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UNIVERSITE VICTOR SEGALEN BORDEAUX 2
Année 2005
THÈSE
Thèse nº 1208
Pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2
Mention : Sciences Biologiques et Médicales
Option : Œnologie et Ampélologie
Présentée et soutenue publiquement le 21 juillet 2005
par
Giuliano ELIAS PEREIRA
Né le 17 novembre 1971 à Lavras-MG-Brésil
Ingénieur Agronome
CONTRIBUTION DE LA CHIMIOMETRIE A LA CARACTERISATION DES FRUITS :
APPLICATION DES PROFILS METABOLIQUES DU RAISIN A L’ETUDE DES EFFETS
DU CLIMAT, DU SOL ET DU CEPAGE
Membres du Jury
M. Denis DUBOURDIEU,
Professeur Université Bordeaux 2
Président
Mme. Marianne DEFERNEZ,
Chercheur Institute of Food Research, Norwich, UK
Rapporteur
Mme. Véronique CHEYNIER,
DR UMR Sciences pour l’Œnologie, INRA Montpellier
Rapporteur
M. Cornelis VAN LEEUWEN,
Professeur ENITA Bordeaux
Membre invité
M. Jean-Pierre GAUDILLÈRE,
DR UMR-Œnologie-Ampélologie, INRA
Directeur de Thèse
M. Dominique ROLIN,
Professeur Université Bordeaux 2
Co-Directeur de Thèse
Je dédie ce travail
A Milene, mon épouse,
pour ton amour, ton aide et tes encouragements pendant toute la durée des travaux !
A ma mère Surama et à mon frère Adriano,
que même de loin, vous étiez toujours prêt de moi. Merci de votre soutien !
A mon père Helio, ma grand-mère Lourdes et à mon grand-père Sebastião,
même là où vous êtes, je vous ai toujours dans mon cœur, éternellement !!
Merci mon DIEU !
2
Je tiens à remercier en premier lieu Monsieur Jean-Pierre GAUDILLERE, Directeur
de Recherches de l’UMR Œnologie-Ampélologie, équipe Ecophysiologie et Agronomie Viticole
de l’INRA de Bordeaux, qui a bien voulu m’accueillir dans ses laboratoires pour la réalisation du
DEA puis de la thèse, en me proposant le sujet que j’ai trouvé de très grand intérêt. Ma profonde
gratitude à tout son soutien amical et la direction des recherches avec une attention et une
disponibilité dont je suis très reconnaissant. Merci infiniment pour toutes les informations passées,
avec sa grande expérience dans le domaine vitivinicole, et toute aide pour la finition du travail et
pendant tout mon séjour en France.
Je remercie également Monsieur le Professeur Denis DUBOURDIEU, qui a très gentiment
accepté de participer et pour l’honneur qu’il me fait en présidant le jury de cette thèse. Merci aussi
pour toutes les informations passées lors de la réalisation de mon Diplôme Universitaire d’Aptitude
à la Dégustation des Vins (DUAD), à la Faculté d’Œnologie de Bordeaux.
Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Dominique ROLIN, qui m’a aussi accueilli
dans son laboratoire d’analyses par RMN, et m’a co-encadré avec une grande attention pendant les
4 ans. Je le remercie vivement pour ses conseils, pour son soutien amical, pour toutes les
informations, ses critiques toujours très constructives, son aide précieuse lors de la finition des
travaux, sa détermination et disposition. Je lui suis très reconnaissant pour son dévouement, sa
gentillesse et son charisme.
J’exprime toute ma reconnaissance à Madame Marianne DEFERNEZ (Chercheur à
l’Institute of Food Research, à Norwich, Royaume-Uni) et à Madame Véronique CHEYNIER
(Directeur de Recherches à l’INRA de Montpellier) pour l’intérêt qu’elles ont bien voulu porter en
acceptant de juger ce travail comme rapporteurs. Ma profonde gratitude à tous les conseils et à
toutes les informations discutées.
Je remercie très vivement aussi Monsieur Kees Van LEEUWEN, Professeur à l’ENITA de
Bordeaux, de m’avoir aidé pendant toute la réalisation de ce travail de thèse. Je lui remercie de
nous mettre à disposition tout son réseau de parcelles viticoles. Je le suis reconnaissant de ses
conseils, de son amitié, de ses enseignements dans le sujet de thèse et dans le domaine de
l’œnologie, avec ses cours de dégustation à la Faculté d’Œnologie pour que je puisse avoir le
DUAD. Je le remercie de sa grande expérience et de son attention.
3
Je remercie Monsieur Olivier LAVIALLE, qui nous a beaucoup aidé sur le traitement
statistique par les analyses multivariées. Il nous a permis de valider nos analyses et d’interpréter les
résultats statistiques.
Je remercie très sincèrement Nathalie OLLAT, qui m’a accueilli dans ses laboratoires lors
de mon séjour en France en 2000, ce qui m’a permis de prendre contact avec Jean-Pierre
GAUDILLERE et de m’aider à écrire le projet de thèse. Je la remercie de son amitié, ses
compétences, sa patience pour m’apprendre le français et de sa volonté, toujours disponible.
Je remercie aussi Ghislaine HILBERT, Annick MOING, Catherine DEBORDE et Mickaël
MAUCOURT, qui m’ont beaucoup aidé pendant toute la réalisation de la thèse. Merci pour les
conseils, les informations passées, les suggestions, la mise au point des méthodes analytiques
(RMN et CLHP). Je leur suis très reconnaissant de tout le travail réalisé et toutes les suggestions à
mon égard.
J’adresse aussi mes sincères remerciements à toutes les personnes de l’équipe
Ecophysiologie
et
Agronomie
Viticole,
en particulier Claude BONNET, Jean-Pascal
GOUTOULY, Jean-Pierre SOYER, Philippe PIERI, Philipe VIVIN, Roland CHIGNON, Sylvie
MILIN et Thierry ROBERT, pour leur aide lors de la réalisation des échantillonnages sur le terrain,
des analyses au laboratoire et de leur soutien amical. Merci à Monique GAUDILLERE (IBVM),
pour son aide précieuse lors des analyses et pour son amitié.
Merci à Paulo LOPES, de son amitié, des moments magnifiques et agréables que nous
avons passés ensemble, pendant les 4 ans en France. Merci à Benjamin BOIS et à Monsieur
Georges FROIDEFOND (Agroclimat, Santé Végétale), votre soutien et votre aide lors du
traitement des données climatiques et Mademoiselle Katharina ZOTT, de son soutien. Merci à
toutes celles et tous ceux qui, directement et indirectement, m’ont aidé à la réalisation et à la
conclusion de ce travail.
Enfin, merci au Conseil National pour le Développement Scientifique et Technologique
(CNPq), lié au Ministère des Sciences et Technologies du Brésil, pour l’accord de la bourse
d’études, qui m’a permis de venir en France et de mener tous les travaux de recherches.
Merci beaucoup !
4
LISTE DES ABREVIATIONS
CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ET MATERIEL ET METHODES
I.1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1.1. La qualité du raisin et du vin …………………………………………………….. . 1
I.1.2. Les facteurs influençant la qualité œnologique du raisin et du vin ………… .…. 7
I.1.2.1. La qualité des vins…………………………………..………… …..…. 7
I.1.2.2. Les facteurs déterminant la qualité des raisins……..……… …….... 8
I.1.3. Terroir : Définition et composantes……………… …………………… .….… 9
I.1.3.1. Le climat et son influence sur la qualité de baies de raisins………….… …. 9
I.1.3.2. Les sols viticoles et leurs effets sur les constituants du raisin……….… .….11
I.1.3.2.1. Alimentation hydrique de la vigne et qualité œnologique des baies de
raisins……………………………………………………………………………….….13
I.1.3.2.2. La nutrition azotée de la vigne et la composition biochimique de baies de
raisins……………………………………………………………………………….… 14
I.1.3.3. Les pratiques culturales en rapport avec la qualité des raisins….……….. 15
I.1.3.4. Les cépages des vignobles Bordelais………………………………….….…..16
I.1.4. Les outils analytiques utilisés pour l’étude de la qualité du raisin……….….…. 17
I.1.5. Les outils analytiques utilisés pour l’étude des profils métaboliques……….…. 17
I.1.5.1. La méthode d’analyses par RMN. Caractéristiques……………………..…19
I.1.5.2. Principes de la détection par RMN………………………………………..... 20
I.1.5.3. Avantages et désavantages de la méthode d’analyses par RMN 1H…….... 22
I.1.5.4. Applications de la méthode analytique par RMN 1H……………………... 23
I.1.6. Les outils statistiques appliqués à l’analyse des données………………….…… 24
I.1.7. Les objectifs de la thèse ……………………………………………………………32
I.2 MATERIEL ET METHODES
I.2.1. L’origine des échantillons étudiés…………………………………..……….…… 28
I.2.1.1. Les parcelles utilisées dans l’étude………………………….………….….. 28
I.2.1.1.1. Echantillons de l’appellation Bordeaux générique………………...….... 28
I.2.1.1.2. Echantillons de l’appellation Saint-Emilion…………….…………….………..…28
I.2.1.1.3. Echantillons de l’appellation Buzet…………..…………………….….…. 29
I.2.1.1.4. Echantillons de l’appellation Pomerol……..……………………….….… 30
I.2.1.1.5. Echantillons de l’appellation Médoc……………………………...…….... 31
I.2.1.1.6. Echantillons de l’appellation Pessac-Léognan…………………….….…. 31
I.2.1.1.7. Echantillons de l’appellation Graves……………….……………...…. ..... 31
I.2.2. Les caractéristiques climatiques des trois millésimes étudiés……….….…..…... 34
5
I.2.3. La récolte des baies de raisins…………………………………………….…..….. 36
I.2.4. Séparation de la pellicule et de la pulpe…………………………………..….….. 36
I.2.5. Extraction des composés solubles du raisin en solution alcoolique…….…….... 37
I.2.5.1. Pulpes et pépins………....……………………………………………..…..... 37
I.2.5.2. Pellicules……………………………………………………………….…..... 37
I.2.6. Détermination du régime hydrique des sols par la discrimination isotopique du
13
C/12C …………………………………………………………………………..……….. 38
I.2.7. Acquisition de profils métaboliques de baies de raisins par RMN 1H : mise au point
de la méthode………………………………………………………...…….……… 39
I.2.7.1 Paramètres d’acquisition des spectres RMN 1H..…………………...……... 39
I.2.7.2. Préparation des extraits pour l’analyse par RMN 1H………….…..……... 40
I.2.7.3. L’identification des résonances dans les spectres RMN 1H……….……… 42
I.2.8. L’analyse des composés du raisin par CLHP………...………………..…….....….... 47
I.2.8.1. Détermination des acides aminés par la méthode CLHP…………...……. 47
I.2.8.2. Détermination des composés phénoliques par la méthode CLHP....…….. 50
CHAPITRE II : DETERMINATION D’EMPREINTES METABOLIQUES DE BAIES DE
RAISINS ISSUES DE DIFFERENTES PARCELLES A BORDEAUX PAR LA METHODE
RMN 1H
1
H NMR Metabolic Fingerprints of Grape Berries Produced in Different Plots in Bordeaux-
France (Acta Horticulturae 2005, sous presse) ……………………..….….….. 58
CHAPITRE III : RMN 1H ET UNE METHODE CHIMIOMETRIQUE UTILISEE POUR
LA CARACTERISATION DE BAIES DE RAISINS A LA MATURITE SUR QUATRE
TERROIRS A BORDEAUX
1
H NMR and Chemometrics to Characterize Mature Grape Berries in Four Wine-Growing
Areas in Bordeaux-France (Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 6382-6389,
2005) …...........................................................................……………….….….. 72
6
CHAPITRE IV : L’INFLUENCE DU MICROCLIMAT DE GRAPPES DE ‘MERLOT
NOIR’ SUR LE PROFIL DE MINERAUX ET SUR LES METABOLITES PRIMAIRES ET
SECONDAIRES DE PELLICULES ET PULPES DE RAISINS
INFLUENCE OF CLUSTER MICROCLIMATE ON ‘MERLOT NOIR’
BERRY PROFILES OF MINERALS, PRIMARY AND SECONDARY METABOLITES
.(soumis) ................................................................................................. 99
CHAPITRE V : EFFETS DU MILLESIME, DE LA NATURE DU SOL ET DU CEPAGE
SUR LES PROFILS METABOLIQUES DES RAISINS…………....….…. 135
V.1. Effets du millésime et du sol sur les profils métaboliques de raisins échantillonnés sur
un réseau étendu de parcelles viticoles en Gironde................................................... 137
V.1.1. Etude de l’effet millésime……………………………...…………….…..…… 137
V.1.1.1. Profils métaboliques déterminés par RMN 1H sur trois millésimes..... 137
V.1.1.2. Profils métaboliques déterminés par la CLHP des acides aminés….... 138
V.1.1.3
Profils
métaboliques
déterminés
par
la
CLHP
des
composés
phénoliques……………………………………...……………………..…….…… 140
V.1.2. Etude de l’effet type de sol……………………………………………..…….. 142
V.1.2.1. Profils métaboliques déterminés par RMN 1H en fonction de l’alimentation
hydrique des sols……………………………………………..….. 142
V.1.2.2. Profils métaboliques déterminés par CLHP des acides aminés en fonction de
l’alimentation hydrique des sols........................................................................ 143
V.1.2.3. Profils métaboliques déterminés par CLHP des composés phénoliques en
fonction en fonction de l’alimentation hydrique des sols……………..……….... 145
V.2. Etude des effets millésimes, types de sols et cépages à Saint-Emilion…………..... 147
V.2.1. L’étude de l’effet millésime à Saint-Emilion………………………...…..…... 147
V.2.1.1. Profils métaboliques déterminés par la RMN
1
H en fonction du
millésime………………………………………………………...……………...…. 147
V.2.1.2. Profils métaboliques déterminés par la CLHP des acides aminés en fonction
du millésime............................................................................................... 149
V.2.1.3. Profils métaboliques déterminés par la CLHP des composés phénoliques en
fonction du millésime………………………………………...………….…….. 150
7
V.2.2. L’étude de l’effet du type de sol à Saint-Emilion…………………....…….. 152
V.2.2.1. Profils métaboliques déterminés par la RMN 1H en fonction du type de
sol…………………………………………………………………………….…..… 152
V.2.2.2. Profils métaboliques déterminés par la CLHP des acides aminés en fonction
du type de sol………………………………………………………….… 154
V.2.2.3. Profils métaboliques déterminés par la CLHP des composés phénoliques en
fonction du type de sol........................................................................................ 156
V.3. Etude de l’effet cépage à Saint-Emilion………………………………………....…. 157
V.3.1. Profils métaboliques déterminés par la RMN
1
H
en fonction des
cépages............................................................................................................................ 157
V.3.2. Profils métaboliques déterminés par la CLHP des acides aminés en fonction des
cépages..................................................................................................................... 159
V.3.3. Profils métaboliques déterminés par la CLHP des composés phénoliques en
fonction des cépages...................................................................................................... 161
Discussion…...…………………………………………………………………………...... 162
CONCLUSIONS……………………………………………………………...……....….. 164
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES …………………………...….. 167
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………....…....….. ….169
ANNEXES…………………………………………………………..……….………...…. 187
8
CHAPITRE I
9
CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ET MATERIEL ET METHODES
I.1 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1.1. La qualité du raisin et du vin
La grappe de raisin est un ensemble de fruits charnus de type baie portés par une rafle
(Champagnol 1984). Elle comporte donc une charpente (rafle) et le(s) fruit(s), grains ou baies.
Cette structure particulière du raisin a son importance car c’est l’ensemble de cet organe qui après
la floraison et la nouaison va évoluer jusqu’à la récolte. Le développement du raisin est divisé en
trois phases principales, selon des critères phénologiques, biochimiques et physiologiques (Tableau
1) :
•
Le développement herbacé ou végétatif après la nouaison, la formation de la baie ;
•
La véraison, correspond aux changements de texture (amollissement) et de couleur (ambre
pour les raisins blancs et rouge pour les noirs) ;
•
La maturation.
Le raisin est un fruit non-climatérique, il ne mûrit plus après la récolte (Chitarra and
Chitarra 1990; Kader 1992). La maturation du raisin entraîne des profondes modifications
qualitatives et quantitatives des constituants biochimiques et des paramètres physico-chimiques de
la baie (Tableau 1). La qualité de baies de raisins est la résultante complexe de nombreux
paramètres physiologiques et biochimiques qui caractérisent un état de la baie. La définition de la
qualité du raisin dépend de son utilisation (vin, raisin sec, jus de raisin, raisin de table). Le raisin de
table, consommé en frais, sera caractérisé par son aspect et ses qualités gustatives.
10
Tableau 1 : Evolution des baies de raisins pendant les quatre phases de croissance (Champagnol
1984; Hrazdina, Parsons et al. 1984).
Phase herbacée
Véraison
Maturation
Surmaturation
Critères
Croissance de la rafle
Changement de
Lignification des
Flétrissement
phénologiques
et du grain, coulure,
structure de la
rafles et des
des baies et
nouaison,
baie (stade II de
sarments
chute du poids
grossissement de
la croissance) :
(aoûtement),
frais,
l’ovaire, divisions
ramollissement
fin de
Abscission des
cellulaires (stade I du
du fruit,
grossissement des
fruits,
développement de la
augmentation du
grains,
installation de
baie)
volume des
augmentation
la pourriture
grains,
progressive de la
noble selon les
changement de
capacité
cas
couleur, arrêt de
germinative des
croissance de la
pépins (stade III)
rafle
Critères
Grappe
biochimiques
chlorophyllienne
et
(rafle et grains), teneur
physiologiques
Perte de la
Accumulation de
Arrêt de la
chlorophylle des métabolites (sucres
fonction puits
baies,
jusqu’à 300 g L-1),
par les baies,
en sucres des baies
accumulation de
eau, synthèse ou
concentration
inférieure à
pigments
dégradation des
des baies (perte
20 g L , teneurs en
épidermiques
substances (acides
d’eau),
acides organiques
(anthocyanes et
organiques),
dégradations,
maximales, teneur en
flavonols), de
synthèse des
liquéfaction
tanins et dérivés
sucres, de
anthocyanes
progressive des
hydroxycinnamiques
précurseurs
glycosylées et
pectines
élevées, synthèse de
aromatiques
acylées, de
protéines dans les
synthétisés,
précurseurs
baies
diminution de
d’arômes
l’acidité, synthèse
(liés et libres), de
et accumulation
protéines
-1
d’acides aminés
La phase I du développement correspond à la croissance végétative de la baie, alimentée
par le xylème de la vigne, jusqu’à la véraison. La phase II, la véraison, est caractérisée par la
11
transformation de la texture et de la couleur des baies, période qui dure de 1 à 2 jours par baie, et
jusqu’à 10 jours pour toute la parcelle. Pendant la phase III du développement, la maturation, le
flux phloémien est seul responsable de l’alimentation de la baie de raisin. La maturation est
marquée par l’accumulation des sucres, des anthocyanes et de précurseurs aromatiques, et aussi par
la diminution des acides organiques, donc de l’acidité du raisin (Figure 1).
Véraison (II)
Phase I
Phase III
Figure 1 : Développement d’une baie de raisin (d’après Kennedy, Université de l’Orégon-EUA).
Si on considère le raisin destiné à la vinification, ou raisin de cuve, il est important de
caractériser au mieux la matière première avant les transformations de la vinification (fermentation
alcoolique, malolactique). La qualité du raisin va dépendre aussi du type de vin recherché (rouge
ou blanc, doux ou sec, pétillant ou tranquille, issu de la pourriture noble, passerillage, préservation
des arômes variétaux), et de la technique de vinification utilisée (la macération pelliculaire pour les
vins rouges, le pressurage pour les vins blancs, la méthode champenoise, la macération carbonique,
etc... (Peynaud 1997)).
12
Pour définir la qualité de raisins, il est nécessaire de prendre en compte des caractéristiques
anatomiques (poids moyens de baies, pellicule/pulpe, …) et la composition biochimique des
raisins. Certains composés sont considérés comme des marqueurs qualitatifs positifs, d’autres
comme des marqueurs de qualité négative. Pour le raisin de table, il y a des critères qualitatifs
différents de ceux requis pour les raisins de cuve, les critères grosses baies, charnues, le caractère
plastique pour la rafle, la résistance à l’éclatement lors des traitements technologiques, l’aptitude à
la conservation sont recherchés. Mais il existe des facteurs communs aux raisins de cuve et de
table, comme la teneur en sucres, en acides. Les arômes sont différents, comme c’est le cas du
raisin ‘Italia’ (de table) et son arôme muscat (Kingston et van Epenhuijsen 1992), et du raisin
‘Cabernet-Sauvignon’ (de cuve) et son arôme frais, de cassis avec une touche végétale (Peynaud
1997).
Pour les raisins de cuve, des composés comme l’antranylate de méthyle et les anthocyanes
diglucosides, présents dans les cépages autres que Vitis vinifera, interdits en France, sont
considérés comme des marqueurs de qualité négative. D’autres composés sont susceptibles de
générer de la qualité négative par leur présence au cours des processus technologiques de
transformation, comme par exemple le mannitol (raisin botrytisé), l’histidine, la laccase
(pourriture) qui peut dégrader les polyphénols, les pectines méthylées (Usseglio-Tomasset 1995).
Les paramètres qui définissent la qualité de raisins destinés à la vinification sont les sucres
fermentescibles (glucose et fructose), le pH, l’acidité totale, les polyphénols totaux et les
précurseurs d’arômes (Huglin 1986). La quantité d’acides aminés dans le moût est aussi un facteur
important pour les raisins de cuve, car les acides aminés sont consommés par les levures pendant la
fermentation alcoolique du vin (Gennadi et al., 2000; Rodriguez-Lovelle et Gaudillère 2002,
Marullo et al., 2004). Des raisins de qualité positive ont des petites baies, avec des taux élevés en
sucres, une acidité moyenne (teneur en acide malique inférieure à 2 g L-1 au moment de la
vendange, avec un pH inférieur à 3.5), avec des fortes teneurs en anthocyanes et une faible teneur
en tanins de pépins, plutôt avec des tanins de pellicules, de poids moléculaire élevé et caractérisés
comme ronds et moins astringents sur le plan sensoriel. L’effet cépage peut aussi faire varier la
composition métabolique, en liaison avec l’adaptation aux différents types de sol et climat et avec
la durée du cycle productif, des cépages plus ou moins précoces et tardifs. Le Tableau 2 montre
une synthèse des composés considérés comme des marqueurs qualitatifs positifs et ceux dont la
présence ou la concentration diminuent la qualité des raisins.
13
Tableau 2 : Composition du raisin souhaitable pour les différents objectifs (Peynaud 1997).
Raisin de cuve
Raisin de table
Raisin industriel (sec, jus)
Composés
Qualité (+)
Qualité (-)
Qualité (+)
Qualité (-)
Qualité (+)
Qualité (-)
Sucres
Fructose,
Dextrane ,
Fructose,
Sucre (c),
Pectates de Ca
Sucres (c),
glucose (Po)
pentoses,
glucose (Po),
pectines
(Po), fructose,
pectines,
pectines
pectates de Ca
hydrolisées
glucose (Po),
hydrolisées
methylées (T)
(e)
(e)
hémicellulose
(e)
(e)
Polyalcool
Mésoinositol,
Mannitol (T)
Glycérol (pr)
aucun
aucun
aucun
Malique (e)
Tartrique,
Malique (e)
Tartrique,
Malique (e)
glycérol (Po)
Acides
Tartrique,
organiques
citrique (Po)
citrique (e)
citrique (e),
ascorbique (Po)
Substances
Ammonium,
Glucoprotéines
Protéines
Antranylate
Protéines
Antranylate
azotées
gluthation,
(Po), antranylate
enzymatiques
de méthyle
thermostables
de méthyle
(pr)
(Po)
(pr)
Aldéhydes
Terpènes libres
Aldéhydes
acides aminés
de méthyle (Vitis et constitutives
(Po), protéines
labrusca, pr),
(Po)
(In)
histidine (e)
Substances
Terpénoïdes
Pyrazines
Terpènes libres
aromatiques
(liés, libres)
(IBMP)
(Po)
Flavonoïdes
Phénols
Flavonoïdes
(anthocyanes,
(Po)
(Po),
aldéhydes, cire
Polyphénols
Phénols
Phénols
Phénols
oxydables (Po),
oxydables
antioxydatifs
oxydables
tanins,
tanins astringents
(Po), tanins
(absence de
(Po), tanins
flavonols),
(e), anthocyanes
astringents
laccase) (Po)
astringents
acides
diglucosides
(e), lignines
(e),
(pr)
anthocyanes
phénoliques
(pr)
Substances
K (e), P (c)
Cu, Fe (T)
K, Ca, Mg (Po)
Cu (pr)
K, Ca, Mg (Po)
Cu, Fe (e)
Peu d’intérêt
Huiles (pr)
Acides gras
aucun
Acides gras
aucun
minérales
Lipides
polyinsaturés
polyinsaturés
(Po)
(T)
Po : teneurs potentielles de la matière (variable selon l’objectif, le cépage, etc …)
T : implication technologique (défaut, accident)
c : carence
e : équilibre
pr : présence
In : interactions dans le produit final
14
Nous proposons d’étudier la qualité de raisins à maturité destinés à la vinification afin de
comprendre les différents facteurs qui jouent sur leur composition. Pour la compréhension de la
qualité de raisins, trois questions se posent:
1) Comment définir la qualité des raisins ?
2) Comment maîtriser la qualité des raisins ?
3) Comment mesurer la qualité des raisins ? Cette troisième question fait l’objet de la thèse.
Il faut disposer d’un outil de mesure de la qualité de raisins pour évaluer les conséquences
des pratiques viticoles et identifier le rôle des facteurs environnementaux.
I.1.2. Les facteurs influençant la qualité œnologique du raisin et du vin
I.1.2.1. La qualité des vins
Produire du vin de qualité est un art, un métier. La qualité est très complexe et dépend de la
matière première puis de plusieurs autres facteurs. Ceux-ci interviennent pendant la vinification,
comme le type de levure pour la fermentation alcoolique, le type et le temps de macération,
l’utilisation ou non de la fermentation malolactique, l’élevage en cuve ou en barriques, le
pourcentage de vin de presse à ajouter au vin de goutte, l’assemblage final entre les différents lots
de vins et les différents cépages. A cela s’ajoute le facteur humain, le consommateur de vin. Le
goût est très subjectif et d’une façon générale, personnel. On ne peut pas affirmer qu’un vin plaira
à toutes les personnes du monde, car il y aura des adeptes de certains vins, mais d’autres personnes
préféreront d’autres types, d’autres profils, parmi les vins blanc et rouges secs, blanc et rouge
liquoreux, rosés, pétillants, etc...
Aujourd’hui, il y a une grande diversité de vins produits dans de nombreux pays, reconnus
comme « les pays producteurs du nouveau monde », Etats-Unis, Chili, Argentine, Afrique du Sud,
Australie et Nouvelle Zélande. Dans ces pays, la réglementation qui régit la production des vins est
peu contraignante, elle ne légifère pas sur le recours à l’irrigation et l’utilisation du bois
artificiellement (copeaux) pour le goût du vin, comme en Europe. La majorité des cépages
s’adaptent bien aux différentes conditions culturales, et permettent la production de vins dont les
qualités gustatives et organoleptiques sont différentes des vins produits en France, avec l’utilisation
de ‘Merlot noir’, ‘Cabernet-Sauvignon’, ‘Cabernet franc’, ‘Pinot noir’ et ‘Syrah’, comme cépages
rouges, et le ‘Chardonnay’ et ‘Sauvignon blanc’ comme cépages pour la production de vins blancs.
En Europe, la viticulture repose sur 2000 ans d’histoire, de traditions et de règles.
I.1.2.2. Les facteurs déterminant la qualité des raisins
15
La qualité du raisin peut être caractérisée et définie par l’ensemble des constituants de la
baie extractibles par la vinification, qui sont responsables de la composition et de la typicité du vin.
Pour un cépage donné, cette qualité ne peut s’exprimer que si les conditions de la maturation sont
bonnes et si l’état sanitaire de la vendange est parfait (Delas 2000).
Plusieurs paramètres jouent un rôle important pour la détermination de la composition du
raisin. Dans ce contexte, nous pouvons citer le climat comme étant le premier facteur et l’un des
principaux acteurs dans la viticulture. Il influence le cycle de développement de la vigne,
notamment pendant la maturation des raisins, la récolte pouvant être de bonne ou mauvaise qualité
selon le climat. Le climat est caractérisé par les facteurs température, précipitation et
ensoleillement. Le succès d’un millésime est étroitement lié aux conditions climatiques. Les
conditions climatiques souhaitables sont celles d’un ensoleillement intense, des températures plus
basses pendant la nuit et plus élevées le jour, qui favorise l’accumulation des précurseurs d’arômes,
des pluies faibles ou même absentes aux alentours des vendanges, permettant un bon état sanitaire
des raisins, sans la présence du champignon Botrytis cinerea. Ce champignon est responsable de la
pourriture grise, un facteur de qualité négative pour les vins blancs et rouges secs, mais aussi
responsable de la pourriture noble, facteur de qualité positive pour les vins blancs liquoreux de
l’appellation Sauternes dans le Bordelais et d’autres en France, en Hongrie, en Allemagne et
Autriche, entre autres.
Le sol est le deuxième facteur essentiel, dont la constitution modifie la nutrition minérale de
la vigne, surtout azotée, et va jouer sur la vigueur des plantes. Un autre constituant des sols
d’extrême importance est l’eau, déterminant l’alimentation hydrique du vignoble. Ces deux
éléments, l’eau et l’azote, seront décisifs et déterminants pour la qualité finale des raisins. Plusieurs
auteurs ont montré qu’une combinaison de deux facteurs du sol, de l’azote, plutôt en faible
quantité, et de l’eau, en conditions de déficit hydrique, sont favorables pour la composition et la
qualité de jus de raisins et des vins (Choné et al. 2001).
Les pratiques culturales appliquées par l’homme sur le vignoble représentent le troisième
facteur important. En général, les pratiques culturales sont utilisées pour améliorer la qualité du
raisin. Par exemple, le viticulteur recherche des vigueurs de la vigne et rendements faibles, et des
rapports feuille/fruit convenables, autour de 1 à 2 m2 de feuilles par Kg de raisin produit
(Champagnol 1984). L’œnologue choisira ensuite les différentes techniques de vinification, pour
obtenir un vin de qualité et d’une typicité recherchée.
L’ensemble des facteurs climat, sol et pratiques culturales d’un domaine viticole constituent
ce que l’on appelle « le terroir ». Cette notion de terroir a conduit à la création de l’appellation
d’origine contrôlée (AOC) en 1935 par Joseph CAPUS (Capus 1947). Il existe environ 500 AOC
en France sur une large gamme de produits, comme le lait, le fromage, l’huile d’olive, la viande de
16
bœuf, d’agneau et le vin. Chaque AOC possède des règles que les producteurs doivent respecter
afin que le produit puisse bénéficier de l’étiquette dans l’appellation régionale. Le règlement et
l’évaluation des compétences sont attribués en France par l’INAO, l’Institut National des
Appellations d’Origine, créée aussi en 1935 (Capus 1947). Ces règlements sont d’ordre pratique,
en établissant, par exemple pour le vin, les cépages utilisés, le rendement de la production dans un
millésime, les techniques culturales, la méthode de vinification, le temps d’élevage. Chacun de ces
paramètres est spécifique à chacune des appellations en France.
I.1.3. Terroir : Définition et composantes
I.1.3.1. Le climat et son influence sur la qualité de baies de raisins
En viticulture, le climat, le sol et la conduite du vignoble (pratiques culturales),
caractérisent un mot utilisé en France depuis plusieurs siècles : le terroir. L’expression terroir est
apparue dès le XIIIme siècle, où elle était utilisée pour caractériser un lieu, un terrain. Ensuite, au
XVIme siècle, elle a été transformée pour définir une fonction, l’utilisation de la terre pour la
production. C’est aussi l’époque où sont apparus les mots similaires tiroir et mouchoir, qui veulent
exprimer la fonction de ranger les vêtements et d’autres objets dans un endroit, et l’utilisation d’un
tissu ou papier pour se moucher, respectivement. Aujourd’hui, le mot terroir est utilisé pour
caractériser les conditions environnementales qui permettent l’expression de la qualité et la typicité
d’un produit agricole, comme le lait, le beurre, le fromage, le raisin et le vin (Vaudour 2003).
L’utilisation du terme terroir est acceptée pour considérer un site, un environnement et une origine
géographique qui permettent l’obtention d’un produit de qualité organoleptique reconnue et
inimitable (Vaudour et al. 2005). Le terroir est très variable d’une région géographique à l’autre,
séparées de quelques kilomètres, ce qui permet d’avoir des produits très différents en terme de
couleur, de saveur, d’arômes et de consistance. Cette notion est plus valorisée en France qu’à
l’étranger.
La vigne est une plante pérenne qui peut s’adapter à des climats variés. Les seules
conditions auxquelles la plante ne s’adapte pas sont les régions présentant des gelées hivernales,
avec une température au-dessous de –15°C (Vitis vinifera L.). Mais dans une viticulture raisonnée,
en recherchant une qualité œnologique optimale, les facteurs climatiques impliqués dans la qualité
sont plus complexes. Les paramètres climatiques pris en compte en viticulture sont généralement la
température, l’ensoleillement et la pluviométrie.
La limite septentrionale pour la production de raisin est assez variable, mais le problème
dans ces zones est le manque d’énergie thermique et de luminosité, ce qui se traduit par une
maturation incomplète du raisin. En général, la culture de la vigne se fait de façon satisfaisante
17
dans la zone comprise entre le 35ème et le 50ème parallèles, où le climat n’exclut pas l’élaboration
d’un vin de bonne qualité.
Les facteurs climatiques qui jouent sur la qualité du raisin sont, dans une échelle macroclimatique, la latitude. A l’échelle du méso-climat, la topographie du terrain, l’orientation de la
pente et la proximité d’un bois sont les facteurs à prendre en compte lors de l’installation du
vignoble. A l’échelle micro-climat, l’orientation des rangs et le mode de conduite du vignoble sont
les variables sur lesquelles le viticulteur peut agir.
