ou dont la valeur d’absorbance est inférieure
ou égale à la Valeur Seuil inférieure de la Zone d’Incertitude est négatif en antigène RSV.
4- INFORMATIONS SUR LE PRODUIT
Conserver tous les réactifs du kit à +2-8°C. Eviter de congeler les réactifs. Laisser les réactifs revenir
à température ambiante (23 ± 3°C) avant chaque utilisation. Après utilisation, les replacer
immédiatement à +2 - 8°C. Tous les réactifs sont stables jusqu’à la date de péremption telle que
spécifiée sur l’étiquette du réactif s’ils sont conservés selon les recommandations du fabricant. Ne
pas substituer les réactifs par des réactifs d’autres fabricants ou provenant de kits portant un numéro
de lot différent. Ne pas utiliser les réactifs après leur date de péremption. Tous les réactifs sont
destinés à être utilisés dans le cadre d’un diagnostic in vitro.
17
Labeling
R1
R2
R3
Reagents
RSV antibody Tubes d’anticorps : Tubes en polystyrène sensibilisés par
tubes
des IgG de lapin anti-RSV
Conjugate
Conjugué : Anticorps monoclonaux de souris anti-RSV-HRP
conjugués à la peroxydase de Raifort en tampon salin à
pH 7,4 avec stabilisateur de protéine
Conservateur ≤ 0,01% Thimerosal
Sample
Diluant pour échantillon : Tampon salin, pH 7,5, EDTA et
diluent
surfactant. Conservateur Thimérosal ≤ 0,01%
Presentation
1 x 50 tubes
1 x 5 ml
1 x 25 ml
R4
Positive
control
Contrôle Positif : RSV inactivé (Long) dans un tampon
salin, pH 7,5, EDTA et surfactant
Conservateur Thimerosal ≤ 0,01%
1 x 3 ml
R5
Substrate
Buffer
Tampon Substrat : Tampon citrate, pH 4,2 et peroxyde
hydrogène
1 x 40 ml
R6
Chromogen
TMB
Chromogène : tétra-méthyl-benzidine dissout
dans du HCI dilué
1 x 2,5 ml
R7 Assay Treatment Tampon de Traitement de l’Echantillon : salin, pH 10,3 et
buffer
EDTA. Conservateur Thimerosal ≤ 0,01%
1 x 2,5 ml
Tubes d’Anticorps RSV : Conserver les tubes dans le sachet. Ne pas ouvrir le sachet contenant
les tubes avant qu’il n’atteigne une température ambiante (23 ± 3°C). Une fois que les tubes
sont prêts pour l’utilisation, retirer les tubes nécessaires pour le dosage. Replacer tous les tubes
inutilisés dans le sachet avec de refermer celui-ci soigneusement. Une fois ouverts, les tubes
conservés tel qu’il est recommandé et en l’absence de contamination microbienne sont stables
pendant 3 mois.
79482
• PathfinderTM RSV positive control : 1 x 3 ml
NOTE: : Ne pas substituer les réactifs par des réactifs d’autres fabricants. Ne pas utiliser les
réactifs après leur date de péremption.
Signes Physiques et Chimiques d’Instabilité
Un trouble chez un quelconque réactif liquide peut être le signe d’une contamination microbienne.
5- MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS D’EMPLOI
1. Destiné à l’utilisation diagnostique in vitro.
2. Les échantillons de patients et le contrôle positif peuvent être traités de manière routinière et avec
un risque minimum si la procédure décrite est suivie. Néanmoins, il est nécessaire de manipuler
ces produits comme des produits potentiellement infectieux selon les précautions universelles et les
bonnes pratiques de laboratoire, quelle que soit leur origine, leur traitement ou une détermination
antérieure. Utiliser un désinfectant approprié pour la décontamination. Conserver et éliminer ces
produits et leurs récipients selon les directives et réglementation en vigueur.
3. Les réactifs contenant des agents biologiques de source animale peuvent être traités de
manière routinière et avec un risque minimum. Néanmoins, il est nécessaire de manipuler
ces produits comme des produits potentiellement bio-dangereux selon les précautions
universelles et les bonnes pratiques de laboratoire.
4. Eviter le contact entre la peau et les muqueuses et le Chromogène et l’acide sulfurique. En
cas de contact, rincer à l’eau. Ne pas ingérer.
5. Neutraliser tout résidu liquide contenant de l’acide avant de procéder à la décontamination.
18
6. Ce kit contient du Thimerosal ≤ 0.01 % (≤ 0.005 % de mercure poids par volume). Les
composés de mercure peuvent être considérés à certaines concentrations/quantités comme
des substances toxiques pour la reproduction et comme polluants de l’environnement par les
agences gouvernementales. Veuillez les manipuler de manière appropriée et les éliminer
selon la réglementation locale, régionale et nationale.
6- PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON
Prélever un minimum de 150 µl d’échantillon nasal par lavage ou aspiration suivant les
méthodes de prélèvement et de transport de routine de votre laboratoire. Les prélèvements
nasaux à l’aide d’un coton-tige ne sont pas considérés comme assez sensibles pour la
détection du RSV (5). Eviter l’utilisation de récipients pour échantillons contenant des
conservateurs, des ions métalliques ou des détergents, ceux-ci pouvant interagir avec le
dosage. Ne pas utiliser de milieux de transport contenant des sérums. Si possible, obtenir les
sécrétions nasales au cours d’une phase aiguë de l’affection lorsque l’excrétion du virus est à
son maximum. Plus l’affection progresse, plus l’excrétion du virus diminue, ce qui diminue
également la quantité de virus détectable.
Conserver les échantillons jusqu’à 24 heures à +2-8°C et les garder à l’abri de l’évaporation et de
la contamination. Pour une conservation plus longue ou un envoi, congeler les échantillons à –70°C
ou à une température inférieure. Des congélations-décongélations répétées peuvent détériorer
l’échantillon. Transporter les échantillons selon la réglementation en vigueur dans votre pays pour le
transport d’agents étiologiques.
Les échantillons contenant des quantités visiblement élevées de sang doivent être évités afin de
s’assurer de l’exactitude des résultats.
7- PROCÉDURE
A) MATÉRIEL FOURNI
R1.
R2.
R3.
R4.
R5.
R6.
R7.
Tubes d’Anticorps Anti-RSV
Anticorps Monoclonaux anti-RSV conjugués à la peroxydase de raifort
Diluant pour Echantillon
Contrôle Positif
Tampon Substrat
Chromogène
Tampon de Traitement de l’Echantillon
B) MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI
1. Eau désionisée ou distillée pour dilution de l’acide sulfurique et lavage des tubes.
2. Acide Sulfurique H2SO4 1N pour arrêter la réaction avant de procéder à l’analyse par
spectrophotométrie. Utiliser un réactif analytique H2SO4 concentré de qualité supérieure pour
obtenir l’acide 1 N. Pour la préparation de 500 ml d’ H2SO4 1 N, ajouter 14 ml de H2SO4
concentré à 486 ml d’eau distillée ou désionisée. Conserver à température ambiante (23 ± 3°C)
dans un récipient en verre recouvert hermétiquement.
3. Des supports pour tubes à essai capables de tenir 12 tubes de 75 mm.
4. Des pipettes avec embouts jetables capables de distribuer de manière précise 100 µl,
300 µl, et 500 µl.
5. Des pipettes sérologiques jetables de 10 ml.
6. 12 tubes à essai en verre jetables de 75mm
7. Tube en verre propre pour la préparation de la solution substrat de travail (voir étape n°9
de la procédure).
19
8. Film plastique.
9. Système pour le lavage des tubes comprenant des dispositifs de rinçage et d’aspiration,
ainsi que des ballons et système de tube adéquats pour la récupération des résidus liquides
(voir Diagramme 1).
a) Dispositifs de rinçage : bouteille de lavage en plastique,
b) Dispositifs d’aspiration : embout d’aspiration et pompe à vide.
10.Agitateur Vortex
11.Spectrophotomètre avec longueurs d’onde variables au sein d’une amplitude lumineuse
visible et d’une amplitude linéaire de 0-2,0 unités d’absorbance pour permettre une lecture
de l’absorbance à 450 nm.
12.Hypochlorite de sodium (agent désinfectant) pour la décontamination.
13.Minuteur capable de chronométrer 15 et 60 minutes.
DIAGRAMME 1
Equipement d’Aspiration
Pompe
à vide
Pipette
d’aspiration
Piège à
vide
Commentaires sur la méthode
1. Avant utilisation, laisser tous les réactifs et échantillons revenir à température ambiante
(23 ± 3°C).
2. Des incubations à des températures ou pendant des durées différentes de celles spécifiées
peuvent engendrer des résultats erronés.
3. Lors de l’addition des réactifs, éviter tout retard ou interruption. Ne pas laisser les tubes
sécher à l’air une fois que le dosage a débuté.
4. ATTENTION : Ne pas pipeter à la bouche.
5. Toujours pipeter à l’aide de l’embout de la pipette et à proximité du fond du tube. Ne pas
pipeter le long de la paroi du tube. Ne pas mettre l’embout de la pipette en contact avec la
solution de réaction.
6. Changer les embouts de pipettes entre chaque échantillon.
7. Les instruments en verre réutilisables doivent être lavés et rincés abondamment sans aucun
détergent. Utiliser de l’eau désionisée ou distillée.
8. Tous les réactifs ont été optimisés pour procéder à l’identification du RSV. La dilution ou la
dénaturation des réactifs peut entraîner une perte de sensibilité.
C) PROCÉDURE
Bien mélanger tous les réactifs avant utilisation.
1. Etiqueter un Tube d’anticorps pour le contrôle négatif et un autre pour le contrôle positif. Etiqueter
un tube d’anticorps pour chaque échantillon de patient.
NOTE : Un contrôle positif et un contrôle négatif (Diluant pour Echantillon) doivent être conduits
pour chacun des dosages.
20
2. Ajouter 1 goutte de Tampon de Traitement dans chaque tube.
3. Ajouter 100 µl d’Anticorps Monoclonal conjugué à la peroxydase de Raifort dans chaque
tube.
4. Ajouter 300 µl de Diluant pour échantillon au tube de contrôle négatif ; ajouter 300 µl de
Contrôle Positif à chaque tube de contrôle positif.
5. Ajouter chaque échantillon de patient au tube étiqueté approprié selon les instructions
suivantes :
Si l’échantillon est conservé dans un milieu de transport dépourvu de sérum, homogéneiser
et ajouter 300 µl au tube approprié. Si l'échantillon n'a pas été conservé dans un milieu de
transport, le diluer à volume égal dans du tampon d'échantillon fourni. Ajouter 300 µl de
l'échantillon dilué dans le tube approprié.
Une dilution plus forte que celle recommandée peut entraîner une perte de sensibilité.
6. Mélanger doucement le contenu des tubes et laisser incuber à température ambiante (23 ± 3°C)
pendant 60 ± 10 minutes.
7. Aspirer avec soin les échantillons de chaque tube.
8. Laver chaque tube 6 fois de suite avec 2-4 ml d’eau désionisée ou distillée. Eliminer l’excès
d’humidité présente dans les tubes une fois le dernier lavage effectué en retournant les tubes
et en séchant les rebords avec du papier absorbant ou en procédant à une aspiration
soigneuse des tubes. Un lavage inadéquat ou un lavage avec de l’eau impure peut
entraîner des résultats erronés.
9. Préparer la solution de travail de coloration.
ATTENTION : Ne laisser entrer un contact aucun métal ou agent d’oxydation avec le
chromogène ou la solution de travail de coloration.
A) Quantité nécessaire de Tampon Substrat = 0,5 ml de Tampon par tube.
Quantité nécessaire de Chromogène = 1 goutte de Chromogène par ml de Tampon
Substrat.
Exemple : pour 6 tubes,
• Quantité nécessaire de Tampon Substrat = 3,0 ml ;
• Quantité nécessaire de Chromogène = 3 gouttes.
Ajouter la quantité nécessaire de Tampon Substrat et de Chromogène dans un tube en verre
ou en plastique propre.
B) Recouvrir le tube avec un film plastique et mélanger son contenu en le retournant plusieurs
fois. Utiliser le mélange dans les 30 minutes. Réduire au maximum l’exposition à la lumière.
L’apparition d’une coloration bleue spontanée peut être le signe d’une contamination du
réactif. La solution de travail de coloration doit rester incolore jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
10.Ajouter 0,5 ml de la solution de travail de coloration à chacun des tubes. Mélanger
doucement leur contenu et laisser incuber à température ambiante (23 ± 3°C) pendant
15 minutes tout en minimisant toute exposition à la lumière. Ne pas laisser réagir plus de
15 minutes.
11.Procéder à une lecture des tubes par examen visuel ou par spectrophotomètrie afin de déterminer
les résultats du test.
Détermination par examen visuel
Ne pas stopper la réaction par addition d’acide.
A la fin de la période d’incubation, le tube de contrôle négatif doit être incolore. Le contrôle
positif doit être de couleur bleu foncé. Les échantillons montrant une coloration bleue sont
positifs en antigène RSV . Les échantillons ne montrant pas de coloration bleue sont négatifs en
antigène RSV.
21
NOTE : Des résultats obtenus par examen visuel concernant des échantillons faiblement positifs
devront être également analysés par méthode de détermination spectrophotométrique.
Détermination par Spectrophotométrie
A) Ajouter 1 ml de H2SO4 1N à chaque tube dans le même ordre et approximativement selon les
mêmes intervalles de temps que pour lesquels la solution de travail de coloration. Agiter les tubes
au Vortex. Eliminer les bulles d’air avant de procéder à la lecture de l’absorbance. Après
l’addition d’acide, le mélange réactionnel est stable pendant 8 heures s’il est conservé à l’abri de
la lumière.
B) Faire le blanc du spectrophotomètre à 450 nm avec de l’eau désionisée ou distillée.
C) Procéder à la lecture de l’absorbance du contrôle négatif (Diluant pour Echantillon), du contrôle
positif et des tubes d’échantillons à 450 nm. Pour pouvoir distinguer les échantillons négatifs des
échantillons positifs, calculer la Valeur Seuil et la Zone d’Incertitude, tel que décrit dans la Section
« Résultats ».
Une valeur supérieure ou égale à 0,06 en unités d’absorbance pour le contrôle négatif (diluant à
échantillon) indique une possible contamination du réactif ou un lavage inadéquat.
8- CONTRÔLE QUALITÉ
Un contrôle positif et un contrôle négatif doivent être testés au cours de chaque dosage.
Contrôle Négatif (Diluant pour Echantillon)
Examen visuel : le contrôle négatif doit être incolore
Par Spectrophotométrie : la valeur d’absorbance doit être inférieure à 0,06 unités.
Contrôle Positif
Examen visuel : le contrôle positif doit être de couleur bleu foncé.
Par Spectrophotométrie : la valeur d’absorbance doit être supérieure à 0,6 unités.
9- DÉTAILS DE L’ÉTALONNAGE
Pour la méthode de spectrophotométrie uniquement
1. Calculer la Valeur Seuil en ajoutant 0,075 à la valeur de DO du contrôle négatif (Diluant
pour Echantillon).
Exemple:
Valeur de contrôle négatif
0,017
+ 0,075
Valeur Seuil
= 0,092
2. Calculer la Zone d’Incertitude. La Zone d’Incertitude correspond à ± 10 % de la Valeur Seuil
(soit 0,90 à 1,10 fois la Valeur Seuil).
Exemple:
Valeur Seuil = 0,092
Zone d’Incertitude = de 0,083 à 0,101
Valeur Seuil x (0,90) = (0,092)x(0,90) = 0,083
Valeur Seuil x (1,10) = (0,092)x(1,10) = 0,101
10- RESULTATS
a) Examen visuel
Les échantillons présentant une coloration bleue sont positifs en antigène RSV. Les échantillons
ne présentant pas de coloration bleue sont négatifs en antigène RSV. Le contrôle négatif doit
rester incolore. Le contrôle positif doit être de couleur bleu foncé.
22
b) Par spectrophotométrie
Les échantillons dont les valeurs d’absorbance sont inférieures ou égales à la Valeur Seuil
inférieure de la Zone d’Incertitude sont négatifs en antigène RSV.
Un échantillon dont la valeur d’absorbance est comprise dans la Zone d’Incertitude est douteux. Le
laboratoire devra donc réitérer le test. Si le résultat obtenu alors, après utilisation du même
échantillon ou d’un nouvel échantillon, montre une valeur d’absorbance comprise dans la Zone
d’Incertitude, les résultats devront être rapportés comme impossibles à déterminer.
Les échantillons aux valeurs d’absorbance supérieures ou égales à la Valeur Seuil supérieure de la
Zone d’Incertitude sont positifs en antigène RSV.
Des échantillons fortement positifs peuvent entraîner la formation de particules de couleur
sombre sous forme d’un précipité au fond du tube.
11- LIMITES DE LA PROCEDURE
1. Il est possible qu’une infection due à d’autres agents pathogènes respiratoires se produise
simultanément à une infection à RSV. Il est par conséquent recommandé de procéder à un
test complémentaire parallèlement à l’EIA PATHFINDER TM RSV. Se référer au chapitre
Performances pour les études de réactivité croisée avec des virus et bactéries.
2. Un résultat négatif n’exclut en rien la possibilité d’une infection à RSV . De faibles
concentrations de virus, un échantillon trop tardif dans l’évolution de l’infection ou des
techniques d’échantillonnage inadéquates ou non correctement conduites peuvent entraîner
un résultat faux négatif.
3. Ce test peut permettre la détection de RSV non viable (culture négative).
4. Les résultats de ce test devront être interprétés conjointement avec l’information disponible
sur l’évaluation clinique du patient ainsi que les résultats d’autres méthodes diagnostiques.
5. Les résultats de ce test sont qualitatifs et doivent être considérés comme soit positifs soit
négatifs pour la présence du RSV .
12- VALEURS ATTENDUES
Les valeurs attendues dépendent de la population de patients testée, des facteurs géographiques
et de la période de l’année. Une infection à virus respiratoire synticial peut cibler n’importe quel
groupe d’âge. L’affection est la plus couramment observée chez les nourrissons de 6 semaines à
6 mois avec un pic à 2 mois (1). Les diagnostics les plus fréquents chez ces nourrissons incluent
la bronchite, la bronchiolite et la pneumonie. L’infection à RSV chez l’adulte est fréquente mais
tend à être moins sévère que chez les nourrissons. Les symptômes peuvent inclure la rhinorrhée,
la pharyngite, la toux, les céphalées, la fatigue et la fièvre (4). Les personnes âgées atteints d’une
infection à RSV peuvent développer une broncho-pneumonie qui peut s’avérer sévère ou fatale
(17).
13- CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE SPECIFIQUES
Exactitude
Deux évaluateurs indépendants ont testé 241 échantillons respiratoires issus de patients âgés de 0 à
93 ans pour recherche du virus respiratoire synticial par culture, immunofluorescence (IF),
PATHFINDERTM RSV et EIA d’un concurrent A. Les sites d’études indépendants étaient des hôpitaux
universitaires de l’Est et de l’Ouest des USA. Tous les échantillons testés par EIA ont été évalués à la
fois par examen visuel et par spectrophotométrie.
Les échantillons destinés à cette étude ont été prélevés au cours de la phase aigüe d’une épidémie
de RSV. Les échantillons ont été mis en culture pour une recherche de virus respiratoires et des frottis
ont été effectués pour une recherche par coloration en immunofluorescence. Le reste des échantillons
23
a été congelé à –70°C pour une évaluation par EIA à une date ultérieure. Dans un centre,
l’immunofluorescence a été conduite sur les frottis au moment de la réception des échantillons. Dans
l’autre, les frottis ont été congelés à –70°C et ont subi une coloration au moment où s’est déroulée
l’étude par EIA. Les échantillons qui étaient positifs par EIA et négatifs par culture ont été confirmés
par les résultats de l’IF ou par dosage par neutralisation (15,16). Le dosage par neutralisation a été
conduit par incubation de l’échantillon pendant 1 heure à température ambiante (23 ± 3°C) avec et
sans antisérum polyclonal anti-RSV ; l’antisérum permettant d’inhiber la réaction d’un échantillon vrai
positif. L’EIA a ensuite été conduit sur ces échantillons. Un échantillon a été considéré comme
neutralisé et donc comme vrai positif si le signal dans le tube avec l’anticorps neutralisant était
diminué d’au moins 50 % par rapport au tube sans anticorps neutralisant.