La température et le rayonnement solaire (l’ensoleillement) jouent sur la photosynthèse et
sur l’ensemble des réactions du métabolisme. Les précipitations agissent sur la croissance, la
longueur du cycle et les conditions phytosanitaires. Le vent peut avoir une action mécanique sur la
végétation mais aussi influencer les conditions phytosanitaires.
Plusieurs auteurs ont pu monter que les années où les conditions climatiques sont
défavorables, les teneurs en azote total et en acidité du moût sont élevées, et la teneur en sucre est
plus faible, caractérisant des millésimes difficiles (Peynaud et Maurie 1953; Peynaud 1997). Le
système est complexe et l’intégration de tous les facteurs est nécessaire. Les facteurs climatiques,
les différents types de sols, les pratiques culturales, l’effet génétique des différents cépages sont
liés. C’est l’ensemble de ces paramètres qui va jouer sur la qualité de baies de raisins et, par
conséquent, sur la qualité des vins. Le choix du cépage est fondamental pour l’obtention d’une
qualité supérieure dans un type de sol et climat donné.
En viticulture, les indices climatiques pris en compte sont l’indice héliothermique de
Huglin (IH), qui dépend de la température et du rayonnement, et l’indice de sécheresse (IS), qui est
basé sur le bilan hydrique de la vigne (Carbonneau 1980; Carbonneau 2001). Dans les études
scientifiques l’indice de fraîcheur des nuits est également pris en compte, principalement à la
période de maturation des raisins (Riou 1998).
Dans notre étude, les données climatiques relevées tout au long des années dans les
vignobles étudiés, sont la pluviométrie, la somme des températures et l’ensoleillement. Ces
données climatiques permettent de simuler les relations hydriques de la vigne en fonction de la
nature du sol, du climat de l’année et de l’architecture du vignoble.
I.1.3.2. Les sols viticoles et leurs effets sur les constituants du raisin
En viticulture, le sol est l’un des facteurs importants pour obtenir un raisin de bonne qualité
œnologique. Il joue un rôle fondamental sur la composition des baies.
Cependant, il existe dans le monde une grande variété de sols sur lesquels la vigne est
cultivée. Dans les différentes régions cultivées, les viticulteurs adaptent leurs cépages et leurs
18
techniques aux conditions du milieu, tout particulièrement en intégrant la nature du sol, afin de
produire un vin de qualité dont la typicité est reconnue sous le terme de terroir.
Dans les vignobles du Bordelais, les sols sont très variables (Duteau et al., 1981 ; Seguin,
1983). Il n’y a pas un seul type de sol permettant de produire un raisin avec une haute potentialité
œnologique, mais plusieurs. La composition physico-chimique des sols joue un rôle important sur
la composition des raisins. On trouve aussi bien des sols avec la texture gravelo-sableuse
(peyrosols-graves), très riches en graviers et en cailloux, ce sont les vignobles des appellations
Pessac-Léognan et Bordeaux générique ; des sols argilo-calcaires profonds (calcosols) du Médoc
ou des Graves. D’autres sols sont du type argilo-calcaire (rendosol), dont le sol est situé sur la
roche calcaire (les vignobles de Saint-Emilion). D’autres ont une texture du type argileuse, ou se
situent sur le calcaire d’Astéries, comme une partie des vignobles de Pomerol et de Saint-Emilion.
Il y a les sols dont la texture est mélangée, du type sableuse, limoneuse et même argilo-limoneuse,
comme c’est le cas des vignobles de l’appellation Buzet (Van Leeuwen 1991). Ces exemples de
sols montrent que la qualité des raisins et des vins n’est pas forcément liée à un type textural défini,
comme l’ont montré les travaux de Guilloux et al. (Guilloux et al. 1978). En revanche, la géologie
peut, à travers le sol, conférer une typicité au vin, avec des zones exclues de l’aire privilégiée des
grands vins, comme c’est le cas avec les sables des Landes et les alluvions récents (« palud ») et les
sables du Périgord, souvent hydromorphes, qui permettent l’accumulation excessive en eau et une
forte vigueur des vignes.
Le facteur eau présent dans les sols est un facteur majeur pour la classification de la qualité
des sols viticoles. La réserve en eau des sols est un facteur fondamental pour la qualité des raisins.
Elle est définie par la réserve utile (RU), qui correspond à la capacité de rétention du sol (le
volume d'
eau que le sol est susceptible d'
absorber), et est exprimée en mm (Valancogne 1992). Elle
se décompose en deux composantes :
•
La réserve facilement utilisable (RFU), est la quantité d’eau dans le sol que la plante peut
absorber sans difficulté. Cette notion est utilisée par les agronomes et est considérée comme
valant 2/3 de la réserve utile ;
•
La réserve de survie (RS), est l’eau plus difficilement utilisable par la plante. C’est l’eau
utilisée à l’approche du point de flétrissement.
La méthode de calcul utilisée couramment pour la détermination de la RU est la suivante :
19
RU = (HE – Hpf) x da x E, RU en mm
Où,
RU : réserve utile ;
HE : humidité équivalente ;
Hpf : humidité au point de flétrissement ;
da : densité apparente ;
E : épaisseur du sol en dm.
Le drainage des sols est nécessaire pour éviter que l’eau occupe les espaces libres du sol,
permettant une bonne aération pour le développement des racines. Les propriétés chimiques des
sols, caractérisées par la teneur en éléments minéraux (cations et anions), ne semblent pas jouer un
rôle déterminant sur la qualité des raisins, sauf si le sol est très riche en matière organique et
humus, ce qui conduit à une alimentation azotée non limitante et des rendements excessifs, et un
excès de K+, qui conduit à des pH élevés. La richesse d’un sol peut être rapportée au volume de sol
exploité par les racines. La profondeur du sol détermine le volume disponible permettant le
développement racinaire. C’est la disponibilité en eau et la profondeur du sol qui déterminent la
surface exploitée par les racines. La présence de macropores joue sur l’aération des sols (Coombe
et Dry 1998). Un enracinement superficiel limite les quantités d’éléments minéraux disponibles
pour la vigne dans un sol riche, et un enracinement profond peut compenser la pauvreté d’un sol.
Pour modérer la vigueur, il suffit qu’un facteur, comme l’alimentation hydrique, la nutrition
minérale, la profondeur du sol exploitée par les racines, soit limitant. Les travaux de recherche
effectués par Tregoat (Tregoat 2003) ont montré que l’alimentation hydrique des différents types
de sols est le facteur principal pour la production de raisins et de vins de haute qualité œnologique.
Le facteur eau est très variable selon la structure des sols, avec comme conséquence une variation
des stades de développement de la vigne et de la maturation des raisins, et un cycle végétatif de
longueur variable.
En général, les propriétés physiques, notamment la texture des sols, influencent plus la
qualité des raisins que les propriétés chimiques (composition minérale, Coombe et Dry 1998). La
texture limoneuse est la moins favorable pour une viticulture de qualité, surtout à cause d’une
réserve utile élevée, qui conduit à des conditions d’alimentation en eau non limitant, pouvant
favoriser le compactage et l’engorgement des racines par l’eau (Vaudour et al. 2005).
I.1.3.2.1. Alimentation hydrique de la vigne et qualité œnologique des baies de raisins
20
L’alimentation hydrique des sols et l’eau disponible pour les plantes (RU) jouent sur la
croissance, le développement végétatif de la vigne et la composition et la qualité des raisins. Une
alimentation en eau de la vigne sans contrainte pendant tout le cycle a un effet négatif sur la
composition du raisin. La croissance des plantes s’effectue de façon continue, avec un allongement
du cycle de développement (retard de maturité). En conséquence, les plantes ont une forte
croissance végétative et les vignes sont plus tardives, un phénomène qui peut retarder la période de
maturation et mettre en risque la qualité des raisins par rapport aux pluies de fin de saison. Une
alimentation en eau excessive disponible pour la vigne se traduit par une diminution de la qualité
des raisins, avec des jus plus acides, moins concentrés en polyphénols, les baies sont plus grandes,
un effet de dilution des sucres s’installe, et même des risques de pourriture peuvent être favorisés.
A l’inverse, une alimentation déficitaire en eau présente aussi des inconvénients, causant un arrêt
de la maturation, un faible développement de la vigne et un faible rendement (Van Leeuwen et
Seguin 1994; Van Leeuwen et al. 2001). Les conditions les plus favorables, dans les meilleurs
terroirs bordelais, sont caractérisées par une alimentation en eau équilibrée dès la période de
floraison et pendant toute la période de maturation des raisins, permettant à la vigne de ne pas
souffrir en cas de sécheresse, mais de ne pas avoir d’eau en excès en cas de pluie abondante
(Duteau et al. 1981).
Un autre facteur influencé par l’alimentation hydrique est la photosynthèse, qui ne peut
avoir lieu que si l’ouverture des stomates permet les échanges gazeux entre les chambres sousstomatiques et le milieu environnant. Dans les conditions de stress hydrique, les cellules de garde
des stomates perdent leur turgescence et les stomates se ferment. Le gaz carbonique ne peut plus
entrer dans les feuilles et il y a un ralentissement puis un arrêt de la photosynthèse. Cela va
influencer le fonctionnement des végétaux d’une façon générale, et plus précisément de la vigne,
notamment avec une diminution de la production en matière sèche. Une alimentation raisonnable,
sans excès ni manque, est souhaitable pour avoir un raisin de qualité positive (Gaudillère et Van
Leeuwen 2000; Choné et al. 2001b).
Plusieurs auteurs ont étudié le facteur eau du sol en rapport avec la qualité du raisin dans les
vignobles de Bordeaux. D’après les études de Seguin (Seguin 1983), le sol joue sur l’alimentation
hydrique de la vigne et, par conséquent, influence la qualité des vendanges. L’alimentation
hydrique de la vigne est le facteur majeur responsable de la qualité de raisins.
Plusieurs
méthodes sont utilisées pour l’évaluation de l’alimentation hydrique dans les sols viticoles. On peut
citer les mesures du rapport entre l’évapotranspiration potentielle (ETP) et l’évapotranspiration
réelle (ETR). Les valeurs plus proches de 1 caractérisent les vignobles où l’eau n’est pas un facteur
limitant. Une autre façon de qualifier le statut hydrique d’un vignoble est l’analyse du rapport entre
13
C/12C (Van Leeuwen et al. 2001; Gaudillère al. 2002), appelé
13
C, basée sur les sucres du moût
21
de raisins à maturité. Cette mesure intègre les conditions de l’alimentation hydrique de la vigne
pendant la maturation liées aux conditions climatiques. L’abondance naturelle du 12C dans le CO2
atmosphérique est de 98,9%, tandis que celle du le
13
C est de 1,1%. En conditions de stress
hydrique, les stomates de la plante se ferment, diminuant la discrimination isotopique. Donc, le
rapport 13C/12C est d’autant plus négatif qu’il y a moins de contrainte hydrique. La discrimination
est exprimée conventionnellement par rapport à un standard international. Les valeurs varient entre
–20 et –30 ‰ pour la vigne (Gaudillère et al. 1999; Van Leeuwen et al. 2001).
Dans notre étude, la caractérisation de l’alimentation hydrique des parcelles étudiées a été
effectuée par la mesure du
13
C réalisée sur le moût des raisins récoltés à maturité.
I.1.3.2.2. La nutrition azotée de la vigne et la composition biochimique de baies de raisins
Généralement, les composés azotés dans le sol sont oxydés par les microorganismes et
transformés en nitrate, une forme facilement assimilable par les plantes (Coombe and Dry 1998).
L’azote sous forme de nitrate est l’un des composés les plus mobiles dans les sols. Un sol très
fertile est souvent associé à une forte teneur en azote, principalement contenu dans la matière
organique.
La teneur en azote des feuilles de vigne varie de 1 à 2 % de la matière sèche, et il y a
environ 2 Kg d’azote par tonne de raisin (Coombe and Dry 1998). L’azote est le constituant
primaire des acides aminés pour former les protéines, dont les enzymes, les acides nucléiques, la
chlorophylle, les auxines et les cytokinines (Huglin 1986; Delas 2000).
Il y a une relation étroite entre la teneur en azote du sol, la croissance, la vigueur et le
rendement exprimé par les plantes en grappes de raisins. La fertilisation peut jouer sur la
composition du raisin. La matière organique fait partie de la structure des sols, la quantité présente
dans les sols a un effet sur la minéralisation, en mettant l’azote à disposition de la plante, favorisent
une forte vigueur des plantes. La relation entre la nutrition minérale de la vigne et la qualité des
terroirs est assez complexe. Il est préférable que les fumures soient effectuées pour la correction
des carences graves et à compensation des faibles exportations par la récolte et par lessivage (Van
Leeuwen 1991). En viticulture de qualité œnologique supérieure, l’apport d’engrais azoté est
limité, car on recherche une faible vigueur des vignes et un rendement limité en raisins. Une forte
vigueur correspond à une forte croissance végétative des plantes, qui occasionne un retard des
étapes phénologiques et de la croissance des raisins, en prolongeant l’étape juvénile et en retardant
la maturation. La composition du raisin est ainsi modifiée, par une déviation du métabolisme qui
favorise la synthèse de protéines, au détriment de la synthèse de composés phénoliques, éléments
essentiels de la qualité. Les vignes sont aussi plus sensibles à l’attaque des maladies, comme le
mildiou (Plasmopara viticola), mais surtout la pourriture grise (Botrytis cinerea) (Delas 2000).
22
Plusieurs auteurs ont monté les effets négatifs d’une nutrition excessive en azote sur la composition
de baies de raisins, avec une baisse des sucres et des composés phénoliques, composés participant
à la notion de qualité oenologique (Champagnol 1984; Bertrand et al. 1991; Van Leeuwen et al.
2000; Choné et al. 2001b; Tregoat et al. 2002; Hilbert et al. 2003).
L’utilisation de parcelles enherbées a un effet réducteur sur la teneur en nitrate des sols,
prélevé activement par l’herbe (Soyer et al., 2000 ; Van Leeuwen et al., 2000). Mais, pour les
cépages blancs, une teneur en azote modérée et même élevé est recherchée, aux alentours de 200
mg N/L de moût, voire plus. Cela permet une concentration élevée en substrat azoté pour les
levures pendant la fermentation alcoolique, qui sera correcte, rapide et complète (Peyrot des
Gachons et al., 2005).
Dans ce travail, le statut azoté des vignes est évalué par la teneur en azote des raisins
(azote total et minéral) et le dosage des acides aminés libres de la pellicule et de la pulpe des
raisins.
I.1.3.3. Les pratiques culturales en rapport avec la qualité des raisins
Le terroir rassemble plusieurs paramètres dont les facteurs climatiques, pédoagronomiques, topographiques et les conduites de culture maîtrisées par les viticulteurs (Van
Leeuwen et al. 2004). Ces derniers modifient les conditions culturales afin de permettre une
amélioration des conditions du milieu. La maîtrise de la vigueur des vignes est une pratique
fondamentale qui permet d’augmenter la qualité potentielle des raisins. Cette maîtrise est obtenue
en associant plusieurs paramètres culturaux : densité de plantation élevée, respect d’un rapport
feuille/fruit, réduction du nombre de grappes par souche, implantation d’herbe dans les entre-rangs
(raisins rouges). La couverture des sols est un facteur assez utilisé dans les vignobles bordelais.
L’utilisation de parcelles enherbées, avec le but de provoquer une concurrence naturelle pour l’eau
et l’azote du sol, devient une pratique fréquente dans les vignobles (Coombe et Dry 1998).
L’ensemble de ces conditions est important et permet de maîtriser la vigueur de la vigne et
d’assurer la maturation complète des raisins (Kliewer et Torres 1972; Hrazdina et al. 1984; Price et
al. 1992; Macaulay et Morris 1993; Dokoozlian et Kliever 1995; Dokoozlian et Kliewer 1996;
Haselgrove et al. 2000).
23
I.1.3.4. Les cépages des vignobles Bordelais
De nombreux cépages sont actuellement utilisés pour la production de vins de qualité, c’est
le cas du ‘Merlot noir’, du ‘Cabernet-Sauvignon’, du ‘Cabernet franc’, du ‘Pinot noir’ et de la
‘Syrah’ pour la production de vins rouges et rosés, et du ‘Chardonnay’ et du ‘Sauvignon blanc’
comme cépages pour les vins blancs. Ces cépages sont utilisés dans les pays de l’« ancien monde »
et ceux du « nouveau monde ». Pour les pays du nouveau monde (Etats-Unis, Australie, Afrique du
Sud, Chili, Argentine, entre autres), la production de vin se fait en climat chaud, les cépages
utilisés sont précoces et adaptés à des climats tempérés. Les raisins produits dans ces pays
expriment une bonne maturité, avec de fortes teneurs en sucres, ce qui explique l’élaboration de
vins avec des degrés alcooliques qui atteignent 14 voire 15°. Le choix du cépage selon le type de
sol et le climat est très important pour la production d’un raisin de bonne qualité œnologique, c’est
pourquoi l’adaptation des cépages est un facteur à prendre en compte lors de l’installation de
nouveaux vignobles.
En France, la réglementation des AOC définit les cépages autorisés. Il est nécessaire de
respecter le règlement régional pour l’installation du vignoble imposé par l’INAO. Dans le
Bordelais, les principaux cépages utilisés dans les vignobles et autorisés par les AOC sont le
‘Cabernet-Sauvignon’, le ‘Cabernet franc’, le ‘Merlot noir’ et le ‘Malbec’ pour les cépages rouges
et le ‘Sauvignon blanc’, le ‘Sémillon’ et la ‘Muscadelle’ pour les cépages blancs (Peynaud 1997).
Dans notre étude, nous avons utilisé trois cépages rouges, le ‘Merlot noir’, le ‘CabernetSauvignon’ et le ‘Cabernet franc’, et le cépage ‘Sauvignon blanc’, dont la description des
échantillons sera détaillée dans le chapitre II.2.1.
I.1.4. Les outils analytiques utilisés pour l’étude de la qualité du raisin
L’évaluation de la qualité des raisins à maturité est effectuée dans les vignobles par le
dosage des sucres solubles totaux (SST), exprimé en degré °Brix, le dosage de l’acidité titrable
totale (AT), exprimé en meq/L ou en g/L d’acide tartrique ou d’acide sulfurique, la mesure du pH
et le dosage des composés phénoliques totaux (Hunter et al. 1991 a et b). Ces analyses permettent
d’avoir une évaluation générale de la maturité du raisin pour le récolter. D’autres techniques
pratiques sont utilisées sur le terrain pour compléter ces informations, comme de regarder la
couleur des pellicules et des pépins et même de les déguster, pour déterminer leur état de
maturation (Kennedy et al. 2000; Kennedy et al. 2000). Mais ces analyses restent globales et
opérateur-dépendant. Elles ne permettent pas de caractériser précisément les différences
qualitatives des raisins. Pour cela, l’utilisation de méthodes analytiques biochimiques, pour doser
un plus grand nombre de métabolites, pourrait être utile pour la détermination de la composition
24
des baies de raisins mûrs issus de différentes conditions de sol, de climat, de millésimes et de
cépages différents.
I.1.5. Les outils analytiques utilisés pour l’étude des profils métaboliques
L’étude du métabolome (un grand nombre de métabolites synthétisés par un système
biologique) et du profil métabolique (l’ensemble des métabolites choisis pour caractériser un
organisme biologique) a commencé au début des années 80 dans le cadre de recherches portant sur
les végétaux (Fan et al. 1986; Trethewey et Willmitzer 2002) et sur la composition de raisins
(Coombe et Jones 1983). L’étude de profils métaboliques à partir d’extraits de cellules ou de tissus
de végétaux ou d’animaux permet d’estimer la composition biochimique totale (Glassbrook et
Ryals 2001; Gidman et al. 2003). Le profil métabolique peut changer selon les effets de
l’environnement, des variétés et des traitements sur les extraits végétaux (Fan 1996; Fiehn et al.
2000 et 2001). Cette étude permet aussi d’évaluer la réponse métabolique à court terme d’un tissu,
à un moment donné du développement ou du métabolisme d’un système biologique (MorotGaudry et Briat 2004). Une autre application très répandue ces dernières années est l’étude
d’empreintes métaboliques basée sur l’analyse d’un grand nombre de métabolites sur une série
d’échantillons (Fiehn 2002). On ne s’intéresse pas à la quantification de chaque métabolite dans
l’extrait, mais on analyse la variabilité par des méthodes statistiques, ce qui permet de discriminer
les différents traitements en trouvant les variables qui expliquent la variabilité (Fiehn 2001).
Pour qu’une méthode analytique puisse contribuer efficacement à un projet métabolome,
elle doit être caractérisée par un haut pouvoir de résolution permettant l’analyse quantitative d’un
grand nombre de constituants. Elle doit être rapide pour permettre l’analyse de nombreux
échantillons nécessaires pour le traitement statistique. Ces sont les méthodes parfois qualifiées à
haut débit.
Les techniques analytiques basées sur la chromatographie gazeuse (GC) permettent
l’analyse d’extraits de plantes (Roessner et al. 2001). La chromatographie gazeuse couplée à
spectrométrie de masse (GC/MS) a permis d’améliorer la sensibilité et l’identification des
composés, comme dans le cas d’études sur des feuilles d’Arabidopsis thaliana (Fiehn et al. 2000).
La chromatographie liquide haute performance (CLHP), aussi utilisée couplée avec la MS (LCMS), est une technique très sensible et sélective (Morot-Gaudry et Briat 2004). Elle permet
d’identifier de nombreux composés. La sensibilité est excellente et elle permet la détection de très
faibles quantités de produits. Progressivement d’autres techniques ont été utilisées, comme la
spectrométrie de masse par transformation de Fourier (FT/MS) (Watson et al. 2003) et
la
spectrométrie par infra−rouge associée à la transformée de Fourier (FT−IR) (Trethewey et
Willmitzer 2002). La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique
25
bien adaptée aux études de certains métabolites in vivo ou après extraction des composés (Fan
1996). C’est un outil utilisé dans les domaines médical, chimique, physique et biologique (Boesch
1999; Antti et al. 2002). Le phénomène de résonance magnétique nucléaire a été mise en évidence
expérimentalement en 1946 par Bloch et Purcell, ce qui a permis à ces deux chercheurs de recevoir
le prix Nobel de Physique en 1952.
L’utilisation de nouveaux outils, avec des méthodes analytiques plus performantes,
permettant la détermination d’un grand nombre de composés métaboliques est d’une grande utilité
pour les chercheurs de tous les domaines. Mais, il n’existe pas actuellement une technique globale,
qui permette observer tous les métabolites présent dans un extrait biologique. Pour cela,
l’utilisation de méthodes complémentaires est une voie très utilisée par les scientifiques (MorotGaudry et Briat 2004).
La CLHP permet notamment de doser quantitativement 20 acides aminés (Spayd et
Andersen-Bagge 1996; Hilbert et al. 2003 ; Hernandez-Orte, Cacho et Ferreira, 2002) et une
trentaine de composés phénoliques (Lamuela-Raventos et Waterhouse 1994; Baldi et al. 1995;
Spayd et Andersen-Bagge 1996; Lehtonen et al. 1999; Karagiannis et al. 2000; Nyman et
Kumpulainen 2001; Rodriguez-Delgado et al. 2001; Sakkiadi et al. 2001; Heier et al. 2002; Hilbert
et al. 2003) de pellicule et de pulpe de baies de raisins.
Nous avons utilisé la RMN du proton et la CLHP des acides aminés et des composés
phénoliques pour la détermination des profils métaboliques de pellicules et pulpes de raisins dans
différentes conditions.
I.1.5.1. La méthode d’analyses par RMN. Caractéristiques.
L’analyse par RMN est devenue aujourd’hui une méthode de routine pour les études du
fonctionnement cellulaire des systèmes biologiques. Des nombreux noyaux atomiques peuvent être
détectés par la technique de RMN. Les noyaux les plus utilisés sont le proton (1H), le carbone
(13C), le phosphore (31P), l’azote (15N), le sodium (23Na), le potassium (39K) et le fluor (19F) (Fan
1996).
C’est une méthode sélective qui permet le dosage et l’identification de plusieurs métabolites
dans un mélange complexe simultanément (Szwergold 1992; Ratcliffe 1994; Yan et al. 1996;
Diakou et al. 1997; Maniara et al. 1998; Kosir et Kidric 2001; Warne et al. 2001). Cette méthode
permet de quantifier des métabolites in vivo et in vitro à partir de la résonance de
13
C, 1H et
31
P,
atomes largement représentés dans les biomolécules (Santos et al. 1993; Wasser et al. 1996; Yan et
al. 1996; Dufour et Bayonove 1999; Richard et al. 2001). La rapidité de l’obtention des résultats,
l’exigence minimale pour la préparation des échantillons (utilisation de l’extrait brut), la
caractéristique d’être une méthode non-destructive et la grande aptitude à déceler les
26
transformations structurales sont quelques unes des caractéristiques de la spectrométrie de RMN
(Fan 1996; Thillart et Waarde 1996; Forveille et al. 1996; Belton et al. 1998; Ramos et Santos
1999; Fiehn 2001). C’est une technique employée aussi pour la détermination de fraudes dans
l’industrie alimentaire, pour la détermination de plusieurs composés des vins, pour contrôler sa
qualité et son origine (Gimenez-Miralles et al. 1999; Fauhl et Wittkowski 2000). Le couplage entre
RMN et LC permet la séparation et la détermination de composés de bas poids moléculaire
(« chemical fingerprint ») (Pedersen et Andersen 1994; Kametani et al. 1996; Ramos et Santos
1999; Mannina et al. 2001).
Une analyse de grande utilité est celle qu’utilise la SNIF-RMN combinée avec des
méthodes chimiométriques. Cette technique est utilisée dans la Communauté Européenne depuis
1990 pour contrôler la chaptalisation de vins (Košir et al., 2001). Elle est basée sur la
détermination du rapport deutérium/hydrogène (D/H) de l’éthanol présent dans les vins (Martin et
al., 1988). La détermination du rapport D/H permet la discrimination entre des échantillons
naturels ou enrichis avec du sucre, issu de la cane sucre ou de la betterave. Elle est aussi utile pour
la détermination de l’origine géographique des vins (Košir et al., 2001).
La RMN 1H comparée à la RMN 13C est plus sensible. Le proton est présent à 99,9% dans
la nature, tandis que l’abondance naturelle du
13
C est seulement de 1,1%. Tous les métabolites
1
organiques qui contiennent des H sont susceptibles de donner des signaux. La RMN du proton est
utilisée pour caractériser le profil métabolique de systèmes biologiques.
La RMN 1H permet une acquisition rapide d’un signal de façon quantitative (Saucier et al.
1997; Akoka et al. 1999; Roessner et al. 2001). On peut obtenir des informations sur des
changements dans les matrices complexes dus à des effets de l’environnement ou à des conditions
de préparation des échantillons (Glabgen et al.; Guyot et al. 1996). Ces méthodes permettent de
construire des bases de données et d’automatiser les manipulations (Lommen et al. 1998; Noteborn
et al. 2000). Des spectres RMN 1H à haute résolution ont été obtenus pour analyser les
changements métaboliques dans les fluides du corps humain et animal, et sur des extraits de tissus
à différents stades de maladies, après traitements avec des drogues ou des toxines (Antti et al.
2002). Cette méthode est utilisée pour l’étude du profil métabolique des végétaux (Le Gall et al.
2003; Defernez et al. 2004; Moing et al. 2004).
I.1.5.2. Principes de la détection par RMN
La spectroscopie par RMN est basée sur l’interaction entre le moment magnétique des
noyaux atomiques de molécules ou spin nucléaire avec un champ magnétique (Bo) statique, intense
et homogène.
27
Un noyau est observable en RMN seulement s’il possède un moment magnétique non nul,
c’est le cas des noyaux d’atome dont le numéro atomique (Z) ou la masse atomique (A) est impair.
Par exemple, le 12C, le 16O ou le 32S ne sont pas observables par RMN (I=0).
Placées dans un champ magnétique (Bo) statique, intense et homogène, la population des
spins nucléaires (I=1/2 pour l’exemple) va se répartir sur deux niveaux d’énergie. La transition
d’un niveau d’énergie à un autre est quantifiée. Lorsque le système est irradié par une radiation
électromagnétique de fréquence discrète de telle sorte qu’il y a transition des spins d’un niveau
d’énergie à l’autre, la condition de résonance est remplie. Cette fréquence est appelée la fréquence
de précession de Larmor. Chaque noyau de spin I non nul possède sa fréquence propre dépendante
de la valeur de son rapport gyromagnétique ( en rad/T.s) et de la valeur du champ magnétique (Bo
exprimé en tesla, T). Pour le spectromètre utilisé pendant la thèse, 500 MHz signifie que les
protons vont résonner aux environs de 500 MHz. Son champ magnétique est de 11,7 Tesla.
Afin de pouvoir mesurer l’aimantation globale M des spins nucléaires après leur excitation
par une radiation électromagnétique à la fréquence de Larmor, il faudra l’amener dans une
direction différente de celle de Bo. En effet, il est impossible de mesurer expérimentalement une
très faible aimantation noyée dans un champ magnétique de plusieurs Tesla. En RMN
impulsionnelle à transformée de Fourier, on applique sous la forme d’une impulsion, un champ de
radiofréquence B1 bref (quelques microsecondes) et intense (environ 10-2T) perpendiculaire à Bo,
afin de perturber instantanément, simultanément et identiquement tous les noyaux d’une même
espèce (1H, ou
13
C…). Les fréquences de résonances de tous les spins (non magnétiquement
équivalents) sont obtenues après transformée de Fourier du signal RMN, détecté après l’excitation
dans une bobine de réception perpendiculaire à Bo. Le signal RMN détecté au niveau de la bobine
puis digitalisé est appelé signal de précession libre (en anglais « free induction decay » ou FID).
La Figure 2 est une représentation schématique d’une expérience RMN 1D.
P1
AQ
DE
FID
Temps
D1
1 scan
Figure 2 : Représentation schématique d’une expérience RMN 1D et ses principaux paramètres.
Le P1 représente la durée de l’impulsion du champ de radiofréquence B1, DE est un délai
de préacquisition destiné à éviter les interférences entre l’émission et la réception, AQ est une
durée d’acquisition de la FID, D1 est un délai de relaxation. L’ensemble de ces étapes constitue un
28
scan. Pour travailler en conditions quantitatives, il est important de générer un pulse de 90º et de
laisser relaxer l’ensemble des protons des composés, de façon à ce que les intensités des
résonances ne saturent pas et qu’il existe une relation entre l’intensité du signal et la quantité de
spins.
Enfin les fréquences de résonances des noyaux constituant le spectre ne sont pas exprimées
en hertz mais en ppm, car les fréquences de résonance différentes suivant les aimants utilisés sont
normalisées par la fréquence de Larmor du noyau étudié (Hatch et al. 1974).
I.1.5.3. Avantages et inconvénients de la méthode d’analyses par RMN 1H
La méthode de RMN présente de nombreux avantages (Fan et al. 1986; Lommen et al.
1998; Fan et al. 2001), comme :
•
Une bonne résolution des signaux permettant la détection et l’identification de plusieurs
composés simultanément ;
•
Toute molécule contenant un H et suffisamment riche est détectable par RMN 1H.
•
Elle permet la détection de composés présents avec une large gamme de concentration
(facteur 10000) dans un spectre d’une solution complexe (grande dynamique de
sensibilité);
•
Un spectre permet d’identifier des composés à partir d’informations structurales ;
•
C’est un outil qui peut être couplé à toutes les techniques de séparation ;
•
Le déplacement chimique d’un 1H est une propriété chimique universelle ;
•
Elle est non-destructif.
Les inconvénients associés à cette technique sont :
•
Une faible sensibilité (besoin d’échantillons concentrés par rapport à autres techniques).
Ceci signifie qu’il faut un nombre suffisant de molécules pour la détection du signal. La
limite inférieure de détection pour la RMN est estimée à 5 nM, moins sensible que la
spectrométrie de masse, qui peut quantifier des molécules à une concentration de 10-12 mol
(Sumner et al. 2003; Krishnan et al. 2005) ;
•
Pour les molécules chargées, les déplacements chimiques obtenus dépendent du pH quand
celui−ci est proche du pKa ;
•
Les molécules chélatant les cations métalliques (Cu, Fe), comme le citrate et le malate sont
invisibles en RMN si un agent de chélatation comme l’EDTA n’est pas ajouté à
l’échantillon.
29
I.1.5.4. Applications de la méthode analytique par RMN 1H
Depuis une vingtaine d’années, la méthode analytique par spectroscopie RMN du proton est
devenue une technique utilisée dans tous les domaines scientifiques. Elle est utilisée pour l’étude
de la biologie végétale et animale (Gadian 1982), la médecine (Bernard et al. 1988), l’étude du
métabolisme de cellules eucaryotes isolées (Norton 1980), et procaryotes (Baxter 1985; Baxter
1985), de tissus animaux et végétaux (Gadian et Radda 1981; Ratcliffe 1987), de plantes entières
(Loughman et Ratcliffe 1984), les études de compartimentation cellulaire dans les tissus
biologiques (Belton et Ratcliffe 1985), l’analyse de la composition minérale de plantes (Ratcliffe
1986) et l’étude des transports ioniques chez les végétaux supérieurs (Loughman 1987).
Plus récemment, la spectroscopie par RMN 1H est devenue un outil analytique très utilisé
pour la détermination de profils métaboliques d’extraits végétaux . Elle a été utilisée pour la
caractérisation de profils métaboliques de jus de fruits (Le Gall et al. 2001 et 2003 ; Gil et al.
2000), pomme de terre (Defernez et al. 2004) et vins (Brescia et al. 2002, Košir et Kidri 2001). La
RMN est aussi utilisée pour l’étude des transformations des composés phénoliques responsables
par la couleur en solution modèle, dans le raisin et dans le vin (Guyot, Vercauteren et Cheynier
1996 ; Es-Safi et al. 2000 a et b ; Atasanova et al. 2002 ; Salas et al. 2004).