Un échantillon a été considéré comme vrai positif s’il était positif en culture ou s’il pouvait être
confirmé comme positif par deux autres méthodes, à savoir par EIA et par neutralisation ou par EIA
et par IF. Un échantillon était considéré comme vrai négatif s’il était négatif en culture et qu’un signal
EIA positif ne pouvait être confirmé par aucune des méthodes d’IF ou de neutralisation.
Note : De faibles concentrations en antigènes RSV peuvent parfois donner des résultats discordants
entre l’évaluation par examen visuel et par spectrophotométrie. Etant donné que la
spectrophotométrie est une méthode objective, elle est légèrement plus précise que la détermination
par examen visuel (Voir Tableaux 1 et 2).
Tableau 1
Comparaison de PATHFINDERTM RSV avec une Culture par isolement.
PAR SPECTROPHOTOMETRIE
CONFIRME
Positif
PATHFINDER™ RSV
119
1
Négatif
8
111
EXAMEN VISUEL
CONFIRME
Positif
PATHFINDER™ RSV
Négatif
Positif
Négatif
Positif
118
4
Négatif
11
108
Par Spectrophotométrie
Concordance globale = (VP* + VN) / Nombre Total d’Echantillons = (119 + 111) / 239** =
96,2 %
Sensibilité = VP / (VP + FN) = 119 / (119 + 8) = 93,7 %
Spécificité = VN / (VN + FP) = 111 / (111 + 1) = 99,1 %
*VP = vrai positif, VN = vrai négatif, FP = faux positif, FN = faux négatif.
Examen visuel
Concordance globale = (VP* + VN) / Nombre Total d’Echantillons = (118 + 108 ) / 241 =
93,8 %
Sensibilité = VP / (VP + FN) = 118 / (118 + 11) = 91,5 %
Spécificité = VN / (VN + FP) = 108 / (108 + 4) = 96,4 %
*VP = vrai positif, VN = vrai négatif, FP = faux positif, FN = faux négatif.
** Deux échantillons n’ont pu être déterminés par évaluation spectrophotométrique et n’ont
donc pas été inclus dans ces donnés.
24
Tableau 2
Comparaison de PATHFINDERTM RSV avec l’EIA RSV d’un Concurrent A
SPECTROPHOTOMETRIE
EIA DU CONCURRENT A
Positif
PATHFINDER™ RSV
Négatif
Positif
117
4
Négatif
10
107
VISUAL
EIA DU CONCURRENT A
Positif
PATHFINDER™ RSV
Négatif
Positif
117
5
Négatif
16
103
Par spectrophotométrie
Sur les 238* échantillons testés, une concordance de 94,1 % (224/238) a été observée entre
PATHFINDERTM et l’EIA du Concurrent A. Une fois que tous les résultats discordants ont été expliqués
et résolus, PATHFINDERTM RSV a montré une sensibilité de 94,5 % et une spécificité de 99,1% par
interprétation spectrophotométrique.
* Trois échantillons sont restés indéterminés par l’évaluation spectrophotométrique PATHFINDERTM et
n’ont donc pas été inclus dans ces données. Un échantillon est resté indéterminé après évaluation
par la méthode concurrente A et n’a donc pas été inclus dans ces données.
Examen visuel
Sur les 241 échantillons testés à l’œil nu, une concordance de 91,3% (220/241) a été
observée entre les méthodes PATHFINDERTM et EIA du Concurrent A. Une fois que tous les
résultats non concordants ont été expliqués et résolus, PATHFINDERTM RSV a montré une
sensibilité de 92,9% et une spécificité de 96,5 % par interprétation à l’œil nu.
PRÉCISION
Variabilité intra-essai
15 réplicats de contrôle positif, 15 réplicats d’une dilution à 1/20 de contrôle positif et 20 réplicats
de contrôle négatif ont été testés en un dosage afin de déterminer la reproductibilité intra- essai. La
moyenne des absorbances optiques a été calculée afin de déterminer la variabilité intra-essai.
Tableau 3
Moyenne (DO à 450 nm)
SD
% C.V.
Positif
1,471
0,045
3,1
Faiblement Positif
0,114
0,008
7
Négatif
0,006
0,003
50
Echantillon
Variabilité inter-essai:
Le contrôle positif, une dilution à 1/20 du contrôle positif et le contrôle négatif ont été dosés
au cours de 9 dosages différents avec 10 réplicats par dosage afin de procéder à la
détermination de la reproductibilité inter-essai. La moyenne des absorbances optiques de
chaque dosage à été calculée afin de déterminer la variabilité inter- essai.
25
Tableau 4
Moyenne
(DO à 450 nm)
SD
% C.V.
Positif
1,511
0,095
6,3
Faiblement Positif
0,118
0,011
9,3
Négatif
0,010
0,009
90
Echantillon
RÉACTIVITE CROISÉE
Etude 1
PATHFINDER™ RSV a été testé avec des organismes susceptibles de causer des présentations
cliniques similaires ou susceptibles de faire partie de la flore respiratoire normale. Le test a été
conduit tel que décrit dans la notice par substitution des organismes avec l’échantillon de patient.
Chaque dosage a été conduit avec 300 µl de suspensions contenant 0,1 unité de densité optique (à
620 nm) de chaque organisme dans une solution tampon saline, à l’exception du Mycoplasma
pneumoniae qui a été testé à une concentration de 5 mg de poids cellulaire humide par µl et de
Chlamydia trachomatis qui a été testé à une concentration de 1x108 corps élémentaires par µl. En
outre, les organismes ont également été testés pour la recherche d’une quelconque interaction dans
la recherche du RSV par combinaison de 12 µl de Contrôle Positif et de 300 µl de chaque
suspension. Les résultats du Tableau 5 montrent qu’aucune réactivité croisée ou interaction ne s’est
produite avec les organismes. Ce résultat est corroboré par le fait qu’aucune absorbance positive
n’a été déterminée au cours du dosage avec les bactéries seules et par l’absence d’une chute
supérieure à 50 % du signal avec les bactéries et le RSV par rapport au Contrôle Positif.
Tableau 5
Micro-organismes Testés pour Réactivité Croisée
Micro-organismes
Souche
Absorbance
(organisme seul)
Absorbance
(organisme + RSV )
Streptococcus Groupe A
12344
0,010
2,108
Staphylococcus aureus, Cowan
12598
0,014
1,982
Staphylococcus aureus
9996
0,022
1,984
Staphylococcus epidermis
12228
0,009
1,989
Escherichia coli
25922
0,024
2,002
Candida albicans
14053
0,034
1,997
Mycoplasma pneumoniae
P11428
0,006
1,435
L2
0,013
1,593
-
0,012
1,964
Long
1.512
1,512
Chlamydia trachomatis
Contrôle Négatif
(Diluant pour Echantillon)
Contrôle Positif
Etude 2
Les virus présentés dans le Tableau 6 ont été testés afin de mettre en évidence une potentielle
réactivité croisée avec PATHFINDERTM RSV. Cette étude a utilisé 300 µl de suspensions
contenant 1 x 105 DICT 50 par ml dans du Diluant pour Echantillon pour chacun des virus, à
l’exception des virus de la grippe et de l’Herpes Simplex de Type 2. Le virus de la Grippe A a été
testé à 1 x 108 unités formant plaques par ml et celui de la Grippe B a été testé à 1 x 107 unités de
26
formant plaques par ml. Le VHS de Type 2 a été testé à 6,8 x 107 unités de formant plaques par ml.
L’interaction virale dans la recherche du RSV a également été testée par combinaison de 12 µl de
Contrôle Positif et de 300 µl de chaque suspension. Aucune réactivité croisée ou interférence ne
s’est produite entre Pathfindertm RSV et ces virus. Ce résultat a été corroboré par le fait qu’aucune
absorbance positive au cours du dosage avec les virus seuls et par l’absence d’une chute supérieure
à 50 % du signal avec les virus et le RSV par rapport au Contrôle Positif.
Tableau 6
Virus Testés pour Réactivité Croisée
Souche Virale
Absorbance
(Virus seul)
Absorbance
(Virus+RSV)
HGP
Thompson
MRH
211
1734
6072
106F
611CV35
0,016
0,006
0,004
0,007
0,014
0,012
0,033
0,005
1,114
1,339
1,270
1,514
1,303
1,367
1,378
1,464
Type A-9
Type B-3
Type B-4
PB Bozek
Nancy
JVB Berschoten
0,008
0,009
0,002
1,636
1,394
1,586
Type 8
Type 11
Type 19
Bryson
Gregory
Burke
0,005
0,006
0,007
1,435
1,517
1,571
C35
Greer
C243
0,017
0,003
0,017
1,692
1,339
1,692
Adenoid6
Rl67
0,011
0,006
1,264
1,447
AD169
0,007
1,583
Maclntyre
MS
0,031
0,003
1,714
1,436
Virus
Rhinovirus
Type
Type
Type
Type
Type
Type
Type
Type
2
6
8
9
15
19
30
59
Coxsackie
Echovirus
Parainfluenza
Type 1
Type 2
Type 3
Adenovirus
Type 2
Type 4
Cytomegalovirus
Herpes Simplex
Type 1
Type 2
Herpesvirus varicellae
OKA
0,010
1,475
Grippe A
WSN
0,007
1,516
Grippe B
B/Lee/40
0,008
1,554
Contrôle Négatif
(Diluant pour Echantillon)
N/A
0,007
1,402
Contrôle Positif
Long
1,827
1,827
27
14- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQES
Voir version Anglaise.
28
PATHFINDER™ RSV
50 TESTS
79674
INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO (EIA) CUALITATIVO PARA LA
DETECCIÓN DIRECTA DEL ANTÍGENO DEL VIRUS RESPIRATORIO
SINCITIAL (RSV) HUMANO EN MUESTRAS DE LAVADOS NASALES
Y ASPIRADOS NASALES
IVD
ÍNDICE
1- USO PREVISTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
2- RESUMEN Y EXPLICACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
3- PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
4- INFORMACIÓN DEL PRODUCTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
5- ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
6- RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
7- PROCEDIMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
8- CONTROL DE CALIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
9- DETALLES DE LA CALIBRACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
10- RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
11- LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
12- VALORES ESPERADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
13- CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO ESPECÍFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
14- BIBLIOGRAFÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
30
1- USO PREVISTO
El sistema de detección directa de antígenos de PATHFINDERTM RSV es un ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas (ELISA) cualitativo para la detección directa del antígeno de del virus respiratorio
sincitial (RSV) humano en muestras de lavados nasales y aspirados nasales.
2- RESUMEN Y EXPLICACIÓN
El virus respiratorio sincitial es una de las principales causas de bronquiolitis y neumonía y lactantes
y niños. La forma más grave de la enfermedad se produce durante el primer año de vida (1). Los
brotes epidémicos de este virus se producen prácticamente casi cada año en otoño, invierno y
primavera (2,3). El RSV es la causa de una enfermedad respiratoria importante en adultos sanos.
Sin embargo, la enfermedad en adultos suele ser más leve que en el caso de los niños pequeños
(4).
El diagnóstico rápido de la infección por RSV ha ido adquiriendo importancia con la llegada de un
tratamiento eficaz, permitiendo así formular un pronóstico, iniciar el tratamiento y la acción
temprana para controlar la propagación de la enfermedad. Los métodos de cultivo celular
tradicionales (5,6,7,8) pueden durar hasta 3 semanas y dependen en gran medida de la calidad
del transporte de la muestra (8, 14). Los tests inmunológicos ofrecen ventajas como son la rapidez,
la simplicidad técnica y un coste menor en comparación con los cultivos víricos. El método
inmunofluorescente (5,6,7,9,10) y el inmunoensayo enzimático (EIA) (11,12,13) han demostrado
ser eficaces en la detección del RSV.
El sistema de detección directa de antígeno PATHFINDERTM RSV utiliza anticuerpos policlonales y
monoclonales para detectar el VRS directamente en las muestras de pacientes. Este test combina la
especificidad y reproducibilidad de los anticuerpos monoclonales, con la velocidad y eficacia de un
EIA. Los resultados cualitativos están listos en 90 minutos desde el comienzo del test. El sistema de
detección directa de antígeno PATHFINDERTM RSV puede detectar RSV no viables (cultivo negativo).
Este test ofrece una alternativa fiable a los cultivos celulares, que requieren de mucho tiempo, y a
las complicadas y subjetivas técnicas de laboratorio.
3- PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO
Los antígenos del RSV presentes en la muestra se unen a los anticuerpos policlonales anti-RSV que
tapizan el tubo. Los anticuerpos monoclonales conjugados con HRP anti-RSV se unen al antígeno
capturado en la pared del tubo. En un paso de lavado se elimina la muestra no unida y el
conjugado. Si hay anticuerpos conjugados a la HRP, el substrato de peroxidasa añadido al tubo
producirá un color azul. La evaluación visual o espectrofotométrica de la muestra determina la
presencia o ausencia de RSV.
Una muestra que presente color azul o con un valor de absorbancia mayor o igual al valor de
corte de la zona gris, se considera positiva para el antígeno del RSV. Una muestra que no
presente color azul o con un valor de absorbancia inferior o igual al valor de corte de la zona
gris, se considera negativo para el antígeno del RSV.
4- INFORMACIÓN DEL PRODUCTO
Conservar todos los reactivos del kit a una temperatura entre +2 y +8ºC. No congelar los reactivos.
Dejar que los reactivos alcancen la temperatura ambiente (23 ± 3°C) antes de cada uso. Una vez
utilizados, devolverlos rápidamente a una temperatura entre +2 y +8ºC. Todos los reactivos son
estables hasta la fecha de caducidad que figura en la etiqueta del reactivo cuando se conservan
siguiendo las recomendaciones indicadas. No sustituir los reactivos por reactivos de otros
fabricantes, ni mezclar reactivos con números de lote diferentes. No utilizar los reactivos después de
la fecha de caducidad indicada.
31
Tubos de anticuerpos anti-RSV: Guardar los tubos en la bolsa. No abrir la bolsa del tubo
hasta que no haya alcanzado la temperatura ambiente (23 ± 3°C). Cuando esté listo para
usar, sacar los tubos necesarios para la prueba. Volver a introducir los tubos no utilizados en
Denominación
R1
R2
Reactivos
RSV antibody Tubos de anticuerpos : tubos de poliestireno tapizados con
tubes
IgG anti-RSV de conejo
Conjugate
Conjugado : anticuerpos monoclonales murinos
conjugados con peroxidasa de rábano en solución salina
tamponada, pH 7,4, estabilizador de proteínas.
Conservante ≤ 0,01% de Timerosal
R3
Sample
diluent
R4
Positive
control
R5
Substrate
Buffer
Assay
Treatment
buffer
1 x 5 ml
Diluyente de la muestra : Solución salina, pH 7,5 con
EDTA y tensioactivo
Conservante ≤ 0,01% de Timerosal
Control positivo : RSV inactivado (Largo) en solución
salina, pH 7,5, EDTA y tensioactivo
Conservante ≤ 0,01% de Timerosal
1 x 25 ml
Tampón sustrato : tampón citrato, pH 4,2 y peróxido de
hidrógeno
1 x 40 ml
R6 Chromogen TMB Cromógeno : tetrametilbenzidina disuelta en HCI diluido
R7
Presentación
1 x 50 tubos
Tampón de tratamiento de la prueba : solución salina
tamponada, pH 10,3, con EDTA
Conservante ≤ 0,01% de Timerosal
1 x 3 ml
1 x 2,5 ml
1 x 2,5 ml
la bolsa y cerrar cuidadosamente la misma. Una vez abiertos, los tubos conservados
siguiendo las indicaciones y en ausencia de contaminación microbiana, se mantienen estables
durante 3 meses.
• PathfinderTM RSV positive control : 1 x 3 ml
79482
NOTA: No sustituir los reactivos por los reactivos de otros fabricantes ni utilizar después de
la fecha de caducidad indicada.
Indicaciones físicas y químicas de inestabilidad
Un aspecto turbio de cualquier reactivo líquido puede ser indicativo de contaminación
microbiana.
5- ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
1. Para uso diagnóstico in vitro.
2. Las muestras de paciente y el control positivo deberán procesarse con el mínimo riesgo usando el
procedimiento descrito. Sin embargo, estos productos deberán manipularse como si se tratase de
sustancias potencialmente infecciosas siguiendo las precauciones universales y las buenas
prácticas de laboratorio clínico independientemente de su origen, tratamiento o antes de su
certificación. Utilizar un desinfectante adecuado para la descontaminación. Conservar y eliminar
estos materiales y sus envases conforme a la normativa y directrices locales.
32
3. Los reactivos que contienen sustancias biológicas de origen animal pueden procesarse con un
mínimo riesgo. No obstante, manipular estos productos con riesgo biológico potencial siguiendo
las precauciones universales y las buenas prácticas de laboratorio clínico.
4. Evitar el contacto con cromógeno y ácido sulfúrico de la piel y membranas mucosas. En caso de
contacto, lavar con agua. No ingerir.
5. Neutralizar cualquier residuo líquido que contenga ácido antes de su descontaminación.
6. Este kit contiene ≤ 0,01% de timerosal (≤ 0,005% de peso por volumen de mercurio). Los
compuestos de mercurio en determinadas concentraciones /cantidades son considerados tóxicos
para la reproducción y contaminantes ambientales por todas las agencias ambientales. Manipule
este kit adecuadamente y elimínelo conforme a las normativas locales, regionales y nacionales.
6- RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Recoger un mínimo de 150 µl de lavado nasal o aspirado nasal utilizando el procedimiento de
recogida y transporte habitualmente utilizado en su laboratorio. Los frotis nasales no se consideran
sensibles para la detección del RSV (5). Evitar utilizar para la recogida de muestras envases con
conservantes, iones metálicos o detergentes que interfieran con la prueba. No utilizar medios de
transporte que contengan suero. Obtener las secreciones nasales en la medida de lo posible
durante la fase aguda de la enfermedad cuando se produce la mayor eliminación vírica. A medida
que la enfermedad progresa, disminuye la eliminación vírica, disminuyendo así la cantidad de virus
detectables.
Conservar las muestras hasta 24 horas a una temperatura entre +2 y +8°C y proteger de la
evaporación y de la contaminación. Si las muestras deben almacenarse durante más tiempo o en
caso de transporte, congelar las muestras a –70°C o a una temperatura inferior. La congelación y
descongelación repetida provocará el deterioro de la muestra. Transportar las muestras conforme a
las normativas nacionales de transporte de agentes etiológicos.
Deberán evitarse muestras con cantidades visiblemente grandes de sangre para garantizar la
exactitud de los resultados.
7- PROCEDIMIENTO
A) MATERIALES SUMINISTRADOS
R1.
R2.
R3.
R4.
R5.
R6.
R7.
Tubos de anticuerpos anti-RSV
Anticuerpos monoclonales conjugados con HRP anti-RSV
Diluyente de la muestra
Control positivo
Tampón substrato
Cromógeno
Tampón de tratamiento de la prueba
B) MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. Agua desionizada o destilada para diluir el ácido sulfúrico y lavar los tubos.
2. Ácido sulfúrico H2SO4 1N para detener la reacción antes del análisis espectrofotométrico.
Utilizar H2SO4 concentrado de calidad analítica para obtener un ácido 1N. Para preparar
500 ml de H2SO4 1N, añadir 14 ml de H2SO4 concentrado a 486 ml de agua destilada o
desionizada. Conservar en un envase de vidrio herméticamente cerrado a temperatura
ambiente (23 ± 3°C).
3. Gradillas de tubos de ensayo con capacidad para 12 tubos de 75 mm.
4. Pipetas con puntas desechables capaces de dispensar exactamente 100 µl, 300 µl y
500 µl.
33
5. Pipetas serológicas desechables, 10 ml.
6. 12 tubos de ensayo de vidrio de 75 mm desechables.
7. Tubo de ensayo de vidrio limpio para preparar la solución substrato de trabajo (véase el paso
9 del procedimiento).
8. Lámina de plástico.
9. Aparato para lavar los tubos que debe incluir dispositivos de lavado y aspiración, los
correspondientes matraces y los tubos para recoger los residuos líquidos (véase el
Diagrama 1).
a) Dispositivos de lavado : botella de lavado de plástico,
b) Dispositivos de aspiración : Pipeta de aspiración y bomba de vacío.
10. Mezclador Vortex.
11. Espectrofotómetro con longitudes de onda variables dentro del espectro de luz visible y un
intervalo lineal de 0–2,0 unidades de absorbancia para la leer la absorbancia a 450 nm.
12. Hipoclorito sódico (lejía) para descontaminación.
13. Cronómetro con capacidad de cronometraje de 15 y 60 minutos.
DIAGRAMA 1
Equipo de aspiración
Bomba
de vacío
Pipeta de
aspiración
Trampa
de vacío
Comentarios sobre el procedimiento
1. Dejar que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (23 ± 3°C) antes de
su uso.
2. Las incubaciones a temperaturas o tiempos distintos a los especificados pueden dar resultados
erróneos.
3. Cuando se añaden reactivos, evitar los retrasos o las interrupciones. No dejar que los tubos se
sequen una vez iniciada la prueba.
4. PRECAUCIÓN : No pipetear con la boca.
5. Pipetear siempre con la punta de la pipeta situada cerca del fondo del tubo. No dispensar los
reactivos resbalando por la pared del tubo. No dejar que la punta de la pipeta entre en contacto
con la solución de reacción.
6. Cambiar las puntas de pipeta para el análisis de muestras diferentes.
7. Los objetos de vidrio reutilizables deberán lavarse y enjuagarse a fondo sin utilizar detergentes.
Utilizar agua desionizada o destilada.
8. Todos los reactivos se han optimizado para la detección del RSV. La dilución o adulteración de
los reactivos puede dar lugar a una pérdida de sensibilidad.
C) PROCEDIMIENTO
Mezclar bien todos los reactivos antes de su uso.
1. Utilizar un tubo de anticuerpos como control negativo y otro tubo de anticuerpos como
control positivo. Utilizar un tubo de anticuerpos para cada muestra de paciente.
34
NOTA : Deberá realizarse un control positivo y negativo (Diluyente de la muestra) con cada
una de las pruebas.
2. Añadir a cada tubo 1 gota de tampón de tratamiento de la prueba.
3. Añadir a cada tubo 100 µl de anticuerpos monoclonales conjugados con HRP.
4. Añadir al tubo de control positivo 300 µl de diluyente de la muestra ; añadir al tubo de
control positivo 300 µl de control positivo.
5. Añadir las muestras de paciente a los correspondientes tubos debidamente etiquetados
siguiendo las siguientes instrucciones :
Si la muestra medio de transporte LIBRE DE SUERO, vortear energicamente y añadir 300ul al
tubo apropiado. Si la muestra no está en el medio de transporte, diluir con un volumen igual de
Diluyente de muestra Pathfinder. Añadir 300ul de la muestra diluida al tubo apropiado. La
dilución de la muestra mayor de la indicada puede adar lugar a una pérdida de sensibilidad.
6. Mezclar suavemente los tubos e incubar a temperatura ambiente
(23 ± 3°C) durante 60 ± 10 minutos.
7. Aspirar cuidadosamente las muestras del tubo.
8. Lavar cada tubo 6 veces con 2–4 ml de agua desionizada o destilada por lavado. Eliminar
el exceso de humedad de los tubos después del lavado final invirtiendo los tubos y secando
el borde con toallitas de papel o aspirando meticulosamente los tubos. Un lavado
inadecuado o un lavado con agua con impurezas puede producir resultados erróneos.
9. Preparar el reactivo de color de trabajo.
ATENCIÓN: Evitar que el cromógeno o el reactivo de color de trabajo entren en contacto con
un metal o con un agente oxidante.
A) Cantidad requerida de tampón substrato = 0,5 ml de tampón por tubo de ensayo.
Cantidad requerida de cromógeno = 1 gota de cromógeno por ml de tampón substrato.
Ejemplo: Para 6 tubos de ensayo,
• La cantidad requerida de tampón substrato = 3,0 ml;
• La cantidad requerida de cromógeno = 3 gotas.
Añadir la cantidad requerida de tampón substrato y cromógeno a un tubo de vidrio o de
plástico limpio.
B) Cubrir el tubo con una película de plástico y mezclar el contenido invirtiendo el tubo varias
veces. Utilizar la solución substrato antes de 30 minutos. Minimizar la exposición a la luz.
La aparición espontánea de color azul puede ser indicativa de contaminación del reactivo.
El reactivo de color de trabajo debe ser incoloro antes de su uso.
10.Añadir 0,5 ml de reactivo de color de trabajo a cada tubo. Mezclar suavemente los tubos e
incubar a temperatura ambiente (23 ± 3°C) durante 15 minutos, minimizando la exposición
a una luz intensa. No dejar que la reacción de color exceda los 15 minutos.
11.Leer los tubos visualmente o con un espectrofotómetro para determinar los resultados del
ensayo.
Determinación visual
No detener la reacción añadiendo ácido.
Al final del período de incubación, el tubo de control negativo deberá ser incoloro. El control
positivo deberá presentar un color azul oscuro. Las muestras que presenten un color azul son
positivas para el antígeno RSV. Las muestras que no presenten color azul son negativas para el
antígeno RSV.
35
Nota : Los resultados visuales para muestras débilmente positivas se deberán procesar y
leer mediante el siguiente método de determinación espectrofotométrica.
Determinación espectrofotométrica
A) Añadir a cada tubo 1 ml de H2SO4 1N en el mismo orden y aproximadamente en el mismo
intervalo de tiempo que los utilizados para añadir el reactivo de color de trabajo a cada tubo.
Mezclar los tubos con Vortex. Eliminar las burbujas de aire antes de leer la absorbancia.
Después de añadir ácido a cada tubo, el material de la reacción final es estable durante 8 horas
protegido de la luz.
B) Hacer el blanco del espectrofotómetro a 450 nm con agua desionizada o destilada.
C) Leer la absorbancia del control negativo (diluyente de la muestra), el control positivo y los tubos
de muestras a 450 nm. Para distinguir las muestras positivas de las muestras negativas, calcular
el valor de corte y la zona gris como se describe en la sección “Resultados”.
Un valor superior o igual a 0,06 unidades de absorbancia para el control negativo (diluyente de
la muestra) indica una posible contaminación del reactivo o un lavado inadecuado.
8- CONTROL DE CALIDAD
Deberá realizarse un control positivo y uno negativo para cada prueba.
Control negativo (Diluyente de la muestra)
Visual : el control negativo deberá ser incoloro.
Espectrofotométrico : el valor de absorbancia debe ser inferior a 0,06 unidades.
Control positivo
Visual : el control positivo deberá ser de color azul oscuro.
Espectrofotmétrico : el valor de la absorbancia deberá ser superior a 0,6 unidades.
Si los controles no reaccionan como se espera, los resultados no serán válidos.
9- DETALLES DE LA CALIBRACIÓN
Sólo el método espectrofotométrico
1. Calcular el valor de corte añadiendo 0,075 al valor de las unidades de absorbancia del
control negativo (diluyente de la muestra).
Ejemplo :
Valor del control negativo
0,017
+ 0,075
Valor de corte
= 0,092
2. Calcular la zona gris. La zona gris es igual a ± 10% del valor de corte (o 0,90 a
1,10 veces el valor de corte).
Ejemplo :
Valor de corte = 0,092
Zona gris = 0,083 a 0,101
Valor de corte x (0,90) = (0,092) x (0,90) = 0,083
Valor de corte x (1,10) = (0,092) x (1,10) = 0,101
10- RESULTADOS
a) Visual
Las muestras que presentan color azul son positivas para el antígeno RSV. Las muestras que no
presentan color azul son negativas para el antígeno RSV. El control negativo debe ser
incoloro. El color positivo debe ser azul oscuro.
36
b) Espectrofotométrico
Las muestras con valores de absorbancia inferior o igual al valor de corte inferior de la zona gris
son negativas para el antígeno RSV.
Una muestra con un valor de absorbancia dentro de la zona gris se considera cuestionable. El
laboratorio deberá repetir la prueba. Si utilizando la misma muestra o una muestra nueva el
resultado repetido presenta un valor de absorbancia dentro de la zona gris, el resultado se
considerará como indeterminado.
Las muestras con valores de absorbancia superiores o igual al valor de corte superior de la zona
gris son positivas para el antígeno RSV.
Las muestras fuertemente positivas pueden formar partículas oscuras de precipitado en el tubo.
11- LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1. Simultáneamente a la infección por RSV, puede existir una infección debida a otros patógenos
respiratorios, por lo que podría ser necesario realizar paralelamente al PATHFINDERTM RSV otras
pruebas adicionales. Véase en la sección “Características de rendimiento específicas” los
estudios de reactividad cruzada bacterianos y víricos.
2. Un resultado negativo de la prueba no excluye la posibilidad de infección por RSV. Pequeñas
cantidades de virus, la obtención de muestras correspondientes a una fase demasiado tardía de
la infección o el empleo de técnicas de recogida de muestras inadecuadas puede dar resultados
negativos.
3. Esta prueba puede detectar RSV no viables (cultivo negativo).
4. Los resultados de esta prueba deberán interpretarse conjuntamente con la información disponible
de la evaluación clínica del paciente y de otros procedimientos diagnósticos.
5. Los resultados de esta prueba son cualitativos y deberán considerarse como positivos o negativos
para la presencia del RSV.
12- VALORES ESPERADOS
Los valores esperados variarán dependiendo de la población de pacientes estudiada, de la
localización geográfica y de la época del año. La infección por el virus respiratorio sincitial puede
producirse en todos los grupos de edad. La enfermedad es más común en lactantes, entres las
6 semanas y los 6 meses de edad, con un máximo en los 2 meses de edad.
(1) El diagnóstico clínico más común en estos lactantes incluye bronquitis, bronquiolitis y neumonía.
La infección por RSV en adultos es común, aunque tiende a ser menos grave que en los lactantes.
Los síntomas pueden incluir rinorrea, faringitis, tos, cefalea, fatiga y fiebre (4). Los pacientes
ancianos con infección por RSV pueden desarrollar bronconeumonía, que puede ser grave o
incluso mortal (17).
13- CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO ESPECÍFICAS
Exactitud
Dos investigadores independientes analizaron 241 muestras respiratorias de pacientes con una
edad que oscilaba desde recién nacidos hasta 93 años para detectar el virus respiratorio sincitial
mediante cultivo, inmunofluorescencia (IF), el PATHFINDERTM RSV y un EIA RSV de un competidor A.
Los centros de estudio independientes fueron hospitales universitarios del este y del oeste del país.
Todas las muestras analizadas mediante EIA se evaluaron visualmente y espectrofométricamente.
Las muestras de este estudio se recogieron durante un brote epidémico de RSV. Las muestras se
cultivaron en las condiciones de cultivo de virus respiratorios y se hicieron frotis para la tinción
inmunofluorescente. La muestra sobrante se congeló a -70°C para su evaluación posterior por EIA.
En un centro, se analizó la inmunofluorescencia en los frotis en el momento de la llegada de las
37
muestras. En el otro centro los frotis se congelaron a –70°C y se tiñeron en el momento del estudio
EIA. Las muestras positivas en el EIA y negativas en el cultivo se confirmaron con los resultados IF o
con un ensayo de bloqueo (15,16). El ensayo de bloqueo se realizó incubando la muestra durante
1 hora a temperatura ambiente (23 ± 3°C) con y sin antisuero policlonal anti-RSV. El antisuero
debería inhibir la reacción de una muestra positiva verdadera. A continuación se realizó el EIA en
estas muestras. Una muestra se consideraba bloqueada, y por consiguiente positiva verdadera, si la
señal en el tubo con un anticuerpo de bloqueo se reducía hasta el 50% como mínimo en
comparación con un tubo sin anticuerpo de bloqueo.
Se consideraba que una muestra era positiva verdadera si era positiva en el cultivo o si se podía
confirmar como positiva mediante los otros dos métodos : EIA y bloqueo o EIA e IF. Se consideraba
que una muestra era verdadera negativa si era negativa en el cultivo y si no se podía confirmar una
señal EIA positiva ni por IF ni por bloqueo.
Nota: Pequeñas cantidades de antígeno RSV pueden dar lugar ocasionalmente a una discrepancia
entre los resultados visuales y espectrofotométricos. Al ser la espectrofotometría un método objetivo,
es ligeramente más exacto que la determinación visual (Véanse las Tablas 1 y 2).
Tabla 1
Comparación del PATHFINDERTM RSV con el cultivo
ESPECTROFOTOMÉTRICO
CONFIRMADO
Positiva
PATHFINDER™ RSV
119
1
Negativa
8
111
VISUAL
CONFIRMADO
Positiva
PATHFINDER™ RSV
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
118
4
Negativa
11
108
Espectrofotométrico
Concordancia global = (VP* + VN)/Número total de muestras = (119 + 111) / 239** = 96.2 %
Sensibilidad = VP / (VP + FN) = 119 / (119 + 8) = 93.7 %
Especificidad = VN / (VN + FP) = 111 / (111 + 1) = 99.1 %
*VP = verdadera positiva, VN = verdadera negativa, FP = falsa positiva, FN = falsa negativa.
Visual
Concordancia global = (VP* + VN)/Número total de muestras = (118 + 108) / 241 = 93.8 %
Sensibilidad = VP / (VP + FN) = 118 / (118 + 11) = 91.5 %
Especificidad = VN / (VN + FP) = 108 / (108 + 4) = 96.4 %
*VP = verdadera positiva, VN = verdadera negativa, FP = falsa positiva, FN = falsa negativa.
** No se incluyen en estos datos dos muestras indeterminadas por evaluación
espectrofotométrica.
38
Tabla 2
Comparación de PATHFINDERTM RSV con el EIA de RSV del competidor A
ESPECTROFOTOMÉTRICO
EIA DEL COMPETIDOR A
Positiva
PATHFINDER™ RSV
Negativa
Positiva
117
4
Negativa
10
107
VISUAL
EIA DEL COMPETIDOR A
Positiva
PATHFINDER™ RSV
Negativa
Positiva
117
5
Negativa
16
103
Espectrofotométrico
De las 238* muestras analizadas, se observó una concordancia del 94,1% (224/238) entre el
PATHFINDERTM y los EIA del competidor A. Una vez resueltos todos los resultados discrepantes,
PATHFINDERTM RSV mostró una sensibilidad del 94,5% y una especificidad de 99,1% por
interpretación espectrofotométrica.
* No se incluyen los datos de tres muestras indeterminadas por evaluación espectrofotométrica con
PATHFINDERTM. Una muestra fue indeterminada en la evaluación del competidor A, por lo que estos
datos no se incluyen.
Visual
De las 241 muestras analizadas visualmente, se observó una concordancia del 91,3% (220/241)
entre el PATHFINDER TM y el EIA del competidor A. Una vez resuelto todos los resultados
discrepantes, PATHFINDERTM RSV mostró una sensibilidad del 92,9% y una especificidad del 96,5%
por interpretación visual.
PRECISIÓN
Variabilidad intraensayo
Se analizaron 15 réplicas del control positivo, 15 réplicas de una dilución 1:20 del control positivo
y 20 réplicas del control negativo en un único ensayo para determinar la reproducibilidad
intraensayo. Se calculó la media de las absorbancias ópticas para determinar la variabilidad
intraensayo.
Tabla 3
Muestra
Media (DO a 450 nm)
DE
% C.V.
Positiva
1.471
0.045
3.1
Positiva baja
0.114
0.008
7
Negativa
0.006
0.003
50
Variabilidad entre ensayos:
Se analizó el control positivo, una dilución 1:20 del control positivo y el control negativo en
9 ensayos diferentes con 10 réplicas por ensayo de un lote del kit para determinar la
reproducibilidad entre ensayos. Se calculó la media de las absorbancias ópticas de cada
ensayo para determinar la variabilidad entre ensayos.
39
Tabla 4
Muestra
Media (DO a 450 nm)
DE
% C.V.
Positiva
1.511
0.095
6.3
Positiva baja
0.118
0.011
9.3
Negativa
0.010
0.009
90
REACTIVIDAD CRUZADA
Estudio 1
Se utilizó PATHFINDERTM RSV con microorganismos susceptibles de provocar presentaciones clínicas
similares o habituales de la flora respiratoria. La prueba se realizó siguiendo las instrucciones
incluidas en el prospecto, sustituyendo los organismos por la muestra del paciente. Cada prueba se
analizó con 300 µl de suspensiones con 0,1 unidades de densidad óptica (a 620 nm) de cada
microorganismo en solución salina tamponada, excepto Mycoplasma pneumoniae, que se analizó
en una concentración de 5 mg de peso de célula húmeda por µl y Chlamydia trachomatis, que
analizó en una concentración de 1x108 cuerpos elementales por µl. Asimismo, también se estudió
la interferencia de estos microorganismos en la detección del RSV mezclando 12 µl de control
positivo (largo) con 300 µl de cada suspensión. Los resultados de la Tabla 5 muestran que no existe
reactividad cruzada ni interferencia con estos microorganismos. Esto se puso de manifiesto por la
ausencia de absorbancia positiva en el ensayo sólo con la bacterias y la ausencia de una
reducción del 50% en la señal con las bacterias y el RSV en comparación con el control positivo.
Tabla 5
Microorganismos en los que se analizó la reactividad cruzada
Microorganismos
Cepa
Absorbance
Absorbance
(microorganismo sólo)
(microorganismo + RSV)
Streptococcus Grupo A
12344
0.010
2.108
Staphylococcus aureus, Cowan
12598
0.014
1.982
9996
0.022
1.984
Staphylococcus epidermis
12228
0.009
1.989
Escherichia coli
25922
0.024
2.002
Candida albicans
14053
0.034
1.997
Mycoplasma pneumoniae
P11428
0.006
1.435
L2
0.013
1.593
-
0.012
1.964
Largo
1.512
1.512
Staphylococcus aureus
Chlamydia trachomatis
Control negativo
(diluyente de la muestra)
Control positivo
Estudio 2
Se analizaron los virus presentados en la Tabla 6 para determinar la reactividad cruzada con el
PATHFINDERTM RSV. Este estudio utilizó 300 µl de suspensiones con 1 x 105 TCID 50 por ml en
diluyente de la muestra con cada uno de los virus, excepto los virus de la gripe y del herpes simple
tipo 2. El virus de la gripe A se analizó en una concentración de 1 x 108 unidades formadoras de
placa por ml y el virus de la gripe B en 1 x 107 unidades formadores de placa por ml. El VHS Tipo
2 se analizó en una concentración de 6,8 x 107 unidades formadoras de placa por ml. La
interferencia vírica en la detección del RSV también se analizó mezclando 12 µl de control positivo
40
(largo) con 300 µl de cada suspensión. No se produjo reactividad cruzada ni interferencia de estos
virus con el PATHFINDERTM RSV. Esto se puso de manifiesto por la ausencia de absorbancia positiva
en el ensayo sólo con los virus y la ausencia de una reducción del 50% en la señal con los virus y el
RSV en comparación con el control positivo.
Tabla 6
Virus en los que se analizó la reactividad cruzada
Cepa de virus
Absorbance
(Virus sólo)
Absorbance
(Virus+RSV)
HGP
Thompson
MRH
211
1734
6072
106F
611CV35
0.016
0.006
0.004
0.007
0.014
0.012
0.033
0.005
1.114
1.339
1.270
1.514
1.303
1.367
1.378
1.464
Typo A-9
Typo B-3
Typo B-4
PB Bozek
Nancy
JVB Berschoten
0.008
0.009
0.002
1.636
1.394
1.586
Typo 8
Typo 11
Typo 19
Bryson
Gregory
Burke
0.005
0.006
0.007
1.435
1.517
1.571
C35
Greer
C243
0.017
0.003
0.017
1.692
1.339
1.692
Adenoid6
Rl67
0.011
0.006
1.264
1.447
AD169
0.007
1.583
Maclntyre
MS
0.031
0.003
1.714
1.436
Virus
Rhinovirus
Typo
Typo
Typo
Typo
Typo
Typo
Typo
Typo
2
6
8
9
15
19
30
59
Coxsackie
Echovirus
Parainfluenza
Typo 1
Typo 2
Typo 3
Adenovirus
Typo 2
Typo 4
Cytomegalovirus
Herpes Simplex
Typo 1
Typo 2
Varicella Zoster
OKA
0.010
1.475
Influenza A
WSN
0.007
1.516
Influenza B
B/Lee/40
0.008
1.554
Control negativo
(Diluyente de la muestra)
N/A
0.007
1.402
Control positivo
Largo
1.827
1.827
14- BIBLIOGRAFÍA
Ver la versión Inglesa.