Dans notre étude, nous avons utilisé la RMN du proton et la CLHP pour analyser des
extraits de pellicules et de pulpes de baies de raisin. Les sucres, acides organiques, acides aminés
et les composés phénoliques sont considérés comme indicateurs de qualité qui peuvent nous
informer sur les processus de maturation du raisin. Ils varient en fonction de la date de récolte,
des conditions pédo−climatiques et des différentes techniques culturales (Roggero et al. 1988;
Puech et al. 1999; Zenarola et al. 1999).
I.1.6. Les outils statistiques appliqués à l’analyse des données
L’analyse statistique avec des méthodes multivariées ou multidimensionnelles a vu ces
dernières années de nombreuses applications dans les domaines de la recherche scientifique,
comme l’écologie, la linguistique, l’économie, la biologie, la chimie analytique, etc. Ces méthodes
permettent de visualiser sur un graphique, normalement avec deux ou trois axes, l’ensemble des
variables et des individus qui ont participé à la création du modèle statistique. Ces méthodes
permettent la confrontation de nombreuses informations, ce qui est beaucoup plus riche que leur
examen séparé. Le graphique peut être appelé de façon concise individus x variables quantitatives
(Escofier et Pages 1998).
30
Les méthodes les plus utilisées pour l’analyse de données issues des analyses
spectroscopiques et des profils métaboliques sont l’analyse en composantes principales (ACP) et
l’analyse par régression partielle (PLS) (Kemsley 1998). Dans notre étude, nous utiliserons ces
deux méthodes pour la discrimination des groupes d’échantillons étudiés.
L’ACP est une méthode qui permet la réduction du nombre de variables au travers de
l’obtention des composantes principales (PCs). Les PCs représentent la réduction, le résumé des
variables de départ. C’est une synthèse des interactions entre les différentes variables selon leurs
intensités et/ou concentrations. Ces sont des combinaisons des mesures d’origine optimisées pour
la discrimination des individus (Defernez et al., 2004). On recherche à expliquer la variabilité des
groupes de variables en n dimensions et n axes, sans a priori.
La PLS est une méthode assez utilisée dans le domaine biologique qui permet une
optimisation de la discrimination entre groupes de variables analysées sur un grand nombre
d’individus. Elle permet l’introduction du choix du groupe, ce qui permet une meilleure séparation
des groupes lors de la création du modèle statistique. Donc, la formation des groupes de variables
avec la PLS est faite a priori, étant optimisée pour la séparation sur le premier axe (Kemsley
1998). Elle permet également d’identifier les variables qui participent à la spécificité des groupes.
Un autre intérêt de ces méthodes statistiques est la possibilité d’introduire dans un modèle
précédemment créé, de nouveaux individus. Ceux-ci vont être projetés dans le graphique, sans
modifier la structure initiale des PCs ou PLS qui expliquaient les variations des groupes
d’échantillons. Les nouveaux individus seront visualisés dans le graphique de façon comparative
avec les individus et les variables précédemment analysées. Cela est très utile afin de pouvoir
décrire de lots de baies de raisins qui sont analysés sans connaître leur origine.
Dans notre étude, nous avons travaillé sur des raisins récoltés à maturité, destinés à
l’élaboration de vins. Nous nous intéressons à la détermination des composés biochimiques de la
pellicule et de la pulpe des raisins, afin de doser un grand nombre de métabolites qui formeront un
profil métabolique. Ceci nous a permis de mieux comprendre les effets terroir, climat et cultivar
sur la composition des baies. Cette détermination est effectuée en utilisant des méthodes
analytiques à haut débit, comme la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire du proton
(RMN 1H), la chromatographie liquide haute performance (CLHP) et les analyses considérées
comme de routine, le pH, le degré °Brix et l’acidité totale, et l’analyse des éléments minéraux sur
le moût des raisins. Ensuite, nous avons appliqué des méthodes statistiques multivariées sur les
résultats obtenus, comme l’analyse en composantes principales (ACP) et l’analyse par régression
partielle (PLS), afin de pouvoir discriminer les différentes origines des extraits de pellicules ou de
pulpes étudiés. Le but étant d’identifier des empreintes de profils métaboliques caractéristiques
des différents sols, climats et cépages utilisés dans ce travail, que nous décrirons pour la suite.
31
I.1.7 Les objectifs de la thèse
La qualité des baies de raisins est essentielle pour la qualité des vins. Les principaux
responsables de la qualité sont les sucres totaux, l’acidité totale, le pH et les polyphénols totaux.
L’analyse de ces composés est effectuée par des méthodes différentes, donnant le plus souvent des
résultats génériques et peu précis pour la caractérisation de lots de raisins.
L’obtention de profils métaboliques est une technique assez répandue aujourd’hui qui
permet de déterminer, au travers de l’étude des constituants métaboliques, les variations associées
aux génotypes utilisés ou aux conditions environnementales (Krishnan et al. 2005). L’étude du
profil métabolique permet de détecter des changements biochimiques inattendus et imprévisibles
sur les échantillons analysés (Fiehn 2002). Cette description est effectuée à un moment précis du
développement d’un système biologique.
Il existe actuellement plusieurs méthodes analytiques à haut débit (rapides et qui permettent
d’avoir beaucoup d’informations) utilisées avec succès afin de déterminer la composition
biochimique des végétaux. Parmi elles, nous pouvons citer la spectroscopie de masse (MS), la
spectroscopie
infra-rouge
avec
la
transformation
de
Fourier
(IR-FT),
les
méthodes
spectrométriques (UV, fluorescence), la spectroscopie de masse couplée avec la chromatographie
gazeuse (MS-GC) ou la liquide (MS-LC), la chromatographie liquide haute performance (CLHP)
et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN).
Dans le présent travail, nous avons utilisé les méthodes classiques, l’analyse des éléments
minéraux, la CLHP pour l’analyse des acides aminés et des composés phénoliques, et la RMN du
proton (RMN 1H) pour la détermination des composés majeurs (sucres, acides aminés et
organiques). La RMN 1H a été choisie parce que nous pouvons avoir beaucoup plus d’informations
sur la composition des extraits de raisins qu’avec d’autres noyaux. Avec ces méthodes, nous avons
pu caractériser le profil métabolique de pellicules et de pulpes de baies de raisins issues de
différents cépages, terroirs et millésimes. Nous avons étudié les effets de l’alimentation hydrique et
azoté des sols, climatiques (effet général et sur le microclimat des grappes) et l’effet génétique sur
la constitution biochimique de raisins.
32
A travers l’utilisation de méthodes statistiques multivariées, comme l’analyse en
composantes principales (ACP) et l’analyse par régression partielle (PLS), nous espérons trouver
des empreintes métaboliques caractéristiques de lots de raisins issus de vignobles dans le bordelais,
afin d’établir une corrélation entre leur composition et les différents types de sols, climats et
cépages.
Les résultats seront présentés sous la forme d’articles dans les chapitres II, III et IV. Dans le
chapitre V, nous montrerons les résultats de validation de la méthode analytique par profilage
métabolique, avec l’analyse d’extraits de pellicules et de pulpes de raisins issus de deux autres
millésimes, différentes parcelles et cépages.
33
I.2. MATERIEL ET METHODES
I.2.1. L’origine des échantillons étudiés
Dans notre étude, une large gamme d’échantillons a été sélectionnée afin de déterminer la
composition de pellicules et de pulpes de raisins issus de plusieurs appellations, terroirs et cépages,
récoltés sur trois millésimes dans le bordelais (2002, 2003 et 2004). Cette variabilité de conditions
a été choisie afin de représenter au mieux l’ensemble des facteurs de qualité trouvés dans les
vignobles bordelais. Les baies de raisins ‘Merlot noir’, ‘Cabernet-Sauvignon’, ‘Cabernet franc’ et
‘Sauvignon blanc’ ont été récoltées à maturité optimale, définie par leur teneur en sucres (degré
°Brix), l’acidité totale, le pH et les polyphénols totaux (cépages rouges), comme cela est pratiqué
habituellement dans les vignobles commerciaux à Bordeaux (Blouin 1992; Coombe 1992).
I.2.1.1. Les parcelles utilisées dans l’étude
I.2.1.1.1. Echantillons de l’appellation Bordeaux générique
Cette parcelle a été étudiée en 2002. Elle est constituée du cépage ‘Merlot noir’ greffé sur le
porte-greffe ‘Fercal’. Les plantes, âgées de 10 ans, sont sur un sol de texture sablo-limoneux. Les
sols sont bien alimentés en eau, facilement disponible pour les plantes, ne présentant pas de
contrainte hydrique pendant tous les stades du développement. La RU estimée est de 350 mm. La
profondeur des sols exploitée par les racines est de 2 mètres. L’espacement des souches est de 2 x
1,5 m (3300 souches/ha), une hauteur de feuillage de 0,9 m et une production estimée à 3 Kg de
raisins/souche, avec un rendement d’environ 10 tonnes/ha. Cette parcelle a servi à
l’expérimentation pour les effets du microclimat sur la composition des raisins (Chapitre IV).
I.2.1.1.2. Echantillons de l’appellation Saint-Emilion
Les échantillons de l’appellation Saint-Emilion ont été analysés pendant les trois
millésimes, 2002, 2003 et 2004. Les cépages sont le ‘Cabernet-Sauvignon’ (clone 191) et le
‘Cabernet franc’ (clone 326), greffés sur les porte-greffes ‘3309 C’ ou ‘101-14 MG’. Le cépage
‘Merlot noir’ a été prélevé en deux millésimes, 2003 et 2004. Les vignes ont environ 30 ans et sont
installées sur quatre types de sols : graveleux, argileux, sableux et calcaire (Van Leeuwen et al.
2004). Le sol graveleux contient plus de 50 % de graviers et cailloux dans toutes les couches
exploitées par le système racinaire. La terre fine est constituée majoritairement par le sable, la
profondeur du sol est limitée à 1,2 m, sur une couche imperméable, dont la réserve utile du sol est
estimée à 40 mm. Sur ce sol, la vigne subit une contrainte hydrique importante. Le sol argileux est
caractérisé par un sous-sol argileux assez compact, entre 0,3 et 0,6 m de profondeur. La quantité
d’argile présente est supérieure à 60 %, et la réserve utile du sol calculée est de 168 mm. L’eau
dans ce type de sol est modérément disponible pour les plantes. Le sol sableux présente une texture
34
sablo-argileuse au-dessous de 1 m de profondeur. La profondeur atteinte par les racine est de 1,35
m. Les racines sont toujours en contact avec une zone de capillarité au-dessus d’une nappe
phréatique pendant la saison de croissance, et la vigne est fortement alimentée en eau. L’ensemble
des caractéristiques des parcelles étudiées dans l’appellation Saint-Emilion sont montrées dans les
annexes (Figures 1a, 1b, 1c, 3a, 3b, 4a, 4b, et Tableaux 3, 4, 5 et 6, dans les annexes, d’après Van
Leeuwen et al. 2004; Tregoat 2003).
La densité de plantation est de 6000 souches/ha, les plantes de vignes espacées de 1,2 x 1,4
m, avec une orientation des rangs dans le sens nord-sud et un hauteur de feuillage de 1,1 m. Le
système de conduite est du type espalier, avec deux fils d’acier, l’un à 0,4 et l’autre à 1,2 m de
hauteur. La taille des vignes est du type Guyot simple. La production s’élève à 1,1 Kg par souche
et le rendement est de 6,6 tonnes/ha.
I.2.1.1.3. Echantillons de l’appellation Buzet
Les échantillons issus de l’appellation Buzet ont été analysés en 2002 et 2003. Le cépage
utilisé dans cette appellation est le ‘Merlot noir’, greffé sur plusieurs types de porte-greffes, le
‘420-A’, le ‘SO4’, le ’41-B’ ou le ‘3309 C’. Dix parcelles ont été sélectionnées dans huit propriétés
différentes. Les plantes ont 12 ans, les types de sols sont argileux, limoneux et argilo-limoneux
(Figure 5). La réserve en eau du sol, évaluée sur 2 m, montre une quantité très importante de 250 à
300 mm d’eau. Les vignes ont donc un régime hydrique peu ou pas limitant pendant toute la
période de végétation et de maturation, confirmé par les mesures du rapport isotopique du carbone
(13C/12C) du moût de raisins à la maturité. Le rendement calculé pour l’ensemble des 10 parcelles
est assez variable, en moyenne il est de 10 tonnes/ha. Les vignes sont plantées à 2,2 x 1,8 m, avec
une densité de plantation de 2500 souches/ha. La hauteur du feuillage est de 1 m. Le système de
conduite est du type espalier et la taille des vignes est du type Guyot simple. La somme des
températures est de 1500 °C pour le cycle productif. La pluviosité mesurée est de 200 mm pendant
toute la période.
35
100
90
Sand %
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Clay %
Figure 5 : Types de sols des 10 parcelles étudiées dans l’appellation Buzet pour le millésime 2002
et 2003. La texture du sol des parcelles varie d’argileuse, argilo-limoneuse à limoneuse, selon le
pourcentage en argiles et sables.
I.2.1.1.4. Echantillons de l’appellation Pomerol
Les échantillons de raisins de l’appellation Pomerol ont été analysés en 2003 et 2004. Dans
cette appellation, le cépage analysé est le ‘Merlot noir’, greffé sur le porte-greffe ‘3309 C’, les
plantes ont 30 ans. Deux parcelles de la même propriété sont analysées dans cette appellation. Les
plantes sont écartées de 1,4 x 1,1 m, avec une hauteur de feuillage de 1 m. La densité de plantes est
de 6400 souches/ha en moyenne, et la productivité est estimée à 6,5 tonnes/ha (Tregoat et al.
2002). La première parcelle se caractérise par un sol dont la texture est très argileuse, avec des
propriétés gonflantes (60 % de smectites). La présence d’éléments grossiers dans la couche de 0-40
cm (environ 20 %) est observée, ce sol étant classé comme un planosol. La réserve utile calculée
est de 136 mm. La deuxième parcelle est caractérisée par une texture graveleuse à gravelolimoneuse, avec la présence d’éléments grossiers (30 %), ce sol étant un brunisol. La réserve utile
calculée est de 100 mm. Les caractéristiques pédologiques des deux parcelles sont dans les Figures
6a et 6b et les Tableaux 7 et 8 dans les annexes.
36
I.2.1.1.5. Echantillons de l’appellation Médoc
Les échantillons de raisins de l’appellation Médoc ont été analysés en 2003 et 2004. Dans
cette appellation, le cépage ‘Merlot noir’, greffé sur le porte-greffe ‘Riparia Gloire de Montpellier’,
est analysé, les plantes ayant environ 20 ans. La texture du sol est très graveleuse (peyrosol), pour
la première parcelle. Le sol de la deuxième parcelle est caractérisé par une texture sableuse. Ce sol
est classé comme un neoluvisol. Les vignes sont espacées de 1,15 x 1,12 m, une haute densité de
plantation de 7700 souches/ha, avec une productivité d’environ 7,5 tonnes/ha (Tregoat et al. 2002).
La réserve utile des sols est de 150 mm. Les caractéristiques pédologiques des deux parcelles sont
rapportées dans les Figures 7a et 7b et les Tableaux 9 et 10 dans les annexes.
I.2.1.1.6. Echantillons de l’appellation Pessac-Léognan
Les échantillons de raisins de l’appellation Pessac-Léognan ont été analysés sur trois
millésimes, 2002, 2003 et 2004. Le cépage ‘Merlot noir’ étudié dans cette appellation est greffé
sur les porte-greffes ‘Fercal’ et ‘420 A’, sur trois parcelles différentes. Les plantes ont 20 ans, avec
une densité de plantation de 6500 souches/ha, avec un écartement de 1,5 x 1 m et une hauteur de
feuillage de 1 m. Le rendement est d’environ 8 tonnes/ha. Les trois parcelles sont graveleuses,
sablo-graveleuses ou argileuses. L’une des parcelles est bien alimentée en eau. La réserve utile
calculée est de 250 mm pour l’ensemble de la parcelle (moyenne de six échantillons). Les
échantillons ont été prélevés sur l’ensemble de cette parcelle, avec des sols variant de sableux,
graveleux à argileux dans la même parcelle. Les sols de deux autres parcelles sont classés comme
peyrosol ou brunisol, avec une alimentation en eau considérée comme faible. La réserve utile
calculée est de 100 mm. Les caractéristiques pédologiques des deux dernières parcelles sont dans
les Figures 8a et 8b et les Tableaux 11 et 12 dans les annexes.
I.2.1.1.7. Echantillons de l’appellation Graves
Le cépage ‘Sauvignon blanc’ a été étudié en 2002 dans l’appellation Graves. Il est greffé
sur les porte-greffes ‘3309 C’, ‘101-14 MG’ et ’41-B’. Trente-six échantillons ont été prélevés sur
3 propriétés différentes (3 répétitions de 12 échantillons chacune, 100 baies par échantillon). Les
sols sont sablo-graveleux sur une roche calcaire et argilo-calcaire. Les plantes sont âgées de 10 ans.
La densité de plantation est de 6000 plantes/ha, avec 1.6 x 1 m d’espacement, et une hauteur de
feuillage de 1 m. Le rendement moyen a été de 7 tonnes/ha. La réserve utile des sols est de 200
mm.
Le Tableau 13 rassemble toutes les informations concernant les divers échantillons, avec les
appellations, les cépages, les porte-greffes, l’âge des plantes, les types de sols et le nombre
d’échantillons.
37
Tableau 13 : Présentation des appellations, cépages, porte greffes, âge des plantes, conditions
pédologiques et nombre d’échantillons issus des parcelles étudiées en 2002, 2003 et 2004 dans
différents vignobles de la région de Bordeaux. Un échantillon correspond à 100 baies.
Appellation
Cépage
Porte-greffe
Age
Sol
(ans)
Bordeaux
‘Merlot noir’
‘Fercal’
Nombre
d’échantillons
10
Sablo-
83
limoneux
Saint-
‘Merlot noir’,
‘3309 C’ ou
Emilion
‘Cabernet-
‘101-14 MG’
Buzet
30
Argileux,
graveleux,
Sauvignon’ et ‘C.
sableux et
franc’
calcaire
‘Merlot noir’
‘420-A’, ‘SO4’,
132
12
Argileux,
‘41-B’, ‘3309 C’
54
Argilolimoneux
et limoneux
Pomerol
‘Merlot noir’
‘3309 C’
30
Argileux et
12
gravelolimoneux
Médoc
‘Merlot noir’
‘Riparia Gloire
20
de Montpellier’
Pessac-
‘Merlot noir’
‘Fercal’
Sableux et
18
graveleux
16
Léognan
Sableux,
61
graveleux et
argileux
Graves
‘Sauvignon blanc’
‘3309 C’,
10
Argilo-
‘101-14 MG’
calcaire,
et ’41-B’
sableux et
36
graveleux
TOTAL
396
I.2.2. Les caractéristiques climatiques des trois millésimes étudiés
Un modèle de bilan hydrique (Lebon et al. 2003) permet de synthétiser les données
climatiques des différents millésimes dans les principales zones viticoles de la région. Le millésime
38
2002 a été caractérisé comme humide d’après l’indice de stress calculé pour une réserve utile des
sols de 150 mm (Van Leeuwen et al. 2004). Le millésime 2003 a été sec et chaud, avec des
températures maximales enregistrées de 40-45 °C. Ceci a conduit à anticiper les dates de vendange
en 15-20 jours par rapport à la normale. Le millésime 2004 a été intermédiaire entre les deux
précédents.
La Figure 9 montre une comparaison entre six appellations étudiées, par rapport à l’indice
de stress. L’indice de stress exprime l’état d’alimentation hydrique de la vigne. Les chiffres
proches de 1 correspondent à un faible stress de la vigne, tandis que les valeurs proches de 0
indiquent un stress élevé. Une comparaison entre les stades de développement de la vigne pour les
trois millésimes est montrée dans quatre appellations, Buzet, Pessac-Léognan, Pauillac et SaintEmilion (Figure 10). Il est intéressant de noter la grande variabilité de la durée du cycle végétatif
de la vigne. Le millésime 2002 a été le plus tardif, lié à l’effet de la somme des températures sur le
développement de la vigne. En revanche, le millésime 2003 a été le plus précoce, en réponse aux
fortes températures.
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
ISvM-02
ISvM-03
ISvM-04
Buzet
Médoc
Pessac- SaintLéognan Emilion
SaintEmilion
Pomerol
Figure 9 : Comparaison de l’indice de stress (pourcentage de satisfaction des besoins en eau) de la
vigne (ISv) des cinq appellations étudiées (Buzet, Médoc, Pessac-Léognan, Saint-Emilion (2
parcelles) et Pomerol) sur les trois millésimes (M) 2002 (02), 2003 (03) et 2004 (04). Les valeurs
proches de 1 indiquent un faible stress, et celles proches de 0 indiquent un stress important.
39
Jours
300
Buzet
250
Pessac-Léognan
200
Saint-Emilion
Pauillac
150
100
50
0
Déb- Déb- Déb- Flo02
03
04
02
Flo- Flo- Vér- Vér- Vér- Mat- Mat- Mat03
04
02
03
04
02
03
04
Figure 10 : Comparaison de la durée du cycle végétatif (en jours) de la vigne en 2002 (02), 2003
(03) et 2004 (04) L’axe x représente les stades phénologiques débourrement (déb), floraison (flo),
véraison (vér) et maturation (mat) dans quatre appellations (Buzet, Pessac-Léognan, Pauillac et
Saint-Emilion), sur les trois millésimes. L’axe y représente le numéro du jour auquel la vigne a
atteinte les stades phénologiques.
I.2.3. La récolte des baies de raisins
Les raisins utilisés dans cette étude sont récoltés à la maturité optimale, selon les analyses
réalisées par les propriétaires et les responsables techniques des vignobles (Blouin 1992). Les
échantillons sont placés dans des boîtes isothermes à environ 8 °C. Ensuite ils sont amenés au
laboratoire afin de procéder à la séparation de la pellicule et de la pulpe. La séparation des
pellicules et pulpes et les extractions sont effectuées environ 15 heures après le prélèvement dans
les vignobles. Les étapes du processus sont détaillées ci−dessous.
I.2.4. Séparation de la pellicule et de la pulpe
Les baies sont pesées. Ensuite la séparation des pellicules et des pulpes plus pépins est
réalisée manuellement. Les deux tissus sont conservés dans la glace afin de limiter les processus de
dégradation (Figure 11a). Pour éviter les processus d’oxydation, dans le mélange de pulpe plus
pépins, 2 mM de metabisulfite sont ajoutés par litre de moût, et les pulpes sont extraites tout de
suite. Les pellicules sont pesées et congelées à – 80°C jusqu’au moment des extractions.
I.2.5. Extraction des composés du raisin solubles en solution alcoolique
40
I.2.5.1. Pulpes et pépins
Les pulpes et les pépins de 100 baies sont mis dans l’éthanol à 96 %. Le mélange pulpe +
pépins + éthanol est mis en agitation par les ultra sons (ELMA Transsonic) pendant 5 min puis
agité à froid avec l’aide d’un agitateur magnétique pendant 15 min (Figure 11b). Nous avons voulu
extraire seulement les composés de la pulpe, pas des pépins. L’échantillon est amené au volume de
250 mL dans une éprouvette avec l’éthanol 96 % puis centrifugé à 5000 rpm (5000 g) pendant 5
min. Ensuite le surnageant est récupéré et congelé à – 80°C jusqu’au moment de la préparation
pour l’analyse RMN.
I.2.5.2. Pellicules
Les pellicules de 100 baies sont broyées en présence de 100 mL d’éthanol à 96 %, avec un
broyeur à hélice (Waring Blender) à faible vitesse pendant 2 min puis avec le Polytron pendant 2
min. Le mélange pellicules + éthanol est agité à froid pendant 1 heure avec un agitateur
magnétique. L’extrait est amené au volume de 250 mL dans une éprouvette avec de l’éthanol 96 %
puis centrifugé à 5000 rpm (5000 g) pendant 5 min. Le surnageant est congelé à – 80°C.
11a
11b
Figure 11a et 11b : Séparation des pellicules et des pulpes de baies de raisins (11a) et extraction
par agitation des pellicules (pendant 1 heure) et des pulpes (pendant 15 min) (11b) dans l’éthanol.
Pendant tout le protocole d’extraction les échantillons sont maintenus dans la glace pour éviter les
processus de dégradation.
Deux types de solvants ont été testés, le méthanol et l’éthanol. L’efficacité d’extraction est
identique entre les deux solvants, au regard des résultats obtenus avec la mesure de la densité
41
optique (DO520 nm) et les données acquises par RMN 1H. Donc, nous avons adopté l’éthanol pour
la suite du travail afin de diminuer les risques de toxicité.
I.2.6. Détermination du régime hydrique des sols par la discrimination isotopique du 13C/12C
L’évaluation de l’alimentation hydrique des parcelles a été effectuée par l’analyse
isotopique
13
C/12C, appelé
13
C, basée sur le sucre du moût des raisins récoltés à maturité (Van
Leeuwen et al. 2001; Gaudillére et al. 2002). Cette mesure intègre l’alimentation hydrique de la
parcelle pendant la maturation des raisins et les conditions climatiques. Le rapport
13
C/12C est
d’autant plus négatif quand il y a moins de contrainte hydrique (valeurs entre –20 et –30)
(Gaudillère et al. 1999; Van Leeuwen et al. 2001).
Nous avons établi trois groupes de parcelles selon les valeurs du
13
C déterminées. Les
parcelles humides ont des valeurs plus négatives (au-dessus de –25,5). Les parcelles avec une
alimentation hydrique moyenne sont celles présentant
considérées comme sèches sont celles avec un
13
13
C entre –24,5 et –25,5. Les parcelles
C moins négatif (au-dessous de –24,5).
I.2.7. Acquisition de profils métaboliques de baies de raisins par RMN 1H : mise au point de
la méthode
I.2.7.1. Paramètres d’acquisition des spectres RMN 1H
Nous avons déterminé les conditions d’acquisition des spectres de façon à interpréter les
variations des résonances quantitativement. La recherche du paramètre T1 (temps de relaxation
longitudinale) permet de déterminer les conditions optimales pour les analyses quantitatives. Le T1
le plus long observé était de 5 secondes. Un délai de 5*T1 (25 s) est donc nécessaire entre deux
pulses pour pouvoir interpréter les variations d’intensité des résonances en variations de spins
nucléaires.
Les spectres sont enregistrés avec un spectromètre RMN Bruker type Avance 500 MHz
(11,7 Tesla) équipé d’une sonde inverse 5 mm 1H-13C et d’un passeur d’échantillons (Figure 12).
Les spectres RMN sont enregistrés avec un angle de basculement de 90° (P1 8 µsec, PL1 -3
dB), un délai de relaxation (D1) de 25 s, une fenêtre spectrale (SWH) de 6009 Hz, et une taille
mémoire de 32 K, un temps d’acquisition (AQ) de 2,73 s et un nombre de scans (ns) de 64. Le
temps d’acquisition de chaque spectre est de 29 min. Avant toute acquisition, le champ est
verrouillé grâce au deutérium du D2O, puis son homogénéité est optimisée. L’analyse est réalisée
lorsque la largeur à mi-hauteur de l’eau résiduelle est égale ou inférieure à 12 Hz. Les spectres sont
obtenus après par transformée de Fourier du signal de précession libre, après multiplication
exponentielle de 0,3 Hz. Le phasage et la correction de ligne de base sont réalisées manuellement.
42
L’échelle des déplacements chimiques est calibrée par rapport au signal de l’acide [2,2,3,3-d4]
(triméthyl)propionique (TSP) à 0 ppm (Belton et al, 1996).
Figure 12 : Spectromètre RMN Bruker type Avance 500 MHz. Plateau technique métabolome
fluxome de l’IFR 103 (IBVM/INRA-Universités de Bordeaux, Villenave d’Ornon Cedex).
I.2.7.2. Préparation des extraits pour l’analyse par RMN 1H
Un millilitre d’extrait de pellicules et/ou de pulpes est mis à sécher sous vide (Speed vac).
Après 5 heures, l’extrait sec est repris avec 1 mL de tampon oxalate 200 mM à pH 4,0 puis mis à
sécher à nouveau (Speed vac), pendant 6 heures afin de réduire le pic d’éthanol dans nos spectres.
Nous avons choisi de travailler à pH 4,0 car à ce pH il y a une meilleure séparation de l’ensemble
des résonances des acides organiques, en particulier pour les acides malique et tartrique qui
résonnent entre 4,40 et 4,44 ppm.
Après le deuxième séchage au speed vac, les échantillons sont repris avec 500 µL de D2O et
homogénéisés avec un agitateur vibrant (Vortex). Les échantillons sont ensuite mis à agiter dans
une chambre froide à 4 °C pendant 4 heures, afin de favoriser les échanges entre l’eau et le D2O
43
pour diminuer le pic d’eau résiduelle dans le spectre. Les molécules d’eau libre sont éliminées
facilement par la lyophilisation. Les molécules d’eau liées aux composés, sont plus difficiles à
éliminer. Il est nécessaire d’assurer une agitation au contact avec du D2O afin d’améliorer les
échanges et de permettre une meilleure élimination de l’eau légère par lyophilisation. Un temps de
contact de 10 min sans agitation a été testé, le pic d’eau résiduelle était trop important (Figure 13
B). Un temps d’échange de 4 h avec agitation a donné de meilleur résultat (Figure 13 A). Des
spectres de RMN 1H d’extraits avec ou sans l’étape d’échange entre l’eau légère et le D2O sont
présentés (Figure 13).
H2O
H2O
A
B
Figure 13 : Spectres RMN 1H de pellicules de baies de ‘Merlot noir’ repris dans D2O. A gauche
(A) le signal de l’eau a diminué, grâce aux échanges H2O−D2O pendant 4 heures d’agitation à
froid. A droite (B) avec un temps de contact sans agitation de 10 minutes. Les spectres ne sont pas
à la même échelle, mais le pic de l’eau est présenté entièrement dans chaque spectre pour montrer
l’efficacité de l’échange avec 4 heures de contact.
Ensuite, le pH de la solution est vérifié et ajusté si nécessaire à 4,0 par titration avec KOH
ou HCl dans D2O. Les échantillons sont ensuite lyophilisés pendant 48 heures. Les extraits secs
lyophilisés sont repris dans 500 µL D2O. Cinq µL de TSP sont mis dans le tube RMN de 5 mm (à
44
2% v/v dans le D2O pour être à 0,02% dans le tube) afin de caler les résonances des spectres, car la
résonance du TSP est à 0 ppm. L’échantillon est transféré du tube eppendorf dans le tube RMN 5
mm, puis les paramètres d’acquisition sont vérifiés. Enfin l’acquisition des spectres est lancée.
Chaque série comporte 24 échantillons grâce à l’utilisation d’un passeur automatique. Un shime
manuel est effectué sur le premier des échantillons de la série, pour les autres, le shime est fait
automatiquement.
I.2.7.3. L’identification des résonances dans les spectres RMN 1H
L’identification des résonances présentes dans les spectres est réalisée à partir des
références bibliographiques mais aussi par co−localisation des signaux avec l’ajout des standards
commerciaux (Fan 1996; Moing, Maucourt et al. 2004). Les pics inconnus sont vérifiés en réalisant
des ajouts avec une concentration connue, au maximum deux fois la concentration qui est trouvée
dans le spectre de l’extrait. La corrélation adoptée pour l’ajout des standards et la confirmation des
pics est: [(Iét)/(Iext)*(Cét)/(Cext)], où Iét est l’intégrale du pic soupçonné dans l’étalon, Iext est
l’intégrale du pic dans l’extrait analysé, Cét est la concentration de l’étalon utilisé et Cext est la
concentration de l’extrait. Une base de données d’une centaine de spectres de référence a été
constituée et a permis d’identifier 19 métabolites dont le glucose, le fructose, le saccharose, la
proline, l’arginine, l’alanine, le gaba, la thréonine, la valine, la leucine, l’isoleucine, la glutamine,
l’acide tartrique, l’acide malique, l’acide lactique, l’acide citrique, l’acide succinique, l’acide
fumarique et l’acide formique. La Figure 14 montre l’exemple de la co-localisation des molécules
dans le spectre RMN, avec la confirmation de la présence de l’alanine, de la thréonine et de l’acide
lactique.
lactate
thréonine
alanine
45
Figure 14 : Spectre de RMN 1H d’un extrait de pellicules de ‘Merlot noir’ repris dans le D2O. Le
spectre avant l’ajout est en noir et en rouge après l’ajout des trois standards, alanine, acide lactique
et thréonine.
Le Tableau 14 montre tous les composés biochimiques identifiés dans les spectres RMN 1H
de pellicules et de pulpes de baies de raisins. Pour chaque composé, sont indiqués le groupe
chimique, la forme du pic (singulet (s), doublet (d), doublet de doublets (dd), triplet (t) ou multiplet
(m)), le nombre de protons magnétiquement équivalents et les valeurs des déplacements chimiques
1
H (ppm) utilisés pour l’identification des différents composés dans les profils métaboliques.
Tableau 14 : Composés identifiés dans les spectres de RMN 1H. L’attribution des signaux à été
réalisée à l’aide des valeurs des déplacements chimiques et à leur multiplicité (singulet (s), doublet
(d), doublet de doublets (dd), triplet (t) ou multiplet (m)).
46
1
H Multiplicité Nombre de 1H
1
Composé
Groupe
Isoleucine
C5H3
t
3
0.93
Leucine
C5H3+C6H3
t
6
0.95
Valine
C4H3 + C5H3
d
6
1.04
Thréonine
C4H3
d
3
1.32
Alanine
C3H3
d
3
1.48
Arginine
C3H2
m
2
1.60-1.78
Proline
C4H2 + C3Ha
m
3
1.95-2.01
Glutamine
C4H2
m
2
2.45
C3H2
m
2
1.94
C4H2
t
2
2.45
C2H2
t
2
3.02
Acide formique
C1H
s
1
8.36
Acide Fumarique
C2H + C3H
s
2
6.69
Acide lactique
C3H3
d
3
1.36
½(C2H2 + C4H2)
d
2
2.74
½(C2H2 + C4H2)
d
2
2.87
C2Ha
dd
1
2.66
C2Hb
dd
1
2.83
C3H
dd
1
4.41
Acide succinique
C2H2 + C3H2
s
4
2.61
Acide tartarique
C2H + C3H
s
2
4.43
GABA
Acide citrique
Acide malique
Fructose
H (ppm)
m
4.09-4.12
m
3.98-4.02
m
3.63-3.73
Glucose
C1H
d
1
4.64
Glucose
C1H
d
1
5.23
Glucopyranosyl-C1H
d
1
5.41
Fructofuranosyl-C3H
d
1
4.21
Saccharose
La Figure 15 montre un exemple de spectre RMN 1H obtenu à partir d’un extrait de pellicule de
‘Merlot noir’ solubilisé dans le D2O. Dans la zone des composés phénoliques, entre 5,5 et 8,5 ppm,
peu de signaux ont été repérés, car ces composés présentent une grande complexité, avec des
47
couplages entre molécules, l’identification des résonances est complexe (Pedersen et al. 1993 ;
Pedersen et Andersen 1994 ; Gil et al. 2003).
Eau
résiduelle
x 100
8.4
8.2
8.0
7.8
7.6
7.4
7.2
7.0
x 50
6.8
6.6
6.4
6.2
6.0
ppm
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
ppm
TSP
10
9
8
7
6
5
4
3
Composés phénoliques
2
1
ppm
Acides aminés
Sucres et acides organiques
Figure 15 : Spectre de RMN 1H d’un extrait de pellicules de raisin, dans le D2O. Entre 0,5 et 3 ppm
se trouvent des acides aminés et quelques acides organiques, entre 3 et 5,6 ppm les sucres et
quelques acides organiques et entre 5,5 et 8,5 ppm les composés aromatiques, dont les composés
phénoliques. La référence TSP utilisée pour caler l’ensemble des résonances du spectre résonne à 0
ppm. A 4,8 ppm résonne le pic d’eau résiduelle.
I.2.8. L’analyse des composés du raisin par CLHP
Les analyses des acides aminés et des composés phénoliques sont réalisées à l’aide d’une
CLHP. Cette méthode est utilisée afin de compléter l’étude des profils métaboliques des raisins. La
48
CLHP a été utilisée par plusieurs auteurs pour la détermination de ces composés (Cohen et
Michaud 1993; Shahrzad et Bitsch 1996; Vinas et al. 2000; Sakkiadi et al. 2001; Souto et al. 2001;
Tsanova-Savova et Ribarova 2002; Hilbert 2002; Hilbert et al. 2003).
I.2.8.1. Détermination des acides aminés par la méthode CLHP
L’analyse des acides aminés est effectuée selon la méthode décrite par Cohen et Michaud
(Cohen et Michaud 1993), avec quelques modifications. A partir des extraits éthanoliques de
pellicules de raisins, 10 µL sont mélangés à 70 µL de tampon borate 0,2 M à pH 8,8 et 20 µL de
réactif AccQ (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl). L’ensemble est chauffé pendant 10 min à
55°C. Après dilution au quart, 20 µL de l’extrait sont injectés dans le système CLHP Waters 2690
Alliance. Pour les échantillons de pulpe, les extraits sont dilués 5 fois avant le mélange avec le
borate et le réactif AccQ, car l’intensité des pics dans le chromatogramme est trop importante. La
séparation est réalisée sur une colonne Nova-Pack C18 AccQ-Tag (ref WAT052885, Waters,
Milford, USA) de 19 cm x 3.9 mm, de 4 µm de taille de particules, équipée d’une pré-colonne
Nova-Pack C18 (ref WAT044380, Waters, Milford, USA) de 2 cm x 3.9 mm. L’ensemble colonneprécolonne est placé dans un four à 37°C. L’élution est réalisée avec un débit de 1 mL.min-1 avec
un gradient binaire. L’éluant A est un tampon acétate de sodium à 140 mM ajusté à pH 5,7.
L’éluant B est constitué d’acétonitrile et d’eau MilliQ (60/40 v/v). Les éluants sont filtrés sur une
membrane en polypropylène GHP de 0,45 µm (Pall Gelman Corporation, Ann Arbor, USA). Le
gradient est indiqué dans le Tableau 16. La détection des acides aminés est faite par fluorimétrie,
avec des longueurs d’onde d’excitation de 250 nm et d’émission de 395 nm (spectrophotométrie à
fluorescense 474 Waters, San Jose, USA). Les acides aminés sont quantifiés à l’aide du logiciel
Millenium32, version 3.05 (Waters, Milford, MA, USA), en référence à des standards externes
(Sigma, St Louis, MO, USA). Vingt acides aminés sont utilisés pour caractériser le profil
métabolique des extraits de pellicules et de pulpes : aspartate, glutamate, asparagine, sérine,
glycine, glutamine, histidine, threonine, alanine, acide -amino-n-butyrique (GABA), proline,
arginine, tyrosine, cystéine, valine, méthionine, isoleucine, leucine, lysine et phénylalanine. Un
chromatogramme des 20 acides aminés est montré (Figure 16) avec les temps de rétention
respectifs (Tableau 17).
Tableau 16 : Gradient d’élution pour l’analyse des acides aminés d’extraits de pellicules et de
pulpes du raisin par CLHP.
Temps (min)
Débit (mL/min)
Eluant A (%)
Eluant B (%)
49
Initial
1
100
0
1
1
98
2
14
1
95
5
37
1
78
22
42
1
78
22
52
1
75
25
56
1
0
100
58
1
100
0
67
1
100
0
Figure 16 : Chromatogramme CLHP des acides aminés d’un extrait de pulpe de ‘Merlot noir’
obtenu avec des longueurs d’onde d’excitation de 250 nm et d’émission de 395 nm. Le temps
d’acquisition d’un chromatogramme est de 55 min, plus 17 min pour le nettoyage de la colonne.
L’identification des acides aminés et les temps de rétention sont présentés dans le Tableau 17.
Acide aminé
Temps de rétention (min)
aspartate (asp)
10,7
glutamate (glu)
13,4
sérine (ser)
17,2
50
asparagine (asn)
17,5
glycine(gly)
19,3
glutamine (gln)
20,2
histidine (his)
21,2
thréonine (thr)
23,8
arginine (arg)
24,1
alanine (ala)
24,9
gaba
26,5
proline (pro)
28.0
tyrosine (tyr)
34,3
cystéine (cys)
35,6
valine (val)
38,9
méthionine (met)
37,3
isoleucine (ile)
42,8
leucine (leu)
44,3
lysine (lys)
44,9
phénylalanine (phe)
48,5
Tableau 17 : Les 20 acides aminés identifiés et quantifiés dans les extraits de pellicules et de
pulpes de raisins et les temps de rétention respectifs.
I.2.8.2. Détermination des composés phénoliques par la méthode CLHP
L’analyse des composés phénoliques des extraits de pellicules et pulpes de raisins est
réalisée à travers l’adaptation de la méthode décrite par ROGGERO, ARCHIER et COEN
(Roggero et al. 1992). Un millilitre d’un extrait éthanolique de pellicules ou de pulpes de raisins est
séché sous vide (Speed-Vac, Savant, USA). Ensuite il est repris avec 0,5 mL de méthanol acidifié à
0,1% HCl (v/v). Pour les analyses par CLHP, les extraits sont filtrés sur des filtres seringues en
polypropylène de 0.45 µm (GHP Acrodisc, Pall Gelman Corporation, Ann Arbor, USA). 20 µL
d’extrait de pellicules ou de pulpes sont injectés dans une chaîne CLHP Waters comprenant un
modèle de séparation (Alliance 2690) connecté à un détecteur UV-Visible (détecteur 2487 à double
longueur d’onde, Waters, Milford, MA, USA). La séparation est réalisée à température ambiante
sur une colonne Ultrasphere ODS de 25 cm x 4.6 mm, 5 mm de taille de particule, équipée d’une
précolonne Ultrasphere ODS de 4.5 cm x 4.6 mm (Beckman Instruments Inc., Fulleron, CA, USA).
L’élution est réalisée avec un débit de 0.6 mL min-1 avec un gradient binaire. L’éluant A est
51
constitué d’eau acidifiée à 10% d’acide formique (v/v). L’éluant B est constitué d’eau MilliQ,
d’acétonitrile et d’acide formique (60/30/10 v/v/v). Les deux éluants sont filtrés sur une membrane
en polypropylène GHP de 0.45 µm (Pall Gelman Corporation, Ann Arbor, USA). Le gradient
utilisé est indiqué dans le Tableau 18.
Tableau 18 : Gradient d’élution pour l’analyse des composés phénoliques d’extraits de pellicules et
de pulpes de raisins par la méthode CLHP.
Temps (min) Débit (mL/min) Eluant A (%) Eluant B (%) Courbe
0
0.6
100.0
0.0
70
0.6
85.0
15.0
6
75
0.6
20.0
80.0
6
80
0.6
20.0
80.0
6
L’acquisition des chromatogrammes est effectuée avec deux longueurs d’onde, à 520 nm
pour la détermination des anthocyanes (Goiffon et al. 1991), et à 360 nm pour la détermination des
flavonols (Price et al. 1995). La quantification des anthocyanes est réalisée en utilisant une courbe
d’étalonnage établie sur la malvidine-3-glucoside (Extrasynthèse, Lyon, France), les autres
anthocyanes sont quantifiées en équivalent malvidine-3-glucoside. Pour les flavonols, la
quantification est effectuée par utilisation d’une courbe d’étalonnage de la quercetine-3-glucoside
(Extrasynthèse, Lyon, France), les résultats étant exprimés en équivalent quercetine-3-glucoside.
La confirmation des pics des composés phénoliques est réalisée grâce aux chromatogrammes des
standards des anthocyanes et des flavonols (Extrasynthèse, Lyon, France). Nous avons identifié
dans les chromatogrammes à 520 nm 15 anthocyanes : delphinidine-3-glucoside, cyanidine-3glucoside, petunidine-3-glucoside, paeonidine-3-glucoside, malvidine-3-glucoside, delphinidine-3(acetyl)-glucoside, cyanidine-3-(acetyl)-glucoside, petunidine-3-(acetyl)-glucoside, paeonidine-3(acetyl)-glucoside,
malvidine-3-(acetyl)-glucoside,
cyanidine-3-(p-coumaryl)-glucoside,
delphinidine-3-(p-coumaryl)-glucoside,
pétunidine-3-(p-coumaryl)-glucoside,
paeonidine-3-(p-
coumaryl)-glucoside et malvidine-3-(p-coumaryl)-glucoside. Nous avons identifié sept flavonols
dans les chromatogrammes à 360 nm : myricetin-3-glucoside, rutine, quercetine-3-glucoside,
myricetine, kaempferol-3-glucoside, isorhamnetine-3-glucoside et quercetine, tandis que 13 autres
n’ont pas été identifiés, avec l’aide de chercheurs de l’INRA d’Angers (x1, x2, x3, x4, x5, x6, x7, ,
x8, x9, x10, x11, x12 et x13). Deux chromatogrammes, l’un pour les flavonols identifiés et
52
quantifiés à 360 nm dans les extraits de pellicules et de pulpes (Figure 17), et l’autre pour les
anthocyanes identifiées et quantifiées dans la pellicule à 520 nm (Figure 18) sont montrés, avec les
temps de rétention respectifs (Tableaux 19 et 20).
Figure 17 : Chromatogramme CLHP des composées phénoliques d’un extrait de pellicules de
‘Merlot noir’ obtenu à la longueur d’onde de 360 nm. Seuls les flavonols sont quantifiés, les
anthocyanes (quantifiées à 520 nm) et acides phénoliques n’ont pas été considérés. Le temps
d’acquisition d’un chromatogramme est de 70 min, plus 10 min pour le nettoyage de la colonne.
Pour les identifications des composés et des temps de rétention, voir le Tableau 19.
Composé phénolique (flavonol) Temps de rétention (min)
Myricetine-3-glucoside
24,5
X1
26,0
X2
27,1
X3
29,9
53
X4
31,9
X5
32,5
Rutine
33,1
Quercetine-3-glucoside
33,8
X6
36,3
X7
38,9
Myricétine
41,9
Kaempférol-3-glucoside
42,6
Isorhamnétine-3-glucoside
460
X8
43,2
X9
47,4
X10
50,2
X11
55,0
X12
58,9
X13
59,5
Quercetine
63,7
Tableau 19 : Les 20 composés phénoliques (flavonols) identifiés et quantifiés dans les extraits de
pellicules et de pulpes de raisins, avec les temps de rétention respectifs.
54
Figure 18 : Chromatogramme CLHP des composées phénoliques d’un extrait de pellicules de
‘Merlot noir’ obtenu à la longueur d’onde de 520 nm. Seuls les anthocyanes sont quantifiées. Le
temps d’acquisition d’un chromatogramme est de 70 min, plus 10 min pour le nettoyage de la
colonne. Pour les identifications des composés et des temps de rétention, voir le Tableau 20.
Composé phénolique (anthocyanes)
Temps de rétention (min)
Delphinidine-3-glucoside (Dp-gl)
15,157
Cyanidine-3-glucoside (Cy-gl)
19,495
Petunidine-3-glucoside (Pt-gl)
23,028
Paeonidine-3-glucoside (Pn-gl)
28,119
Malvidine-3-glucoside (Mv-gl)
31,018)
Delphinidine-3-(acetyl)-glucoside (Dp-gl-ac)
34,720
Cyanidine-3-(acetyl)-glucoside (Cy-gl-ac)
40,822
Petunidine-3-(acetyl)-glucoside (Pt-gl-ac)
44,174
Peonidine-3-(acetyl)-glucoside (Pn-gl-ac)
50,638
Malvidine-3-(acetyl)-glucoside (Mv-gl-ac)
53,017
Delphinidine-3-(p-coumaryl)-glucoside Dp-gl-cou)
56,300
Cyanidine-3-(p-coumaryl)-glucoside (Cy-gl-cou)
57,158
Petunidine-3-(p-coumaryl)-glucoside (Pt-gl-cou)
60,735
Peonidine-3-(p-coumaryl)-glucoside (Pn-gl-cou)
65,440
Malvidine-3-(p-coumaryl)-glucoside] (Mv-gl-cou)
67,150
Tableau 20 : Les 15 anthocyanes identifiées et quantifiées dans les extraits de pellicules et de
pulpes de raisins, avec les temps de rétentions respectifs.
55
III. RESULTATS
Les résultats obtenus sont présentés sous forme d’articles sous presse et soumis dans les
chapitres II, III et IV. Le cinquième présente l’analyse chimiométrique appliquée aux données
acquises par RMN 1H et CLHP des acides aminés et composés phénoliques, issues de trois
millésimes, différents cépages et terroirs dans le bordelais, pour la détermination de profils
métaboliques de pellicules et de pulpes de raisins.
56
CHAPITRE II
57
CHAPITRE II : DETERMINATION D’EMPREINTES METABOLIQUES DE BAIES DE
RAISINS ISSUES DE DIFFERENTES PARCELLES A BORDEAUX PAR LA METHODE
RMN 1H
1
H NMR Metabolic Fingerprints of Grape Berries Produced in Different Plots in Bordeaux,
France
G.E. Pereiraa; G Hilberta, J.P. Gaudillèrea, J.P. Soyera, C. Van Leeuwena, O. Lavialeb, A. Moingc,
C. Debordec, M. Maucourtc and D. Rolinc.
a
UMR Œnologie-Ampélologie, Equipe Ecophysiologie & Agronomie Viticole, INRA - Université
Victor
Ségalen
Bordeaux
2,
BP
81,
33883
Villenave
d’Ornon
Cedex,
France
[email protected] ; [email protected]
b
ENITA Bordeaux, Département Biologie Expérimentale, Unité Mathématiques Appliquées –
Statistiques. BP 101, 33175 Gradignan Cedex, France.
c
UMR Physiologie et Biotechnologie Végétales, INRA - Universités Bordeaux 1 - Victor Ségalen
Bordeaux 2, BP 81, 33883 Villenave d’Ornon Cedex, France [email protected]
Keywords: grape berries, terroir, metabolite profiling, PCA, PLS, 1H NMR
Article accepté pour la publication par ACTA HORTICULTURAE 2005, issu des Proceedings of
the 7th International Symposium of Grapevine Physiology & Biotechnology, juin/2004, DavisCalifornie-USA
Résumé de l’article
La concentration en sucres, acides organiques, acides aminés et composés phénoliques est
très importante pour la qualité de baies de raisins. L’objectif de cette étude a été de déterminer le
profil métabolique de pellicules et de pulpes de baies de raisins à la maturité sur des cépages
rouges (‘Cabernet-Sauvignon’ et ‘Cabernet franc’) et un cépage blanc (‘Sauvignon blanc’) par
rapport aux conditions environnementales. La résonance magnétique nucléaire du proton (RMN
1
H) permet de quantifier en une seule analyse divers composés sur des extraits de raisins. Les baies
de raisins ont été récoltées pour le millésime 2002 sur des vignes cultivées en différents types de
58
sols et climats dans le Bordelais. Après l’extraction hydro-alcoolique, les spectres RMN 1H des
extraits de pellicule et pulpe ont été obtenus en 15’ par analyse. Les analyses discriminantes ont été
appliquées sur les données issues des spectres après la transformation de ceux-ci en 190
histogrammes (buckets) chaque 0,04 ppm, entre 0 et 8 ppm. Les analyses en composantes
principales (PCA) et par régression multiple partielle (PLS) sur des extraits de pellicules ont
discriminé les différents échantillons de baies à la maturité sur des différents types de sols. Les
spectres RMN 1H des extraits de pulpes ont été moins discriminants. Les résonances qui ont
contribué pour la discrimination des groupes ont été attribuées aux sucres et aux acides aminés. En
conclusion, l’analyse par RMN 1H sur des extraits de pellicules de raisins a discriminé baies issues
de différentes origines plus efficacement que les analyses biochimiques classiques basées sur les
sucres, l’acidité et les composés azotés. Cette technique pourra aider les études des effets de
l’environnement sur la qualité de baies de raisins, discriminées par la détermination de profils
métaboliques.
Abstract
Sugars, organic acids, amino acids and phenolics are important determinants of grape berry
quality. The aim of this study was to determine the metabolite profiles of skin and pulp tissues
from ripe berries of ‘Cabernet franc’, ‘Cabernet-Sauvignon’ and ‘Sauvignon blanc’ in relation to
their growing conditions. Proton nuclear magnetic resonance (1H NMR) allows one to quantify
many different compounds in berry extracts at a single time. Grape berries were collected at
harvest in 2002 from grapevines cultivated in different soil types and climates near Bordeaux,
France. After an ethanolic-water extraction, the 1H NMR spectra of water-soluble extracts of the
pulp and skin were run in 15 minutes. Discriminant analyses were performed on spectra data after
segmentation into 190 spectra domains of 0.04 ppm between 0 to 8 ppm. Principal component
analysis and partial least square analysis of skin spectra significantly discriminated ripe fruit of
grapevine grown on different soils. The 1H NMR spectra of pulp were less discriminanting. The
resonances, contributing to significant discrimination, were attributed to sugars and amino acids. In
conclusion, 1H NMR analysis of berry skin extracts discriminates berries from different locations
more efficiently than classical biochemical analyses based on sugar, acidity and nitrogen
measurements. This technique will help in the studies of environmental effects on grape berry
quality discriminated by metabolite profiling.
59
INTRODUCTION
The term “terroir” is used to characterize the conditions under which grapevines are
produced to include soil, climate and cultural practices (Van Leeuwen et al., 2004). It is used in the
European Union for the determination of viticultural areas and in order for a wine to obtain the
quality label called Appellation of Controlled Origin (AOC).
Wine-growing “terroirs” and the quality of grape berries are characterized via routine
analyses using parameters such as sugar, acidity and phenolic contents and the pH measured
separately. 1H NMR spectroscopy allows one to quantify, in a single analysis, the major sugars,
organic and amino acids and phenolic compounds and thus to obtain the metabolic profiles in a
complex mixture (Duarte et al., 2002; Le Gall et al., 2004). In addition, the NMR method is nondestructive, non-invasive and rapid.
The aim of this study was: (1) determine by 1D 1H NMR spectra the metabolic profiles of
berry skin and pulp tissues of ‘Cabernet franc’, ‘Cabernet-Sauvignon’ and ‘Sauvignon blanc’ in
relation to their growing conditions and (2) to apply chemometric methods to discriminate among
berry samples from different terroirs of the Bordeaux Region.
MATERIALS AND METHODS
The berry samples were collected at harvest in the summer of 2002. A 200-berry sample
was obtained on three cultivars. ‘Cabernet franc’ and ‘Cabernet-Sauvignon’ were cultivated in
clayey, gravelly or sandy soils in the Saint-Emilion appellation, the samples formed by four
replicates of each cultivar to each soil type led to twelve samples for ‘Cabernet franc’ and twelve
for ‘Cabernet-Sauvignon’ cultivated in the three soil types. ‘Sauvignon blanc’ was grown at three
estates in the Pessac-Léognan appellation, one with a sandy-gravelly soil, the second with a sandy
soil on chalky rock and the third on a clayey-chalky soil. There were twelve samples of 200 berries
from each estate. Each sample was separated in two subsamples, one of 120 berries for classical
biochemical analysis based on sugar, acidity and nitrogen measurements and the other of 80 berries
(20 berries replicated four times) for NMR and HPLC analyses. The skins and pulps were
separated in order to process them separately. The skins were ground by the use of a Waring
blendor for 2 min, followed by extraction with 96% ethanol on ice for 1 h. The pulp was extracted
on ice with 96% ethanol for 15 min. Ethanolic extracts were dried under vacuum. Dried extracts
were dissolved in 400 mM oxalate buffer pH 4 and dried under vacuum. The extracts were
dissolved in D2O, titrated to pH 4, and lyophilized.
1D 1H-NMR spectroscopy was performed on extracts corresponding to fresh weights of
between 4.9 and 21.2 mg for skins and between 30 and 84 mg for the pulp, dissolved in 0.5 ml D2O
60
(internal lock). Sodium salt of (trimethyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid (TSP) in D2O was added in all
samples at a final concentration of 0.01% for chemical shift calibration.
The 1D 1H-NMR spectra were recorded at 27°C with a 500 MHz Avance Bruker
spectrometer using a 5 mm inverse probe and fitted with an autosampler. Each spectrum consisted
of 64 scans of 32K data points with a spectral width of 6000 Hz, an acquisition time of 2.73 s, and
a recycle delay of 25 s per scan in order to allow complete relaxation and absolute quantification.
The pulse angle was 90°. Spectra were acquired under an automation procedure (automatic
shimming and automatic sample loading) requiring about 15 min per sample. Spectra were Fourier
transformed with 0.3 Hz line broadening, phased and baseline corrected using XWINNMR
software (Bruker Biospin, Karlsruhe, Germany). Signal assignment was performed following
published data (Fan, 1996).
The D2O (99.9%) was purchased from Euristop (Gif sur Yvette, France). The TSP (98%)
was purchased from Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). All other chemicals used were of
reagent grade.
The statistical analysis was performed using a combination of two multivariate statistical
techniques, the principal component analysis (PCA) and partial least squares (PLS) to discriminate
the groups (Bailey et al., 2003; Kemsley, 1998). Before the statistical analyses, the 1D 1H NMR
spectra were segmented into about 190 spectra domains of 0.04 ppm (buckets) using metabolite
mode of AMIX software (Bruker Biospin, Karlruhe, Germany) between 0.8 and 8.5 ppm (190
variables). The resonances between 4.8 - 5.0 ppm, associated mainly to residual water signal, were
removed. Data were converted to Excel software format, and further processed with the Win-Das
software (Kemsley, 1998) for PCA and PLS analyses.
RESULTS AND DISCUSSION
A typical 1D 1H-NMR spectrum for the skin of ‘Sauvignon blanc’ grown on a sandygravelly soil in one of the three estates in the Pessac-Léognan appellation, Bordeaux-France is
shown in Figure 1. Clear differences are observed between spectra, especially in the aliphatic
region with the organic and amino acids (between 0-3 ppm), and to a lesser extent with the sugar
(3-5.5 ppm) and the aromatic regions (6-9 ppm) for all three cultivars. Some differences were
observed in the aliphatic region of the NMR profiles for the ‘Cabernet-Sauvignon’ skins. For
example, the proline amino acid signal (about 2 ppm) was higher in the skins produced on the
gravely soil compared to the sandy and clayey soils. The malic acid signal (patterns centered at 2.6
and 2.8 ppm) was higher in the skins produced on the sandy soil compared to the clayey and
gravelly soils. The sugar signal region (3-5.5 ppm) intensity was higher in the skins produced on
61
the clayey soil compared to the gravelly and sandy soils. The phenolic profiles (6-8 ppm) presented
by the skins produced in the three soils were slightly different and lower on the sandy soil.
Similarly, some differences were observed in the aliphatic, sugar and aromatic regions of the NMR
profiles for the ‘Sauvignon blanc’ skins (Fig. 1).
While differences between spectra were readily observed, it is important to derive
metabolic differences between samples based on the mathematical variance in the matrix rather
than solely through visual inspection. Hence, PCA was used to reduce the dimensionality of the
data thus allowing easier interpretation of the results.
The three clusters observed in the PCA analysis corresponded to samples of ‘CabernetSauvignon’ or ‘Cabernet franc’ cultivars cultivated in the three different soil types in the SaintEmilion appellation: clayey, gravelly and sandy soils (Fig. 2). The first four principal components
(PCs) explained 62.9% of the total variance. The first PC (PC1) indicated that this separation could
be explained by differences in the sugar region (on the positive side) and sugar and phenolic
regions (on the negative side). Examination of PC2 indicated that this separation could be
explained by differences in the aliphatic and sugar regions. The positive side is represented by the
aliphatic, sugar and aromatic spectra regions and the negative side is represented by the aliphatic
spectra region.
After, Partial least squares (PLS) analysis was applied for sample classification, based on
multivariate regression (Kemsley, 1998). It allows one to introduce various parameters before the
statistical analysis. Therefore, soil type was introduced as a parameter to discriminate among plots.
A better separation of the three soil groups using grape skins was obtained with PLS than PCA
(Fig. 3). The first four PLS scores represented ~ 60% of the total variance. The first PLS score,
separating the clayey soil from the two other soils, is based on the spectra domains in the sugar
region on the positive side (3.54, 4.58, 5.34, 3.9, 3.26 ppm) and of the aliphatic region on the
negative side (0.94, 0.98, 1.7, 1.74, 1.02, 1.9 ppm). The second PLS score separated the gravelly
soil from that of the sandy soil based on the spectra domains of the aliphatic and sugar regions on
the positive side (2.82, 2.78, 2.62, 4.38, 3.46, 4.62 and 2.22 ppm) and on the spectra domains of the
sugar and aliphatic regions on the negative side (3.62, 1.66, 4.14, 3.18, 2.06 ppm). These results
indicate that grape maturity (sugar level) may be an important factor distinguishing among
samples. The berry skins of the clayey soil had higher glucose and fructose contents compared to
those of the gravelly and sandy soils samples, similar to the results of Van Leeuwen et al. (2001).
The clayey soil had lower amounts of total nitrogen in the skins, as determined by the amino acid
content, than the other two soils (data not shown).
Despite the differences found among the three soil types, little variation was related to
cultivar. This result has also been found by Van Leeuwen et al. (2004). The effect of cultivar on
62
phenolic compounds, for seeds and leaves (Forveille et al., 1996), may have been underestimated
in our berry analyses due to the complexity of 1D NMR profiles and their low concentration (Gil et
al., 2003).
The differences observed for the metabolite profiles in the study could be explained by
water availability in the three soil types. The amount of water available in gravelly soil is low,
medium in the clayey soils and high in the sandy soils (Van Leeuwen et al., 2001). Low to
moderate water supply increases the skin-to-pulp ratio, which can impact the concentrations of
various compounds in the berry. Excess water supply or severe drought can decrease the fruit
quality (Seguin, 1983). In addition, grape quality also is affected by geographic location, cultivar
and year (Soufleros et al., 2003).
Three groups represented by ‘Sauvignon blanc’ harvested at three estates on different soil
types in the Pessac-Léognan appellation in Bordeaux could be separated to some extent by PCA.
The skin PCAs were less discriminatory than the PLS analysis, as found for the red cultivars.
However, some samples were not separated (data not shown). The first four PCs explained 76 % of
the total variation. After the PCA, PLS analysis was run after introducing the parameter ‘estate’
(Fig. 4). The first four PLS scores expressed 51.2 % of the total variation. The spectra domains
responsible for the discrimination in the PLS 1 score were 2.42, 2.34, 3.46, 7.62, 7.98, 4.62 and 2.1
ppm on the positive side, and 6.26, 1.14, 6.94, 6.42, 6.9 and 4.42 ppm on the negative side. These
spectra domains corresponded to sugars, amino and organic acids with little contribution from the
phenolic region. The PLS 2 score is represented by spectra domains in the organic and amino acid
regions on the positive side and the amino acid region on the negative side. The first two PLS
scores separated Group 1 from the others. The skin samples of ‘Sauvignon blanc’ showed some
variations in the NMR profiles in relation to the soil type of the estates. The skin samples of Group
2 represented higher amounts of alanine (1.47 ppm) than for Groups 1 and 3. The Group 1 samples
were more concentrated in lactic acid (1.36 ppm) than the other two. The Group 3 samples
represented a higher concentration of malic acid than that of Groups 1 and 2. The phenolic profile
(6-8 ppm) of the three estates was different, because some resonances in the phenolic zone
participated to discriminate between samples.
Similar clustering results were found using multivariate analyses of the routine
measurements (data not shown). The statistical analyses of the pulps either by NMR or routine
analyses were less discriminating than those of the skins.
CONCLUSIONS
The preliminary results presented here indicate that the combination of metabolite profiling
1
by 1D H NMR spectroscopy together with chemometric data analyses (PCA and PLS) is readily
63
amenable to the rapid screening of ripe grape berries and to discriminate the wine-growing
“terroirs” in the Bordeaux Region. The 1D 1H NMR metabolite profiles of skin and pulp tissues of
ripe berries harvested on grapevines cultivated in different soil types showed clear differences in
composition, i.e. sugars, organic and amino acid and phenolic compounds. These variations could
be correlated to soil type. However, there were no variations related to genotype using the two red
cultivars. These results confirmed the importance of vineyard soil on grape berry composition and
strengthens the concept of ‘terroir” used to characterize where grapevines are grown. This
technique may improve our knowledge of the effects of climate and cultural practices on the
quality of grape berries in the future.
ACKNOWLEDGEMENTS
Many thanks to all the wineries in the Bordeaux region for their collaboration by providing
fruit for the analyses. Thanks to the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e
Tecnologico (CNPq) linked to the Ministry of the Sciences and Technology of the Brazil for the
financial support of grant (G. E. Pereira), to the Conseil Interprofessionnel du Vin de Bordeaux
(CIVB) and Aquitaine region for their financial support to the project, and to all people of UMR
Oenologie-Ampélologie and UMR Physiologie et Biotechnologie Végétales, for help with the data
acquisition and processing.
Literature Cited
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65
Figures
Fig. 1 A typical 1D 1H-NMR spectrum for the skin of ‘Sauvignon blanc’ grown on a sandygravelly soil in one of the three estates in the Pessac-Léognan appellation, Bordeaux-France
66
Partial Least Squares
Principal Component Analysis
15
10
CF Clayey
5
PLS
PC2 Score
2
-15
CS Clayey
CF Gravelly
0
-10
-5
0
5
10
15
20
CS Gravelly
CF Sandy
-5
CS Sandy
-10
-15
PLS Score 1
PC1
Fig. 2.
Scores plot of the PC1 and PC2 axes (explained 42.3 % of total variance) for NMR
spectra of berry skin of ‘Cabernet-Sauvignon’ and ‘Cabernet franc’ cultivated in different
soil types.
67
Partial Least Squares
15
10
CF Clayey
5
PLS
Score
2
CS Clayey
CF Gravelly
0
-15
-10
-5
0
-5
5
10
15
CS Gravelly
CF Sandy
CS Sandy
-10
-15
PLS Score 1
Fig. 3.
First two PLS scores (explained 38.2 % of total variance) for berry skin of ‘CabernetSauvignon’ and ‘Cabernet franc’ cultivated in different soil types.
68
Partial Least Squares
8
6
4
2
PLS
Score
-25
2
Group 1
0
-20
-15
-10
-5 -2 0
5
10
15
Group 2
Group 3
-4
-6
-8
-10
PLS Score 1
Fig. 4.
First two PLS scores (explained 51.2 % of total variation) for berry skin of ‘Sauvignon
blanc’ cultivated in different estates in the Pessac-Léognan appellation. Sandy-gravelly
soil (Group 1), sandy soil on a chalky rock (Group 2) and clayey-chalky soil (Group 3).
69
CHAPITRE III
Dans le chapitre II il est montré que la RMN du proton des extraits de pulpe et de pellicule
permet de discriminer des raisins cultivés sur des parcelles viticoles bien différenciées. Les
différences de fonctionnement de la vigne sont associées à la nature des sols, sableux, argileux ou
graveleux et à la présence éventuelle de nappe d’eau. Ces différences structurales provoquent des
différences de réserve utile dans l’ordre du plus humide au plus sec. L’analyse discriminante
standard (analyse en composantes principales) permet de séparer les raisins des 3 origines.
L’analyse PLS (régression partielle), qui intègre l’information sur l’origine parcellaire des raisins,
améliore le groupement et permet d’identifier les résonances les plus significatives. Des résonances
dans la zone des sucres et des acides aminés participent à la définition du premier axe.
Le même travail a été réalisé sur des extraits de raisins blancs (‘Sauvignon blanc’), qui
montre également la capacité du spectre RMN des pellicules de discriminer des raisins issus de
parcelles viticoles différentes après une analyse discriminante PLS. Sur ces échantillons, des
résonances dans la zone des composés aromatiques sont actives.
Le chapitre III reprend les méthodes employées dans le chapitre II et les applique à un plus
large échantillonnage de raisins noirs (‘Merlot noir’, ‘Cabernet-Sauvignon’ et ‘Cabernet franc’)
cultivés sur une zone géographique plus étendue.