41
42
PATHFINDER™ RSV
50 TESTS
79674
QUALITATIVER NACHWEIS VORESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS
(RSV) ANTIGENEN IN HUMANEN NASEN/RACHEN-ASPIRATEN
MIT ENZYM-IMMUNOASSAY (EIA)
IVD
INHALTSVERZEICHNIS
1- VERWENDUNGSZWECK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
2- KLINISCHE BEDEUTUNG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
3- TESTPRINZIP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
4- INHALT DER TESTPACKUNG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
5- WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
6- ENTNAHME UND VORBEREITUNG DER PROBEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
7- TESTVERFAHREN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
8- QUALITÄTSKONTROLLE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
9- KALIBRIERUNGSDETAILS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
10- ERGEBNISSE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
11- GRENZEN DES VERFAHRENS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51
12- NORMALWERTE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51
13- SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51
14- LITERATUR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
44
1- VERWENDUNGSZWECK
The PATHFINDERTM RSV ist ein qualitativer Enzym-Immunoassay (EIA) und dem qualitativen Nachweis
von Respiratory Syncytial Virus (RSV) antigenen in humanen Nasen/Rachen-Aspiraten.
2- KLINISCHE BEDEUTUNG
Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) zählt zu den Hauptursachen für Bronchiolitis und Pneumonie
bei Säuglingen und Kindern. Die schwerste Erkrankungsform tritt im ersten Lebensjahr auf (1).
Nahezu jedes Jahr verursacht dieses Virus im Herbst, Winter und Frühjahr epidemiologische Schübe
(2,3). RSV löst signifikante Atemwegserkrankung bei gesunden Erwachsenen aus, wobei der
Krankheitsverlauf jedoch tendenziell leichter als bei Kleinkindern ist (4).
Die rasche Diagnose von RSV Infektionen gewinnt mit der Entwicklung wirksamer Therapien
zunehmend an Bedeutung. Sie ermöglicht es, eine Prognose zu erstellen, die Therapie einzuleiten
und frühzeitig zu handeln, um eine Weiterverbreitung der Erkrankung zu vermeiden. Herkömmliche
Zellkulturmethoden (5,6,7,8) können bis zu 3 Wochen dauern und hängen stark von den
Bedingungen des Probentransports ab (8,14). Immunologische Tests bieten Vorteile, da sie schneller,
anwenderfreundlicher und kostengünstiger als Virenkulturen sind. Immunfluoreszenz (5,6,7,9,10)
und Enzym-Immunoassay (EIA) (11,12,13) sind dabei Methoden, die nachweislich für den RSVNachweis geeignet sind. Der PATHFINDERTM RSV dient dem qualitativen Antigennachweis und
ver wendet polyklonale und monoklonale Antikörper zum direkten RSV Nachweis in
Patientenproben. Dieser Test verbindet die Spezifizität und die Reproduzierbarkeit monoklonaler
Antikörper mit der Schnelligkeit und Effizienz eines EIA. Qualitative Ergebnisse liegen innerhalb von
90 Minuten nach Testbeginn vor. Der PATHFINDERTM RSV zum direkten Antigennachweis kann auch
nicht lebensfähige RSV nachweisen, die in der Kultur negativ sind. Der Test bietet eine zuverlässige
Alternative zu zeitaufwendigen Zellkulturen und subjektivenarbeitsaufwendigen
Fluoreszenztechniken.
3- TESTPRINZIP
RSV Antigene in der Probe binden an polyklonale Anti-RSV Antikörper,mit denen die Röhrchen
beschichtet sind. Die HRP-konjugierten, monoklonalen Antikörper sind gegen das RSV gerichtet und
binden an die RSV, die bereits von den polyklonalen Antikörpern an die Röhrchenwand gebunden
wurden. Mit einem Waschschritt werden ungebundene Probenanteile bzw. Konjugate entfernt.
Peroxydasesubstrat wird in die Röhrchen gegeben und führt über die HRP-konjugierten Antikörper zu
einer Blaufärbung. Eine visuelle oder spektrophotometrische Auswertung der Proben lässt auf das
Vorhandensein bzw. Fehlen von RSV schliessen.
Proben mit einer Blaufärbung oder einem Wert der OD, der größer oder gleich dem oberen
Grauzonen-Grenzwert ist, sind RSV Antigen positiv. Proben ohne Blaufärbung oder mit einem
Dichtewert der kleiner oder gleich dem unteren Grauzonen Grenzwert ist,sind RSV Antigen negativ.
4- INHALT DER TESTPACKUNG
Lagern Sie alle Testreagenzien bei +2-8°C. Vermeiden Sie das Einfrieren der Reagenzien. Bringen
Sie die Reagenzien vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur (23 ± 3°C) und nach dem Gebrauch
unverzüglich wieder auf +2-8°C. Die Stabilität aller Reagenzien ist bei vorschriftsmäßiger Lagerung
bis zum Ablaufdatum auf dem Etikett gewährleistet. Verwenden Sie keine Reagenzien anderer
Hersteller oder andere Kit-Chargen. Verwenden Sie keine abgelaufenen Reagenzien.
Alle Reagenzien sind für die in vitro Diagnostik bestimmt.
45
Bezeichnung
R1
R2
R3
R4
R5
Reagenz
RSV antibody Antikörperröhrchen : mit anti-RSV IgG (Kaninchen) tubes
beschichtete Polystyrenröhrchen
Conjugate
Konjugat : Meerrettich Peroxydase konjugierte monoklonale
Maus Antikörper in gepufferter Kochsalzlösung, pH 7.4,
Proteinstabilisator.
Konservierungsmittel ≤ 0,01% Thimerosal
Sample diluent Probenverdünner : gepufferte Kochsalzlösung, pH 7.5, mit
EDTA und Oberflächenentspanner
Konservierungsmittel ≤ 0,01% Thimerosal
Positive control Positive Kontrolle : inaktiviertes RSV (Long) in gepufferter
Kochsalzlösung, pH 7.5, EDTA, und
Oberflächenentspanner
Konservierungsmittel ≤ 0,01% Thimerosal
Substrate Buffer Substratpuffer : Citratpuffer, pH 4.2, und Wasserstoffperoxyd
Präsentation
1 x 50
Röhrchen
1 x 5 ml
1 x 25 ml
1 x 3 ml
1 x 40 ml
R6 Chromogen TMB Chromogen : Tetramethylbenzidin gelöst in verdünnten HCI
1 x 2,5 ml
R7 Assay Treatment Tropfen des Testpuffer : gepufferte Kochsalzlösung, pH
buffer
10.3, mit EDTA
Konservierungsmittel ≤ 0,01% Thimerosal
1 x 2,5 ml
RSV Antikörper Röhrchen: Lagern Sie die Röhrchen im versiegelten Beutel. Öffnen Sie diesen
erst nach Erreichen der Raumtemperatur (23±3°C). Entnehmen Sie die für die vorgesehene
Testung erforderliche Anzahl an Röhrchen. Geben Sie die übrigen Röhrchen wieder in den
Beutel zurück und verschließen Sie diesen sorgfältig.
Nach dem Öffnen ist die Stabilität der Röhrchen bei Einhaltung der Lagerungsempfehlungen und
ohne mikrobielle Kontamination für 3 Monaten gewährleistet.
• PathfinderTM RSV positive control : 1 x 3 ml
79482
HINWEIS: Verwenden Sie keine Reagenzien anderer Hersteller oder abgelaufene
Reagenzien
Physikalische oder chemische Hinweise auf Instabilität
Eine Trübung der Reagenzien kann auf eine mikrobielle Kontamination hinweisen.
5- WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
1. Zur in vitro Diagnose.
2. Patientenproben und positive Kontrollen lassen sich routinemäßig bei minimalem Risiko nach dem
beschriebenen Testverfahren abarbeiten. Betrachten Sie jedoch alle Proben als potentiell infektiös
gemäß den allgemeinen Vorsichtsmaßnahmen und den GLP, ungeachtet ihrer Herkunft,
Behandlung oder früheren Zertifizierung. Verwenden Sie zur Dekontamination ein geeignetes
Desinfektionsmittel. Beachten Sie bei der Lagerung und Entsorgung dieser Materialien und ihrer
Verpackung die vor Ort geltenden Vorschriften und Richtlinien.
3. Reagenzien tierischen Ursprungs lassen sich routinemäßig mit minimalem Risiko einsetzen.
Behandeln Sie jedoch diese Produkte als potentiell bioschutzgefährdend gemäß den allgemeinen
Vorsichtsmaßnahmen und den GLP.
4. Vermeiden Sie Haut- und Schleimhautkontakt mit Chromogen und Schwefelsäure. Bei Kontakt mit
Wasser abwaschen. Nicht schlucken.
5. Neutralisieren Sie alle flüssigen, säurehaltigen Abfälle vor dem Dekontaminieren.
46
6. Die Reagenzien der Testpackung enthält ≤ 0,01% Thimerosal (≤ 0,005% Quecksilbergewicht pro
Volumen). Quecksilberbestandteile sind von den nationalen Behörden bei bestimmten
Konzentrationen/Mengen als toxisch für die Reproduktion und umweltschädlich eingestuft. Bitte
beachten Sie beim Umgang und der Entsorgung dieser Stoffe die örtlichen, regionalen und
nationalen Vorschriften.
6- ENTNAHME UND VORBEREITUNG DER PROBEN
Entnehmen Sie mindestens 150 µl Nasen-/Rachen-Aspirat gemäß Routineentnahme- und
Probentransport Ihres Labors. Nasopharyngeale Abstriche können ebenfalls verwendet werden,
weisen aber grundsätzlich eine niedrigere Sensitivität beim Nachweis von RSV auf (5). Vermeiden
Sie den Einsatz von Abnahmematerialien mit Konservierungsstoffen, Metallionen oder
Reinigungsmitteln wegen einer ihrer mgl. Interferenz mit dem Test. Verwenden Sie keine
serumhaltigen Transportmedien. Wenn möglich, sind die Nasalsekrete in der akuten
Krankheitsphase mit der höchsten Anzahl abgestoßener Viren zu entnehmen. Bei fortschreitendem
Krankheitsverlauf verringert sich die Menge abgestoßener und damit auch nachweisbarer Viren.
Lagern Sie die Proben bis zu 24 Stunden bei +2-8°C geschützt vor Austrocknung und
Kontamination. Bei längerer Lagerung oder Versand frieren Sie die Proben auf mindestens -70°C
ein. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen beeinträchtigt die Probe. Beachten Sie beim Versand der
Proben die geltenden Vorschriften zur Beförderung von Krankheitserregern.
Vermeiden Sie die Verwendung von Proben mit erkennbar hohem Blutanteil, um mglst. genaue
Ergebnisse zu gewährleisten.
7- TESTVERFAHREN
A) Bestandteile der testpackung
R1.
R2.
R3.
R4.
R5.
R6.
R7.
Anti-RSV Antikörper Röhrchen
Anti-RSV HRP – Konjugierte monoklonale Antikörper
Probenlösungsmittel
Positive Kontrolle
Substratpuffer
Chromogen
Testpuffer
B) Zusätzliche benötigte materialen (nicht enthalten)
1. Entionisiertes oder destilliertes Wasser zum Verdünnen der Schwefelsäure und zum Waschen
der Röhrchen.
2. 1N Schwefelsäure (H2SO4) zum Abstoppen der Reaktion vor der spektrophotometrischen
Analyse. Verwenden Sie konzentriertes H2SO4 in Analysenqualität zur Herstellung der 1N
Säure. Zur Vorbereitung von 500 ml 1N H2SO4 geben Sie 14 ml konzentriertes H2SO4 in
486 ml destilliertes oder entionisiertes Wasser.Lagern Sie das sorgfältig abgedeckte
Glasgebinde bei Raumtemperatur (23 ± 3°C).
3. Röhrchenständer für 12 x 75 mm Röhrchen.
4. Mikropipetten mit Einwegspitzen für die genaue Abgabe von 100 µl, 300 µl und 500 µl.
5. Serologische Einwegpipetten 10 ml.
6. 12 x 75 mm Einweg-Glasröhrchen.
7. Saubere Glasröhrchen zur Vorbereitung der gebrauchsfertigen Substratlösung (siehe unter
Nr. 9).
8. Parafilm.
47
9. Waschgerät zum Waschen der Röhrchen mit Spül- und Absaugvorrichtung, entsprechenden
Anschlüssen und Verbindungen zum Auffangen flüssigen Abfalls (siehe Diagramm 1).
a) Spülgerät zum Waschen der Kunstoffröhrchen
b) Ansaugvorrichtung : Ansaugspitze und Vakuumpumpe.
10. Vortex Mischer.
11. Spektrophotometer mit einstellbarer Wellenlänge im sichtbaren Lichtspektrum und einem linearen
Spektrum von 0-2,0 Dichteeinheiten zum Ablesen der optischen Dichte (OD) bei 450 nm.
12. Natriumhypochlorit (Bleichung) zur Dekontamination.
13. Stoppuhr für 15 und 60 Minuten.
DIAGRAMM 1
Waschvorrichtung
Vakuum
pumpe
Aspiration
Pipette
Vakuum
falle
Bemerkungen zum Verfahren
1. Bringen Sie alle Reagenzien und Proben vor dem Einsatz auf Raumtemperatur (23°C ± 3°C).
2. Die Inkubation bei Temperaturen außerhalb des angegeben Bereichs kann zu falschen
Ergebnissen führen.
3. Vermeiden Sie nach der Zugabe der Reagenzien Verzögerungen und Unterbrechungen. Die
Röhrchen dürfen nach Testbeginn nicht austrocknen.
4. CAVE: Pipettieren Sie nicht mit dem Mund.
5. Pipettieren Sie immer mit der Pipettenspitze am Boden des Röhrchens. Reagenzien nicht entlang
der Röhrchenwand pipettieren. Vermeiden Sie jeden Kontakt zwischen Pipettenspitze und
Reaktionslösung.
6. Wechseln Sie die Pipettenspitze bei jeder Probe.
7. Mehrwegglas ist zu waschen und sorgfällig von Reinigungsmitteln freizuspülen. Verwenden Sie
entionisiertes oder destilliertes Wasser.
8. Alle Reagenzien sind für den RSV-Nachweis optimiert. Verdünnen oder Strecken der Reagenzien
kann die Sensitivität verringern.
C) TESTDURCHFÜHRUNG
Mischen Sie alle Reagenzien vor Gebrauch gründlich durch
1. Kennzeichnen Sie ein Antikörperröhrchen für die negative Kontrolle und ein
Antikörperröhrchen für die positive Kontrolle. Kennzeichnen Sie weitere Antikörperröhrchen
für jede Patientenprobe.
HINWEIS : Eine positive und negative Kontrolle (Probenlösungsmittel) sind bei jedem Testlauf
mitzuführen.
2. Geben Sie 1 Tropfen des Testpuffers (R7) in jedes Röhrchen.
3. Geben Sie 100 µl des HRP-konjugierten, monoklonalen Antikörpers in jedes Röhrchen.
48
4. Geben Sie 300 µl Probenverdünner (R3) in das negative Kontrollröhrchen und 300 µl positive
Kontrolle in das positive Kontrollröhrchen.
5. Geben Sie jede Patientenprobe in das entsprechend gekennzeichnete Röhrchen unter Beachtung
der nachstehenden Anleitungen:
Proben, die in einem Serum-freien Transportmedium in das Labor gelangen, sollten zunächst
sorgfältig gemischt werden (Vortex). Anschliessend werden jeweils 300 µl der durchmischten
Probe in das entsprechende Probenröhrchen pipettiert.
Proben, die nicht in einem Transportmedium in das Labor gelangen, sind zunächst mit einem
gleichen Volumenteil des PATHFINDER TM Probenverdünners zu verdünnen. Nach dem
Durchmischen der Probe werden hiervon jeweils 300 µl in ein entsprechendes Probenröhrchen
gegeben.
Werden die Proben entgegen diesen Angaben stärker verdünnt, ist mit Sensitivitätsverlusten zu
rechnen.
6. Mischen Sie den Inhalt der Röhrchen vorsichtig durch und inkubieren Sie diese bei
Raumtemperatur (23 ± 3°C) ür 60 ± 10 Minuten .
7. Saugen Sie den Inhalt der Röhrchen wieder vorsichtig ab.
8. Waschen Sie jedes Röhrchen 6 mal mit 2-4 ml entionisiertem oder destilliertem Wasser pro
Waschschritt. Entfernen Sie überflüssige Feuchtigkeit nach dem letzten Waschschritt aus den
Röhrchen, indem Sie diese umdrehen und den Röhrchenrand mit saugfähigem Papier abwischen
oder den Inhalt der Röhrchen gründlich Absaugen. Fehlerhaftes Waschen oder Waschen mit
unreinem Wasser kann zu falschen Ergebnissen führen.
9. Herstellung der gebrauchsfertigen Substratlösung :
CAVE: Vermeiden Sie jeglichen Kontakt von Metall oder Oxidationsfaktoren mit dem
Chromogen und der Substratlösung.
A) Erforderliche Substratpuffermenge = 0,5 ml pro Teströhrchen.
Erforderliche Chromogenmenge = 1 Tropfen Chromogen pro ml Substratpuffer.
Beispiel: Für 6 Teströhrchen beträgt die
• Erforderliche Substratpuffermenge = 3,0 ml Puffer ;
• Erforderliche Chromogenmenge = 3 Tropfen.
Füllen Sie die erforderliche Menge Substratpuffer und Chromogen in ein sauberes Glas- oder
Kunststoffröhrchen.
B) Decken Sie die Röhrchen mit Parafilm ab und mischen Sie den Inhalt durch mehrmaliges
Umdrehen der Röhrchen. Verwenden Sie die fertige Substratlösung innerhalb von 30 Minuten.
Schützen Sie die Röhrchen vor Licht.
Eine spontane Blaufärbung weist ggf. auf eine Kontamination des Reagenz hin. Die
Substratlösung sollte vor dem Gebrauch farblos sein.
10. Geben Sie 0,5 ml der gebrauchsfertigen Substratlösung in jedes Röhrchen. Mischen Sie die
Ansätze vorsichtig und inkubieren Sie bei Raumtemperatur (23±3°C) für 15 Minuten unter Schutz
vor starkem Licht. Die Reaktionszeit der Farbreaktion sollte nicht mehr 15 Minuten betragen.
11. Werten Sie die Röhrchen visuell oder mit einem Spektrophotometer zur Bestimmung der
Testergebnisse aus.
Visueller Nachweis
Stoppen Sie die Reaktion nicht durch Säurezugabe ab.
Am Ende des Inkubationszeitraums sollten die negativen Kontrollröhrchen farblos sein. Die positiven
Kontrollen sind tiefblau. Proben mit Blaufärbung sind RSV Antigen positiv. Proben ohne Blaufärbung
sind RSV Antigen negativ.
49
HINWEIS : Visuelle Ergebnisse bei schwach positiven Proben sollten weiterausgewertet und
mit der nachstehenden spektrophotometrischen Nachweismethode untersucht werden.
Spektrophotometrischer Nachweis
A) Geben Sie 1 ml 1N H2SO4 in jedes Röhrchen und zwar in der selben Reihenfolge bzw. in den
gleichen Zeitabständen wie die vorherigen Reagenzien in jedes Röhrchen. Mischen Sie die
Röhrchen mit dem Vortex. Entfernen Sie evtl. Luftblasen vor dem Ablesen der OD. Nach Zugabe
der Säure in jedes Röhrchen bleibt das Ergebnis in den Röhrchen bei Lichtschutz über 8 Stunden
stabil.
B) Stellen Sie das Spektrophotometer mit entionisiertem oder destilliertem Wasser bei 450 nm ein.
C) Lesen Sie die OD der negativen Kontrolle (Probenverdünner ), der positiven Kontrolle und der
Probenröhrchen bei 450 nm ab. Zur Unterscheidung der positiven von den negativen Proben
berechnen Sie die Grenzwerte und die Grauzone gemäß Beschreibung im Abschnitt
“Ergebnisse“.
Ein OD-Wert von oder über 0,06 bei der negativen Kontrolle (Probenverdünner) weist auf eine
mgl. Kontamination von Reagenzien bzw. auf nicht vorschriftsmäßiges Waschen hin.
8- QUALITÄTSKONTROLLE
Führen Sie bei jedem Testlauf eine positive und eine negative Kontrolle mit.
Negative Kontrolle (Probenverdünner)
Visuell: Die negative Kontrolle sollte farblos sein.
Spektrophotometrisch: Die OD sollte unter 0,06 liegen.
Positive Kontrolle
Visuell: Die positive Kontrolle sollte tiefblau sein.
Spektrophotometrisch: Die OD sollte über 0,6 liegen.