70
CHAPITRE III : RMN 1H ET UNE METHODE CHIMIOMETRIQUE UTILISEE POUR LA
CARACTERISATION DE BAIES DE RAISINS A LA MATURITE SUR QUATRE
TERROIRS A BORDEAUX
1
H NMR and Chemometrics to Characterize Mature Grape Berries in Four Wine-Growing
Areas in Bordeaux-France
GIULIANO E. PEREIRA+, JEAN-PIERRE GAUDILLERE+*, CORNELIS VAN LEEUWEN+ #, GHISLAINE
HILBERT+, OLIVIER LAVIALLE# , MICKAEL MAUCOURT ++, CATHERINE DEBORDE++, ANNICK
MOING++, DOMINIQUE ROLIN++
+
UMR Œnologie-Ampélologie, INRA Centre de Bordeaux, BP 81, 33883 Villenave d’Ornon
Cedex, France ; #ENITA Bordeaux, UMR LAPS-CNRS 5131, BP 101, 33175 Gradignan Cedex,
France ; and
++
UMR Physiologie et Biotechnologie Végétales, INRA, Universités Bordeaux 1,
Victor Ségalen Bordeaux 2, BP 81, 33883 Villenave d’Ornon Cedex, France
short title: Grape chemometric characterization
Editorial annotations
R.T. Moulineux
(Assoc. Ed.)
Article accepté pour la publication dans le Journal of Agricultural and Food Chemistry (2005)
Résumé de l’article
Corresponding author. Tel: +33 557122521.
[email protected]
+
UMR Œnologie Ampélologie
#
ENITA Bordeaux
++
UMR Physiologie et Biotechnologie Végétales
*
Fax:
+33
557122515.
E-mail:
71
La composition biochimique de baies de raisins dépend du génome du cépage et est
influencée par les conditions environnementales et pratiques culturales, variant selon l’origine du
terroir. Les analyses couramment utilisées pour déterminer le potentiel qualitatif de raisins destinés
à la vinification sont celles des sucres, de l’acidité, du pH, des anthocyanes et des polyphénols
totaux. Ce travail a permis d’établir des profils métaboliques sur des extraits de pellicules et pulpes
de raisins à maturité, en utilisant les analyses physico-chimiques et la spectroscopie par résonance
magnétique nucléaire du proton (RMN 1H), dans quatre appellations situées dans la région de
Bordeaux. Les analyses discriminantes des composantes principales (ACP) ont été appliquées sur
les données des analyses physico-chimiques et des spectres RMN 1H afin de vérifier la variabilité
de la composition des raisins et pour caractériser les groupes d’échantillons. Une séparation
significative des profils métaboliques des pellicules et des pulpes par rapport au terroir d’origine a
été observée. Les analyses physico-chimiques sont plus discriminantes que la RMN 1H. Mais la
RMN 1H a permis de déterminer des empreintes métaboliques en utilisant des métabolites
identifiés et d’autres composés non identifiés.
ABSTRACT
The biochemical composition of grape berries depends on the cultivar genome and is
influenced by environmental conditions and growing practices, which vary according to origin and
“terroir” (French word accounting for the factors: climate, soil and cultural practices on grape and
wine quality). The components currently measured to determine the potential quality of grapes for
winemaking at harvest are sugars, acidity, pH and total phenolics referred to as “classic analysis”.
The aim of this work was to establish metabolic profiles using both conventional physicochemical
analyses and 1H NMR spectroscopy of skin and pulp of mature berry extracts in four appellations
situated in different locations in the Southern-West part of France (Bordeaux). Principal
component analysis (PCA) was applied to the physiochemical and 1H NMR data to investigate the
variability of the grape composition and to characterize groups of samples. A significant clustering
of the metabolic profile of pulps or skins in relation to their “terroir” was observed.
Physicochemical analyses were more discriminant than 1H NMR data. But NMR spectroscopy
allowed to determine metabolic fingerprintings using identified metabolites and some still non
attributed resonances.
KEYWORDS: Vitis vinifera L., grape, NMR spectroscopy, PCA, metabolic profile.
72
INTRODUCTION
Genetic and environmental factors are both essential to the grape and wine quality. Two
different perspectives have emerged in worldwide wine production to indicate the origin and
quality of grapes and wines. The first, common in the new world countries, indicates the grape
cultivar on the label. The second, common in the old world countries is called “terroir”, and is used
to describe all aspects of the environment, which include the soil, climate and cultural practices (1).
The parameters most often used to assess grape quality are total soluble solids, total acidity,
pH and total phenolics. This small number of variates limits the capacity of quantitative
discrimination between different grape batches related to different “terroirs” (2).
Metabolites are the intermediates and end products of cellular regulatory processes, and
their levels can be regarded as the ultimate response of biological systems to genetic or
environmental changes. Recently the concept of metabolomic analysis was introduced in plant
biochemistry in order to provide a comprehensible insight into the metabolic state of the plant by
detecting the metabolome (the full suite of metabolites expressed in plants). This metabolomic
analysis is considered as the quantitative measurement of the dynamic multiparametric metabolic
response of living systems to environmental stimuli or genetic modification (3, 4, 5). For the
metabolome studies, an effort has been carried out to develop more rapid and informative
analytical methods as well as to explore the possibility of direct analysis with as much information
as possible, thus avoiding the need for specific fractionation and preparation procedures of the
samples. It is unlikely that a single analytical method will yield information about all the
metabolites in a plant system. Differences due to volatility, polarity, solubility and
chromatographic behavior mean that multiple methods will need to be deployed to analyze
different subsets of metabolites. In this context high performance liquid chromatography (HPLC)
(6, 7, 8), mass spectroscopy (MS) (9), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) (10, 11),
spectroscopy methods (UV, fluorescence) (12) and coupled gas chromatography-mass
spectrometry (GC-MS) (5) have already been successfully, when applied to plant metabolite
profiling.
Another potentially powerful tool for plant metabolite analysis is high-resolution nuclear
magnetic resonance spectroscopy (NMR), in particular 1H NMR (13-16). This technology has been
used extensively to profile metabolites in fruits and fruit juices (14, 17, 18), olive oil (19), tea (20),
potatoes (21), beers (16) and musts and wine (3, 13, 22). 1H NMR can simultaneously detect all
proton-bearing compounds in a sample (15). This covers most of the organic compounds such as
carbohydrates, amino acids, organic and fatty acids, amines, esters, ethers and lipids, which are
present in plant tissues. Thus, the 1H NMR spectrum of unpurified solvent extracts of plants can
73
provide a relatively unbiased fingerprint, containing overlapping signals of the majority of the
metabolites present in the solution.
The use of chemometric methods on data obtained by spectrometer analyses together with
recent advances in computer technology, allows the development of multivariate data analysis as a
powerful tool in the evaluation of food quality. Principal components analysis (PCA) is a method
essentially used to describe samples present in an n-dimensional space of a starting set of variables
into a smaller number of dimensions, called principal components (PCs) that represent sources of
successively maximized variance of data. This method is the first step in data exploration, which
allows the main variability aspects of a data set to be visualized, without the constraint of an initial
hypothesis concerning the relationship within samples and between samples and variables (23). It
estimates how many components are necessary to explain the greater part of total variance with a
minimum of information loss (3, 12, 16, 24). PCA has been successfully applied to the analytical
results of tomatoes (18), potatoes (21), beers (16), juices (25) and musts and wines (6, 10, 13, 26).
The aim of the present work was to use 1H NMR spectroscopy so as to describe the
variability in the composition of skin and pulp tissues of grape berries harvested at maturity in four
appellations in the Bordeaux area, in addition to conventional physicochemical analysis carried out
on the same batch of berries sampled in different vineyards, and to identify the metabolic
compounds responsible for the separation between sample clusters.
MATERIALS AND METHODS
Origin of the samples. ‘Merlot noir’, ‘Cabernet franc’ or ‘Cabernet-Sauvignon’ cultivars
divided into four groups according to appellation were harvested in September 2002. The choice of
the plots was carefully done in order to be representative of the variability in each vineyard in
Bordeaux. Group 1 was sampled on cultivar ‘Merlot noir’ grown on one estate in the Bordeaux
appellation. The grapevines were ten years old, grafted on ‘Fercal’ (Vitis berlandieri x Vitis
vinifera) rootstock. The plot was located on sandy soil. Group 2 was sampled on ‘CabernetSauvignon’ or ‘Cabernet franc’ cultivars in the Saint Emilion appellation, in the same estate. The
samples were gathered from three plots of the same estate established in three different soil types:
clay, gravelly or sandy soil. The grapevines were thirty years old grafted on ‘3309 C’ (Vitis riparia
x Vitis rupestris) rootstocks in the gravelly and clayey soils, and ‘101-14 MG’ (Vitis riparia x Vitis
rupestris) rootstock in the sandy soil (1). Group 3 was sampled on ‘Merlot noir’ cultivar harvested
in 8 vineyards in the Buzet appellation. The grapevines were about twelve years old grafted on four
different rootstocks: ‘420 A’, ‘SO4’ (Vitis riparia x Vitis berlandieri), ‘41 B’ (Vitis berlandieri x
Vitis vinifera) and ‘3309 C’. The plots were located in clay, clay-loamy, to loamy soils. Group 4
74
was harvested from ‘Merlot noir’ cultivars in the Pessac-Léognan appellation. The grapevines were
sixteen years old, grafted on ‘Fercal’ rootstock grown in a clay or sandy soil.
The date of harvest of mature grape berries in each plot was determined using total soluble
sugars, total acidity, pH and total anthocyanins analysis. It was separated into two subsamples for
NMR analysis and for physicochemical analyses.
The different soil compositions of the four plots were determined after analysis of their
physical and chemical composition, carried out by Ecophysiologie et Agronomie Viticole Unit
(INRA Bordeaux, data not shown).
75
Physicochemical analyses.
Seventeen variables were measured using the juice (must) and skin extracts from entire
grapes and centrifuged (5 min with 5,000 g at ambient temperature). Berry fresh weights and skin
percentage dry weight were determined on 80 berries. pH, total acidity, total soluble solids (°Brix)
and total anthocyanins (OD520 nm) were measured and constituted the classic method analysis in
vineyards to evaluate the grape maturity. Total titratable acidity and pH were determined with an
automated pH meter. Optical density (OD360 for flavonols and OD520 nm for total anthocyanins)
were carried out on the skins after ethanolic extraction, with a Cary Bio 1 UV-Vis
spectrophotometer (Varian) to determine the phenolic compounds (28), with a 1 cm pathlengh.
Fifty µL of skin extract were mixed with 950 µL of H2O acidified with 2% v/v HCl. Anthocyanin
content was expressed as mg malvidin/g fresh weight (FW) and flavonols as OD360/ g FW
subtracted from the contribution of anthocyanins (29). Other analyses were performed in order to
describe the mineral composition of the berries. Total and mineral nitrogen, total and mineral
phosphorus, potassium, calcium and magnesium were determined on must supernatant. Total
nitrogen and phosphorus were determined following digestion by means of a modified procedure
(30) using sulfuric acid and hydrogen peroxide. Total Ca, Mg and K contents were determined
following dilution of the juices, using a Vista inductively coupled plasma atomic emission
spectrometer (Varian, Mulgrave, Australia). NH4+ and PO43- were determined with an automated
colorimetric method using the TRAACS 800 autoanalyser (NH4+ with salicylate and PO43- with
phosphomolybdate). Total sugars and total soluble solids °Brix, tartaric and malic acid
concentration, were also determined on the must (28). Total soluble solids (°Brix) were determined
using a hand refractometer with temperature compensation. Total sugars, tartaric and malic acids
were determined with an automated colorimetric method using the TRAACS 800 autoanalyser
(total sugars with 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline, tartaric with ammonium vanadate and malic
with malic enzyme).
Extraction of skins and pulp.
The skins and pulp were separated manually in order to achieve two separate extractions.
The skins were ground using a Waring blender for 2 min and then extracted with 96 % ethanol (80
mL EtOH per 40 skins) on ice for 1 hour. The pulp was extracted on ice with 96 % ethanol (80 mL
EtOH per 40 pulps) for 15 min with agitation. After drying under vacuum, the pellets were
dissolved in 0.5 mL 400 mM oxalate buffer, pH 4, and dried again under vacuum. Each extract was
dissolved in 0.5 mL D2O and titrated to pH 4.0 with KOH or HCl, mixed for 4 h at 4 °C and
freeze-dried to reduce the residual water signal in the spectra.
76
1
H-NMR analysis.
Dried titrated tissue extracts were solubilized in 0.5 mL D2O, with addition of the sodium
salt of (trimethyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid (TSP) in D2O at a final concentration of 0.01 % for
chemical shift calibration and transferred into a 5 mm NMR tube (16). Spectra acquisition was
performed on a titrated extract issued from a known weight of tissue, between 4.5 and 10.4 mg FW
for skin extracts and 30.2 and 84.7 mg FW for pulp extracts.
1D 1H-NMR spectra were recorded at 300 K on a 500 MHz Avance spectrometer (Bruker,
Wissembourg, France) using a 5 mm inverse probe and fitted with an autosampler. Each spectrum
was acquired with 64 scans of 32 K data points with a spectral width of 6000 Hz, a pulse angle of
90°, an acquisition time of 2.73 s and a recycle delay of 25 s per scan in order to allow complete
relaxation and absolute quantification. Spectra were acquired under an automation procedure
(automatic shimming and automatic sample loading) requiring about 29 min per sample. Free
induction decays (FIDs) were Fourier transformed with 0.3 Hz line broadening, phased and
baseline corrected using XWINNMR software (Bruker Biospin, Karlsruhe, Germany). The
resulting spectra were aligned by shifting the TSP signal to zero.
Before statistical analyses, 1H NMR spectra were segmented into about 200 spectra
domains of 0.04 ppm (buckets) (31) using metabolite mode of AMIX software (Bruker Biospin,
Karlsruhe, Germany) between 0.76 and 8.8 ppm (200 NMR variables). The resonances between
4.7-5.0 ppm, associated mainly with residual water, were removed.
Statistical analyses.
Data of classic and other analytical methods were analysed first with ANOVA (Systat
software) then with principal components analysis (PCA). 1H NMR data were converted to Excel
software format, and further processed with Win-Das software (23) for PCA analysis. Before the
data analyses, all NMR data were normalized to the total spectra intensity without water region.
Variables issued from physicochemical analyses or NMR were analyzed using PCA on the
correlation matrix. The objectives of this procedure were to look for compositional similarities and
to explore the overall variability in the population of samples (5, 16). The correlation method is
used to allow all variables to explain the variability, not only the major resonances (sugars) as in
the covariance method. The variables were mean-centered before PCA analysis (23). For NMR
variables, the buckets situated between 2.60 and 2.88 ppm (malic and citric acids) and between
4.36 and 4.48 ppm (tartaric and malic acids) were added up to take slight peak shifts in the organic
acid zone into account. For the other peaks no shift was observed in the spectra.
77
Chemicals.
For the classic analyses, all chemical reagents were of analytical grade (Mallinckrodt Baker
France, Noisy-Le-Sec, France). For NMR, D2O (99.9%) was purchased from Euristop (Gif sur
Yvette, France), and TSP (98%) from Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). All the other
chemicals were reagent grade.
RESULTS AND DISCUSSION
Physicochemical analyses. PCA was performed on the matrix of the 17 physicochemical
variables, revealing some defined and discriminated clusters of samples. Five groups were formed
from the 134 samples according to the different geographical origins and cultivars of the grape
samples, the PC1/PC2 plot describing 70.1% of the total variance (Figure 1). PC1 clearly
separated Group 1 from Groups 2, 3 and 4. The examination of the loadings (data not shown)
suggested that this separation was due to total and mineral nitrogen (N) and total acidity on the
positive side and sugars (expressed in g/L and °Brix) on the negative side of PC1. This result was
confirmed after examination of the group means (Table 1). ‘Merlot noir’ berries from the Group 1
(Bordeaux appellation) had lower concentrations in sugars and higher concentrations in
nitrogenous compounds, total titratable acidity and tartaric acid than berries of the Groups 3 and 4
(same cultivar, ‘Merlot noir’) or the Group 2 (other cultivars, ‘Cabernet-Sauvignon’ and ‘Cabernet
franc’) from the other appellations. It also showed that berries of the Group 2 (Saint-Emilion
appellation) were split into two subgroups according to the soil type. The cultivar effect was less
important than the soil type, in agreement with preliminary data in the same plots (1). The two
cultivars were present in both subgroups. Group 2 samples were close to the ‘Merlot noir’ samples
to confirm these results. The PC2 separated berries from Groups 2, 3 and 4 (Saint-Emilion, Buzet
and Pessac-Léognan appellations, respectively). The examination of PC2 loadings (data not
shown) suggested that this separation was due to malic acid, OD520 nm-anthocyanins, total
phosphorus amount and berry weights as positive scores; and potassium and magnesium amount
and percentage of skins as negative scores. The same sample clustering was obtained without the
berry weight data (data not shown), although the berry weights varied significantly between Group
2 and the other groups. Berries from the Groups 3 and 4 had significantly higher berry fresh
weights and total phosphorus and lower amounts in malic acid and magnesium than Group 2. This
is in agreement with Brescia et al. (3) and Gonzalez and Pena-Méndez (32), who found mineral
elements as discriminating factors for musts and wines in relation to different terroirs. This is also
in agreement with the results found by Herbert et al. (33) concerning amino acids, they contributed
78
to discriminate grape must samples. Further PCs did not contribute to the separation of the
appellation groups, but revealed intra-group heterogeneity (data not shown).
The combined results of the 17 physicochemical analyses allowed a good separation between
samples harvested from four groups of different origins, corresponding to three cultivars harvested
in four appellations, Group 1 (‘Merlot noir’, Bordeaux appellation), Group 2 (‘CabernetSauvignon’ and ‘Cabernet franc’, Saint-Emilion appellation), Group 3 (‘Merlot noir’, Buzet
appellation) and Group 4, (‘Merlot noir’, Pessac-Léognan appellation). For most of these 17
physicochemical variables, measured using seven different analytical methods, differences in
intensities were found between sample clusters. PCA analysis showed that the PC1 seemed to
reveal slight differences in berry maturity, related to the sugar/acidity ratio.
Characterization of metabolites by 1H NMR spectroscopy.
The biochemical composition of grape berries was determined by 1H NMR spectroscopy on
the same mature grape berry samples as for physicochemical analyses. The extraction method was
designed to eliminate water and to control the pH in order to limit chemical shift drift. Figures 2
and 3 show typical 1H NMR spectra obtained at 500 MHz for skin and pulp of ‘Merlot noir’,
‘Cabernet-Sauvignon’ and ‘Cabernet franc’. Signal assignment of the different extracts was
identified after peak assignement using 1H NMR spectra from pure compounds associated with
comparison of published data (15, 34). In case where further confirmation of the assignement was
required, the extracts were spiked with appropriate standards to confirm that the chemical shifts
were identical. Nineteen compounds were identified in the pulp and skin 1H NMR spectra (Table
2). It was possible to observe clear differences between these spectra, indicating changes in
biochemical status with respect to the tissue and cultivar specificity. The major resonances of the
spectra corresponded to fructose, glucose and sucrose for skin extracts and fructose, glucose,
malate and proline for pulp extracts.
Although differences between the spectra were readily observed, it was important to derive
metabolic differences between sample classes based on the mathematical variance in the matrix
rather than solely through visual inspection. Hence, principal components analysis (PCA) was used
to reduce the dimensionality of the data, thereby allowing easier interpretation of the results.
Pattern recognition analysis of the pulp 1H NMR spectra.
The PCA analysis was performed on the 134 pulp samples from four areas in Bordeaux.
Figure 4 shows the PC1/PC2 plot of the pulp samples that explained 50.5% of total variance of the
dataset. The dataset of NMR spectra from the grape berry pulps displayed a good clustering of
79
replicates. The clusters are separated mostly by the second axis. Goups 3 and 4 are totaly
overlapped in the same cluster and can not be distinguished by pulp 1H NMR spectra.
Cluster 1 is made up of samples from Group 1 cv. ‘Merlot noir’ grown in the Bordeaux
appellation on sandy soil, on the negative side of axis 2. Cluster 2 is made up of samples from
Group 2 in the Saint-Emilion appellation, with ‘Cabernet-Sauvignon’ or ‘Cabernet franc’ cultivars,
on the positive sides of the axis 1 and 2, but the samples showed a large dispersion (Figure 4).
Cluster 3 is made up of samples from Group 3 cv. ‘Merlot noir’ in the Buzet appellation, Group 4
cv. ‘Merlot noir’ in the Pessac-Léognan appellation and samples from Group 2 in the SaintEmilion appellation, on the negative side of axis 1 and positive side of axis 2.
The examination of PC1 loadings showed that the sample variability whitin Groups 1 and 2
was due to buckets in the aromatic zones (6.86, 7.26, 7.18, 8.06, 7.02, 6.90 ppm) on the positive
side, unidentified due to their complexity, and buckets in the sugar zones on the negative side,
identified as fructose (3.98, 3.70, 4.10 ppm), glucose (4.62, 5.22 ppm), -amino-n-butyric acid
(GABA, at 3.02 ppm), an unknown compound (5.02 ppm), and buckets made up of overlapping
sugar resonances (3.78, 3.86 and 3.70 ppm). It also showed the variability inside Groups 1 and 2.
Berries from Group 2 are split by PC1 from the physicochemical analyses and the 1H NMR pulp
analysis. But this axis cannot be confused with the two methods. For 1H NMR pulp analysis, it is
not simply a maturation scale, as the relative position of the groups is quite different from the PCA
of the physicochemical data.
The examination of PC2 loadings showed that the cluster separation was due to buckets in
the sugar zone on the positive side, such as sucrose (5.42, 5.38 and 4.22 ppm), fructose (4.06, 3.66
ppm), an unknown compound (5.38 ppm) and one bucket made up of overlapping sugar resonances
(3.82 ppm); amino acids on the negative side, identified as GABA (1.90, 3.02 and 3.06 ppm),
proline (1.94, 1.98, 2.02 ppm), an unknown compound (1.86 ppm), arginine (1.70 and 1.74 ppm)
and GABA + glutamine (2.46 ppm). This suggested that samples of Group 1 had lower relative
concentrations in sugars and higher relative concentrations in amino acids (GABA, proline,
arginine, glutamine) than those of Groups 2, 3 and 4. This also suggested that samples of Group 2
had higher relative concentrations of amino acids than samples from Groups 3 and 4. The PCA was
applied on correlation matrix, and it was expected that the variability can be spread over all
spectra. The covariance method was carried out, but only the sugar resonances accounted for the
separation. PC3 and PC4 accounted for respectively 13.5% and 6% of the total variance and
showed the intra group variability of the samples (data not shown).
80
Pattern recognition analysis of the skin 1H NMR spectra.
A PCA on the data correlation matrix with the PC1/PC2 plot explained 44.8 % of the total
variance (Figure 5). A good clustering of replicates and a good separation of the sample groups in
three clusters was observed. PC1 separated Group 1 from Groups 2, 3 and 4. Three clusters were
formed, the first is made up by the Group 1, on the positive side of the axis 1. The second in made
up by the Group 2, on the negative side of the axis 1 and positive side of the axis 2. The cluster 3 is
made up by some samples of the Group 2 and the Groups 3 and 4, that were overlapped. The PC1
loadings separated the clusters by the buckets in the amino and organic acids zone as positive
scores, identified as alanine (1.46 ppm), GABA + proline (1.94 ppm), arginine + GABA (1.90
ppm), arginine (1.74 and 1.70 ppm), an unknown compound (1.42 ppm), isoleucine and leucine
(0.94 ppm) and lactic acid + threonine (1.34 ppm); and in the sugars zone as negative scores,
identified whole as glucose (3.50, 3.26, 3.42, 5.22, 4.66 and 3.46 ppm) and overlapping sugar
resonances (3.74 ppm). This suggested that samples from Group 1 had a lower relative
concentration in glucose and a higher relative concentration in the amino acids alanine, proline,
arginine, GABA, isoleucine, leucine and threonine than those of the Groups 2, 3 and 4. PC2
separated Group 2 from Groups 3 and 4. It showed the heterogeneity of Group 1 samples. The
examination of PC2 loadings showed that the variability of the clusters was explained by the
buckets in the sugars and organic acids zones on the positive side. They were identified as glucose
(3.22, 3.38 and 4.62 ppm), fructose (3.98, 3.70 ppm), an overlapping of sugar resonances (3.86,
3.58, 3.62, 4.14, 3.90 and 3.94 ppm), malic, citric and succinic acids (2.62-2.88 ppm), malic and
tartaric acids (4.36-4.48 ppm) and an unidentified bucket (2.58 ppm); and the aromatic compounds
zone (6.90, 6.94, 6.86 and 6.42 ppm) on the negative side. This suggested that skin extracts from
Group 2 had higher relative concentrations in glucose, fructose, sucrose and lactic acid, than those
of the Groups 3 and 4. The lactic acid found in skin spectra was a significant variable in the
samples from the Bordeaux appellation. This organic acid is usually accumulated after hypoxia, a
fermentation product in roots or seeds (35, 36). It is concluded that when berries started to soften,
some fermentation activity in the field occur. This observation cannot be related to wine
composition because lactic bacteria activity during the winemaking process produce large amount
of lactic acid from malic acid (37).
As conclusion, in recent years, progress has been made in developing new tools to allow
more complete and informative analytical methods as well as the possibility of direct analysis of
foods, providing a maximum of information. In the present study, a comparison between
physicochemical analyses and 1D 1H NMR spectroscopy was carried out on the pulps and skins of
81
grape berries harvested at maturity to determine the components responsible for the separation of
berries from different origins.
This study showed that the combination of 1H NMR spectra with chemometric methods by
multivariate statistical analysis is able to discriminate between berry samples from different
environments or terroirs, using only one analytical method. However, only three clusters were
obtained from the four groups (appellations), as compared with physicochemical data. 1H NMR
spectrometry of ethanolic extracts diluted in deuterated water did not allow the identification of
phenolic compounds due to overlapping signal resonances and the complexity of their spectrum.
High performance liquid chromatography (HPLC) analyses of phenolics (7, 8) would complete the
metabolic profiling of the grape berries in further studies.
1
H NMR data were less discriminating than physicochemical analyses, but they provided
untargeted information about the metabolites involved in the differences between groups. It also
allowed to characterize metabolites involved in the separation, sugars, amino and organic acids.
Moreover, the data were able to discriminate between samples inside groups. Groups 3 and 4 were
located in different appellations but were similar according to metabolic profile composition
determined by 1H NMR spectroscopy.
The absolute or relative amounts of sugars, amino and organic acids varied strongly
according to the different environmental conditions. The four plots were located in different
appellations in Bordeaux, and 1H NMR spectroscopy could distinguish between pulp and skin
samples in a different way than physicochemical analyses. 1H NMR spectroscopy will be a useful
tool to study metabolite fingerprinting of grape berries produced in different conditions of soil and
climate.
The definition of the PC2 was more complex and differed according to the type of
analytical method. PCA from the physicochemical analyses seemed to point to ionic balance as the
complex factor involved in the separation between groups. PCA on 1H NMR data gave another
discriminating profile, but the separation between groups, again observed in skin extracts, was less
clear in pulp extracts. PCA is an unsupervised method, i.e, analysis is performed without
knowledge of sample class, which reduces the dimensionality of the data input whilst expressing
much of the original n-dimensional variance on a 2 or 3-D map. The next step will be to apply
partial least squares (PLS) analysis to build a model that discriminates between berry samples
according to their origin. The PLS model allows to choose the individuals and variables that will
take part in the group definition. For PLS modeling, more samples covering wider berry
variability, and different vintages, need to be analyzed. PLS modeling seems promising as group
clustering was observed using PCA analysis of data. A model could be created after introducing
82
data of the 2003 vintage and validated using the 2004 vintage. Such a method/tool would help to
differentiate between mature grape lots at harvest.
The factors responsible for the assigning of grape berries to different clusters are complex
and can be related to environmental factors, such as, soil type (1, 38, 42), climate (1, 3, 6, 39-42),
fertilization (43), age of plants (44) and genetic factors (rootstock and cultivar) (31, 45). The
cultivar effect may have contributed to the separation between samples from the clusters. The
‘Merlot noir’ cultivar was close to Group 2, constituted by ‘Cabernet-Sauvignon’ and ‘Cabernet
franc’ cultivars, but cultivar effect appears less significant than environmental effect (1). The
vintage effect will be studied to verify the most important insights on the grape composition.
This approach will be useful to better understand the plot variability relative to harvest and
to identify the enological potential of the grapes, with the determination of metabolic
fingerprintings. A more precise separation between berry lots at harvest will help to analyze the
effect of environmental factors on wine grape composition and quality. Producing high quality
grape berries requires a good knowledge of all of these factors as well as an understanding of the
vineyard environment.
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank the National Council to Scientific and Technologic Development (CNPq-Brazil)
for a grant (G.E. Pereira), the CIVB and Aquitaine Region (France) for their financial support to
the project and the wineries that provided the grape berry samples.
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87
Table 1. Physicochemical analyses of mature grape berries in four wine-growing areas in
Bordeaux. Berry fresh weights (g/berry), total soluble sugars, °Brix, pH, total titratable acidity,
tartaric, malic acids and total and mineral nitrogen and phosphorus concentration, potassium,
calcium, magnesium amounts, percentage of skin (% skin), optic densities OD520 (mg anthocyanins
g-1 dry weight) and OD360 nm (mg flavonols g-1 dry weight) from the four groups of samples
studied. Means accompanied by the same letter are not significantly, different letters significantly
according to the Bonferroni test (P < 0.05). From n=134 samples, each sample formed by 80
berries.
Variable
Group 1 (n= 80) Group 2 (n=24)
2.10 a
1.22 b
Berry weights (g/berry)
8.5 c
12.1 a
% skin
198.0 b
227.0 a
Soluble solids (g/L)
19.5 b
21.6 a
°Brix
3.32 b
3.33 b
pH
96.4 a
84.7 b
Titrat. acidity (meq/L)
94.5 a
80.0 b
Tartaric acid (meq/L)
39.9 a
38.4 a
Malic acid (meq/L)
562.0 a
311.0 b
Total N (ppm)
62.8 a
28.7 b
Mineral N (ppm)
110.1 b
119.4 b
Total P (ppm)
92.4 b
95.2 b
Mineral P (ppm)
2079.5 a
1937.7 bc
K (ppm)
49.7 b
69.4 a
Ca (ppm)
66.7 b
83.8 a
Mg (ppm)
66.0 a
41.3 c
OD (520 nm)
0.40 a
0.30 c
OD (360 nm)
Group 3 (n= 24)
2.12 a
9.6 b
233.0 a
22.5 a
3.38 a
84.8 b
84.5 b
33.5 b
208.6 c
12.0 c
155.5 a
130.8 a
1817.0 c
75.2 a
66.0 b
41.2 c
0.35 b
Group 4 (n= 6)
2.16 a
10.4 b
207.0 b
19.8 b
3.35 a
84.5 b
83.1 b
30.9 b
228.0 c
15.0 c
168.3 a
82.1 c
1870.7 c
56.9 b
55.4 c
50.4 b
0.27 c
88
Table 2. 1H chemical shifts used for metabolite identification Chemical shifts were determined at
pH 4 in D2O and expressed as relative values to that of TSP at 0 ppm Groups are indicated
according to Fan (15) and Moing et al. (31). Nineteen compounds were identified in the 1D 1H
NMR spectra of grape berry extracts (skins and pulp tissues). d, doublet; dd, doublet of doublets;
m, multiplet; s, singlet; t, triplet.
Compound
Group
1
H Multiplicity
1
H number
1
H (ppm)
Isoleucine
C5H3
t
3
0.93
Leucine
C5H3+C6H3
t
6
0.95
Valine
C4H3 + C5H3
d
6
1.04
Threonine
C4H3
d
3
1.32
Alanine
C3H3
d
3
1.48
Arginine
C3H2
m
2
1.60-1.78
Proline
C4H2 + C3Ha
m
3
1.95-2.01
Glutamine
C4H2
m
2
2.45
GABA
C3H2
C4H2
C2H2
m
t
t
2
2
2
1.94
2.45
3.02
Formic acid
C1H
s
1
8.36
Fumaric acid
C2H + C3H
s
2
6.69
Lactic acid
C3H3
d
3
1.36
½(C2H2 + C4H2)
½(C2H2 + C4H2)
C2Ha
C2Hb
C3H
d
d
dd
dd
dd
2
2
1
1
1
2.74
2.87
2.66
2.83
4.41
Succinic acid
C2H2 + C3H2
s
4
2.61
Tartaric acid
C2H + C3H
s
2
4.43
Citric acid
Malic acid
m
m
m
Fructose
4.09-4.12
3.98-4.02
3.63-3.73
Glucose
C1H
d
1
4.64
Glucose
C1H
d
1
5.23
d
d
1
1
5.41
4.21
Sucrose
Glucopyranosyl-C1H
Fructofuranosyl-C3H
89
5
4
PC2
21.6%
Group 1
Group 2
Group 3
3
Group 4
2
1
PC1
48.5%
0
-7
-5
-3
-1
-1
1
3
5
-2
-3
-4
-5
Figure 1: PCA scores on the physicochemical variables measured on 134 samples of grape berries
from four appellations. PC1 and PC2 explained 70.1 % of the total variance. Group 1 was from the
Bordeaux appellation, Group 2 from Saint-Emilion, Group 3 from Buzet and Group 4 from
Pessac-Léognan.
90
Figure 2 . Example of 1H NMR representative spectra of a freeze-dried extracts of skin tissues of
cultivars ‘Merlot noir’, ‘Cabernet-Sauvignon’ and ‘Cabernet franc’, with 64 scans and acquisition
time of 29 min.
91
Figure 3. Example of 1H NMR representative spectra of a freeze-dried extracts of pulp tissues of
cultivars ‘Merlot noir’, ‘Cabernet-Sauvignon’ and ‘Cabernet franc’, with 64 scans and acquisition
time of 29 min.
92
20
PC2
22.9%
Group 1
Group 2
Group 3
15
Group 4
10
5
PC1
27.6%
0
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
-5
-10
Figure 4. PCA scores on the 200 buckets of the 1D 1H NMR spectra from pulp extracts of berries
harvested in 2002 in four appellations in Bordeaux. The PC1/PC2 plot explained 50.5% of the total
variance. Group 1 is from the Bordeaux appellation, Group 2 from Saint-Emilion, Group 3 from
Buzet and Group 4 from Pessac-Léognan.
93
20
Group 1
PC2
19.2%
15
Group 2
Group 3
Group 4
10
5
PC1
25.6%
0
-15
-10
-5
0
5
10
15
-5
-10
-15
Figure 5. PCA scores on the 200 buckets of the 1D 1NMR spectra from skin extracts of berries
harvested in 2002 in four appellations in Bordeaux. The PC1/PC2 plot explained 44.8 % of the
total variance. Group 1 is from the Bordeaux appellation, Group 2 from Saint-Emilion, Group 3
from Buzet and Group 4 from Pessac-Léognan.
94
CHAPITRE IV
Dans le chapitre III la technique RMN est validée et l’attribution des résonances aux
principaux métabolites des extraits de pulpes et de pellicules de raisins est établie dans nos
conditions analytiques. L’analyse statistique du spectre RMN permet de montrer que les
groupes de raisins issus de parcelles différentes sont bien individualisés. Ces résultats
confirment et généralisent les résultats présentés dans le chapitre II.
Il faut maintenant identifier les facteurs de l’environnement qui contribuent à établir ces
profils métaboliques caractéristiques. C’est l’objet des 2 prochains chapitres. Le chapitre IV
explore les effets du microclimat de la zone des grappes. L’éclairement de la zone des grappes
modifie profondément les caractéristiques qualitatives des raisins. L’apport d’énergie lumineuse
dans la zone des grappes a des effets thermiques et photochimiques. Un dispositif expérimental a
été mis en place sur une parcelle viticole pour créer des différences climatiques dans la zone
fructifère. Des échantillons de raisins ont été prélevés sur les faces ouest et est du rang et à
différentes positions dans les grappes. Des modalités d’effeuillage ont été ajoutées pour disposer de
lots de raisins diversement exposés à la lumière. Ces lots ont été classés en « exposés » et à
l’ « ombre », et une comparaison des profils métaboliques issus de l’analyse
RMN 1H et
d’analyses CPLH des composés phénoliques et des acides aminés est faite. Le but est d’augmenter
le nombre de variables analytiques pour améliorer la compréhension des effets de la lumière. Les
composés phénoliques sont connus comme réactifs à la lumière et sont mal évalués par la
technique RMN 1D. L’analyse CPLH apporte des information complémentaires. L’analyse des
acides aminés permet de valider les attributions des résonances RMN.
95
CHAPITRE IV : L’INFLUENCE DU MICROCLIMAT DE GRAPPES SUR LA
COMPOSITION MINERALE ET LES PROFILS METABOLIQUES DE BAIES DE RAISINS
MICROCLIMATE INFLUENCE ON MINERAL AND METABOLIC PROFILES OF GRAPE
BERRIES
Pereiraa, G. E.; Gaudillerea,*, J.-P.; Pieria, P.; Hilberta, G.; Maucourt C, M.; Debordec, C.; Moingc,
A.; Rolinc, D.
a
UMR Œnologie-Ampélologie, Ecophysiologie & Agronomie Viticole, INRA – ENITA Bordeaux
- Université Bordeaux 2, BP 81, 33883 Villenave d’Ornon Cedex, France
c
UMR Physiologie et Biotechnologie Végétales, INRA - Universités Bordeaux 1 - Victor Segalen
Bordeaux 2, IFR Biologie Végétale Intégrative, BP 81, 33883 Villenave d’Ornon Cedex, France
* To whom correspondence should be addressed. Tel: +33 557122521. Fax: +33 557122515. Email: [email protected]
Received: 2005
4 Tables
9 Figures
Running title: grape microclimate and metabolic profiles
Cet article est soumis à Journal of Experimental Botany.
Résumé de l’article
96
Il est connu que le microclimat des grappes influence la qualité des raisins. Les effets de
l’exposition des grappes de raisins sur la composition des baies ont été étudiés sur le cépage
‘Merlot’ dans un vignoble à Bordeaux. L’exposition de la zone fructifère à la lumière a été
modifiée en utilisant différents niveaux d’effeuillage, la position des grappes par rapport à l’azimut
et la position des baies dans la grappe. L’exposition des baies a été mesurée in situ par le relevé des
températures des baies. Les baies ont été prélevées à maturité optimale pour la détermination des
profils métaboliques sur la pellicule et/ou pulpe, basés sur la mesure des éléments minéraux (N, P,
K, Ca, Mg), d’empreintes métaboliques par RMN 1H, par les analyses ciblées CLHP des acides
aminés et des composés phénoliques et des analyses physico-chimiques. Chaque méthode utilisée
pour la détermination des profils a permis une discrimination des baies exposées ou à l’ombre en
appliquant l’analyse discriminante PLS. Les composés quercetine-3-glucoside, kaempferol-3glucoside, myricetine-3-glucoside et isorhamnetine-3-glucoside comme polyphénols (CLHP),
histidine, valine, GABA, alanine et arginine comme acides aminés (CLHP), et malate comme acide
organique (RMN et physico-chimique), ont contribué pour expliquer la variabilité métabolique par
rapport à l’exposition des baies. La capacité de discrimination des profils par les méthodes
analytiques a été comparée. Malgré la discrimination des baies par la méthode RMN, la variabilité
expliquée a été faible par rapport aux autres analyses. L’exposition des baies a augmenté les
flavonols des pellicules et des pulpes, les acides aminés histidine et valine, et a diminué les acides
organiques, le GABA et l’alanine. Ces classes de métabolites peuvent être utilisées pour trier des
baies issues d’un environnement inconnu. La signifiance physiologique des effets lumière et
température sur la composition des baies est discutée.
97
ABSTRACT
The grape berry microclimate is known to influence berry quality. The effects of the light exposure
of grape berry clusters on the composition of berry tissues were studied on ‘Merlot’ variety grown
in a vineyard in Bordeaux-France. The light exposure of the fruiting zone was modified using
different intensities of leaf removal, cluster position relative to azimuth and berry position in the
cluster. Light exposures were identified and classified by in situ measurements of berry
temperatures. Berries were sampled at maturity for determination of skin and/or pulp chemical and
metabolic profiles based on chemical measurement of minerals (N, P, K, Ca, Mg), untargeted 1H
NMR metabolic fingerprints, and HPLC targeted analyses of amino acids and phenolics, and
physico-chemical analyses. Each profiling method allowed to discriminate light from shaded
berries using Partial Least Square discriminant analysis. Quercetin-3-glucoside, kaempferol-3glucoside, myricetin-3-glucoside and isorhamnetin-3-glucoside for the phenolics, histidine, valine,
GABA, alanine and arginine for the amino acids, and malate for the organic acids contributed to
explain the metabolic variance in relation to berry light exposure. Capacities of the different
profiling techniques to discriminate berries were compared. Although 1H NMR fingerprints
allowed to identify light and shaded berries, the proportion of explained variance from NMR
results was low compared to chemical measurements. Light exposure of berries increased the skin
and pulp flavonols, histidine and valine contents, and reduced the organic acids, GABA and
alanine contents. These metabolite classes can be used to sort berries collected in an unknown
environment. The physiological significance of light and temperature effects on berry composition
is discussed.
Key words: Amino acids; flavonols; 1H NMR; HPLC; metabolic profiles; microclimate; Partial
Least Square; temperature; Vitis vinifera
Introduction
In a vineyard, a wide range of external factors influences the grape berry composition for a
given cultivar. Climate, soil, and training system modify the vine light interception, vegetative
growth, water status and the grape microclimate and maturation. The amount of light intercepted
by the vines is determined by the architecture of the vineyard, mainly row orientation, height and
width of the canopy and distance between rows (Pieri and Gaudillere, 2003). At canopy level, the
amount of intercepted light affects the whole plant photosynthetic capacity, water balance, and
carbon partitioning between vegetative and reproductive growth (Castelan-Estrada et al., 2002).
The source sink balance is a main parameter that controls berry content of sugar, organic acids and
98
secondary metabolites with qualitative potentialities (Bureau et al., 2000; Guidoni et al., 2002;
Smart et al., 1990).
Direct light irradiation of clusters affects berry composition in many aspects. Berry
temperature is increased above the mean air temperature (Smart and Sinclair, 1976) and a direct
effect of light wavelength on berry metabolism can be expected. In field experiments it is not easy
to separate temperature from photochemical effects (Spayd et al., 2002). Net solar radiation
absorbed by fruits is mainly converted into heat (Smart and Sinclair, 1976). A lower organic acid
content (malic acid) is generally reported when the berry temperature is increased, in relation to
respiration stimulation (Ruffner et al., 1984). If berry temperature is too high (>40°C) a decrease in
sugar and anthocyanin content is observed (Haselgrove et al., 2000).
Red, blue and UV photons can activate key enzymes of the flavonoid pathway
[phenylalanine ammonia lyase, chalcone synthase, stilbene synthase (Lin, 2002; Moller et al.,
2002)]. Phytochromes, cryptochromes and phototropin are ubiquitous photoreceptors that take
place in fruits (Alba et al., 2000; Giliberto et al., 2005). Detailed studies on grape berries are
lacking but it has been suggested that phenolic metabolism can be controlled by light quality
signals (Bureau et al., 2000; Wade et al., 2001). Conversely, sun exposed berries show a high
content of flavonols in skin (Haselgrove et al., 2000). This flavonol increase is not due to a
temperature effect but to a photochemical one (Spayd et al., 2002b). In the canopy, the sun light is
filtered by the leaves and the red-far red ratio is lower in the cluster zone (Dokoozlian and Kliewer,
1995). The UV irradiation depends on the diffuse sky light received by the clusters (Gao et al.,
2002). The main factor of variation of UV irradiation is the local amount of incident UVB, the
height of the canopy and local leaf shading. However, there is a significant correlation between
global irradiation and the amount of the photo-active radiations in the canopy (Dokoozlian and
Kliewer, 1995). In summary, berry composition is the result of the effects of carbon availability
(source sink balance), berry temperature and red, UV radiations and their interactions.
The highly variable light exposition in the grape region of a canopy is related to the daily
sun exposition (morning or afternoon), and the local position of the berries, exposed or shaded
berries inside the clusters. Different berry sets can be sampled in various locations in the canopy
and classified according to their position and their mean temperature. Chemometric approaches are
also possible to compare exposed and shaded field grown fruits. They have been applied
successfully in food science (Benton et al., 1998) and plant biology (Roessner et al., 2001).
Although metabolite fingerprinting is based on a very limited number of metabolites compared to
the potential number of 100000 secondary metabolites (Schwab, 2003). It can be applied on
discrete analytical data or on data issued from spectrometric techniques. The metabolic profiles are
compared by multivariate statistical methods (Kemsley, 1998). The analytical techniques currently
99
used for metabolite profiling are HPLC, GC-mass spectrometry, and 1H-NMR. The number of
metabolites that can be quantified is determined by the specificity and the sensitivity of the
methods (Krishnan et al., 2005). Mass spectrometry has a higher potential of identification,
compared to 1D 1H NMR which is limited by low sensitivity, overlapping signals and dynamic
range problems in a crude extract. However, 1H NMR spectroscopy is a promising non-targeted
profiling method, because it detects a broad range of metabolites (amino acids, organic acids,
sugars, and phenolics) in a quantitative way (Ward et al., 2003). Therefore, 1H NMR can be used
for fingerprinting by using the primary data of the spectrum, keeping in mind that the identification
of the major metabolites is always possible (Krishnan et al. 2005).
In this work metabolic profiles of field grown berries were determined based on classical
analytical data and 1H-NMR spectral pattern recognition (Lindon et al., 2001). Partial least square
(PLS) and linear discriminant analysis were used to compare the capacities of the different
profiling techniques to discriminate exposed and shaded berries and to identify the most significant
variables typical of the light environment of the berries. All the targetted and non targetted
analytical data set used made it possible to discriminate sun exposed and shaded berries. Flavonol
content pattern was the most efficient one in order to sort test observations.
Materials and methods
Sample origin
The grape berry samples were harvested in September 2002 at maturity defined as mean
°Brix> 20 and titratable acidity (TA) < 100 meq according to the local general commercial
practices. Each berry sample, made of 20 berries, was rapidly collected in the vineyard and
transferred to the laboratory within a thermic box at 8 °C.
The vineyard was localized close to Bordeaux (France, lat 44.883°; long –0.567°). The
grapevines, cultivar ‘Merlot’ were 12 years old, grafted on ‘Fercal’ rootstock (Vitis berlandieri x
Vitis vinifera) and cultivated in a sandy soil. The plantation density was 6600 plants/ha (1.5 m inter
row, 1 m spacing on the row), North-South row orientation, 1 m canopy height. Shoot trimming
was achieved after flowering to maintain the canopy height and width to 1 and 0.3 m respectively.
The vineyard was chemically protected against powdery mildew, downy mildew and Botrytis.
Experimental design
Illumination in the cluster zone depends on the side of the row (East or West), the local leaf
density and the position of the berries in the cluster (outside or inside the canopy). Illumination
level was modified using leaf removal treatments. When applied, the leaf removal treatments were
implemented in one side only of each vine, either the East-looking or West-looking side, bearing
100
4.5 bunches on average. They were applied individually to clusters, at veraison (start of berry
maturation). Standard leaf removal was designed to be similar in intensity to the practice of
commercial growers. All the leaves in front of a grape clusters and situated within a radius of 25
cm were removed manually. This way, the East-looking clusters were illuminated directly by the
solar radiation all morning long and the West-looking clusters all afternoon long. The partial leaf
removal was applied on the East side of the rows by removing only the leaves that shaded the
clusters between 08:00 and 09:00 (a.m. solar time). Similarly, clusters on the West side of rows
were treated in the afternoon from 15:00 to 16:00 (solar time). During these symmetrical time
windows, the clusters were directly lit by approximately half the maximum solar radiation. The
total leaf removal refers to removal of all the leaves around clusters on the East and West sides of
the plant in the row (Table 1).
The sampling of the berries on seven consecutive vines in one row was achieved on the
both sides of the row with three levels of leaf removal around clusters (total leaf removal, 50% leaf
removal and no leaf removal) and three berry positions in the cluster (exterior, in the middle or
interior of the canopy). That makes a total of 18 cases where samples of 20 berries, repeated 4
times, were collected at harvest of the vineyard for further analysis.
The temperature of the berries was recorded with thin thermocouples pricked in one berry
sampled in each of the 18 situations. Data were stored continuously from veraison to maturity in a
data logger (Campbell 10X, Logan USA). A weather station next to the plot recorded local climate,
air temperature, solar radiation, wind speed and dew point (Simel, Gevrey Chambertin, France).
The one-sided leaf area (Y), measured by image analysis, was significantly correlated with
the length square (L2) of the main vein of leaves (Y = 1.11 x L2) using 50 leaves of various sizes
sampled randomly. Therefore, the main veins were measured on a total of 72 primary leaves,
equally distributed between the three shoot thirds (basal, middle and apical one), leading to an
average leaf area of 129 cm2. On laterals, one leaf out of four was sampled resulting in an average
leaf area of 47.8 cm2. The average one-sided leaf area removed was estimated (9 August) by
counting numbers of leaves removed per vine from primary shoots (primary leaves) and from
laterals (secondary leaves).
To apply statistical analysis on chemical and profiling results of skin and pulp extracts, 18
conditions repeated 4 or 5 times were pooled into 2 lots according to the mean daily sum of
temperature of the berries: shaded (38 samples) and sun exposed (22 samples). Twenty samples (8
sun exposed and 12 shaded) were set aside to test the model drawn by linear discriminant analysis
after PLS discriminant analysis of the primary data set.
101
Extraction of skin and pulp tissues
The berry fresh weight was measured. Skins and pulps were isolated manually, on ice, in
order to carry out two separate extractions and weighed. The skins were ground by use of a Waring
blender during 2 min at ambient temperature followed by extraction with ethanol 96 % on ice
during one hour (40 mL EtOH per 20 skins). The pulp was centrifuged 5 min at 3000 g. One
aliquote was used for physico-chemical measurements carried out on the pulp (must). The remnant
was extracted on ice with ethanol 96% during 15 min (40 mL EtOH per 20 pulps).
Physico-chemical characterization of grape berries.
Five mineral variables were measured on the must: total nitrogen (N), total phosphorus (P),
potassium (K+), calcium (Ca++) and magnesium (Mg++) were determined. Total nitrogen and
phosphorus were measured following digestion using sulfuric acid and hydrogen peroxide (Hach et
al., 1985). Total K+, Ca++ and Mg++ contents were determined following dilution of the musts, by
inductively coupled Plasma atomic emission spectrometer (Varian Vista, Varian, Mulgrave,
Australia). PO42- was determined with an automated colorimetric method using TRAACS 800
methods (TRAACS-800, 1978). Total acidity at pH 7 and pH was determined with an automated
pH meter and titration with NaOH (0.1N). Total soluble solids (°Brix) were determined using a
hand refractometer with temperature compensation. Total sugars, tartaric and malic acid
concentrations were determined with an automated colorimetric method using the autoanalyzer
TRAACS 800 (total sugars reaction with 2-9-dimethyl-1-10-phenanthroline, tartaric reaction with
ammonium vanadate and malic reaction with malic enzyme and cofactors), according to Blouin
(1992). Flavonols (OD360) and anthocyanin contents (OD520) were determined on skin extracts with
a UV-visible spectrophotometer Cary at 360 nm and 520 nm respectively. The ethanolic extracts
were diluted (5%) by acidified water containing 2% v/v HCl (10N). The optical densities were
measured at 360 and 520 nm (Keller et al., 1998 and Cabrita et al., 2000). Anthocyanins (OD520)
were expressed as mgg-1 FW and OD360 was expressed as OD360 g-1FW.
These measurements were grouped into the “maturity analytical data set” (15 variables)
made out of the must content of minerals (N, P, K+, Ca++, Mg++), soluble solids, sugars, malic acid,
tartaric acid, total acidity, pH, skin anthocyanins and flavonols, mean berry weight, and the skin to
pulp fresh weight ratio.
1D 1H NMR analysis
102
An aliquote of each skin or pulp extract was dried under vacuum (Speed Vac Savant,
Ramsey USA) then dissolved in 400 mM oxalate buffer, pH 4 and dried again. After concentration
under vacuum the residues were dissolved in D2O, titrated to pH 4.0, stirred during four hours at 4
°C, and freeze-dried to reduce the residual water signal in the spectra.
The NMR spectra were performed on the titrated extracts dissolved in 0.5 mL D2O. Sodium salt of
(trimethyl)-propionic-2,2,3,3-d4 acid (TSP) in D2O was added in all samples at a final
concentration of 0.01% for chemical shift calibration at 0 ppm. 1D 1H-NMR spectra were recorded
at 27ºC with a 500,162 MHz Avance Bruker spectrometer using a 5 mm inverse probe and fitted
with an autosampler. Each spectrum consisted in 64 scans of 32K data points with a spectral width
of 6000 Hz, an acquisition time of 2.73 s, and recycle delay of 25 s per scan in order to allow
complete relaxation and absolute quantification. The pulse angle was 90°. Spectra were acquired
under an automation procedure (automatic shimming and automatic sample loading) requiring
about 29 min acquisition per sample. Preliminary data processing was carried out with XWIN
NMR software (Brucker Biospin, Karlsruhe, Germany). Free induction decays (FID) were Fourier
transformed with 0.3 Hz line broadening, phased and baseline corrected using XWINNMR
software (Bruker Biospin, Karlsruhe, Germany). Signal assignment was performed following
published data (Fan, 1996; Moing et al., 2004) and confirmation with addition of standards.
In order to use all the information of the spectra signature, each 1D 1H NMR spectrum was
baseline corrected and segmented into 190 spectra domains of 0.04 ppm (variables called buckets)
using metabolite mode of AMIX software (Bruker Biospin, Karlsruhe, Germany) between 0.76 and
8.8 ppm (190 variables). The resonances between 4.7-5.0 ppm, corresponding to residual water,
were removed. All NMR buckets were normalized to the total spectra intensity without the water
region. The NMR variables situated between 2.60 and 2.88 ppm (malic, succinic or citric acids) or
4.36 and 4.48 ppm (tartaric or malic acids) were summed and named S2.8 and S4.4 respectively to
take uncontrolled peak shifts in these organic acid regions into account (Defernez and Kemsley,
1997; Defennez and Colquhoun, 2003). For the other peaks no shift was observed in the spectra.
HPLC analysis of free amino acids
The amino acid content in skin and pulp extracts was determined according to Cohen and
Michaud
(Cohen
and
Michaud,
1993).
After
derivatization
with
6-aminoquinolyl-N-
hydroxysuccinimidyl carbamate, amino acids were analyzed using an HPLC system consisting in a
P100 gradient pump and an AS100 XR automated sampler (Thermo Separation Products, San Jose,
CA, USA). Separation was carried out on a Nova-Pack C18 AccQ-Tag (WAT052885, Waters,
Milford, USA) column at 37°C with elution at 1 mL min-1 with a 67 min linear gradient (Eluent A,
sodium acetate buffer, 140 mM at pH 5.7; Eluent B, acetonitrile 60 % (v/v) and water).
Fluorescence detection was performed with a FL 3000 dual monochromator detector (Thermo
103
Detector Products, San Jose, CA, USA). To maintain consistent retention times and stable
baselines, a control was used before each run of 18 samples to detect possible trouble in the
chromatogram. Peak areas were integrated by Millenium32 software, version 3.05 (Waters, Milford,
MA, USA). A standard of 20 amino acids (Sigma Aldrich, Lyon, France) was used after control
and in the middle of each run to calibrate the amino acid quantification. Twenty amino acids were
identified and quantified in pulp or skin extracts: aspartate, glutamate, asparagine, serine, glycine,
glutamine, histidine, threonine, asparagine, alanine, -amino-n-butyric acid (GABA), proline,
tyrosine, cysteine, valine, methionine, isoleucine, leucine, lysine and phenylalanine. The results
were expressed in µg N/100 g fresh weight (FW) of skin or pulp.
HPLC analysis of phenolic compounds
One mL of ethanolic extract was dried under vacuum (Speed-Vac, Savant ). Then the
extract was solubilized in 0.5 ml of acidified methanol at 0.1 % of HCl (v/v), filtered through a
0.45 µm membrane (Pall Gelman Corp., Ann Arbor, USA). Twenty µL of the solution were
injected for the HPLC separation (2690 Alliance Separation Module, Waters, Milford, MA, USA)
and detected with a UV-V variable wavelength detector operating at 360 and 520 nm (Blouin,
1992). Separation was achieved on a reverse-phase Ultrasphere ODS column 25 cm x 4.6 mm, 5
µm particle size with an Ultrasphere ODS guard column 4.5 cm x 4.6 mm from Beckman
Instruments Inc. (Fullerton, CA, USA), at ambient temperature. Water was purified
(18 M ) with an ELGA UHQ water purification system (Bucks, UK). The duration of one
analysis was 80 min., with an elution gradient of solvent A (water and formic acid, 90/10 v/v), and
solvent B (water, acetonitrile and formic acid, 60/30/10 v/v). A binary gradient at 1 mL min-1 flow
rate was used: 0 min, A 80%, B 20%; 70 min, A 15%, B 85%; 75 to 80 min, A 80 %, B 20%. The
column temperature was 25°C. An external standardization was used for the quantification on the
basis of peak area of malvidin-3-glucoside for all the anthocyanins (at 520 nm), and quercetin-3glucoside as common standard for all quantified flavonols and unknown compounds (at 360 nm).
Malvidin-3-glucoside and quercetin-3-glucoside were purchased from Extrasynthese (Genay,
France). In the pulp extracts only the flavonols were analyzed at 360 nm, 20 compounds were
observed and quantified in the profiles, 7 were identified (myricetin-3-glucoside, rutin, quercetin3-glucoside, myricetin, kaempferol-3-glucoside, isorhamnetin-3-glucoside and quercetin) and 13
unknown (x1 to x13). In the skin extracts, 35 phenolic compounds were quantified: 15
anthocyanins determined at 520 nm (delphinidin-3-glucoside, cyanidin-3-glucoside, petunidin-3glucoside,
paeonidin-3-glucoside,
cyanidin-3-(acetyl)-glucoside,
malvidin-3-glucoside,
petunidin-3-(acetyl)-glucoside,
delphinidin-3-(acetyl)-glucoside,
paeonidin-3-(acetyl)-glucoside,
malvidin-3-(acetyl)-glucoside, delphinidin-3-(p-coumaryl)-glucoside, cyanidin-3-(p-coumaryl)104
glucoside, petunidin-3-(p-coumaryl)-glucoside, paeonidin-3-(p-coumaryl)-glucoside and malvidin3-(p-coumaryl)-glucoside and 20 flavonols determined at 360 nm, as for the pulp extracts.
Statistical analyses
All the variables except NMR buckets were analyzed by ANOVA (Systat software). Then
significant differences between means were determined with the Bonferoni’s test. For multivariate
analyses, separated statistical analyses were performed on 3 groups of variables: group 1, berry and
skin weight, N, P, K, Ca, Mg, soluble solids, acidity and phenolics (OD520, and OD360), group 2,
amino acids, anthocyanins, flavonols, in pulp and skin, group 3, 1H NMR spectra domains
(buckets) in pulp and skin. Principal component analysis (PCA, correlation method) and Partial
Least Square regression (PLS) multivariate methods were used [Windas software, (Kemsley,
1998)]. PCA is the first step in data exploration, which allows the main variability aspects of a data
set to be visualized. It estimates how many components are necessary to explain the greater part of
total variance with a minimum loss of information. PLS calculates synthetic variables and the
scores are maximized to discriminate the group of samples defined here by their temperature due to
light exposure (Duarte et al., 2002; Lindon et al., 2001).
Chemicals
All the chemical reagents were of analytical grade (Mallinckrodt Baker France, Noisy-LeSec, France). D2O (99.9%) was purchased from Euristop (Gif sur Yvette, France), TSP (98%) from
Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Methanol (HPLC grade) was obtained from Baker
(Mallinckrodt Baker France, Noisy-Le-Sec, France) and formic acid (99 %) from Merck (Merck
Eurolab, Fontenay-sous-Bois, France). Chemical standards for HPLC analyzes were purchased
from Sigma (St Louis, MO, USA).
Results
Berry microclimate
The intensity of leaf removal was measured one month before harvest by using the ratio of
the leaf area removed divided by the total leaf area (Table 1). The average leaf area per vine, 2.9
m2 (leaf area index, LAI = 1.5), was estimated on August 2nd 2002. On 12 vines randomly
selected, all the primary shoots and laterals were counted (7.7 and 37.7 per vine, respectively) as
well as their leaves (Table 1). The total leaf area per vine was not significantly different for the
three conditions.
105
An example of the daily variations of berry temperature in 3 conditions, berries exposed on
the east and west side and shaded berries, is shown Figure 1 for a clear day. The summation of the
light exposure of berries in the different positions described in material and methods was
quantified by summing the daily berry temperature above 10°C recorded each 15 min. The
summation of the berry temperature was used to separate sample into two classes, sun exposed and
shaded berries.
Table 1. Experimental device and intensity of leaf removal around bunches on a per vine basis.
Grape berries were sampled in an experimental vineyard made of 30 50-meter long rows. Leaf area
was measured on number 220 day of the year and leaves were removed partially or totally in the
fruiting zone on the East or the West side of the row according to Material and Methods. The
intensity of leaf removal did not change significantly the canopy vineyard light interception.
Number of vines sampled
Total mean leaf area (m2vine -1)
Leaf Removal (% of the total)
Leaf Removal (% in the fruiting
zone)
Vines before
leaf removal
12
Total leaf
removal
79
0
Partial leaf
removal
79
2.9±0.8
4.5
0
50
100
12
11.4
EO
EX
WO
WX
10
8
T*
6
4
2
0
-2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
hour
Figure 1: Grape berry temperature difference with air temperature (°C) along a clear day recorded
on sun exposed and shaded berries on the east and the west side of the canopy. The orientation of
106
the rows was north-south (EO: east shaded; EX: east exposed; WO: west shaded; WX: west
exposed).
Discriminant analysis from classical maturity analytical data sets
Anova was performed on the 16 variables measured on 60 samples of grape berries, 38
from shaded and 22 from exposed berries (Table 2). Differences between sun exposed and shaded
berries were significant for all analytical variables except anthocyanins, P, K, Ca contents and
percentage of skins. Exposed berries had higher total sugars and flavonols (absorbance at 360 nm),
and lower total acidity, tartaric and malic acid concentrations and lower berry weight than shaded
berries.
107
Table 2. Means of berry weights, percentage of skins, total acidity, tartaric and malic acid
concentrations, pH, soluble sugars (°Brix), total sugars, total anthocyanins (OD520 nm), flavonols
(OD360 nm), total nitrogen, phosphorus, potassium, calcium and magnesium amounts from shaded
and sun exposed berries. In each line, different letters indicate significant differences between
means (Bonferroni test, P< 0.05). Berry samples were grouped according to the mean sum of
temperature above 10°C of the berries recorded after leaf removal treatment in the 18 different
locations combining the 3 levels of leaf removal, the azimuth of the clusters (East and West) and
the position of the berries in the cluster.
Variables
Shaded (n=38)
Sun Exposed (n=22)
Berry weight (g 100 berries-1)
212.8 a
203.1 b
Percentage of skins (%fw)
8.45 a
8.39 a
Total acidity (meq L-1)
101.0 a
87.8 b
-1
Tartaric acid (meq L )
96.2 a
90.9 b
Malic acid (meq L-1)
42.7 a
34.4 b
pH
3.28 b
3.39 a
Soluble solids (°Brix)
19.2 b
19.8 a
Total sugars (g/L)
197.0 b
211.0 a
Total anthocyanins ( mg g-1)
12.9 a
12.1 a
Total flavonols (OD360 g-1)
58.8 b
80.1 a
Total N (µg g-1)
541 b
614 a
Total P (µg g-1)
109 a
112 a
K (µg g-1)
2092 a
2032 a
-1
Ca (µg g )
51.2 a
48.7 a
Mg (µg g-1)
69.0 a
64.4 b
PLS discriminant analysis (Figure 2A) was performed on both groups of berries. The first
PLS score clearly separated the group of exposed berries from the shaded group. It explained
22.3% of total variability. This score was loaded by variables related to berry acidity (malate, total
acidity and K+) on the positive side and N and total flavonols on the negative side (Figure 2B).
Sugars contributed slightly to the first score. The second PLS score explained 24% of total
variability and was related to P on the positive side and Ca++ and sugars on the negative side.
108
A
PLS2
24.5%
5
Shaded
4
Exposed
B
0.4
P
3
2
PLS1
22.3%
1
0
-6
-4
-2
-1
0
2
-2
-3
4
Malate
0.2
K+
N
0
-0.6
-0.4
-0.2
DO360
0
-0.2
Sug
°Brix
-0.4
Anth 0.2
Tar
BW
Mg++
0.4
TA
0.6
Ca++
-4
-5
-0.6
Figure 2: PLS discriminant analysis applied on classical maturity analytical data measured on 22
sun exposed and 38 shaded berry samples sampled at mature stage. A) Position of the samples
along the first 2 PLS axes. The percentages of variance explained by each axis is reported. B)
Variate loadings for the first 2 axes (DO360: optical density of the ethanol extract at 360 nm,
flavonols, N: total nitrogen, Sug: glucose+fructose, Anth: anthocyanins, Tar, tartrate, BW, mean
berry weight, TA: titratable acidity).
Metabolite profiling by 1D 1H NMR spectroscopy in pulp and skin berry extracts
Quantitative 1H NMR fingerprints were determined on the titrated ethanolic extracts of pulp
and skin solubilized in D2O (Figure 3). The region of the spectrum between 0 and 3 ppm is related
to aliphatic compounds, amino and organic acids. The sugar region (3-5.5 ppm) showed a great
number of overlapping peaks. The 6-9 ppm region pointed out aromatic compounds, but owing to
the complexity of the signals (Gil et al., 2003), 1D 1H NMR does not allow to identify individual
compounds.
PLS was applied on the 190 variables issued from the bucketing (0.04 ppm) of each NMR
spectrum of 60 samples from exposed or shaded berries (Figure 4). For pulp extracts, the first 2
PLS scores explained 36.4 % of total variance and allowed to separate the 2 groups (Figure 4A),
except for a few samples.
109
Arginine
Lactic acid
Threonine
Alanine
GABA
Proline
Proline
Malate
Valine
Isoleucine
Leucine
Alanine
Valine + Isoleucine
Proline
GABA
GABA
Proline
Succinate
Citrate
Citrate
Malate
Fructose
Residual Water
Glucose
Tartrate
Glucose Fructose Sucrose
Fructose
Sucrose
Glucose
B
Residual Water
Glucose
Glucose
A
Succinate
Glucose Fructose Sucrose
Figure 3: Representative 1H NMR spectra of pulp (A) and skin (B) extracts of ‘Merlot’ cultivar in
shaded condition, with 64 scans and acquisition time of 29 min.
The first PLS score (Figure 4B) was loaded by buckets from the aliphatic region (malate,
tartrate, citrate and/or succinate, grouped buckets S2.8 and S4.4) on the positive side. The negative
side was loaded by buckets from the aliphatic region (leucine, threonine, 0.98ppm, 1.34 ppm
respectively) and sugar region (fructose, 4.1 ppm). The second PLS score was described by
resonances in the aliphatic region on the positive side (arginine and proline) and sugars on the
negative side.