Wenn die Kontrolle nicht normal reagiert, sind die Ergebnisse ungültig.
9- ANGABEN ZUR TESTAUSWERTUNG
Nur für die spektophotometrische Methode
1. Berechnen Sie den Grenzwert durch Addition von 0,075 zur OD der negativen Kontrolle
(Probenverdünner).
Beispiel:
Negativer Kontrollwert
0,017
+ 0,075
Grenzwert
= 0,092
2. Berechnen Sie die Grauzone. Die Grauzone entspricht ± 10% des Grenzwerts (oder
0,90 bis 1,10 mal den Grenzwert).
Beispiel:
Grenzwert = 0,092
Grauzone = 0,083 to 0,101
Grenzwert x (0,90) = (0,092) x (0,90) = 0,083
Grenzwert x (1,10) = (0,092) x (1,10) = 0,101
10- AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
a) Visuell
Proben mit einer Blaufärbung sind RSV Antigen positiv. Proben ohne Blaufärbung sind RSV
Antigen negativ. Die negative Kontrolle sollte farblos sein. Die positive Kontrolle ist tiefblau
50
b) Spektophotometrisch
Proben mit OD-Werten gleich oder kleiner als der untere Grauzonen-Grenzwert sind RSV
Antigen negativ.
Proben mit OD-Werten im Graubereich gelten als fraglich. Der Test sollte wiederholt werden.
Liegt das neue Ergebnis der selben oder einer neuen Probe ebenfalls in der Grauzone, sollte
der Befund als fraglich bewertet werden.
Proben mit einem Dichtewert gleich oder größer als der obere Grenzwert der Grauzone sind
RSV Antigen positiv.
Stark positive Proben können dunkle Präzipitate in den Röhrchen bilden.
11- GRENZEN DES VERFAHRENS
1. Gleichzeitig mit der RSV Infektion können andere Pathologien der Atemwege vorliegen. Daher
sollten parallel zum PATHFINDERTM RSV. zusätzliche Tests erfolgen. Der Abschnitt "Spezifische
Leistungsmerkmale" beschreibt die bakteriellen und viralen Kreuzreaktivitätsstudien.
2. Ein negatives Testergebnis schließt die Möglichkeit einer RSV Infektion nicht aus. Geringe
Virusmengen, eine zu späte Probenentnahme im Krankheitsverlauf sowie fehlerhafte bzw.
nicht vorschriftsmäßige Proben können falsch negative Ergebnisse bewirken.
3. Dieser Test kann nichtlebensfähige (kulturnegative) RSV nachweisen.
4. Die Interpretation der Testergebnisse hat in Verbindung mit den Daten der klinischen Bewertung
des Patienten und weiteren Diagnostikverfahren zu erfolgen.
5. Die Testergebnisse sind qualitativ und als entweder positiver oder negativer Nachweis des
RSV zu betrachten.
12- NORMALWERTE
Die Normalwerte hängen von der getesteten Patientenpopulation, vom Aufenthaltsort und von der
Jahreszeit ab. Respiratory Syncytial Virus Infektionen können in allen Altersgruppen auftreten. Am
häufigsten erkranken Säuglinge im Alter von 6 Wochen bis 6 Monaten mit einem Peak bei
2 Monaten (1). Die häufigsten klinischen Diagnosen bei diesen Säuglingen sind u.a. Bronchitis,
Bronchiolitis und Pneumonie. RSV Infektionen treten oft bei Erwachsenen auf, verlaufen jedoch
tendenziell leichter als bei Säuglingen. Zu den Symptomen zählen „laufende“ Nase, Pharyngitis,
Husten, Kopfschmerzen, Müdigkeit und Fieber (4). Ältere Patienten mit RSV Infektion können eine
Bronchopneumonie entwickeln, die schwer oder letal sein kann (17).
13- SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE
Präzision
Zwei unabhängige Labore untersuchten 241 Atemwegsproben von Patienten im Säuglingsalter bis
zu einem Alter von 93 Jahren auf Respiratory Syncytial Virus mit Kultur, Immunfluoreszenz (IF),
PATHFINDERTM RSV und RSV EIA des Mitbewerbers A. Die unabhängigen Studien erfolgten an
Universitätskrankenhäusern im Osten und Westen der USA. Alle Proben mit EIA wurden visuell und
spektrophotometrisch bewertet.
Die Probengewinnung für diese Studie erfolgte bei einem epidemischen RSV Ausbruch. Die Proben
wurden zur Isolierung von Atemwegsviren kultiviert und Abstriche zur Immunfluoreszenzfärbung
hergestellt. Die Probenreste wurden bei -70°C tiefgefroren, um sie später im EIA zu bewerten. Ein
Zentrum führte die Immunfluoreszenz mit den Abstrichen gleich nach bei Erhalt der Proben durch.
Das andere Zentrum fror die Abstriche auf -70°C ein und färbte sie zum Zeitpunkt der EIA Studie.
Proben mit EIA positiven und Kultur negativen Ergebnissen wurden mit IF oder dem Blocking Test
abgeklärt (15,16). Für den Blocking Test inkubierte man die Proben 1 Stunde bei Raumtemperatur
(23 ± 3°C) mit und ohne polyklonalem RSV Antiserum. Das Antiserum sollte die Reaktion einer
51
richtig positiven Probe hemmen. Dann wurden die Proben im EIA getestet. Eine Probe galt als
gestoppt und damit als richtig positiv, wenn sich das Signal in den Röhrchen mit Blocker-Antikörpern
um mindestens 50% im Vergleich zu den Röhrchen ohne Blocker-Antikörper verringerte.
Eine Probe galt als richtig positiv, wenn sie in der Kultur positiv war oder mit zwei anderen
Methoden als positiv erkannt wurde: EIA und Blocking Test oder EIA und IF. Eine Probe galt als
richtig negativ, wenn sie in der Kultur negativ war und sich ein positives EIA Signal weder mit IF
noch mit dem Blocking Test bestätigen ließ.
HINWEIS: Geringe RSV Antigenmengen führen bisweilen zu diskrepanten Ergebnissen beim
visuellen und spektrophotometrischen Nachweis. Da die Spektrophotometrie eine objektive Methode
ist, gilt sie als etwas genauer als die visuelle Auswertung. (Siehe Tabelle 1 und 2).
Tabelle 1
Vergleich des PATHFINDERTM RSV mit Kultur.
SPEKTROPHOTOMETRISCH
BESTÄTIGT
Positiv
PATHFINDER™ RSV
119
1
Negativ
8
111
VISUELL
BESTÄTIGT
Positiv
PATHFINDER™ RSV
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
118
4
Negativ
11
108
Spektrophotometrisch
Gesamt-übereinstimmung = (RP* + RN)/Probengesamtanzahl = (119 + 111) / 239** = 96,2 %
Sensitivität = RP / (RP + FN) = 119 / (119 + 8) = 93,7 %
Spezifizität = RN / (RN + FP) = 111 / (111 + 1) = 99,1 %
*RP = richtig positiv, RN = richtig negativ, FP = falsch positiv, FN = falsch negativ.
Visuell
Gesamt-übereinstimmung = (RP* + RN)/Probengesamtanzahl = (118 + 108) / 241 = 93,8 %
Sensitivität = RP / (RP + FN) = 118 / (118 + 11) = 91,5 %
Spezifizität = RN / (RN + FP) = 108 / (108 + 4) = 96,4 %
*RP = richtig positiv, RN = richtig negativ, FP = falsch positiv, FN = falsch negativ.
**Zwei Proben ließen sich mit der spektrophotometrischen Bewertung nicht genau bestimmen
und befinden sich nicht in diesen Daten.
Tabelle 2
Vergleich des PATHFINDERTM RSV mit dem RSV EIA des Mitbewerbers A
SPEKTROPHOTOMETRISCH
EIA MITBEWERBER A
Positiv
PATHFINDER™ RSV
52
Negative
Positiv
117
4
Negativ
10
107
VISUELL
EIA MITBEWERBER A
Positiv
PATHFINDER™ RSV
Negative
Positiv
117
5
Negativ
16
103
Spektrophotometrisch
Die 238* getesteten Proben ergaben 94,1% Übereinstimmung (224/238) zwischen PATHFINDERTM
und dem EIA des Mitbewerbers A. Nach Abklärung aller diskrepanten Ergebnisse ergab sich für
den PATHFINDER TM RSV eine Sensitivität von 94,5% und eine Spezifizität von 99,1% bei
spektrophotometrischer Interpretation.
Drei Proben ließen sich mit der PATHFINDERTM spektrophotometrischen Bewertung nicht eindeutig
bestimmen und wurden nicht in diese Daten aufgenommen. Eine Probe ließ sich nicht eindeutig mit
dem Test des Mitbewerbers A bestimmen und wurde nicht in diese Daten aufgenommen.
Visuell
Die 241 visuell ausgewerteten Proben ergaben 91,3% Übereinstimmung (220/241) zwischen dem
PATHFINDERTM Test und dem EIA des Mitbewerbers A. Nach Abklärung aller diskrepanten
Ergebnisse bewies der PATHFINDERTM RSV eine Sensitivität von 92,9% und eine Spezifizität von
96,5% bei visueller Interpretation.
PRÄZISION
Intraassay Variation
15 Wiederholungen einer positiven Kontrolle, 15 Wiederholungen einer 1:20 Verdünnung der
positiven Kontrolle und 20 Wiederholungen einer negativen Kontrolle wurden in einem Test auf ihre
Intraassay Reproduzierbarkeit überprüft. Zur Bestimmung der Intraassay Variation erfolgte die
Berechnung des Mittelwerts der optischen Dichte.
Tabelle 3
Probe
Mittelwert
(OD bei 450nm)
Standardabweichung
% Grenzwert
Positiv
1.471
0.045
3.1
Schwach positiv
0.114
0.008
7
Negativ
0.006
0.003
50
Interassay Variation:
Die positive Kontrolle, die 1:20 Verdünnung der positiven Kontrolle und die negative Kontrolle
wurden in 9 verschiedenen Tests mit 10 Wiederholungen pro Test der selben Testpackung auf ihre
Interassay Reproduzierbarkeit überprüft. Zur Bestimmung der Interassay Variation erfolgte die
Berechnung des Mittelwerts der optischen Dichte.
Tabelle 4
Probe
Mittelwert
(OD bei 450nm)
Standardabweichung
% Grenzwert
Positiv
1.511
0.095
6.3
Schwach positiv
0.118
0.011
9.3
Negativ
0.010
0.009
90
53
KREUZREAKTIVITÄT
Studie 1
PATHFINDER™ RSV wurde mit Erregern geprüft, die ähnliche klinische Bilder verursachen können
oder zur normalen Flora der Atemwege zählen. Der Test wurde gemäß der Packungsbeilage mit
diesen Erregern an Stelle der Patientenproben durchgeführt. Jeder Test erfolgte mit 300 µl
Suspensionen in einer OD von 0.1 (bei 620 nm) eines Erregers in gepufferter Kochsalzlösung außer
für Mycoplasma pneumoniae, das bei einer Konzentration von 5 mg Nasszellgewicht pro µl sowie
für Chlamydia trachomatis, das bei einer Konzentration von 1x108 Elementarkörpern pro µl getestet
wurde. Zusätzlich überprüfte die Studie auch die Interferenz der Mikroorganismen auf den
Nachweis von RSV durch Kombination von 12 µl positiver Kontrolle (Long) mit 300 µl jeder
Suspension. Die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen, dass alle untersuchten Erreger weder eine
Kreuzreaktivität noch eine Interferenz bewirken. Als Nachweis dafür dientedie fehlende positive OD
beim Test mit den Bakterien alleine und das Ausbleiben eines über 50% Rückgangs im Signal der
Bakterien und des RSV im Vergleich zur positiven Kontrolle.
Tabelle 5
Mikroorganismen im Kreuzreaktivitätstest
Mikroorganismen
Stamm
Optische Dichte
Optische Dichte
(organismus alleine)
( organismus+RSV)
0.010
2.108
Streptococcus Gruppe A
12344
Staphylococcus aureus, Cowan
12598
0.014
1.982
9996
0.022
1.984
Staphylococcus epidermis
12228
0.009
1.989
Escherichia coli
25922
0.024
2.002
Candida albicans
14053
0.034
1.997
Mycoplasma pneumoniae
P11428
0.006
1.435
L2
0.013
1.593
-
0.012
1.964
Long
1.512
1.512
Staphylococcus aureus
Chlamydia trachomatis
Negative Kontrolle
(Probenlösungsmittel)
Positive Kontrolle
Studie 2
Die Viren in Tabelle 6 wurden auf ihre Kreuzreaktivität mit dem PATHFINDER™ RSV überprüft. Diese
Studie verlief mit 300 µl Suspensionen und 1 x 105 TCID 50 pro ml im Probenverdünner bei jedem
Virus, ausgenommen Influenzaviren und Herpes Simplex Typ 2. Die Überprüfung von Influenza A
fand mit 1 x 10 8 blättchenbildenden Einheiten pro ml und von Influenza B mit 1 x 10 7
blättchenbildenden Einheiten pro ml statt. HSV Typ 2 wurde mit 6,8 x 107 blättchenbildenden
Einheiten pro ml getestet. Die Studie überprüfte auch die virale Interferenz beim Nachweis von RSV
durch Kombination von 12 µl positiver Kontrolle (Long) mit 300 µl jeder Suspension. PATHFINDER™
RSV ergab keine Kreuzreaktivität oder Interferenz mit diesen Viren. Als Nachweis diente das
Ausbleiben einer positiven Dichte beim Test mit den Viren alleine und die Tatsache, dass es zu
keinem über 50% Rückgang im Signal der Viren und des RSV im Vergleich zur positiven Kontrolle
kommt.
54
Tabelle 6
Viren im Kreuzreaktivitätstest
Optische Dichte
Optische Dichte
(Virus alleine)
(Virus+RSV)
HGP
Thompson
MRH
211
1734
6072
106F
611CV35
0.016
0.006
0.004
0.007
0.014
0.012
0.033
0.005
1.114
1.339
1.270
1.514
1.303
1.367
1.378
1.464
Typ A-9
Typ B-3
Typ B-4
PB Bozek
Nancy
JVB Berschoten
0.008
0.009
0.002
1.636
1.394
1.586
Typ 8
Typ 11
Typ 19
Bryson
Gregory
Burke
0.005
0.006
0.007
1.435
1.517
1.571
C35
Greer
C243
0.017
0.003
0.017
1.692
1.339
1.692
Adenoid6
Rl67
0.011
0.006
1.264
1.447
AD169
0.007
1.583
Maclntyre
MS
0.031
0.003
1.714
1.436
Virus
Virusstamm
Rhinovirus
Typ
Typ
Typ
Typ
Typ
Typ
Typ
Typ
2
6
8
9
15
19
30
59
Coxsackie
Echovirus
Parainfluenza
Typ 1
Typ 2
Typ 3
Adenovirus
Typ 2
Typ 4
Cytomegalovirus
Herpes Simplex
Typ 1
Typ 2
Varicella Zoster
OKA
0.010
1.475
Influenza A
WSN
0.007
1.516
Influenza B
B/Lee/40
0.008
1.554
Negative Kontrolle
(Probenlösungsmittel)
N/A
0.007
1.402
Positive Kontrolle
Long
1.827
1.827
14- LITERATUR
Siehe Englische Version.
55
56
PATHFINDER™ RSV
50 TESTS
79674
DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO (EIA) PER LA DETERMINAZIONE
DIRETTA DELL’ANTIGENE DEL VIRUS RESPIRATORIO SINCIZIALE
UMANO (RSV) IN CAMPIONI DI LAVAGGIO NASALE E ASPIRATO
NASO-FARINGEO
IVD
SOMMARIO
1- SCOPO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
2- SINTESI E SPIEGAZIONE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
3- PRINCIPI DEL METODO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
4- INFORMAZIONI SUL PRODOTTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
5- AVVERTENZE E PRECAUZIONI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60
6- PREPARAZIONE E PRELIEVO DEI CAMPIONI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
7- PROCEDURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
8- CONTROLLO DI QUALITA’ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
9- DETTAGLI DI CALIBRAZIONE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
10- RISULTATI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
11- LIMITI DI PROCEDURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65
12- VALORI ATTESI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65
13- CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI SPECIFICHE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65
14- BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69
58
1- SCOPO
PATHFINDER TM RSV è un dosaggio immunologico enzimatico qualitativo (ELISA) per la
determinazione diretta dell’antigene umano del virus respiratorio sinciziale umano (RSV) in
campioni di lavaggio nasale e aspirato naso-faringeo.
2- SINTESI E SPIEGAZIONE
Il virus respiratorio sinciziale costituisce una delle cause principali di bronchiolite e polmonite nei
neonati e nei bambini. La malattia in fase più grave si manifesta nel primo anno di età (1). Le
epidemie causate da questo virus insorgono quasi tutti gli anni in autunno, in inverno e in primavera
(2,3). Il virus RSV è causa di malattie respiratorie significative negli adulti sani. Tuttavia, la malattia
tende ad essere più mite negli adulti che nei bambini (4).
La diagnosi rapida di infezione da RSV è divenuta sempre più importante in seguito alla scoperta
di una terapia efficace. Essa consente la formulazione di una prognosi, l’avvio di una terapia e
un’azione precoce con lo scopo di tenere sotto controllo la diffusione della malattia. I metodi
tradizionali di coltura cellulare (5,6,7,8) possono richiedere fino a 3 settimane e dipendono
fortemente dalla qualità del trasporto del campione (8,14). I test immunologici offrono vantaggi di
rapidità, semplicità tecnica e costi inferiori, in rapporto alla coltura virale. I metodi
dell'immunofluorescenza (5,6,7,9,10) e i dosaggi immunoenzimatici (EIA) (11,12,13) si sono
rivelati efficaci nella individuazione di RSV.
Il PATHFINDERTM RSV Direct Antigen Detection System utilizza anticorpi policlonali e monoclonali per
la determinazione diretta di RSV nei campioni dei pazienti. Tale saggio coniuga la specificità e la
riproducibilità degli anticorpi monoclonali con la velocità e l’attendibilità del metodo EIA. Risultati di
qualità sono già disponibili entro 90 minuti dall’inizio del dosaggio. Il PATHFINDERTM RSV Direct
Antigen Detection System è capace di individuare RSV non apparente (coltura negativa). Questo test
offre un’alternativa affidabile alla coltura cellulare, soggettiva e di lunga durata, e alle tecniche
fluorescenti estremamente laboriose.
3- PRINCIPI DEL METODO
Gli antigeni RSV presenti nel campione si legano con gli anticorpi policlonali anti-RSV nella
provetta. Gli anticorpi monoclonali coniugati HRP diretti verso RSV si legano all’antigene catturato
nella parete della provetta. La fase di lavaggio rimuove il campione non legato e il coniugato.
L’aggiunta di un substrato di perossidasi nella provetta genera una colorazione bluastra qualora
siano presenti anticorpi coniugati HRP. L’analisi visiva o spettrofotometrica del campione determina
l’assenza o la presenza di RSV.
Un campione che presenti una colorazione blu o un valore di assorbenza superiore o pari al valore
massimo della zona grigia intorno al Cut-Off è positivo all’antigene RSV
Un campione che non presenti una colorazione blu o con un valore di assorbenza inferiore o pari
al valore minimo della zona grigia intorno al Cut-Off è negativo all’antigene RSV.
4- INFORMAZIONI SUL PRODOTTO
Conservare i reagenti del kit ad una temperatura di +2-8°C. Evitare che i reagenti si congelino.
Prima di ogni utilizzo riportare i reagenti a temperatura ambiente (23°C ± 3°C). Dopo l’uso
riportarli immediatamente alla temperatura di +2-8°C. Se conservati attenendosi alle indicazioni,
tutti i reagenti restano stabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta. Non sostituire i
reagenti con quelli di altri produttori o tra Kits di lotti diversi. Non usare i reagenti dopo la data di
scadenza. Tutti i reagenti sono destinati ad uso diagnostico in vitro.
59
Descrizione
R1
R2
Reagenti
RSV antibody Provette per anticorpo : provette in polistirene sensibilizzate
tubes
IgG con anti- RSV di coniglio.
Conjugate
Coniugato : anticorpo monoclonale murino coniugato con
perossidasi di rafano con tampone salino, pH 7.4,
stabilizzatore delle proteine.