110
16
PLS2
24.9%
0.2
Shaded
1.66
Exposed
1.74
11
0.1
6
PLS1
11.5%
1
-12
-7
-2
3
8
0.98
-0.2
A
-9
-14
S2.8
2.94
S4.4
1.34
0
-0.1
-4
1.94
1.62
3.98
4.1
0.0
-0.1
3.7
3.78
-0.2
0.1
3.5
0.2
0.3
3.86
B
Figure 4: PLS discriminant analysis applied on the 190 buckets extracted from the 1H NMR of the
pulp extracts from 22 sun exposed and 38 shaded berry samples sampled at mature stage. A)
Position of the samples along the first 2 PLS axes. The percentages of variance explained by the
axis are reported. B) Variate loading for the first 2 axes. The figure B is the NMR resonance
position of the bucket (0.04 ppm) in the spectra. The most significant buckets loading on the first
axis are S2.8 and S 4.4 (sum of 3 buckets, see text) representative of proton respectively from
malic/citric/succinic acid and malic/tartaric acid. 2.94 ppm: GABA, 0.98 ppm: leucine, 4.1 ppm:
sugar, 1.34 ppm: threonine).
For skin extracts, PLS analysis resulted in a good discrimination between the exposed and
shaded groups with the first scores (Figure 5A). The first PLS score was loaded by buckets of the
aliphatic region of the spectrum (Figure 5B), sugar region and organic acid signals on the positive
side (higher amounts in shaded berries). The concerned compounds were malic, and/or citric
and/or succinic acids (S2.8 ppm), malic and/or tartaric acids (S4.4 ppm) and sucrose (5.42 ppm)
and 2 unattributed buckets (1.22 and 1.26 ppm). On the negative side, the first PLS score (higher
1
H signal amounts for exposed berries) was loaded by buckets of the aliphatic region, valine (1.06
ppm), proline (1.98, 2.34, 2.38 ppm) and in the aromatic domain (6.1 ppm). This first PLS score
separated exposed from shaded berries quite well although it explained only 6.2% of total variance.
The second PLS score explained 16.2% of total variance and revealed a large intra-group
variability. It was loaded by buckets attributed to organic acids (tartaric and/or malic acids, S4.4
ppm, GABA (1.94 ppm) and proline or GABA (1.94 ppm) and arginine (1.66 ppm) on the positive
side. On the negative side, it was loaded by buckets in the sugar region (3.54 ppm) and in the
aromatic region (7.22 and 8.38 ppm).
111
PLS2
16.2%
A
13
Shaded
0.2
B
Exposed
1.74
1.66
1.94
S4.4
8
0.1
2.38
3
-8
-6
-4
-2
-2 0
2.34
PLS1
6.2%
2
4
6
-0.2
1.98
6.1
1.06
1.26
1.22
0.0
-0.1
0.0
-0.1
-7
7.22
2.58
-12
4.22
5.42
S2.8
8.5
8.38
0.1
0.2
3.54
-0.2
Figure 5: PLS discriminant analysis applied on the 190 buckets extracted from the 1H NMR spectra
of the skin extracts of 22 sun exposed and 38 shaded berry samples sampled at mature stage. A)
Position of the samples along the first 2 PLS axes. The percentages of variance explained by each
axis are reported. B) Variate loadings for the first 2 axes. The figure B is the NMR resonance
position of the bucket (0.04 ppm) in the spectra. The most significant buckets loading on the first
axis are 1.26, 1.22 ppm: unknown, S2.8 (sum of 3 buckets, see text M&M) representative of proton
from malic/citric/succinic acid, 5.42 ppm: sucrose, 0.98 ppm: leucine, 4.22 ppm: fructose, 1.98,
2.34-2.38 ppm: proline, 1.06 ppm: valine, 6.1 ppm: aromatic compound domain.
Amino acids concentrations in pulp and skin extracts of grape berries
PLS discriminant analysis was applied on the amino acid content of pulp extracts. The
separation of the exposed and shaded groups by the first score was satisfactory (Figure 6A). The
first score explained 20.8 % of total variance and the second score 15.1 %. The main loadings of
the first score (Figure 6B) were determined by arginine, phenylalanine, asparagine and GABA on
the positive side (shaded berries), and histidine, valine, proline and methionine on the negative side
(exposed berries). The second PLS score separated samples within the groups and was determined
by arginine, alanine and methionine on the positive side and glycine on the negative side.
PLS applied to amino acid data of skin extracts discriminated the two groups of berries
(data not shown) poorly. The first score explained 29% of total variance, the second one 17%. The
first PLS score was loaded by alanine, GABA, leucine, and glutamate on the positive side. No
major amino acid contributed to the negative side of the first score since only histidine,
methionine, aspartate and proline contributed weakly to the negative loading of the score 1.
112
PLS2
15.1%
4
Shaded
0.4
Met
Exposed
3
2
0.2
PLS1
20.8%
1
-5
-4
-3
-2
-1
-1
0
1
2
3
0
4
-0.4
-2
-0.2
0
Val
0.4
Asn
Gaba
B
-4
0.2
-0.2
Pro
-3
A
Phe
His
0
-6
Arg
Ala
Gly -0.4
-5
Figure 6: PLS discriminant analysis applied on amino acid analysis of pulp extracts of 22 sun
exposed and 38 shaded berry samples sampled at mature stage. A) Position of the samples along
the first 2 PLS axes. The percentages of variance explained by each axis are reported. B) Variate
loadings for the first 2 axes. Phe: phenylalanine, Asn: asparagine, Gaba: γ-aminobutyrate, arg:
arginine, Asn: asparagine, His: histidine, Val: valine, Pro: proline, Met: methionine, Ala: alanine,
Gly: glycine.
Phenolics in pulp and skin extracts of grape berries
PLS analysis was applied on the data of phenolics from the pulp extracts of shaded or
exposed berries. The 2 groups were clearly separated by the first score (Figure 7A), explaining
32% of total variance. The variables which contributed to this score are shown on Figure 7B.
Flavonols, kaempherol-3-glucoside and quercetin-3-glucoside were the main variables on the
negative side and myricetin-3-glucoside and some unidentified phenolics on the positive side.
PLS2
6.6%
3
Shaded
0.8
Exposed
2.5
X12
0.6
2
1.5
PLS1
32.1%
0.5
-3
-1
-0.5
-1
1
3
X7
5
-0.6
-0.4
Kae3g
Que3g
X2
0.0
-0.2
0.0
0.2 Myr3g
-0.2
-1.5
-2
X10
0.2
0
-5
X1
0.4
1
-0.4
X9
0.4
X6
Myr
Figure 7: PLS discriminant analysis applied on phenolics (flavonols) of pulp extracts of 22 sun
exposed and 38 shaded berry samples sampled at mature stage. A) Position of the samples along
the first 2 PLS axes. The percentages of variance explained by each axis are reported. B) Variate
loadings for the first 2 axes. X1, X2, X6, X7, X10: unknown flavonols, Myr3g: myricetin-3glucoside, Myr, Myricetin, Kae3g: Kaempferol-3-glucoside, Que3g: Quercetin-3-glucoside.
113
PLS analysis applied on anthocyanins and flavonols data of skin extracts separated the
exposed and shaded groups (Fig. 8A). The first PLS score explained 31% of total variance (Fig.
8B) with several flavonols contributing to the negative side and anthocyanins to the positive side.
However, malvidin 3 glucoside, the most abundant anthocyanin in red vine varieties, did not
significantly contribute to the loading of the first score.
4
PLS2
4.3%
Shaded
3
0.4
PetCou
Exposed
X13
PLS1
31.2%
0
-9
-7
-5
-3
-1
1
-1
X2
Myr3g
1
A
MavAc
0.2
2
-11
X1
X3 X8
3
5
X7
-0.4 Que3g
B
X4
Kae3g
-0.2
Irh3g
Myr
CyAc
DpAc
PnAc
0.0
0.0
X12
CyCou
-0.2
Cyn3g 0.2
Dp3g
0.4
Pn3g
-2
-3
-0.4
Figure 8: PLS discriminant analysis applied on phenolics (anthocyanins and flavonols) of skin
extracts of 22 sun exposed and 38 shaded berry samples sampled at mature stage. A) Position of
the samples along the first 2 PLS axes. The percentages of variance explained by the axis are
reported. B) Variate loadings for the first 2 axes. X1, X2, X6, X7, X10: unknown flavonols,
Myr3g: myricetin-3-glucoside, Myr, Myricetin, Kae3g: Kaempferol-3-glucoside, Que3g:
Quercetin-3-glucoside, Irh3g: isorhametyl-3-glucoside, CyAc: cyanidin-3-glucoside acetate, Pn3G,
peonidin-3-glucoside, Cyn3g: Cyanidin-3-glucoside, Dp3g: delphinidin-3-glucoside, DpaAc:
delphinidin-3-glucoside acetate, Cycou: cyanidin-3-glucoside coumarate.
PLS discriminant analysis based on the most discriminating variables
To identify the most significant variables related to the light effect on grape berries, a
composite data set was made up with the two most significant variables on the positive and the
negative side of the first score for each previously shown discriminant analysis (Table 3) for pulp
and skin together. These new data set allow to compare the relative capacity of these selected
variables to separate the groups of shaded from that of sun exposed berries. A PLS discriminant
analysis was carried out on this new set of 28 variables and 60 samples. Figure 9A shows the data
plot for the two first scores. The first score accounted for 31% of total variance and clearly
separated the groups. The variables that contributed to the first score on the positive side were
related to berry acidity: S2.8 and S4.4 are pulp NMR variables related to organic acid resonances,
malate measured enzymatically on pulp extracts. On the negative side of the score, all variables
114
related to flavonols were found, associated with histidine and NMR variables (4.1 ppm
corresponding to fructose+proline and 0.98 ppm corresponding to isoleucine+leucine+valine).
Sorting of a test data set from berries sampled in the intermediary exposition
Twenty berry samples collected from sun (8 samples) and shaded (12 samples) locations in
the canopy were used to test the discriminant analysis performed previously with the analytical
data of the initial sampling. These samples were considered as intermediary according to
temperature measured in these zones. After each PLS, a linear discriminant analysis using the first
2 axes was calculated, performed and saved. The 20 samples were tested with the 8 models issued
from the PLS analysis (Table 4) and the squared Mahalanobis distances of each data set of the test
sample to the center of each group (sun and shaded) were calculated. PLS analysis carried out with
maturation analytical data, NMR data, or HPLC amino acid data gave an erratic repartition of the
test samples between the sun and shaded groups. HPLC phenolics data from skin made it possible
to sort 7 out of 8 (87%) samples of berries from sun exposed clusters after full leaf removal.
Phenolic data from the pulp made it possible to sort 62% (5 out of 8 samples) of the sun exposed
clusters.
115
Table 3. Metabolites and minerals contributing to sun exposed and shaded berries discrimination.
List of the selected variables having the 2 highest loadings on both sides of the first 2 axes from the
7 PLS discriminant analyses carried out on pulp and skin mineral and metabolite contents from
shaded and sun exposed berries. Test determined from Figure 9 and Table 4.
.
Variable
Name
Mal
K
D0360
Ntot
S2.8
S4.4
4.1
0.98
Origin
Definition
pulp
pulp
skin
pulp
pulp
pulp
pulp
pulp
1.26
skin
5.42
6.1
2.38
Phe
Arg
His1
Val
Ala
Gaba
His2
Met
X6
skin
skin
skin
pulp
pulp
pulp
pulp
skin
skin
skin
skin
pulp
Myr 3g
Que 3 g1
Kae 3g
Cy Ac
Pn 3g
Irh 3g
Que3g2
pulp
pulp
pulp
skin
skin
skin
skin
malate
potassium
flavonols (optical density 360nm)
total soluble nitrogen
1
H NMR resonance (organic acids)
1
H NMR resonance (organic acids)
1
H NMR resonance (fructose)
1
H NMR resonance (aliphatic
compound)
1
H NMR resonance (aliphatic
compound)
1
H NMR resonance (sucrose)
1
H NMR resonance (aromatic)
1
H NMR resonance (proline)
phenylalanine
arginine
histidine
valine
alanine
GABA
histidine
methionine
unidentified flavonols absorbing at
360nm
myricetin-3-glucoside
quercetin-3-glucoside
kaempferol-3-glucoside
cyanidin-3-glucoside acetate
peonidin-3-glucoside
isorhamnetol-3-glucoside
quercetin-3-glucoside
116
PLS2
13.9%
6
0.4
K
Shaded
5
Exposed
X6
4
3
PLS1
31.0%
2
1
0
-8
-6
-4
-2
-1
0
2
4
-2
Ntot
His1
IrH3g
DO360
Kae3g
val
Quer3g2
Que3g1
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
4.1
-3
-4
A
Myr3g
Ala
Phe
CyAc
Mal
0.2
S4.4
0.1
S2.8
0
0.0
0.1
0.2
0.3
-0.1
0.98
-0.2
B
-5
0.3
Figure 9: PLS discriminant analysis applied on selected variables of the 4 most discriminant
metabolites or minerals from pulp and skin extracts of 22 sun exposed and 38 shaded berry
samples collected at mature stage. A) Position of the samples along the first 2 PLS axes. The
percentages of variance explained by each axis are reported. B) Most significant variate loadings
for the first 2 axes: Variates from pulp metabolites: X6: unknown flavonol, Myr3g: myricetin-3glucoside, Kae3g: Kaempferol-3-glucoside, 0.98, 4.1, NMR buckets respectively leucine, sugar,
S4.4 and S2.8, NMR buckets from organic acids, DO360, optical density of ethanol extract at 360
nm (flavonols), N tot: total soluble nitrogen, Mal: malate. Variates from skin metabolites: Que3g:
Quercetin-3-glucoside, Irh3g: isorhamnetin-3-glucoside (see Table 3).
Table 4. Linear discriminant analysis on 8 data sets from 20 berry sampled in shaded or exposed
position. The percentage of correct classification of the berries by application of PLS
discrimination models for the 8 analytical data sets. Berries are classified by calculating
Mahalanobis distance from the centers from the sun and shaded groups. The percentage of the
berries correctly classified as exposed or shaded is reported after different PLS discriminant
analysis. Skin phenolics is the most efficient analytical data set to separate exposed and shaded
berries.
Analytic Classica NMR NMR Phenoli Phenolic Amino
al data
l
skin Pulp cs skin s pulp
acids
analyse
skin
s
Expose
d%
correct
Shaded
%
correct
Amino
acids
pulp
Syntheti
c data
set
25
12.5
5
87.5
62.5
28
50
62.5
92
83
83
100
82
54
25
100
117
Discussion
Berry microclimate in the vineyard is variable and difficult to define by simple architectural traits.
Light exposure induces differences in temperature between clusters and between
berries in a cluster. The timing of this effect is very dependent on the azimuth. Berries
exposed toward East and West are hotter in the morning and the afternoon respectively. The
rest of the time berry temperatures are very close to air temperature. Shaded berries in a
light exposed cluster were warmer than in a shaded cluster, due to heat conduction between
berries. This effect is more significant close to maturity in compact clusters (data not shown).
Therefore, it is very difficult to evaluate the level and the variability of the exposition of
berries in a commercial vineyard only through an architectural description. The azimuth of
the row, the height of the foliage above the clusters, the leaf density in the cluster region, the
cluster compactness, all contribute to the berry microclimate. A classification of clusters of
field grown berries based on metabolites profiles will allow more precise studies of the effects
of cultural practices and more generally the environment on grape quality.
Response of classical maturity analytical data to light exposition
Fruits were sampled in a commercial vineyard. The light environment was modified by
selecting berries exposed to the sunrise (East) and the sunset (West) in a vineyard with NorthSouth oriented rows. Partial and total leaf suppression modified the light exposure, recorded as
berry sum of temperatures all along the maturation phase. Sun and shaded berries were sampled at
different positions. The source/sink ratios estimated by the leaf area/berry weight ratios (data not
shown) were very similar. Exposed berries were smaller, contained less organic acids, but more
sugars and nitrogen. The skin extract showed a higher optical density in the near UV (360 nm)
attributed to flavonols. These analytical data are not independent. Smaller berries facilitate the
concentration of sugars, amino acids. The diminution of organic acid is explained by a temperature
effect (Spayd et al., 2002b). The increase of the optical density in the near UV is explained by the
light effect on flavonols content by a photochemical effect (Haselgrove et al., 2000).
Discriminant capacity of non-targeted versus targeted metabolic profiles?
1
H NMR profiles were used as non targeted analytical data. The profiles were described by
190 buckets representative of the protons amount in the diversity of their molecular environment.
The discriminant analyses were performed on these basic quantitative data. Some of the significant
buckets were secondarily attributed to identified molecules. The use of untargeted data offered the
possibility to identify non expected compounds. But actually very few unattributed buckets were
identified as being related to the local climate in the fruiting zone. In skin extracts two resonances
118
localized in the aliphatic zone are related to shaded. All the other significant resonances from the
NMR spectra were identified and some of them were confirmed by HPLC analysis. The untargeted
approach did not improve the efficiency of the dicrimination between the groups. This is probably
due to the relative low sensibility of the 1H NMR technique and the overlapping of the signals from
different metabolites (Krishnan et al., 2005).
Discriminant metabolites for light exposure.
Partial least square analysis was based on sample grouping according to microclimatic
measurements. Two groups were identified as shaded and sun exposed berries. They were made up
with berries sampled in the different positions in the vineyard (East or West side), outside, inside
or opposite to the clusters, not or partly shaded by leaves. The sun exposed and shaded batches
were made respectively of 5 and 8 different positions repeated 5 times. This sampling allowed to
study the sun exposure effect on a population of berries which carries the natural variability
observed inside a cluster, between clusters and between plants in a vineyard.
A data base was made up of 7 analytical variable sets measured at maturity: classical
mature berry analytical data (N, P, K+, Ca++, Mg++, solid solubles, sugars, tartaric and malic acid
and total anthocyanins, total flavonols), phenolics, 1H NMR spectra and amino acids in pulp and
skin, allowed to satisfactorily separate the sun exposed and shaded groups by partial least square
analysis and linear discriminant analysis.
The most significant metabolites that contributed to the separation of the shade and sun
berries were the flavonols (quercetin-3-glucoside, kaempferol-3-glucoside, myricetin-3-glucoside
and isorhamnetin-3-glucoside) in pulp and skin. This confirmed the already reported light effect on
berry flavonols (Price et al. 1995; Haselgrove et al., 2000). Flavonols are synthesized in the outer
part of the skin to screen UV radiations (Spayd et al., 2002b). Their accumulation would be
induced by a light stress. But a temperature effect cannot be excluded because kaempferol-3glucoside and quercetin-3-glucoside are also increased in the pulp of sun exposed berries although
the light is fully filtered by the skin. In the pulp, sun exposure mainly has a temperature effect.
Myricetin-3-glucoside showed an opposite behavior in skin and pulp. It is higher in pulp and lower
in skin of shaded berries compared to sun exposed ones. It can be suggested that the synthesis of
flavonols is regulated by both light and temperature with a specific pattern for each compound. In a
berry, the skin is more exposed to light than pulp when temperature gradient is small, due to a high
thermal conductivity of water in the fruits. Few other unknown compounds absorbing at 360 nm
were significantly increased by light exposure. This pattern may reflect a complex response
combining light stimulation of the synthesis and temperature activated degradation of anthocyanins
in sun berries.
119
Anthocyanin pattern is also clearly affected by light exposure. Malvidin-3-glucoside, the
most abundant anthocyanin, was not affected by the lower light exposure met in this experiment
(shaded position in the canopy). But shaded berries contained more peonidin-3-glucoside, and
cyanidin-3-glucoside acetate. These two anthocyanins follow a separate pathway from malvidin-3glucoside related to the activity of the flavonoid 3’-hydroxylase and flavonoid 3’5’-hydroxylase
(Boss and Davies, 2001).
It has been shown that darkness significantly reduces the amount of anthocyanins
(Dokoozlian and Kliewer, 1996), but clearly the small amount of light in the fully shaded part of
the canopy is enough for the synthesis of the malvidin-3-glucoside. High temperature induces a
selective loss of grape anthocyanins by degradation (Spayd et al., 2002a; Bergqvist et al., 2001).
The present data confirms the absence of the temperature effect on malvidin-3-glucoside amounts.
Little is known about the in vivo catabolism of berry anthocyanins. Glucosidases which degrade
anthocyanins are induced during the maturation of the berries, but there is no information on their
selective affinity concerning the different anthocyanins (Aryan et al., 1987). Light exposure of the
berries reduced the amount of the intermediary anthocyanidins of the delphinidin branch (and their
esterified forms) and cyanidin-3-glucoside and peonidine-3-glucoside in the cyanidin branch (Boss
and Davies, 2001).
Organic acid NMR buckets and malate content were very significant metabolites
related to light exposure. Malate content at maturity has been related to the temperature of
the fruit. A high temperature increases berry respiration which is partially fed by malate
degradation through malic enzyme (Martinoia and Rentsch, 1994).
Amino acid content in pulp and skin showed different patterns in response to sun
exposure. The pulp of exposed berries contained more histidine, valine and proline. These
same berries contained more total nitrogen. Pulp of shaded berries contained more arginine,
phenylalanine, asparagine and GABA. Phenylalanine, precursor of the phenylpropanoid
pathway, increased. This increase can be associated with a lower biosynthetic activity of the
flavonol pathway in shaded fruits. Arginine is the main storage for amino acid in grape with
proline (Stines et al., 2000). In exposed berries, less arginine and more proline were found. At
high temperature in exposed berries the arginine/proline balance was modified. A differential
effect of temperature on the partition between proline and arginine at ornithine level can be
suggested (Stines et al., 2000). More nitrogen was stored in proline in exposed berries than in
shaded ones. This observation is consistent with a significant biosynthesis of proline from
ornithine pathway as proline accumulation is not controlled by the ∆1-pyrroline-5carboxylate synthetase activity (Stines et al., 1999). Histidine and valine are very significant
markers of the microclimate. They are increased by light exposure, but little is known about
120
their role and their metabolism in grape berry. Valine change can be related to the report of
Broeckling et al (Broeckling et al., 2004), which showed that valine and other branched
amino acids were accumulated after methyl jasmonate treatment in Medicago truncatula and
a change in the phenylpropanoid pathway by the same elicitor in the berry skin (Larronde et
al., 2003). Histidine accumulation in Arabidopsis has been explained by a modification of the
feedback control of the pathway at the ATP phosphoribosyl transferase step (Wycisk et al.,
2004). Alternatively, histidine metabolism could be involved in the control of cytosolic pH
(Picton et al., 1993). The amino acid patterns in skin and must were different. In skin and
pulp GABA was more abundant in shaded berries. GABA and alanine are associated to
abiotic stress and cytosol pH control (Shelp et al., 1999). But GABA is also related to the C:N
balance and defense against insects (Bouché and Fromm, 2004). The GABA response is
hardly explained by a temperature stress which is lower on shaded berries. Its contribution
to tissue specific N management in skin is a more attractive interpretation. A maturing berry
must cope with the nitrogen import coupled with sugar carried by the phloem sap. GABA
can store a significant amount of N in skin when pulp can also store the excess of imported N
into arginine (Rodriguez-Lovelle and Gaudillère, 2002). Howewer, GABA is more abundant
in shaded berries that contain less total soluble nitrogen. A change in the free amino acid
content was related to an altered feedback control of the biosynthetic pathway (Kim et al.,
2005). A detailed study of the glutamate decarboxylase activity, cytosol pH control and/or the
protein biosynthesis and degradation activity will bring new information on the role of
GABA in grape berries in relation to temperature (Shelp et al., 1999).
Metabolic profiling of sun exposed and shaded berries
Discriminant analysis based on the total 1H NMR signature made it possible to separate the
two berry groups although 10% or less of total variance was explained by the first score for pulp
and skin respectively. The NMR buckets are representative of a wide range of metabolites, amino
acids, organic acids, sugars, and aromatic compounds. However, this capacity did not improve the
separation of the different groups compared to other analytical data. The 1H NMR fingerprinting
capacity of grape berries was disappointing in the present experiment. Since the stability of the
position of some signals can be questioned, mainly for organic acids (Defernez and Colquhoun,
2003), summing the signals of the organic acid regions was used. The very high amount of soluble
sugars, their extremely great number of overlapping signals and the lack of sensitivity in the
aromatic region contributed to considerably reduce the efficiency of the method (Krishnan et al.,
2005).
121
Despite these limits the 1H NMR data showed a significant contribution of proline and
valine confirmed by targeted amino acid analysis. The resonance attributed to protons from
organic acids was clearly related to shaded berries. NMR results are consistent with targeted
analytical data and showed that sucrose in skin was more abundant in shaded berries. This
results have not been observed previously. Sucrose can be an interesting indicator of berry
status.
A synthetic data set was made up with the four most significant loadings from each
analytical set. It will be used to identify the most discriminant metabolic analytical variables for
sun exposed and shaded grape berries. The PLS discriminant analysis based on these 28 selected
variables showed that most of the variance induced by grape exposure was explained by an
accumulation of flavonols (quercetin 3-glucoside, kaempferol-3-gl, isorhamnetyl-3-gl) in pulp
and/or skin. Valine and histidine in the pulp were also significant markers of light exposure.
Organic acid, mainly malate content was also a significant indicator of exposed berries. But it must
not be used alone because organic acids are related to berry temperature which is not specifically
related to light exposure.
Test of the metabolite profiling model
Data sets from berries collected in the same field experiment but not used for the PLS and
linear discriminant analysis had been used to check the capacity of the model to sort out sun
exposed from shaded berries (Table 4). Skin and pulp phenolic profilings gave the best results. The
other analytical data set did not allow to sort berries efficiently. The metabolic profile which
associates phenolics (HPLC), sugars (NMR), amino acids (HPLC) and organic acids (NMR) gave
a poor result compared to phenolics alone.
In conclusion, the most significant effect of light exposition observed in this experiment on
grape is flavonol content. This effect is explained by the high effect of light exposition on the
content of this class of compounds. The metabolic flux in the flavonoid pathway is known to be
regulated by red and ultra violet light activated photoreceptors in several species (Weller et al.,
2001). These compounds are good indicators of light exposure because they are closely controlled
by photochemical reactions and are probably secondarily affected by the increase of temperature
correlated to light exposure. Anthocyanins which are photochemically regulated are also affected
by a temperature increase (Bergqvist et al., 2001). Their response is more ambiguous. And finally
organic acids which are mainly affected by temperature (Ruffner et al., 1984), appeared poorly
discriminating for light exposure of the clusters. Although it was not possible to separate the light
effect from the temperature effects in this field experiment, the comparison of sun exposed or
shaded metabolic profiles of pulp and skin allowed to separate apparent light from temperature
122
effects on metabolites. Flavonols are more representative of a light effect except myricetin 3glucoside. Organic acids, valine, histidine, proline and arginin in the pulp are more affected by
temperature. The major anthocyanins are both increased by light but inhibited by temperature.
They are not significant markers. Conversely, secondary anthocyanins and some acylated forms are
favored by low light and contribute to the metabolite profiling discrimination of grape berries. It is
proposed to carry out leaf removal treatments to allow a grape sun exposition on commercial
vineyards only in the East side, because in the West side air temperature is hotter in the afternoon,
and a degradation of the anthocyanin content is observed. A discriminating tool based on PLS
discriminant analysis and a data base is now available to characterize unknown berries differently
exposed to light during maturation. It points out characteristic metabolites but raises many
questions about the metabolic origin of this metabolic patterns.
Acknowledgements
Thanks to Mark Fermaud for his collaboration to the field experiment. Thanks to the
Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq) linked to the Ministry of
the Sciences and Technology of the Brazil for the financial support of grant (G. E. Pereira), to the
Conseil Interprofessionnel du Vin de Bordeaux (CIVB) and Aquitaine region for their financial
support to the project.
123
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128
CHAPITRE V
Le chapitre IV a permis de montrer les variables analytiques affectées par le microclimat
des grappes. On observe l’hétérogénéité structurelle de la vendange du fait de la diversité des
expositions des grappes et du fait inévitable qu’une partie des baies est à l’ombre des feuilles et des
raisins. Du point de vue pratique, ce travail souligne l’importance de l’échantillonnage pour
apprécier la qualité d’une vendange et l’importance d’analyser l’architecture de la vigne et la
densité du feuillage pour définir des pratiques adaptées pour optimiser l’éclairage des grappes.
Les flavonols et les anthocyanes sont les composés les plus discriminants. Ce résultat était
attendu du fait de la sensibilité de leur métabolisme à la lumière. Les capacités discriminantes des
profils RMN et d’acides aminés est par contre un résultat original. Le rapport proline/arginine peut
être un marqueur intéressant pour qualifier une vendange. Les rôles de la valine, de l’histidine et du
GABA devront être étudiés. Plus généralement ce travail souligne le manque de connaissances sur
le métabolisme général et sa variabilité dans les baies de raisin.
Le chapitre V présente une étude complète de la variabilité des profils métaboliques de
raisins en fonction du millésime, des caractéristiques du sol et du cépage. A partir d’une base de
données analytique de raisins couvrant une large gamme de situations environnementales, nous
cherchons à caractériser la diversité des profils métaboliques, puis nous avons déterminé les effets
relatifs du millésime, du sol et du cépage en comparant les profils métaboliques par analyse
discriminante (PLS).
129
Chapitre V : Effets du millésime, de la nature du sol et du cépage sur les profils métaboliques
des raisins
Les analyses discriminantes réalisées sur des lots de raisins ont montré la possibilité de
caractériser les terroirs de façon très globale pour un millésime donné. L'
intervention du
microclimat sur le profil métabolique a été démontrée. Dans ce dernier chapitre, nous présentons
une analyse discriminante qui inclut l'
effet millésime et l'
effet terroir. Nous avons bénéficié de 3
millésimes bien différenciés, ce qui a permis d'
explorer la variabilité de la composition des raisins
cultivés à Bordeaux en conditions de vignoble.
Des échantillons de raisin (en majorité cépage ‘Merlot noir’) ont été récoltés à maturité en
2002, 2003 et 2004 dans le réseau de parcelles décrit dans matériel et méthodes (chapitre I.2.1). Ce
dispositif permet de disposer d’échantillons représentatifs de la diversité des millésimes et des
terroirs.
Les 3 millésimes sont bien différenciés par la température moyenne et le régime hydrique
(matériel et méthodes, chapitre I.2.1). Le millésime 2002 est humide, le millésime 2003 est chaud
et sec, le millésime 2004 est intermédiaire. Les parcelles viticoles sont très variées et elles ont été
classées en 3 groupes d’offre en eau pour la vigne (sec, moyen et humide). Cette classification est
basée sur les mesures de la discrimination isotopique du carbone (δ13C) mesurée sur les sucres des
raisins (Gaudillère et al., 2002). La classification des parcelles est rapportée dans le chapitre I.2.6.
Un échantillonnage sur un dispositif restreint a été réalisé pour évaluer l’effet cépage. Ce dispositif
permet de disposer d’échantillons appartenant à 3 millésimes, 3 types de sols et 3 cépages.
Les profils métaboliques ont été établis à partir de l’analyse d’extraits éthanoliques de
pellicules par 1H RMN, tandis que la composition phénolique de la pellicule et la composition en
acides aminés des pulpes ont été déterminées par CLHP. Les matrices de données analytiques ont
été traitées par une analyse multivariée de régression partielle (Partial Least square, PLS). Les
groupes testés sont successivement les 3 millésimes et les 3 classes de sols. Le premier axe de la
PLS est défini par les variables qui permettent de séparer au mieux les groupes prédéfinis au
moment du calcul (Kemsley, 1998). L’analyse des résultats est donc basée sur la capacité
d’individualiser les groupes (millésimes ou type de sol). Il est alors possible d’identifier les
métabolites les plus significatifs dans le sens positif ou négatif.
V.1. Effets du millésime et du sol sur les profils métaboliques de raisins échantillonnés sur un
réseau étendu de parcelles viticoles en Gironde.
V.1.1. Etude de l’effet millésime
Les raisins collectés les 3 années sur un réseau de 40 parcelles ont permis de constituer une
base de données contenant 360 analyses qui ont été groupées en fonction du millésime.
130
V.1.1.1. Profils métaboliques déterminés par RMN 1H sur trois millésimes
L’analyse discriminante par PLS appliquée au spectre RMN discrimine clairement les
échantillons de raisin récoltés les 3 années (Figure 1). L’effet millésime est très significatif.
A
PLS2
10.9%
15
2002
B
0.2
2003
0.2
2004
10
0.1
5
2002
0.0
0
-15
-10
-5
0.1
PLS1
23.1%
0
5
10
15
20
-0.2
-0.2
-0.1
-0.1
0.0
0.1
0.1
0.2
-0.1
-5
-0.1
-10
-0.2
Figure 1 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée. PLS en fonction des
millésimes, appliquée aux 190 buckets de l’analyse RMN de 360 extraits de pellicules. A)
Représentation des échantillons de raisin collectés sur le réseau de parcelles en 2002, 2003, 2004.
B) Position des buckets les plus significatifs de l’axe 1 (les buckets les plus significatifs sont
identifiés dans le Tableau 1).
La séparation des échantillons de pellicules de raisins des trois millésimes est réalisée
surtout sur l’axe 1. Le millésime humide (2002) se situe dans la partie positive de l’axe 1. Le
millésime intermédiaire (2004) est positionné dans la partie négative du 1er axe. Le millésime le
plus sec (2003) est en position intermédiaire. Les échantillons de ce millésime sont largement
dispersés le long de ce premier axe. Les résonances qui décrivent la variabilité des échantillons sur
l’axe 1 sont rapportées dans le Tableau 1.
131
Tableau 1 : Buckets les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet millésime après
une analyse PLS des données RMN des extraits de pellicule de raisin. Sucres : Glucose + Fructose
+ Saccharose
Bucket
PLS 1
Bucket
PLS 1
(ppm)
Loading
(ppm)
Loading
+0.134
3.78
+0.127
3.70
+0.127
4.18
+0.125
3.98
+0.124
4.10
+0.123
3.86
+0.122
3.22
+0.118
4.62
+0.118
3.66
3.26
7.02
5.34
6.9
6.94
6.98
5.06
7.1
6.86
6.78
Glucose
Composé
Phénolique
Composé inconnu
(multiplet)
Composé
Phénolique
Composé
Phénolique
Composé
Phénolique
Composé inconnu
(doublet)
Composé
Phénolique
Composé
Phénolique
Composé
Phénolique
Sucres
Glucose + Fructose
Fructose + Saccharose +
Proline
Fructose + Composé
inconnu
Fructose + Saccharose
Sucres
Glucose
Glucose + Composé
inconnu (singulet)
Fructose + Glucose
-0.144
-0.137
-0.133
-0.130
-0.128
-0.124
-0.124
-0.110
-0.105
+0.118
Du côté positif de l’axe les buckets supérieurs à 6 ppm correspondent à des composés
aromatiques non identifiés, probablement des composés phénoliques. Du côté négatif de l’axe les
buckets correspondent tous à des résonances de sucres appartenant principalement au glucose,
fructose et saccharose.