Conservante: Thimerosal ≤ 0,01%
Presentazione
1 x 50
provette
1 x 5 ml
Sample diluent Diluente per campione : tampone salino, pH 7.5, con
EDTA, e agente di emersione.
Conservante: thimerosal ≤ 0,01%.
Positive control Controllo positivo : RSV inattivato ( Long) in tampone
salino, pH 7.5, EDTA, e agente tensioattivo. Conservante:
thimerosal ≤ 0,01%.
1 x 25 ml
R5 Substrate Buffer Tampone substrato : tampone citrato, pH 4,2, e perossido
di idrogeno
1 x 40 ml
R3
R4
1 x 3 ml
R6 Chromogen TMB Cromogeno : tetrametilbenzidene dissolto in HCI diluito
1 x 2,5 ml
R7 Assay Treatment Tampone per il trattamento : tampone salino, pH 10,3,
buffer
con EDTA
Conservante: thimerosal ≤ 0,01%.
1 x 2,5 ml
Provette per anticorpo di RSV: Conservare le provette nella busta. Non aprire la busta delle
provette prima che abbia raggiunto la temperatura ambiente (23±3°C). Appena pronte per
l’uso, togliere le provette necessarie per il dosaggio. Ricollocare le provette non utilizzate nella
busta e chiuderla accuratamente.
Una volta aperte, le provette, conservate secondo le indicazioni fornite e in assenza di
contaminazione microbica, restano stabili per 3 mesi.
79482
• PathfinderTM RSV positive control : 1 x 3 ml
NOTA: Non sostituire i reagenti con quelli di altri produttori. Non usare i reagenti dopo la
data di scadenza
Segni fisici o chimici di instabilità
L’aspetto opalescente di qualsiasi reagente liquido può essere indice di contaminazione
microbica.
5- AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1. Per uso diagnostico in vitro.
2. I campioni dei pazienti e il controllo positivo possono essere trattati, di prassi, con il minimo dei
rischi, mettendo in atto la procedura descritta. Tuttavia, si raccomanda di manipolare tali
prodotti come se fossero potenzialmente infetti secondo le precauzioni universali e la buona
pratica di laboratorio, indipendentemente dalla loro origine, trattamento o precedente
certificazione. Usare un disinfettante apposito per la decontaminazione. Conservare e disporre di
tale materiale e dei relativi contenitori conformemente ai regolamenti e procedure locali.
3. I reagenti che contengono materiale biologico di origine animale possono essere, di prassi,
trattati con il minimo rischio. Tuttavia, si raccomanda di maneggiare tali prodotti come se fossero
a rischio biologico potenziale conformemente alle precauzioni universali e alle procedure corrette
da laboratorio.
4. Evitare il contatto tra la pelle e le mucose con il cromogeno e l’acido solforico. In caso di contatto
con la pelle, lavare abbondantemente con acqua. Non ingerire.
60
5. Neutralizzare tutti i liquidi di scarico che contengano acido prima della decontaminazione.
6. Questo kit contiene thimerosal ≤ 0.01% (≤ 0.005% di peso mercuriale per volume). I composti di
mercurio possono essere considerati vettori tossici e inquinanti per l’ambiente da parte di alcuni
governi a certe concentrazioni/quantità. Si prega di maneggiarli con cura e di utilizzarli
conformemente ai regolamenti locali, regionali e nazionali.
6- PREPARAZIONE E PRELIEVO DEI CAMPIONI
Raccogliere almeno 150 µl di lavaggio nasale o aspirato naso-faringeo secondo la procedura
standard di prelievo e trasporto prevista dal proprio laboratorio. I tamponi nasali non sono
considerati sensibili per la determinazione di RSV (5). Evitare l’uso di contenitori di prelievo
contenenti conservanti, ioni metallici, detergenti poiché essi interferiscono con il dosaggio. Non
usare terreni di trasporto contenenti sieri. Se possibile, prelevare le secrezioni nasali durante la fase
acuta della malattia quando è in circolo la maggiore quantità di virus. Man mano che la malattia
progredisce, il virus in circolazione diminuisce e ciò riduce la quantità di virus individuabile. I
campioni prelevati 8 giorni o più dopo la comparsa dei sintomi potrebbero non contenere sufficienti
antigeni per produrre una reazione positiva.
Conservare i campioni fino a 24 ore a +2-8°C e proteggere da evaporazione e contaminazione.
Per conservazione di più lunga durata o trasferimento, congelare i campioni a –70°C o inferiore. Il
congelamento e lo scongelamento ripetuti possono provocare deterioramento del campione. Il
trasporto dei campioni è soggetto alle norme federali sul trasporto di agenti eziologici.
I campioni che contengono livelli di sangue visibilmente alti dovrebbero essere scartati allo scopo
di garantire l’accuratezza dei risultati.
7- PROCEDURA
A) Materiale fornito
R1.
R2.
R3.
R4.
R5.
R6.
R7.
Provette per anticorpo Anti-RSV
Anticorpo monoclonale Anti RSV coniugato HRP
Diluente per campione
Controllo positivo
Tampone substrato
Cromogeno
Tampone per il trattamento
B) Materiale necessario, ma non fornito
1. Acqua distillata o deionizzata per diluire l’acido solforico e lavare le provette.
2. 1N Acido solforico (H2SO4) per arrestare la reazione prima dell’esame spettrofotometrico.
Usare H2SO4 concentrato di grado analitico per rendere acido l’1N. Per preparare 500 ml di
1N H 2SO 4, aggiungere 14 ml di H 2SO 4 concentrato a 486 ml di acqua distillata o
deionizzata. Conservare in un contenitore di vetro ben chiuso a temperatura ambiente
(23 ± 3°C).
3. Porta provette con capacità di alloggio per provette da 12 x 75 mm.
4. Pipette con puntali monouso in grado di dispensare esattamente 100 µl, 300 µl, e 500 µl.
5. Pipette sierologiche monouso, 10 ml.
6. Provette di vetro monouso 12 x 75 mm.
7. Provette di vetro pulite per la preparazione della soluzione substrato operativa (vedi procedura
fase 9).
8. Pellicola plastica.
61
9. Sistema per il lavaggio delle provette inclusivo di dispositivi di risciacquo e aspirazione e
ampolla appropriata e condotto per la cattura del liquido di scarto (vedi Immagine 1).
a) Dispositivi di risciacquo: flacone di lavaggio in plastica,
b) Dispositivi di aspirazione: beccuccio aspiratore e pompa a vuoto.
10. Miscelatore di tipo vortex.
11. Spettrofotometro con lunghezze d’onda variabili all’interno del fascio di luce visibile e con
gamma lineare delle unità di assorbenza compresa tra 0 e 2.0 per la lettura dell’assorbenza a
450 nm.
12. Ipoclorito di sodio ( candeggina) per decontaminazione.
13. Timer capace di contare da 15 a 60 minuti.
IMMAGINE 1
Dispositivo di aspirazione
pompa
a vuoto
pipetta di
aspirazione
catturatore
a vuoto
Note procedurali
1. Prima dell’uso, portare i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (23°C ± 3°C).
2. L’incubazione effettuata a temperature diverse da quelle indicate può dare risultati errati.
3. Quando si aggiungono i reagenti evitare pause o interruzioni. Impedire che le provette si
asciughino una volta iniziato il dosaggio.
4. ATTENZIONE: Non pipettare con la bocca.
5. Pipettare sempre con l’estremità della pipetta vicino al fondo della provetta. Non dispensare i
reagenti sulle pareti della provetta. Non toccare il puntale della pipetta con la soluzione di
reazione.
6. Cambiare il puntale della pipetta ad ogni campione.
7. Gli oggetti riutilizzabili in vetro devono essere lavati e sciacquati abbondantemente senza
detersivi. Usare acqua distillata o deionizzata.
8. Tutti i reagenti sono stati ottimizzati per identificare il virus RVS. La diluizione o adulterazione di
tali reagenti può indurre una perdita di sensibilità.
C) PROCEDURA
Mescolare bene tutti i reagenti prima dell’uso
1. Etichettare una provetta anticorpo per il controllo negativo ed una provetta anticorpo per il
controllo positivo. Etichettare una provetta per ogni campione di un paziente.
NOTA : il controllo positivo e negativo (diluente per campione) devono essere effettuati con
ogni campione.
2. Aggiungere una goccia di tampone per il trattamento ad ogni provetta.
3. Aggiungere 100 µl di anticorpo monoclonale coniugato HRP ad ogni provetta.
4. Aggiungere 300 µl di diluente per campione alla provetta per il controllo negativo; aggiungere
300 µl di controllo positivo alla provetta per il controllo positivo.
62
5. Aggiungere ogni campione del paziente alla provetta adeguatamente etichettata secondo le
seguenti istruzioni:
Se il campione è conservato in mezzo di trasporto SERUM FREE, vortexare bene e dispensare
300 µl nella provetta appropriata. Se il campione non è conservato in mezzo di trasporto, diluire
con volume uguale di Diluente per campioni Pathfinder. Dispensare 300 µl di campione diluito
nella provetta appropriata. Una diluizione del campione superiore a quella raccomandata può
causare una perdita di sensibilità.
6. Agitare delicatamente le provette e incubare a temperatura ambiente (23°C ± 3°C) per
60 ± 10 minuti.
7. Aspirare con cura i campioni dalle provette.
8. Lavare ogni provetta 6 volte con 2 - 4 ml di acqua distillata o deionizzata per lavaggio.
Rimuovere la miscela in eccesso dalle provette dopo il lavaggio finale capovolgendo le provette e
appoggiando il bordo su un fazzoletto di carta o mediante aspirazione Un lavaggio insufficiente
o effettuato con acqua non pura può causare risultati errati.
9. Preparare ll reagente colorante di lavoro .
ATTENZIONE : impedire il contatto tra cromogeno e la soluzione colorante di lavoro con
qualsiasi metallo o agente ossidante.
A) Quantità necessaria di tampone substrato = 0,5 ml di tampone per provetta da dosaggio.
Quantità necessaria di cromogeno = 1 goccia di cromogeno per ml di tampone substrato
Esempio: per 6 provette da dosaggio
• Quantità necessaria di tampone substrato = 3,0 ml;
• Quantità necessaria di cromogeno = 3 gocce.
Aggiungere la quantità necessaria di tampone substrato e la quantità necessaria di cromogeno in
una provetta di vetro.
B) Coprire la provetta con la pellicola plastica e mescolare il contenuto capovolgendo la provetta
diverse volte. Usare la soluzione di substrato entro 30 minuti. Ridurre al minimo l’esposizione alla
luce diretta. La comparsa spontanea di colore bluastro può indicare la contaminazione del
reagente. Il reagente colorante di lavoro deve rimanere privo di colore prima dell’uso.
10. Aggiungere 0.5 ml di reagente colorante di lavoro ad ogni provetta. Mescolare delicatamente le
provette e incubare a temperatura ambiente (23±3°C) per 15 minuti. Non esporre a luce diretta
durante l’incubazione. Evitare di far reagire al colore per più di 15 minuti.
11. Procedere con la lettura visiva o con spettrofotometro per determinare i risultati del test.
Determinazione visiva
Non arrestare la reazione aggiungendo acido.
Alla fine della fase di incubazione, la provetta per il controllo negativo deve essere priva di
colorazione. La provetta per il controllo positivo deve essere blu scuro. I campioni che
presentano una colorazione blu sono positivi all’antigene di RSV. I campioni che non
presentano una colorazione blu sono negativi all’antigene di RSV.
NOTA : I risultati visivi di campioni debolmente positivi dovrebbero essere sottoposti e letti
attraverso il seguente metodo di determinazione spettrofotometrica
Determinazione spettrofotometrica
A) Aggiungere 1 ml di 1N H2SO4 ad ogni provetta nello stesso ordine e approssimativamente con
lo stesso intervallo di tempo impiegato per aggiungere il reagente colorante di lavoro ad ogni
provetta. Miscelare le provette. Rimuovere le bolle d’aria prima della lettura dell’assorbenza.
Dopo l’aggiunta di acido ad ogni provetta, il materiale di reazione finale è estremamente stabile
63
fino a 8 ore se tenuto al buio.
B) Azzerare lo spettrofotometro con acqua distillata o deionizzata a 450 nm.
C) Leggere l’assorbenza del controllo negativo (diluente per campione), controllo positivo, e delle
provette campione a 450 nm. Per distinguere i risultatii positivi da quelli negativi, calcolare il
valore soglia e la zona grigia, come descritto nel paragrafo “Risultati”.
Un valore superiore o pari a 0.06 unità di assorbenza per il controllo negativo (diluente per
campione) indica una possibile contaminazione del reagente o un lavaggio non idoneo.
8- CONTROLLO DI QUALITA
Il controllo positivo e negativo devono essere effettuati per ogni dosaggio.
Controllo negativo (diluente per campione)
Visivo: Il controllo negativo deve essere privo di colorazione.
Spettrofotometrico: Il valore di assorbenza deve essere inferiore a 0,06 unità.
Controllo positivo
Visivo: Il controllo positivo deve essere blu scuro.
Spettrofotometrico: Il valore di assorbenza deve essere superiore a 0,6 unità.
Se i controlli non rispondono come atteso, i risultati non sono validi.
9- DETTAGLI DI CALIBRAZIONE
Solo metodo spettrofotometrico
1. Calcolare il valore soglia aggiungendo il fattore 0.075 al valore del controllo negativo
(diluente per campione).
Esempio:
Valore controllo negativo
0,017
+ 0,075
valore soglia
= 0,092
2. Calcolare la zona grigia. La zona grigia è pari a ± 10% del Valore soglia (o da 0,90
a 1,10 volte il valore soglia).
Esempio:
Valore soglia = 0.092
Zona grigia = 0,083 to 0.101
Valore soglia x (0,90) = (0,092) x (0,90) = 0,083
Valore soglia x (1,10) = (0,092) x (1,10) = 0,101
10- RISULTATI
a) Visivo
I Campioni che presentano colorazione blu sono positivi all’antigene di RSV. I campioni che
non presentano una colorazione blu sono negativi all’antigene di RSV. Il controllo negativo
deve essere privo di colorazione. Il controllo positivo deve essere blu scuro.
b) Spettrofotometrico
I campioni con valori di assorbenza inferiori o pari al valore minimo della zona grigia Cut-Off sono
negativi all’antigene RSV.
Un campione con un valore di assorbenza all’interno della zona grigia è dubbio. Il laboratorio
dovrebbe ripetere il test. Qualora il risultato ripetuto, sia usando lo stesso campione che usando un
nuovo campione, mostri un valore di assorbenza all’interno della zona grigia, i risultati devono
essere considerati come dubbi.
64
I campioni con valori di assorbenza superiori o pari al valore massimo della zona grigia Cut-Off
sono positivi all’antigene RSV.
I campioni fortemente positivii possono formare particelle scure di precipitato nella provetta.
11- LIMITI DI PROCEDURA
1. L’infezione da altri patogeni respiratori può coesistere con l’infezione da RSV. In questo caso,
mettere a punto dei test supplementari parallelamente al dosaggio mediante PATHFINDERTM RSV.
Riferirsi al paragrafo "Caratteristiche di risultati specifici" relativo agli studi sulla reattività crociata
batterica e virale.
2. Il risultato negativo del test non esclude la possibilità di infezione da RSV. Quantità di virus troppo
scarse, campioni raccolti troppo tardi rispetto allo stato infettivo, oppure effettuazione inadeguata
o impropria dell’esame possono dare luogo a falsi negativi.
3. Questo test è in grado di individuare RSV non rilevabile (coltura negativa).
4. I risultati di questo test devono essere interpretati in combinazione con le informazioni disponibili
tratte dalla valutazione clinica del paziente e da altri procedimenti diagnostici.
5. Il presente test produce risultati qualitativi che dovrebbero essere presi in considerazione come
positivi o come negativi per la presenza di RSV.
12- VALORI ATTESI
I valori attesi variano in dipendenza della popolazione di pazienti testata, della posizione
geografica, del periodo dell’anno. L’infezione da virus respiratorio sinciziale può manifestarsi
in individui di tutte le età. La malattia è più comune nei bambini di età compresa tra
6 settimane e 6 mesi, con picchi a 2 mesi (1). La diagnosi clinica più comune presso questi
bambini è di bronchite, bronchiolite e polmonite. L’infezione da RSV è diffusa anche presso gli
adulti ma tende ad essere meno grave che nei bambini. I sintomi possono essere rinorrea,
faringite, tosse, mal di testa, fatica e febbre (4). I pazienti più anziani affetti da infezione da
RSV possono sviluppare la broncopolmonite ad uno stadio grave o addirittura fatale (17).
13- CARATTERISTICHE DI RISULTATI SPECIFICI
Accuratezza
Due laboratori indipendenti hanno testato 241 campioni respiratori prelevati da pazienti di età
compresa tra 0 e 93 anni per la ricerca del virus respiratorio sinciziale attraverso coltura,
immunofluorescenza (IF), PATHFINDERTM RSV, un Kit commerciale RSV EIA . I siti di ricerca erano tutti
ospedali universitari. Tutti i campioni trattati con EIA sono stati valutati visivamente e
spettrofotometricamente.
I campioni utilizzati per lo studio sono stati prelevati in occasione di una esplosione epidemica di
RSV. I campioni sono stati sottoposti a coltura per virus respiratori ed è stato effettuato lo striscio per
la colorazione immunofluorescente. Il campione rimanente è stato congelato a -70°C per essere
analizzato con EIA in data successiva. In uno dei centri, l’immunofluorescenza è stata effettuata
sugli strisci contestualmente al ricevimento dei campioni. Nell’altro centro, gli strisci sono stati
congelati a –70°C e trattati al momento dell’effettuazione dello studio con EIA. I campioni che sono
risultati positivi con EIA e negativi all’esame colturale sono stati confermati con i risultati del metodo
IF oppure mediante dosaggio con bloccante (15,16). Il dosaggio con bloccante è stato effettuato
incubando il campione per 1 ora a temperatura ambiente (23 ± 3°C) con e senza anti-siero
policlonale per RSV. L’anti-siero avrebbe bloccato la reazione di un campione vero positivo. I
campioni sono stati sottoposti a EIA. Un campione è stato considerato bloccato e dunque vero
positivo quando il segnale nella provetta con anticorpo bloccante si è ridotto di almeno il 50% in
confronto alla provetta senza anticorpo bloccante.
65
Un campione è stato considerato vero positivo quando è risultato positivo all’esame colturale oppure
quando ha potuto essere confermato come positivo con altri due metodi: EIA e bloccante o EIA e IF.
Un campione è stato considerato vero negativo qualora negativo all’esame colturale e qualora il
segnale positivo EIA non avrebbe potuto essere confermato né con IF né con bloccante.
Nota: Bassi quantitativi di antigene di rotavirus possono occasionalmente presentare discordanza di
risultato tra l’esame visivo e quello spettrofotometrico. Poiché la spettrofotometria è un metodo
obiettivo, essa è di gran lunga più attendibile della determinazione visiva. (Vedi Tavole 1 e 2).
Tabella 1
Confronto tra PATHFINDERTM RSV ed esame colturale.
SPETTROFOTOMETRICO
CONFERMATO
Positivo
PATHFINDER™ RSV
119
1
Negativo
8
111
VISIVO
CONFERMATO
Positivo
PATHFINDER™ RSV
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
118
4
Negativo
11
108
Spettrofotometrico
Concordanza totale = (VP*+VN)/Numero totale di campioni)= (119 + 111) / 239** = 96,2 %
Sensibilità = VP / (VP + FN) = 119 / (119 + 8) = 93,7 %
Specificità = VN / (VN + FP) = 111 / (111 + 1) = 99,1 %
* VP = vero positivo, VN = vero negativo, FP = falso positivo, FN = falso negativo.
Visivo
Concordanza totale = (VP*+VN)/Numero totale di campioni) = (118 + 108) / 241 = 93,8 %
Sensibilità = TP / (VP + FN) = 118 / (118 + 11) = 91,5 %
Specificità = VN / (VN + FP) = 108 / (108 + 4) = 96,4 %
* VP = vero positivo, VN = vero negativo, FP = falso positivo, FN = falso negativo.
**Due campioni sono risultati irrisolti all’esame spettrofotometrico e non sono stati inclusi in
questi dati.
Tabella 2
Confronto tra PATHFINDERTM RSV e Competitor A’s RSV EIA
SPETTROFOTOMETRICO
COMPETITOR A EIA
Positivo
PATHFINDER™ RSV
66
Negativo
Positivo
117
4
Negativo
10
107
VISIVO
COMPETITOR A EIA
Positivo
PATHFINDER™ RSV
Negativo
Positivo
117
5
Negativo
16
103
Spettrofotometrico
Su 238* campioni testati, il 94,1% presentava concordanza (224/238) tra il metodo
PATHFINDER TM e il Competitor A’s EIA. Dopo aver risolto tutti i risultati discordanti,
PATHFINDERTM RSV ha mostrato una sensibilità del 94,5% e una specificità del 99,1% attraverso
interpretazione spettrofotometrica.
Due campioni sono risultati irrisolti all’esame spettrofotometrico mediante PATHFINDERTM e non sono
stati inclusi in questi dati. Un campione è risultato irrisolto all’esame mediante Competitor A’s e non
è stato incluso in questi dati.
Visivo
Su 241 campioni testati visivamente, il 91,3% presentava concordanza (220/241) tra il metodo
PATHFINDER TM e il Competitor A’s EIA. Dopo aver risolto tutti i risultati discordanti,
PATHFINDERTM RSV ha mostrato una sensibilità del 92,9% e una specificità del 96,5% attraverso
interpretazione visiva.
PRECISIONE
Variabilità Intra-dosaggio
Allo scopo di determinare la riproducibilità intra-dosaggio sono state testate in uno stesso dosaggio
15 ripetizioni di controllo positivo, 15 ripetizioni di una diluizione 1:20 di controllo positivo e
20 ripetizioni di controllo negativo. Per determinare la variabilità intra-dosaggio è stata calcolata la
media delle assorbenze ottiche.
Tabella 3
Media (DO 450 nm)
D.S.
% C.V.
Positivo
1.471
0.045
3.1
Positivo Basso
0.114
0.008
7
Negativo
0.006
0.003
50
Campione
Variabilità Inter-dosaggio:
Allo scopo di determinare la riproducibilità inter-dosaggio, il controllo positivo, una diluizione
1:20 di controllo positivo, e il controllo negativo sono stati testati in 9 diversi dosaggi con
10 ripetizioni per dosaggio di uno stesso lotto di kit. Per determinare la variabilità interdosaggio è stata calcolata la media delle assorbenze ottiche di ogni dosaggio.
Tabella 4
Media (DO 450 nm)
D.S.
% C.V.
Positivo
1.511
0.095
6.3
Positivo Basso
0.118
0.011
9.3
Negativo
0.010
0.009
90
Campione
67
REATTIVITA’ CROCIATA
Studio 1
E’ stato utilizzato PATHFINDERTM RSV EIA per testare organismi che possono causare aspetti
clinici simili oppure che possono presentare una flora respiratoria normale. Il dosaggio è stato
effettuato sostituendo gli organismi sul campione del paziente. Ogni dosaggio è stato
realizzato con una sospensione di 300 µl contenente 0.1 unità di densità ottica (a 620 nm) di
ogni organismo in tampone salino ad eccezione del Mycoplasma pneumoniae, che è stato
esaminato ad una concentrazione di 5 mg di peso cellulare umido per µl, e della Chlamydia
trachomatis, che è stata esaminata ad una concentrazione di 1x108 di corpi elementari per µl.
E’ stata, inoltre, esaminata l’interferenza degli organismi nella determinazione di RSV
combinando 12 µl di controllo positivo (Long) con 300 µl di ogni sospensione. I risultati della
Tavola 5 mostrano che non si è verificata né reattività crociata, né interferenza con tali
organismi. Ciò è dimostrato dall’assenza di assorbenza positiva nel dosaggio relativo ai
batteri da soli e dall’assenza di decadimento del segnale superiore al 50% per l’esame di
batteri e RSV paragonato al controllo positivo.
Tavola 5
Microrganismi testati per la reattività crociata
Microrganismo
Ceppo
Assorbenza
(Organismo da solo)
Assorbenza
(Organismo + RSV)
Streptococcus Gruppo A
12344
0.010
2.108
Staphylococcus aureus, Cowan
12598
0.014
1.982
Staphylococcus aureus
9996
0.022
1.984
Staphylococcus epidermis
12228
0.009
1.989
Escherichia coli
25922
0.024
2.002
Candida albicans
14053
0.034
1.997
Mycoplasma pneumoniae
P11428
0.006
1.435
L2
0.013
1.593
-
0.012
1.964
Lungo
1.512
1.512
Chlamydia trachomatis
Controllo negativo
(diluente campioni)
Controllo positivo
Studio 2
La Tavola 6 elenca i virus testati mediante PATHFINDERTM RSV per la ricerca di reattività crociata. Lo
studio ha utilizzato sospensioni da 300 µl contenenti 1 x 105 TCID 50 per ml in diluente per
campioni per ogni virus ad eccezione dei virus dell’influenza e dell’Herpes Simplex Tipo 2. Il virus
di tipo Influenza A è stato testato a 1 x 108 unità formanti colonie per ml e il virus Influenza B è stato
testato a 1 x 107 unità formanti colonie per ml. Il virus HSV Tipo 2 è stato testato a 6.8 x 107 unità
formanti colonie per ml. E’ stata, inoltre, esaminata l’interferenza virale nella determinazione di RSV
combinando 12 µl di controllo positivo (Long) con 300 µl di ogni sospensione. Non si è verificata
né reattività crociata, né interferenza con tali virus usando il sistema PATHFINDERTM RSV. Ciò è
dimostrato dall’assenza di assorbenza positiva nel dosaggio relativo ai virus da soli e dall’assenza
di decadimento del segnale superiore al 50 per l’esame di virus e RSV paragonato al controllo
positivo.
68
Tabella 6
Virus testati per la reattività crociata
Ceppo Virus
Assorbenza
(Virus da solo)
Assorbenza
(Virus+RSV)
HGP
Thompson
MRH
211
1734
6072
106F
611CV35
0.016
0.006
0.004
0.007
0.014
0.012
0.033
0.005
1.114
1.339
1.270
1.514
1.303
1.367
1.378
1.464
Typo A-9
Typo B-3
Typo B-4
PB Bozek
Nancy
JVB Berschoten
0.008
0.009
0.002
1.636
1.394
1.586
Typo 8
Typo 11
Typo 19
Bryson
Gregory
Burke
0.005
0.006
0.007
1.435
1.517
1.571
C35
Greer
C243
0.017
0.003
0.017
1.692
1.339
1.692
Adenoid6
Rl67
0.011
0.006
1.264
1.447
AD169
0.007
1.583
Maclntyre
MS
0.031
0.003
1.714
1.436
Varicella Zoster
OKA
0.010
1.475
Influenza A
WSN
0.007
1.516
Influenza B
B/Lee/40
0.008
1.554
Controllo negativo
(Diluente campioni)
N/A
0.007
1.402
Controllo positivo
Long
1.827
1.827
Virus
Rhinovirus
Typo
Typo
Typo
Typo
Typo
Typo
Typo
Typo
2
6
8
9
15
19
30
59
Coxsackie
Echovirus
Parainfluenza
Typo 1
Typo 2
Typo 3
Adenovirus
Typo 2
Typo 4
Cytomegalovirus
Herpes Simplex
Typo 1
Typo 2
14- BIBLIOGRAFIA
Vedere la versione Inglese.
69
70
PATHFINDER™ RSV
50 TESTES
79674
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO QUALITATIVO PARA A DETECÇÃO
DIRECTA DO ANTIGÉNIO DO VÍRUS SINCICIAL RESPIRATÓRIO (VSR)
HUMANO EM AMOSTRAS DO LAVADO E DE ASPIRAÇÃO DE
SECREÇÕES NASAIS
IVD
ÍNDICE
1- FIM A QUE SE DESTINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
2- SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
3- PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
4- INFORMAÇÃO SOBRE O PRODUTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
5- AVISOS E PRECAUÇÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74
6- RECOLHA E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75
7- PROCEDIMENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75
8- CONTROLO DE QUALIDADE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78
9- DETALHES DA CALIBRAGEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78
10- RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78
11- LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .79
12- VALORES EXPECTÁVEIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .79
13- CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ESPECÍFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .79
14- BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83
72
1- FIM A QUE SE DESTINA
O Sistema PATHFINDERTM de Detecção Directa de Antigénios do RSV consiste num ensaio
imunoenzimático qualitativo (ELISA) para a detecção directa de antigénios do vírus sincicial
respiratório (VSR) humano em amostras do lavado e de aspiração de secreções nasais.
2- SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
O vírus sincicial respiratório é uma das causas principais de bronquiolite e pneumonia em bébés e
crianças. A forma mais severa da doença ocorre no primeiro ano de vida (1). Epidemias devidas a
este vírus ocorrem quase todos os anos no Outono, Inverno e Primavera (2,3). O VSR causa doença
respiratória significativa em adultos saudáveis. No entanto, a doença nos adultos tende a ser mais
moderada do que nas crianças pequenas (4).
O rápido diagnóstico da infecção pelo VSR tem ganho importância com o advento da terapia
efectiva. Esta permite a formulação de um prognóstico, iniciação de tratamento e uma acção
atempada para controlar a transmissão da doença. Os métodos tradicionais de cultura de células
(5,6,7,8) podem demorar cerca de 3 semanas e são altamente dependentes da qualidade do
transporte da amostra (8, 14). Os testes imunológicos oferecem as vantagens da rapidez,
simplicidade técnica e custos inferiores quando comparados com as culturas virais. Os métodos
imunofluorescentes (5,6,7,9,10) e ensaios imunoenzimáticos (EIA) (11,12,13) têm demonstrado ser
eficazes para a detecção do VSR.
O Sistema PATHFINDERTM de Detecção Directa de Antigénio usa os anticorpos poli e monoclonais
para detectar o VSR directamente em amostras de doentes. Este ensaio combina a especificidade e
a reprodutibilidade de anticorpos monoclonais com a velocidade e eficiência de um EIA. Passados
90 minutos do início do ensaio os resultados qualitativos estão disponíveis. O Sistema
PATHFINDERTM RSV de Detecção Directa de Antigénio pode detectar formas não viáveis do VSR
(cultura negativa). Este teste constitui uma alternativa fiável em comparação com o método de
cultura de células que exige consumo de tempo e as técnicas fluorescentes, subjectivas, que exigem
muita mão de obra.
3- PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
Os antigénios do VSR presentes na amostra ligam-se aos anticorpos anti-VSR policlonais que
revestem o tubo. Os anticorpos monoclonais anti-VSR conjugados com a HRP ligam-se ao
antigénio capturado na parede do tubo. Um passo de lavagem remove a amostra e o
conjugado. A adição de um substrato de peroxidase ao tubo gera uma coloração azul na
presença dos anticorpos conjugados com HRP. A determinação visual ou espectrofotométrica
da amostra indica a presença ou a ausência do VSR.
Uma amostra que apresente a cor azul ou com um valor de absorvância superior ou igual ao
máximo do valor do Ponto-de-Corte da Zona Cinzenta é positiva para o antigénio do VSR.
Uma amostra que não apresente a cor azul ou com um valor de absorvância inferior ou igual
ao mínimo do valor do Ponto-de-Corte da Zona Cinzenta é negativa para o antigénio do VSR.
4- INFORMAÇÃO SOBRE O PRODUTO
Guarde todos os kits de reagentes a uma temperatura entre +2 °C e +8 °C. Evite a congelação dos
reagentes. Coloque os reagentes à temperatura ambiente (23 °C ± 3 °C) antes de cada utilização.
Imediatamente após a utilização volte a colocá-los a uma temperatura entre +2°C e +8 °C. Todos
os reagentes são estáveis até à data de fim de validade indicada no rótulo do reagente, quando
respeitadas as condições recomendadas de armazenamento. Não substitua kits de reagentes de
lotes de diferentes números. Não use reagentes fora do prazo de validade.
Todos os reagentes se destinam a uso em diagnóstico in vitro.
73
Tubos de Anticorpos de VSR: Armazene os tubos no saco selado. Não abra o saco do tubo até que
este atinja a temperatura ambiente (23 ± 3°C). Quando estiver pronto para utilização, retire os
Rotulagem
R1
R2
R3
R4
R5
Reagentes
RSV antibody Tubos de Anticorpos : tubos de poliestireno com
tubes
revestimento IgG de coelho anti-VSR
Conjugate
Conjugado : anticorpos monoclonais de murina
conjugados com peroxidase de rábano em solução salina
tamponada, pH 7,4, estabilizador proteico.
Conservante ≤ 0,01% de Timerosal
Sample diluent Solvente da amostra : Solução tampão salina, pH 7,5,
com EDTA e surfactante
Conservante ≤ 0,01% de Timerosal
Positive control Control positivo : VSR inactivo (Long) em solução salina
tamponada, pH 7,5, EDTA e surfactante
Conservante ≤ 0,01% de Timerosal
Substrate
Tampão do substrato : tampão de citrato, pH 4,2 e
Buffer
peróxido de hidrogénio
R6
Chromogen
TMB
R7
Assay
Treatment
buffer
Apresentação
1 x 50 tubos
1 x 5 ml
1 x 25 ml
1 x 3 ml
1 x 40 ml
Cromogénio :
tetrametilbenzidina dissolvida em HCl diluído.
1 x 2,5 ml
Tampão de Tratamento do Ensaio : solução salina
tamponada, pH 10,3 com EDTA
Conservante ≤ 0,01% de Timerosal
1 x 2,5 ml
tubos necessários para o ensaio. Remeta todos os tubos não utilizados para o saco e feche-o
cuidadosamente.
Uma vez abertos os tubos, se tiverem sido armazenados conforme recomendado e na ausência de
contaminação microbiana, são estáveis durante 3 meses.
• PathfinderTM RSV positive control : 1 x 3 ml
79482
NOTA: Não substitua os reagentes por outros de fabricantes diferentes ou não utilize
reagentes fora do prazo de validade
Indicações Físicas ou Químicas de Instabilidade
Um aspecto turvo em qualquer reagente líquido pode indicar contaminação microbiana.
5- AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Para uso em diagnóstico in vitro.
2. O processamento de rotina das amostras do doente e o controlo positivo pode ter um risco
mínimo associado usando o procedimento descrito. No entanto, deve manusear estes produtos
como produtos potencialmente infecciosos de acordo com as precauções universais e boas
práticas clínicas, independentemente da sua origem, tratamento ou certificação prévia. Use um
desinfectante apropriado para a descontaminação. Guarde e elimine estes materiais e seus
recipientes de acordo com as regras e directrizes locais.
3. Os reagentes que contenham itens biológicos de origem animal podem ser processados com um
risco mínimo associado. No entanto, manuseie estes produtos como potencialmente perigosos de
acordo com as precauções universais e boas práticas de laboratório.
4. Evite o contacto da pele e de membranas mucosas com o Cromogénio e o ácido sulfúrico. Se
ocorrer o contacto com a pele, lave com água. Não ingira.
5. Faça a neutralização de qualquer líquido residual que contenha ácido antes da
74
descontaminação.
6. Este kit contém ≤ 0,01 % de timerosal (≤0,005% de mercúrio em peso por volume). Os
compostos de mercúrio podem ser considerados venenos reprodutíveis e poluentes ambientais
pelas agências governamentais em determinadas concentrações/quantidades. Por favor
manuseie estes produtos de forma apropriada e elimine-os de acordo com as regulamentações
locais, regionais e nacionais.
6- RECOLHA E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS
Recolha um mínimo de 150 µl de amostra de lavado ou de aspiração de secreções nasais
usando o procedimento de rotina para recolha e transporte de amostras do seu laboratório.
As zaragatoas nasais não são consideradas sensíveis para a detecção do VSR (5). Evite usar
recipientes para recolha com conservantes, iões metálicos ou detergentes, os quais interferem
todos com o ensaio. Não use meios de transporte que contenham soros. Se for possível,
obtenha a amostra de secreções nasais durante a fase aguda da doença, quando é maior o
número de vírus contagiantes. À medida que a doença progride, diminui o número de vírus
contagiantes, assim como o número de vírus detectáveis.
Guarde as amostras até um máximo de 24 horas a uma temperatura entre +2 °C e + 8 °C e
proteja-as de evaporação e contaminação. Para um armazenamento por tempo superior ou
envio, deve congelar as amostras a – 70 °C ou a temperatura inferior. A congelação e
descongelação repetidas podem causar a deterioração da amostra. O envio de amostras
deve ser feito em conformidade com as leis federais de transporte para agentes etiológicos.
Amostras que contenham níveis altos visíveis de sangue devem ser evitadas para garantir a
precisão dos resultados.
7- PROCEDIMENTO
A) MATERIAIS FORNECIDOS
R1.
R2.
R3.
R4.
R5.
R6.
R7.
Tubos de Anticorpos anti-VSR
Anticorpos monoclonais anti-VSR conjugados com HRP
Solvente da amostra
Controlo positivo
Tampão do substrato
Cromogénio
Tampão de Tratamento do Ensaio
B) MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Água desionizada ou água destilada para a diluição do ácido sulfúrico e lavagem dos tubos.
2. Ácido sulfúrico H2SO4 1N para fazer parar a reacção antes da análise espectrofotométrica. Use
um reagente de qualidade analítica de H2SO4 concentrado para preparar a solução 1N. Para
preparar 500 ml de H2SO4 1N, junte 14 ml de H2SO4 concentrado a 486 ml de água destilada
ou desionizada. Guarde em recipiente de vidro bem tapado à temperatura ambiente
(23 °C ± 3 °C).
3. Suportes de tubos de teste com capacidade para tubos de 12 x 75 mm.
4. Pipetas com pontas descartáveis para as capacidades de 100 µl, 300 µl e 500 µl.
5. Pipetas serológicas descartáveis de 10 ml.
75
6. Tubos de teste de vidro descartáveis de 12 x 75 mm.
7. Limpe o tubo de vidro para a preparação do solução de desenvolvimento de substrato (ver o
procedimento - passo 9).
8. Película de plástico.
9. Sistema para a lavagem dos tubos que inclui os mecanismos de enxaguamento e de aspiração,
frascos apropriados e tubagens para a recolha do líquido residual (ver o diagrama 1).
a)Aparelho de lavagem: garrafa de lavagem de plástico, b) Aparelho de aspiração:
extremidade de aspiração e bomba de vácuo.
10. Agitador de vórtex.
11. Espectrofotómetro com comprimentos de onda variáveis dentro da gama do visível e uma gama
de linearidade de 0 a 2,0 unidades de absorvância para ler a absorvância a 450 nm.
12. Hipoclorito de sódio (lixívia) para a descontaminação.
13. Temporizador para marcar intervalos de tempo de 15 e 60 minutos.
DIAGRAMA 1
Equipamento de Aspiração
Bomba
de vácuo
Pipeta de
aspiração
Recipiente de
segurança
Comentários ao procedimento
1. Coloque os reagentes e as amostras à temperatura ambiente (23 °C ± 3°C) antes da
utilização.
2. A incubação a outras temperaturas ou intervalos de tempo que não os especificados pode levar
a resultados erróneos.
3. Ao adicionar os reagentes, evite esperas ou interrupções. Não deixe que os tubos sequem (ao
ar) se o ensaio já tiver sido iniciado.
4. CUIDADO: Não pipetar com a boca.
5. Pipete sempre com a ponta da pipeta encostada ao fundo do tubo. Não despeje os reagentes
ao longo da parede do tubo. Não toque com a ponta da pipeta na solução de reacção.
6. Mude as pontas da pipeta entre amostras.
7. A vidraria reutilizável deve ser lavada e abundantemente enxaguada para arrastar detergentes.
Use água desionizada ou destilada.
8. Todos os reagentes foram optimizados para a detecção do VSR. A diluição ou adulteração
destes reagentes pode resultar em perda de sensibilidade.
C) PROCEDIMENTO
Efectue uma boa homogeneização de todos os reagentes antes de os utilizar.
1. Identifique com uma etiqueta um Tubo de Anticorpo para o controlo negativo e outro para
o controlo positivo. Identifique um tubo de anticorpo para cada amostra de cada doente.
NOTA : Um controlo positivo e um controlo negativo (solvente da amostra) devem fazer
parte de cada ensaio.
76
2. Junte 1 gota do Tampão de Tratamento do Ensaio a cada tubo.
3. Junte 100 µl de Anticorpo Monoclonal Conjugado com HRP a cada tubo.
4. Junte 300 µl de Solvente da Amostra ao tubo do controlo negativo; junte 300 µl de Controlo
Positivo ao tubo do controlo positivo.
5. Adicione a amostra de cada doente ao tubo com a etiqueta apropriada seguindo as instruções
seguintes:
Se a amostra é recebida no meio de transporte sem soro, centrifugue intensamente a amostra e
adicione 300 ul no tubo apropriado. Se a amostra não se apresenta num meio de transporte,
dilua com um volume igual do Diluente de Amostra PATHFINDERTM. Adicione 300 ul da amostra
diluida ao tubo apropriado.
Uma maior diluição da amostra para além do recomendado pode resultar em perda de
sensibilidade.
6. Agite os tubos suavemente e coloque-os em incubação à temperatura ambiente (23 °C ± 3 °C)
durante 60 minutos ± 10 minutos.
7. Aspire cuidadosamente as amostras dos tubos.
8. Lave cada tubo 6 vezes com 2 ml a 4 ml de água desionizada ou destilada, em cada lavagem.
Remova o excesso de humidade dos tubos após a lavagem final, invertendo-os e secando a
borda com uma toalha de papel ou através de aspiração dos tubos. Uma lavagem inadequada
ou uma lavagem com água impura podem originar resultados erróneos.
9. Prepare o reagente de desenvolvimento de cor.
CUIDADO: Não permita o contacto entre o Cromogénio ou o reagente de desenvolvimento da cor
e qualquer metal ou agente oxidante.
A) Quantidade necessária de Tampão de Substrato = 0,5 ml de Tampão por tubo de ensaio.
Quantidade necessária de Cromogénio = 1 gota de Cromogénio por ml de Tampão de
Substrato.
Exemplo: Para 6 tubos de ensaio,
• A quantidade necessária de Tampão de Substrato = 3,0 ml ;
• A quantidade necessária de Cromogénio = 3 gotas.
Junte a quantidade necessária de Tampão de Substrato e Cromogénio a um tubo limpo de vidro
ou de plástico.
B) Tape o tubo com película de plástico e faça a homogeneização do conteúdo invertendo o
tubo várias vezes. Use a solução do substrato dentro de 30 minutos. Minimize a exposição à luz.
A geração espontânea de uma cor azul pode ser indicativa de contaminação de reagente. O
reagente de desenvolvimento de cor deve manter-se incolor antes da utilização.
10. Junte 0,5 ml do reagente de desenvolvimento de cor a cada tubo. Agite os tubos suavemente e
coloque-os em incubação (23 ± 3°C) durante 15 minutos, minimizando a exposição a luz forte.
Não deixe que a reacção de formação de cor exceda 15 minutos.
11. Faça a leitura dos tubos visualmente ou por espectrofotometria para determinar os resultados do
teste.
Determinação visual
Não pare a reacção através da adição de ácido.
No fim do período de incubação, o tubo do controlo negativo deve estar incolor. O controlo
positivo deve apresentar a coloração azul escura. As amostras com coloração azul são
positivas para o antigénio do VSR. As amostras sem coloração azul são negativas para o
antigénio do VSR.
77
Nota: Os resultados visuais de amostras fracamente positivas devem ser processados e lidos pelo
método seguinte de Determinação Espectrofotométrica.
Determinação Espectrofotométrica
A) Junte 1 ml de H2SO4 1N a cada tubo pela mesma ordem e aproximadamente no mesmo
intervalo de tempo em que é adicionado o reagente de desenvolvimento de cor a cada tubo.
Agite os tubos no agitador de vórtex. Retire as bolhas de ar antes de ler a absorvância. Após a
adição de ácido a cada tubo, o material da reacção final é muito estável durante cerca de
8 horas, se for protegido da luz.
B) Use água desionizada ou água destilada como branco do espectrofotómetro, a 450 nm.
C) Leia a absorvância a 450 nm do controlo negativo (solvente da amostra), controlo positivo e
tubos de amostra. Para fazer a distinção entre amostras positivas e negativas, calcule o valor do
Ponto-de-corte e a Zona Cinzenta, tal como está descrito na secção de “Resultados”.
Um valor superior ou igual a 0,06 unidades de absorvância para o controlo negativo (solvente
da amostra) indica uma possível contaminação de reagente ou uma lavagem inadequada.
8- CONTROLO DE QUALIDADE
Um controlo positivo e negativo devem fazer parte de cada ensaio.
Controlo Negativo (Solvente da Amostra)
Visual : O Controlo Negativo deve ser incolor.
Espectrofotometria : O valor da absorvância deve ser inferior a 0,06 unidades.
Controlo Positivo
Visual : O Controlo Positivo deve apresentar a coloração azul escura.
Espectrofotometria : O valor da absorvância deve ser superior a 0,6 unidades.
Se os controlos não reagirem da maneira esperada, os resultados não são válidos.
9- DETALHES DA CALIBRAGEM
Apenas Método Espectrofotométrico
1. Calcule o valor do Ponto-de-corte através da adição do factor 0,075 ao valor da unidade de
absorvância do controlo negativo (solvente da amostra).
Exemplo:
Valor do controlo negativo
0,017
+ 0,075
Valor do Ponto-de-corte
= 0,092
2. Calcule a Zona Cinzenta. A Zona Cinzenta é igual a ± 10 % do valor do Ponto-de-corte
(ou 0,90 a 1,10 vezes o valor do Ponto-de-corte).
Exemplo: Valor do Ponto-de-corte = 0,092
Zona Cinzenta = 0,083 a 0,101
Valor do Ponto-de-corte x (0,90) = (0,092) x (0,90) = 0,083
Valor do Ponto-de-corte x (1,10) = (0,092) x (1,10) = 0,101
10- RESULTADOS
a) Visual
As amostras com coloração azul são positivas para o antigénio do VSR. As amostras sem
coloração azul são negativas para o antigénio do VSR. O controlo negativo deve ser incolor.
O controlo positivo deve apresentar a coloração azul escura.
78
b) Espectrofotometria
As amostras com valores de absorvância inferiores ou iguais ao valor mínimo do Ponto-de-corte da
Zona Cinzenta são negativas para o antigénio do VSR.
Uma amostra com um valor de absorvância dentro da Zona Cinzenta é questionável. O laboratório
deve repetir o teste. Se o resultado repetido, usando quer a mesma amostra quer uma nova
amostra, apresentar um valor de absorvância dentro da Zona Cinzenta, os resultados devem ser
reportados como não determinantes.
As amostras com valores de absorvância superiores ou iguais ao valor máximo do Ponto-de-corte
da Zona Cinzenta são positivas para o antigénio do VSR.
As amostras fortemente positivas podem dar origem à formação de precipitados negros no tubo.
11- LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
1. A infecção por outros patogenes respiratórios pode estar presente simultaneamente com a
infecção por VSR, portanto, podem ser indicados testes adicionais em paralelo com o teste
PATHFINDERTM RSV. Consulte a secção «Características Específicas de Desempenho» para os
estudos de reactividade cruzada bacteriana e viral.
2. Um resultado de teste negativo não significa que está excluída a possibilidade de infecção por
VSR. Pequenas quantidades de vírus, a obtenção tardia da amostra na infecção ou técnicas
inadequadas ou impróprias de amostragem podem originar um resultado falsamente negativo.
3. Este teste permite detectar formas não viáveis do VSR (cultura negativa).
4. Os resultados deste teste devem ser interpretados conjuntamente com a informação disponível da
avaliação clínica do doente e de outros procedimentos de diagnóstico.
5. Os resultados deste teste são qualitativos e devem ser considerados quer positivos quer negativos
para o VSR.
12- VALORES EXPECTÁVEIS
Os valores expectáveis podem variar em função da população de doentes estudada,
localização geográfica e altura do ano. A infecção pelo vírus sincicial respiratório pode
ocorrer em todos os grupos etários. A doença é mais comum em crianças pequenas de
6 meses a 6 anos de idade, com um pico aos 2 meses (1). O diagnóstico clínico mais comum
nestas crianças inclui a bronquite, bronquiolite e pneumonia. A infecção pelo VSR é comum
em adultos, mas tende a ser menos grave do que em crianças. Os sintomas podem incluir a
rinorreia, faringite, tosse, dor de cabeça, fatiga e febre (4). Os doentes idosos com infecção
por VSR podem contrair broncopneumonia, que pode ser grave ou fatal (17).
13- CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ESPECÍFICAS
Precisão
Dois investigadores independentes pesquisaram a presença do vírus sincicial respiratório em
241 amostras respiratórias de doentes com idades desde recém-nascido até aos 93 anos, por
cultura, imunofluorescência (IF), PATHFINDER TM RSV e Competitor A’s RSV EIA. Os locais
independentes escolhidos para o estudo foram hospitais universitários de Este e de Oeste. Todas as
amostras analisadas por EIA foram avaliadas visualmente e espectrofotometricamente.
As amostras foram recolhidas para este estudo durante um surto epidémico de VSR. As amostras
foram sujeitas a cultura celular para vírus respiratórios, tendo sido feitos esfregaços para a
coloração imunofluorescente. As amostras sobrantes foram congeladas a –70 °C para avaliação
posterior por EIA. Num dos centros, foi efectuada a imunofluorescência nos esfregaços no momento
em que a amostra foi recebida. No outro, os esfregaços foram congelados a –70 °C e foram
corados no momento do estudo do EIA. As amostras positivas pelo EIA e negativas pelo meio de
79
cultura foram confirmadas pelos resultados de IF ou pelo ensaio de bloqueio (15, 16). O ensaio de
bloqueio foi efectuado pela incubação da amostra durante 1 hora à temperatura ambiente
(23 ± 3 °C) com e sem antisoro policlonal para o VSR. O antisoro serve para inibir a reacção de
uma amostra verdadeira positiva. O EIA foi então efectuado nestas amostras. Uma amostra é
considerada bloqueada e consequentemente verdadeira positiva, se o sinal no tubo com o
anticorpo de bloqueio diminui pelo menos 50 % quando comparado com o tubo sem o anticorpo
de bloqueio.
Uma amostra é considerada verdadeira positiva se é positiva por cultura celular ou pode ser
confirmada como positiva por outros dois métodos: EIA e bloqueio ou EIA e IF. Uma amostra é
considerada negativa verdadeira se é negativa por cultura celular e o sinal positivo a EIA não pode
ser confirmado quer por IF ou bloqueio.
Nota: Pequenas quantidades de antigénio do VSR dão ocasionalmente origem a discrepância entre
os resultados visuais e espectrofotométricos. Uma vez que a espectrofotometria é um método
objectivo, torna-se ligeiramente mais preciso do que uma determinação visual. (ver as Tabelas
1 e 2).
Tabela 1
Comparação entre o método PATHFINDERTM RSV EIA e o método de Cultura Celular
ESPECTROFOTOMÉTRICO
CONFIRMADO
Positiva
PATHFINDER™ RSV
119
1
Negativa
8
111
VISUAL
CONFIRMADO
Positiva
PATHFINDER™ RSV
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
118
4
Negativa
11
108
Espectrofotometria
Concordância = (VP* + VN) / Número total de amostras = (119 + 111) / 239** = 96,2 %
Sensibilidade = VP / (VP + FN) = 119 / (119 + 8) = 93,7 %
Especificidade = VN / (VN + FP) = 111 / (111 + 1) = 99,1 %
*VP = verdadeiramente positivo, VN = verdadeiramente negativo, FP = falsamente positivo,
FN = falsamente negativo.
Visual
Concordância = (VP* + VN) / Número total de amostras = (118 + 108 ) / 241 = 93,8 %
Sensibilidade = VP / (VP + FN) = 118 / (118 + 11) = 91,5 %
Especificidade = VN / (VN + FP) = 108 / (108 + 4) = 96,4 %
*VP = verdadeiramente positivo, VN = verdadeiramente negativo, FP = falsamente positivo,
FN = falsamente negativo.
**Duas amostras foram consideradas não determinantes por avaliação espectrofotometria e
não foram incluídas nestes dados.
80
Tabela 2
Comparação entre o método PATHFINDERTM RSV EIA e o método Competitor A’s RSV EIA
ESPECTROFOTOMÉTRICO
COMPETITOR A EIA
Positiva
PATHFINDER™ RSV
Negativa
Positiva
117
4
Negativa
10
107
VISUAL
COMPETITOR A EIA
Positiva
PATHFINDER™ RSV
Negativa
Positiva
117
5
Negativa
16
103
Espectrofotometria
Das 238 amostras testadas, foi observada 94,1 % de concordância (224/238) entre os métodos
PATHFINDERTM e Competitor A’s EIA. Todos os resultados discrepantes foram ultrapassados, o
método PATHFINDERTM RSV demonstrou uma sensibilidade de 94,5 % e uma especificidade de
99,1 % por interpretação espectrofotométrica.
* Três amostras foram consideradas não determinantes por avaliação espectrofotométrica
PATHFINDERTM e não estão incluídas nestes dados. Uma amostra foi considerada não determinante
por avaliação Competitor A’s e não faz parte destes dados.
Visual
Das 241 amostras testadas visualmente, foi observada 91,3% (220/241) de concordância entre os
métodos PATHFINDER TM e Competitor A’s EIA. Todos os resultados discrepantes foram
ultrapassados, o método PATHFINDERTM RSV demonstrou uma sensibilidade de 92,9% e uma
especificidade de 96,5% por interpretação visual.
PRECISÃO
Variabilidade Intra-Ensaio
Foram testadas 15 réplicas do controlo positivo, 15 réplicas de uma diluição a 1:20 do controlo
positivo e 20 réplicas do controlo negativo, num ensaio, para determinar a reprodutibilidade intraensaio. A média das absorvâncias ópticas foi calculada para determinar a variabilidade intraensaio.
Tabela 3
Amostra
Média (DO 450 nm)
DP
% C.V.
Positiva
1.471
0.045
3.1
Fracamente Positiva
0.114
0.008
7
Negativa
0.006
0.003
50
Variabilidade Inter-Ensaios:
Foi feita a análise do controlo positivo, de uma diluição de 1:20 do controlo positivo e do controlo
negativo em 9 ensaios diferentes com 10 réplicas por ensaio, de um lote de kit, para determinar a
reprodutibilidade inter-ensaios. A média das absorvâncias ópticas de cada ensaio foi calculada
para determinar a variabilidade inter-ensaios.
81
Tabela 4
Amostra
Média (DO 450 nm)
DP
% C.V.
Positiva
1.511
0.095
6.3
Fracamente Positiva
0.118
0.011
9.3
Negativa
0.010
0.009
90
REACTIVIDADE CRUZADA
Estudo 1
O método PATHFINDERTM RSV foi testado com organismos que podem causar quadros clínicos
similares ou que podem fazer parte da flora normal respiratória. O ensaio foi efectuado tal como
indicado no folheto da embalagem, substituindo os organismos pela amostra do doente. Cada
ensaio foi desenvolvido com suspensões de 300 µl contendo 0,1 unidades de densidade óptica (a
620 nm) de cada organismo, em solução salina tamponada, excepto Mycoplasma pneumoniae,
que foi testado à concentração de 5 mg peso húmido por µl, e Chlamydia trachomatis, que foi
testado à concentração de 1x108 de corpos elementares por µl. Adicionalmente, foi também feita
uma verificação da interferência na detecção do VSR pela combinação de 12 µL do Controlo
Positivo (Long) com 300 µl de cada suspensão. Os resultados na Tabela 5 não evidenciaram
ocorrência de reactividade cruzada ou de interferência com os organismos. Isto está evidenciado
pela não existência de absorvância positiva no ensaio com a bactéria sozinha e pela ausência de
mais do que 50 % de decréscimo no sinal, pela bactéria e VSR comparativamente ao Controlo
Positivo.
Tabela 5
Microorganismos testados em função de Reactividade Cruzada
Microorganismos
Estirpe
Absorvância
(organismo sozinho)
Absorvância
(organismo + VSR)
Streptococcus Grupo A
12344
0.010
2.108
Staphylococcus aureus, Cowan
12598
0.014
1.982
Staphylococcus aureus
9996
0.022
1.984
Staphylococcus epidermis
12228
0.009
1.989
Escherichia coli
25922
0.024
2.002
Candida albicans
14053
0.034
1.997
Mycoplasma pneumoniae
P11428
0.006
1.435
Chlamydia trachomatis
L2
0.013
1.593
Controlo Negativo
(Solvente da amostra)
-
0.012
1.964
Long
1.512
1.512
Controlo positivo
Estudo 2
Os vírus listados na Tabela 6 foram testados em função da reactividade cruzada pelo método
PATHFINDERTM RSV. Neste estudo foram usadas 300 µl de suspensões contendo 1 x 105 TCID
50 por ml de Solvente da Amostra, para cada um dos vírus, excepto os vírus influenza e Herpes
Simplex Tipo 2. O vírus Influenza A foi testado a 1 x 108 unidades de formação de placas por ml e
Influenza B a 1 x 107 unidades de formação de placas por ml. O vírus HSV Tipo 2 foi testado
82
a 6,8 x 107 unidades de formação de placas por ml. Foi também avaliada a interferência viral na
detecção do VSR pela combinação de 12 µl de Controlo Positivo (Long) com 300 µl de cada
suspensão. Não ocorreu reactividade cruzada ou interferência no ensaio PATHFINDERTM RSV com
estes vírus. Isto está evidenciado pela não existência de absorvância positiva no ensaio com os
vírus e pela ausência de mais do que 50 % de decréscimo no sinal, pelos vírus e VSR
comparativamente ao Controlo Positivo.
Tabela 6
Vírus testados em função de Reactividade Cruzada
Estirpe de vírus
Absorvância
(Vírus sozinho)
Absorvância
(Vírus + VSR)
HGP
Thompson
MRH
211
1734
6072
106F
611CV35
0.016
0.006
0.004
0.007
0.014
0.012
0.033
0.005
1.114
1.339
1.270
1.514
1.303
1.367
1.378
1.464
Tipo A-9
Tipo B-3
Tipo B-4
PB Bozek
Nancy
JVB Berschoten
0.008
0.009
0.002
1.636
1.394
1.586
Tipo 8
Tipo 11
Tipo 19
Bryson
Gregory
Burke
0.005
0.006
0.007
1.435
1.517
1.571
C35
Greer
C243
0.017
0.003
0.017
1.692
1.339
1.692
Adenoid6
Rl67
0.011
0.006
1.264
1.447
AD169
0.007
1.583
Maclntyre
MS
0.031
0.003
1.714
1.436
Varicella Zoster
OKA
0.010
1.475
Influenza A
WSN
0.007
1.516
Influenza B
B/Lee/40
0.008
1.554
Controlo Negativo
(Solvente da amostra)
N/A
0.007
1.402
Controlo positivo
Long
1.827
1.827
Virus
Rhinovirus
Tipo
Tipo
Tipo
Tipo
Tipo
Tipo
Tipo
Tipo
2
6
8
9
15
19
30
59
Coxsackie
Echovirus
Parainfluenza
Tipo 1
Tipo 2
Tipo 3
Adenovirus
Tipo 2
Tipo 4
Cytomegalovirus
Herpes Simplex
Tipo 1
Tipo 2
14- BIBLIOGRAFIA
Veja a versão Inglesa.
83
-
IVD
CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro)
Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)
EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)
Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)
Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro)
CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)
CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)
- For in vitro diagnostic use
- Pour diagnostic in vitro
- Para diagnóstico in vitro
- In vitro-Diagnostikum
- Per uso diagnostico in vitro
- Para uso em diagnóstico in vitro
- In vitro diagnostik
- In vitro diagnose
- Manufacturer
- Fabricant
- Fabricante
- Hersteller
- Produttore
- Fabricante
- Tillverkad av
- Fremstillet af
LOT
84
REF
EC REP
- Catalogue number
- Référence catalogue
- Número de catálogo
- Bestellnummer
- Numero di catalogo
- Número de catálogo
- Katalognummer
- Katalognummer
- Authorised Representative
- Représentant agréé
- Representante autorizado
- Bevollmächtigter
- Distributore autorizzato
- Representante Autorizado
- Auktoriserad representant
- Autoriseret repræsentant
- Batch code
- Code du lot
- Código de lote
- Chargen-Bezeichnung
- Codice del lotto
- Código do lote
- Batch nr.
- Batchkoden
- Expiry date YYYY/MM/DD
- Date de peremption AAAA/MM/JJ
- Estable hasta AAAA/MM/DD
- Verwendbar bis JJJJ/MM/TT
- Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG
- Data de expiração AAAA/MM/DD
- Utgångsdatum År/Månad/Dag
- Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD
- Storage temperature limitation
- Limites de températures de stockage
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- Lagerungstemperatur
- Limiti di temperatura di conservazione
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- Consulter le mode d'emploi
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85
86
87
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09/2004
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