L’axe 2 a séparé les échantillons des millésimes 2002 (côté positif) et 2003 (côté négatif).
Les résonances qui expliquent la variabilité ont été identifiés comme les composés aromatiques du
côté positif et aux sucres du côté négatif de PLS2 (données non montrées).
V.1.1.2. Profils métaboliques des acides aminés déterminés par la CLHP
L’analyse PLS appliquée aux analyses CLHP des acides aminés (Figure 2) montre un effet
millésime significatif. Les échantillons 2003 sont séparés de 2002 et 2004. En revanche, le profil
de composition des acides aminés ne permet pas de séparer ces 2 derniers millésimes. Le climat
132
2003 particulièrement chaud et sec a donc particulièrement affecté le métabolisme azoté des
vignes, indépendement du type de parcelle.
PLS2
14.5%
A
0.6
7
BB
6
0.5
5
0.4
4
3
0.3
2
0.2
PLS1
35.6%
1
0.1
0
-6
-4
-2
0
2
4
-1
6
8
2002
-2
0
-0.4
- 0.3
2003
-3
- 0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
- 0.1
2004
-4
-0.2
-0.2
Figure 2: Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en fonction des
millésimes, appliquée à l’analyse des acides aminés de 360 extraits de pulpes. A) représentation
des échantillons de raisin collectés sur le réseau de parcelles en 2002, 2003, 2004. B) position des
acides aminés les plus significatifs de l’axe 1 (les acides aminés les plus significatifs sont identifiés
dans le Tableau 2).
Les millésimes 2002 et 2004 sont caractérisés par des teneurs plus élevées en leucine,
proline, alanine et GABA. Le millésime 2003 a produit des raisins enrichis en histidine, arginine et
lysine.
Tableau 2 : Acides aminés les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet millésime
après une analyse PLS des teneurs en acides aminés des extraits de pulpes de raisin.
Variable PCLoading1 Variable PCLoading1
Leu
+0.332
His
-0.325
Ala
+0.308
Arg
-0.303
Ser
+0.269
Lys
-0.285
Pro
+0.262
Asn
-0.222
Glu
+0.250
Gln
-0.182
Gly
+0.228
Met
-0.176
GABA
+0.211
133
V.1.1.3. Profils métaboliques des composés phénoliques déterminés par la CLHP
L’analyse PLS appliquée aux analyses CLHP des composés phénoliques montre un effet
millésime très marqué. Parmi les 3 profils, déterminés par RMN et CLHP sur les acides aminés et
les composés phénoliques, l’analyse des composés phénoliques est la plus significative. Les
échantillons de 2003 sont situés dans la partie négative de l’axe 1. Les échantillons 2002 sont du
côté positif de l’axe 1. Les échantillons 2004 sont intermédiaires. Cette distribution suit l’ordre des
contraintes hydriques du plus sec au plus humique, de gauche à droite (du côté négatif au positif de
l’axe 1). Rappelons que les données métaboliques RMN sont discriminantes mais ne sont pas
classées dans le même ordre, le millésime 2003 est intermédiaire.
6
6
PLS2
PLS2 PLS2
15.3%
15.3%15.3%
AA
2002
6
2003
2004
0.5
B
0.4
44 4
0.3
0.2
22 2
Dp-3g-ac
0.1
00 0
-5
-5
-5
-3
-3
-3
-1
-1 -1
-2
-2 -2
-4 -4
-4
-6 -6
-6
11 1
33 3
555
77
7
PLS1 999
30.8%
PLS1
PLS1
30.8%
30.8%
2002
2002
2003
2003
2004
2004
0.0
-0.4
-0.3
Pt-3g-cou
-0.2
-0.1
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
x7
-0.2
myricét-3-gl
-0.3
0.4
Pt-3g-ac
Pn-3g
-0.4
Figure 3 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en fonction des
millésimes, appliquée à l’analyse des composés phénoliques de 360 extraits de pellicule. A)
représentation des échantillons de raisin collectés sur le réseau de parcelles en 2002, 2003, 2004.
B) position des composés phénoliques les plus significatifs de l’axe 1 (les composés phénoliques
les plus significatifs sont identifiés dans le Tableau 3).
L’axe 1 (Tableau 3) est défini principalement par la delphinidine-3-gl, un flavonol inconnu
(x7), la péonidine-3-gl et la pétunidine-3-glucoside du côté positif. Il est décrit par d’autres
anthocyanes secondaires et des flavonols (myricetine-3-gl et inconnus) du côté négatif.
L’anthocyane la plus abondante, la malvidine-3-gl n’est pas représentative d’un climat
particulier. Si on considère les voies de biosynthèse des anthocyanes de raisins (Boss et Davies,
2001), on ne peut pas conclure à l’activation privilégiée d’une des 2 branches via la synthèse de
cyanidine ou de delphinidine. On constate une accumulation simultanée de péonidine-3-gl et de
pétunidine-3-gl en climat humide (millésime 2002). En revanche, on constate que le climat sec
134
(2003) favorise l’accumulation de flavonols, sans cependant affecter spécifiquement le flux
métabolique vers les anthocyanes puisque la malvidine-3-gl n’est pas particulièrement affectée.
L’acylation des anthocyanes est apparemment favorisée dans les 2 régimes climatiques 2002 et
2004. Ces acylations sont effectuées sur les anthocyanes dérivant des 2 branches indépendamment
du climat. La dérivation des anthocyanes glycosylées permet leur stabilisation en les protégeant des
glucosidases (Saito et Yamzaki, 2002). On ne met pas en évidence une augmentation des formes
acylées associées à un éventuel stress lié au régime climatique. L’action différentielle de la
température sur les enzymes de la voie de biosynthèse et éventuellement de dégradation des
différentes formes naturelles des anthocyanes de la vigne peut être à l’origine de ce changement de
profil métabolique.
Tableau 3 : Composés phénoliques les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet
millésime après une analyse PLS des teneurs des extraits de pellicules de raisin en fonction du
millésime.
Variable PLSLoading1
Variable
PLSLoading1
Dp-3g-ac
+0.278
Pt-3g-cou
-0.304
x7
+0.278
myricét-3-gl
-0.252
Pn-3g
+0.278
x6
-0.230
Pt-3g-ac
+0.271
x9
-0.229
x2
+0.257
Mv-3g-cou
-0.221
Pt-3g
+0.247
x5
-0.197
x8
+0.214
quercet-3-gl
-0.182
Dp-3g
+0.193
Pn-3g-ac
-0.125
Cy-3g
+0.132
Mv-3g-ac
-0.117
Cy-3g-ac
+0.129
Pn-3g-cou
+0.117
L’axe 2 a séparé les échantillons des millésimes 2002 (côté positif) et 2004 (côté négatif).
Les variables qui expliquent la variabilité sont des flavonols inconnus et des anthocyanes
coumariques du côté positif et des flavonols majeurs du côté négatif de PLS2 (données non
montrées).
V.1.2. Etude de l’effet type de sol
135
V.1.2.1. Profils métaboliques déterminés par RMN 1H en fonction de l’alimentation hydrique
des sols
Dans cette étude, nous cherchons à mettre en évidence un effet sol indépendamment de
l’effet millésime. L’analyse PLS est donc conduite sur le même jeux de données analytiques (360
échantillons) mais classés en fonction des caractéristiques hydriques du sol. L’ensemble des
parcelles échantillonnées au cours de 3 millésimes a été classé en 3 groupes, sec, moyen et humide
en fonction du critère δ13C mesuré sur les sucres des raisins murs.
Le profil RMN ne permet pas de discriminer les échantillons provenant des 3 types de sols
(Figure 4).
8
PLS2
5.4%
Humide
6
Moyen
Sec
4
2
0
-30
-25
-20
-15
-10
-5
-2
-4
0
5
10
PLS1
13.7%
-6
-8
-10
-12
-14
Figure 4 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en fonction des
types de sols, appliquée aux 190 buckets de l’analyse RMN de 360 extraits de pellicules :
représentation des échantillons de raisin collectés sur le réseau de parcelles sur les 3 classes de sols
(sec, moyen et humide) pour les 3 millésimes.
Les échantillons se trouvent mélangés au centre du plan, quelle que soit la classe du sol.
Quelques individus sortent du lot. Ils correspondent aux raisins cultivés sur les parcelles les plus
sèches (graveleuses) en 2003. Le fait de mélanger des millésimes secs et humides masque les effets
sols. Les millésimes humides rapprochent le statut hydrique des vignes. En revanche, les
millésimes secs augmentent les écarts entre les parcelles.
136
V.1.2.2. Profils métaboliques des acides aminés déterminés par CLHP en fonction de
l’alimentation hydrique des sols
Comme pour les données RMN, la composition en acides aminés ne permet pas de
caractériser des types de sols classés sur le critère hydrique (Figure 5).
PLS2
13.3%
AA
-10
-8
-6
-5
-4
-2
4
4
3
3
2
2
1
1
0
-1
Humide
PLS2
13.3%
Humide
Moyen
PLS2 0.5
13.3%
B
0.4
Sec
Moyen
Sec
0.3
0.2
0
0
0.1
0
-1
2
5
4
6
10 8
PLS1PLS1
25.3%
25.3%
0.0
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
-2
-2
-3
-3
-0.2
-4
-4
-0.3
-5
-5
-0.4
0.1
0.2
0.3
-0.1
0.4
0.5
PLS1
25.3%
glu
Figure 5 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en fonction des
types de sols, appliquée à l’analyse des acides aminés de 360 extraits de pulpes. A) représentation
des échantillons de raisin collectés sur les 3 millésimes sur des parcelles classées sec, moyen et
humide). B) position des acides aminés les plus significatifs de l’axe 1 (les acides aminés les plus
significatifs sont identifiés dans le Tableau 4).
On observe un groupement indépendant du type de sol en 2 groupes qui ne sont pas encore
caractérisés. L’analyse PLS n’est pas adaptée pour caractériser ces groupes inconnus car elle prend
en compte l’hypothèse initiale de l’existence de groupes proposés par l’opérateur. L’analyse en
composantes principales (ACP) qui établit les corrélations multiples sans groupes prédéfinis
permet de vérifier que ces 2 groupes sont aussi bien caractérisés et correspondent à un
comportement azoté différencié des vignes échantillonnées (non présenté). Le côté positif de l’axe
1 (Tableau 4) est associé à la présence de GABA, d’alanine, de thréonine et de proline. Tous ces
acides aminés sont associés à des stress : anoxie (GABA), stress hydrique (proline), défense
(thréonine). La partie négative de l’axe 1 est associée à la nutrition (glutamine, transport et
transamination) et le stockage de l’azote (arginine). Ces acides aminés peuvent indiquer les raisins
développés dans des conditions de bonne alimentation en azote.
137
Tableau 4 : Acides aminés les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet sol après
une analyse PLS des teneurs en acides aminés des extraits de pulpes de raisin.
Variable PLSLoading1 Variable PLSLoading1
GABA
+0.361
Met
-0.180
Ala
+0.300
Arg
-0.291
Gly
+0.286
Gln
-0.426
Thr
+0.275
Glu
+0.270
Ser
+0.262
Pro
+0.199
Asp
+0.172
V.1.2.3. Profils métaboliques des composés phénoliques déterminés par CLHP en fonction de
l’alimentation hydrique des sols
L’effet sol sur la composition phénolique est très peu marqué. La PLS (Figure 6) montre
une indication de groupement, mais avec beaucoup de recouvrements. Les parcelles sèches et
moyennes sont plus représentées dans la partie négative de l’axe 1 (Figure 6). Cet axe est décrit par
des anthocyanes secondaires, certaines acylées, et des flavonols du côté positif de l’axe 1 (Tableau
5).
5
A A
3
1
-8
-8
-6
-6
-4
-4
-2
-2
5
PLS2
16.8%
PLS2
16.8%
3
Humide
Humide
Moyen
Sec
Sec
-3
-3
-5
-5
0.2
PLS1
20.9%
1
0
-1 -1
PLS2 0.4
16.8%
0.3
B
Moyen
0
22
44
66
PLS1
20.9%
0.1
8
PLS1
20.9%
8 -0.5
0.0
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0
-0.1
0.1
0.2
0.3 Dp-3g 0.4
Pt3g
-0.2
-0.3
-0.4
-7
-7
-0.5
Figure 6 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en
fonction des types de sols, appliquée à l’analyse des composés phénoliques de 360 extraits de
pellicules. A) représentation des échantillons de raisin collectés sur les sols sec, moyen et humide
pour les 3 millésimes. B) position des composés phénoliques les plus significatifs de l’axe 1
(Tableau 5).
138
Cette structure est comparable à celle observée en fonction des millésimes. Les situations
humides favorisent l’accumulation de flavonols et défavorisent les anthocyanes minoritaires. De
même, on ne constate pas de modification de la teneur en malvidine-3-gl.
Tableau 5 : Composés phénoliques les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet des
sols secs, moyens et humides pour les 3 millésimes après une analyse PLS.
Variable PLSLoading1
Variable
PLSLoading1
Dp-3-gl
+0.301
x9
-0.376
Pt-3-gl
+0.282
isorhamn-3-gl
-0.287
Cy-3-g-ac
+0.261
x6
-0.274
Cy-3-gl
+0.246
x3
-0.264
Dp-3-g-cou
+0.225
Mv-3-g-ac
-0.26
Dp-3-g-ac
+0.132
quercet-3-gl
-0.227
Pt-3-g-ac
+0.118
kaempf-3-gl
-0.209
V.2. Etude des effets millésimes, types de sols et cépages à Saint-Emilion.
Nous disposons d’un échantillonnage de raisins collectés en 2002, 2003, 2004 sur 3
parcelles de l’appellation Saint-Emilion bien décrites par ailleurs (Van Leeuwen et al., 2004) et
pour 3 cépages (‘Cabernet Sauvignon’, ‘Cabernet franc’ et ‘Merlot noir’ en 2003 et 2004). Ces
données permettent de préciser l’étude précédente et en particulier de caractériser l’effet cépage.
L’analyse PLS a été réalisée avec les données RMN et CLHP acides aminés et composés
phénoliques des pellicules de raisin de cépages rouges (‘Merlot noir’, ‘Cabernet-Sauvignon’ et
‘Cabernet franc’). Les effets millésimes et sols ont été recherchés sur ce sous échantillon pour
vérifier que cet échantillonnage restreint est cohérent avec l'
échantillon étendu présenté
précédemment.
V.2.1. L’étude de l’effet millésime à Saint-Emilion
V.2.1.1. Profils métaboliques déterminés par la RMN 1H en fonction du millésime
L’analyse PLS des données RMN montre un effet millésime très significatif et comparable
à celui observé sur le réseau complet (Figure 1). Le millésime 2003 est intermédiaire entre les 2
autres millésimes, et il est aussi très dispersé (Figure 7).
139
A
A
PLS2
14.6%
10PLS2
14.6%
-15
-10
-10
-5
-5
0.14
0.12
2004
0.10
0
0
-5
B
2004
5
5
-15
20022002
2003
2003
10
0.08
0
0
5
5
10
-5
10
15
15
0.06
PLS1
30.1%
PLS1
0.04
30.1%
-10
0.02
-10
-0.150
-15
-15
-0.100
-0.050
0.00
0.000
-0.02
0.050
0.100
0.150
-0.04
-20
-20
-0.06
Figure 7 : Répartition des échantillons de raisin Saint-Emilion par la régression multivariée PLS en
fonction des millésimes, appliquée aux 190 buckets de l’analyse RMN de 78 extraits de pellicules.
A) représentation des échantillons de raisin, 3 cépages collectés sur les 3 parcelles en 2002, 2003,
2004. B) position des buckets les plus significatifs de l’axe 1 (les buckets les plus significatifs sont
identifiés dans le Tableau 6).
Le premier axe est expliqué du côté positif par des résonances de composés aromatiques
(Tableau 6). Du côté négatif il est associé à des résonances de sucres. Ce profil est très similaire à
celui observé sur l’ensemble du réseau.
140
Tableau 6 : Buckets les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet millésime
après une analyse PLS des données RMN des extraits de pellicules de raisin provenant de SaintEmilion. Sucres : Glucose + Fructose + Saccharose
Bucket
5.06
PLS Loading
Bucket
Composé
Saccharose +
inconnu
Fructose
(doublet)
+0.133
4.10
Composé
6.94
6.86
phénolique
Composé
phénolique
Composé
phénolique
7.06
+0.130
3.78
+0.126
3.70
6.78
6.62
6.90
6.46
Glucose +
Fructose
Fructose +
-0.108
4.18
Proline
-0.108
Fructose +
Composé
+0.121
Composé
phénolique
Composé
phénolique
Composé
phénolique
Composé
phénolique
Composé
phénolique
-0.112
Saccharose +
+0.124
6.82
-0.125
Sucres
Composé
phénolique
6.74
PLS Loading
3.98
inconnu
-0.099
+0.120
+0.120
+0.120
+0.120
+0.118
Le deuxième axe a discriminé les millésimes 2002 (du côté positif) et 2003 (du côté
négatif). Les résonances qui expliquent la variabilité ont été identifiés comme des sucres et la
proline (2002) et des acides aminés (valine, leucine et GABA) pour 2003 (non présentées).
V.2.1.2. Profils métaboliques des acides aminés déterminés par la CLHP en fonction du millésime
L’effet millésime sur le profil d’acides aminés (Figure 8) est proche de celui obtenu avec
l’ensemble de l’échantillonnage (Figure 2). Le millésime 2003 est très individualisé. Les
millésimes 2002 et 2004 son proches mais pas confondus.
Les acides aminés qui expliquent l’axe 1 sont identiques à ceux identifiés sur l’échantillon
complet (Tableau 7).
141
AA
PLS2
PLS2
9.9%
9.9%
5
4
B
5
0.6
PLS2
9.9%
4
0.4
33
0.2
2002
22
2003
PLS1
2004
37.5%
11
-6
-6
-4
-4
-2
-2
0
0.0
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
-0.2
0
0
-1
-1
0
2
2
4
4
6
2002
6
-3
-3
0.3
0.4
0.5
PLS1
37.5%
-0.4
PLS1
37.5%
-2
-2
0.2
2003
-0.6
2004
-0.8
Figure 8 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en fonction des
millésimes, appliquée à l’analyse des acides aminés de 78 extraits de pulpes. A) représentation des
échantillons de raisin, 3 cépages, collectés sur le réseau de 3 parcelles en 2002, 2003, 2004. B)
position des acides aminés les plus significatifs de l’axe 1 (Tableau 7).
Tableau 7 : Acides aminés les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet millésime
après une analyse PLS des teneurs en acides aminés des extraits de pellicules de raisin de SaintEmilion.
Variable
PLSLoading1
Variable
PLSLoading1
Leu
+0.386
His
-0.368
Pro
+0.277
Arg
-0.291
Ser
+0.276
Asn
-0.284
Ala
+0.273
Met
-0.263
GABA
+0.195
Lys
-0.236
Glu
+0.183
Gln
-0.178
Gly
+0.167
Asp
+0.164
142
L’axe 2 discrimine quelques échantillons des millésimes 2002 et 2004. Du côté positif, les
acides aminés caractérisant des échantillons du millésime 2002 sont le glutamate, l’alanine et
l’aspartate, tandis que du côté négatif (2004) sont serine et proline que sont les acides aminés
significatifs (données non présentées).
V.2.1.3. Profils métaboliques des composés phénoliques déterminés par la CLHP en fonction
du millésime
La variabilité des teneurs en composés phénoliques sépare très clairement les millésimes
selon le 1er axe de la PLS (Figure 9). L’année 2004 est intermédiaire entre 2002 et 2003.
PLS2
6
PLS2 6
18.8
A A
2002
2003
2003
B
2002
18.9%
44
0.50
0.40
2004
2004
0.30
22
0.20
0.10
-6
-6
-4
-4
-2
-2
00
0
-2
-2
0
2
2
4
4
6
PLS1
31.8%PLS1
6
-0.400
-0.300
-0.200
-0.100
31.9%
0.00
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
-0.10
-0.20
-4
-4
-6
-6
-0.30
-0.40
Figure 9 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en fonction des
millésimes, appliquée à l’analyse des composés phénoliques de 78 extraits de pellicules. A)
représentation des échantillons de raisin, 3 cépages, collectés sur un réseau de 3 parcelles en 2002,
2003, 2004 à Saint-Emilion. B) position des composés phénoliques les plus significatifs de l’axe 1
(les composés phénoliques les plus significatifs sont identifiés dans le Tableau 8).
Ce profil métabolique est très proche de celui obtenu avec les dosages RMN, qui
s’adressent à des constituants différents (sucres, acides organiques et acides aminés).
Le premier axe est décrit par la péonidine-3-gl, des formes acylées d’anthocyanes du côté
positif (Tableau 8). Le côté négatif est expliqué par des teneurs plus élevées en flavonols. La
malvidine-3-gl, la forme la plus abondante, ne participe pas à la différenciation entre les
millésimes. Des composés absorbant à 360 nm inconnus (X) apparaissent comme particulièrement
actifs en année sèche. Il sera utile de procéder à leur identification.
143
Le deuxième axe a très bien discriminé les millésimes 2002 et 2004. Du côté positif (2002),
des flavonols inconnus et des anthocyanes acylées et coumariques sont les marqueurs du millésime
2002. Du côté négatif, des flavonols majeurs (quercetine-3-glucoside et isorhamnetine-3glucoside) et la delphinidine-3-glucoside marquent le millésime 2004 (données non présentées).
Tableau 8 : Composés phénoliques les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet
millésime après une analyse PLS des teneurs des extraits de pellicule de raisin en fonction du
millésime à Saint-Emilion.
Variable
PLSLoading1
Variable
PLSLoading1
x7
+0.319
myricétine-3-gl
-0.300
Pn-3-gl
+0.287
x6
-0.286
Pt-3-gl-ac
+0.256
x9
-0.279
Dp-3-gl-ac
+0.222
Pt-3g-cou
-0.275
Pt-3-gl
+0.196
Mv-3gl-cou
-0.203
Cy-3-gl-ac
+0.194
x5
-0.172
Cy-3-gl
+0.165
Mv-3-gl-ac
-0.168
Pn-3-gl-cou
+0.160
quercetine-3-gl
-0.160
Dp-3-gl
+0.149
isorhamnetine-3-gl
-0.142
V.2.2. L’étude de l’effet type de sol à Saint-Emilion
Les sols ont été classés en 3 types, secs, moyen et humides, comme dans le réseau étendu.
Cependant, nous disposons d’informations plus précises sur leur texture (δ13C) et l'
offre en eau par
un suivi depuis 10 ans des potentiels hydriques et de la discrimination isotopique. La parcelle
sableuse assure en général une alimentation en eau de la vigne non limitante du fait de la présence
d’une nappe d’eau accessible aux racines de la vigne. La parcelle argileuse met à disposition de la
vigne une réserve moyenne à faible. La parcelle graveleuse est caractérisée par une réserve utile en
eau limitant pour la plupart des millésimes.
144
V.2.2.1. Profils métaboliques déterminés par la RMN 1H en fonction du type de sol
Les résultats de l’analyse des profils métaboliques issus de la méthode par RMN 1H sont
présentés dans la Figure 10. Cette analyse ne permet pas de séparer les groupes associés clairement
aux caractères hydriques de la parcelle. Ce résultat confirme les observations réalisées sur
l’ensemble du réseau.
On observe un groupe constitué par des raisins des 3 parcelles au centre du plan. Les
échantillons de la parcelle graveleuse en 2003 se détachent clairement. L’effet sol n’est très
significatif que dans les parcelles à faible réserve utile et en année sèche. On peut conclure à
l’existence d’un effet sol mais avec une forte interaction avec le climat de l’année. Cependant, au
centre du plan, la distribution des points expérimentaux suggère une classification selon le type de
sol. Les parcelles argileuses sont distribuées principalement du côté positif de l’axe 1, les parcelles
graveleuses sont plutôt du côté négatif. Les parcelles sableuses, qui sont les mieux alimentées en
eau, sont intermédiaires. Ce dispositif expérimental permet donc d’identifier les variables
métaboliques associées au sol indépendamment de l’effet millésime.
A
-22
A
-22
PLS2
PLS2
17.8%
17.8%
-17
-17
-12
-12
-7
-7
15
15
10
10
5
5
0
0
-2
-2
-5
0.10
0.05
PLS1
16.3%
3
-5
3
8
8
PLS1
16.3%
-10 -10
-15 -15
-20 -20
PLS2 0.15
17.8%
B
-0.20
-0.15
-0.10
-0.05
0.00
0.00
0.05
0.10
-0.05
0.15
PLS1
16.3%
-0.10
Sandy
Sandy
Gravelly
Gravelly
ClayClay
-0.15
-0.20
Figure 10 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en fonction des
types de sols, appliquée à l’analyse RMN de 78 extraits de pellicules. A) Régression partielle en
fonction du type de sol pour les 3 millésimes et les 3 cépages. Sol sableux, réserve en eau non
limitante (nappe), sol argileux, réserve en eau moyenne, sol graveleux, faible offre en eau. B)
Répartition des principaux signaux RMN (buckets) décrivant l'
axe PLS 1 (Tableau 9).
Les principales variables (buckets) qui décrivent l’axe 1 sont rapportées dans le Tableau 9.
Le côté positif est défini par des buckets exclusivement situés dans le massif des résonances des
145
sucres (glucose, fructose et inconnu). La partie négative est définie par des résonances d’acides
aminés (alanine, proline et GABA).
Tableau 9 : Principaux buckets décrivant l'
axe 1 de l'
analyse PLS des dosages de métabolites par
RMN des extraits de pellicules de raisins, 3 cépages collectés sur 3 parcelles, sèche, moyenne et
bien alimentée en eau en 2002, 2003, 2004. Sucres : Glucose + Fructose + Saccharose
Variable
3.50
PLSLoading1 Variable
Glucose
+0.105
1.50
Fructose +
PLS Loading1
Alanine
-0.154
Proline
Composé
4.02
inconnu
+0.104
Glucose +
3.90
Saccharose
-0.151
2.34
GABA
+0.094
-0.148
3.02
Fructose +
Alanine
3.58
Glucose
+0.094
1.46
-0.143
3.74
Sucres
+0.083
1.94
GABA + Proline
-0.142
3.26
Glucose
+0.074
2.38
Proline
-0.142
3.42
Glucose
+0.069
V.2.2.2. Profils métaboliques des acides aminés déterminés par la CLHP en fonction du type
de sol
L’analyse PLS des données analytiques des acides aminés montre des groupes mal définis
(Figure 11). On retrouve le groupement observé sur l’échantillon complet (Figure 5). Des
échantillons appartenant aux trois types de sol sont regroupés dans la partie négative de l’axe 2.
Cependant, on peut observer que les échantillons de la parcelle argileuse sont bien séparés des 2
autres groupes (grave et sable). Le sol argileux est intermédiaire pour l’alimentation en eau de la
vigne, mais proche du sol graveleux. L’alimentation azotée de la vigne dans ces parcelles n’a pas
été évaluée en détail. On observe cependant que les raisins des 3 parcelles ont des teneurs en acides
aminés libres différentes (Tableau 10). Les raisins de la parcelle de grave sont beaucoup plus riches
en acides aminés libres. La parcelle argileuse et la parcelle sableuse sont peu différentes. Le niveau
d’alimentation en azote ne permet donc pas d’expliquer le profil « acides aminés » des raisins de la
parcelle argileuse. La PLS révèle un effet qui n'
est ni associé à la sécheresse ni à l'
alimentation
azotée. La texture du sol et son effet sur le fonctionnement du système racinaire de la vigne
146
pourraient expliquer ce profil particulier de raisins produits sur ce sol argileux. Les acides aminés
qui décrivent cet axe sont le GABA, la proline du côté positif et l’arginine et la glutamine du côté
négatif. Ce sont les mêmes acides aminés qui établissent l’axe qui discrimine les groupes de sol
établis pour l’échantillonnage complet (Figure 5 et Tableau 4). Il faut noter une inversion du sens
de l’axe entre les 2 analyses multivariées, ce qui ne modifie pas l’analyse comparée de ces 2 études
de l’effet sol.
Tableau 10 : Teneur en azote aminé libre de la pulpe de raisins (µgN/g pulpe) récoltés sur 3
parcelles de Saint-Emilion en 2002, 2003, 2004.
millésime
sable
grave
argile
2002
555±45
1038±30
339±35
2003
2006±103
8293±508
2222±84
2004
1441±69
2469±142
1455±98
147
5
PLS2
PLS2
25.0%
25.0%4
A
-6
-6
-4
-4
-2
-2
5
4
3
3
2
2
1
1
0
0
-1
0-1
-2
-2
-3
-3
-4
-4
-5
-5
B
Sandy
Sable
Gravelly
Clay
2
2
4
4
Ala
0.5
0.4
grave
0.3
Argile
GABA
PLS1
20.6%
0
0.6
PLS2
25.0%
0.2
0.1
Pro
6
6
-0.5
Gly
-0.4
PLS1
20.6%
-0.3
0.0
-0.2
-0.1
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
Gln
-0.2
Arg
0.4
PLS1
20.6%
-0.3
-0.4
-0.5
Figure 11: Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en fonction des
types de sols, appliquée à l’analyse CLHP des acides aminés de 78 extraits de pellicules. A)
Régression partielle en fonction du type de sol pour les 3 millésimes et les 3 cépages. Sol sableux,
réserve en eau non limitante (nappe), sol argileux, réserve en eau moyenne, sol graveleux, faible
offre en eau en fonction de la teneur en acides aminés. B) Répartition des principaux acides aminés
décrivant les axes 1 et 2 de la PLS (Tableau 11).
Tableau 11 : Poids relatif des acides aminés qui définissent le premier axe de la PLS effet type de
sol, sec, moyen et humide (analyse de la pellicule de 78 lots raisins mûrs de 3 cépages et de 3
millésimes).
Variable PLSLoading1 Variable PLSLoading1
Arg
0.356
Gly
-0.449
Gln
0.247
GABA
-0.376
Thr
0.199
Pro
-0.319
Glu
-0.266
Asp
-0.249
148
V.2.2.3. Profils métaboliques des composés phénoliques déterminés par la CLHP en fonction du
type de sol
Le profil des composés phénoliques en fonction du type de sol (Figure 12) montre une
grande dispersion des échantillons. La variabilité due aux millésimes et aux cépages (chapitre
V.3.3.) surpasse l'
effet sol. Les écarts entre parcelles sont variables en fonction des millésimes.
AA
Sandy
4
PLS2
16.4 4
PLS2
16.4%
3
Gravelly
3
PLS2
16.4 0.4
B
0.3
Clay
2 2
0.2
Sable
grave
1 1
0.1
argile
0 0
-8
-8
-6
-6
-4
-4
-2 -2
0
0 0
22
-1 -1
-4
-5
66
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
-0.1
PLS 1
22.0
PLS1
22.0%
- 2 -2
-3
4
0.4
PLS 1
22.0
-0.2
-3
-0.3
-4
-0.4
-5
-0.5
Figure 12 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en fonction du
type de sol, appliquée à l’analyse des composés phénoliques de 78 extraits de pellicules. A)
représentation des échantillons de raisin, 3 cépages, collectés sur un réseau de 3 parcelles en 2002,
2003, 2004 à Saint-Emilion. B) position des composés phénoliques les plus significatifs de l’axe 1
(les composés phénoliques les plus significatifs sont identifiés dans le Tableau 12).
On observe que les variables actives (Tableau 12) sont les anthocyanes déjà identifiées
(Tableau 5). Par contre le côté positif de l'
axe 1 révèle pour la première fois le rôle de la malvidine3-gl. Cependant, le pouvoir discriminant de cet axe est insuffisant pour exploiter ces profils.
Tableau 12 : Composés phénoliques les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet sol
après une analyse PLS des teneurs des extraits de pellicule de raisin en fonction du millésime à
Saint-Emilion.
Variable
PLSLoading1
Variable
PLSLoading1
Mv-3-gl-cou
+0.274
Pt-3-gl
-0.368
Mv-3-gl-ac
+0.268
Cy-3-gl
-0.343
x9
+0.238
Dp-3-gl
-0.337
x8
+0.199
Cy-3gl-ac
-0.323
Mv-3-gl
+0.187
Dp-3-gl-ac
-0.229
x3
+0.185
Pt-3-gl-ac
-0.149
V.3. Etude de l’effet cépage à Saint-Emilion
149
V.3.1. Profils métaboliques déterminés par la RMN 1H en fonction des cépages
Cette étude a porté sur 2 millésimes (2003 et 2004) car nous ne disposions pas
d’échantillons ‘Merlot noir’ en 2002. L’analyse PLS des données analytiques RMN révèle un effet
cépage très significatif (Figure 13). Le ‘Cabernet franc’ est clairement séparé du ‘Merlot noir’ et du
‘Cabernet-Sauvignon’. Les échantillons de ‘Cabernet-Sauvignon’ sont séparés en 2 lots. Les
échantillons ‘Cabernet-Sauvignon’ qui sont situées dans la partie négative de l’axe sont issus des
parcelles argileuses et graveleuses en 2003. On peut noter que le cépage ‘Cabernet franc’ présente
aussi une dispersion mais beaucoup moins marquée que le ‘Cabernet-Sauvignon’. L’homogénéité
de la réponse de ‘Merlot noir’ indépendamment du sol et du millésime est remarquable.
AA
PLS2
PLS2
22.3%
22.3%
1010
B
PLS2
22.3%
0.15
0.1
5 5
0.05
- 20-20
- 15-15
- 10-10
-5-5
0 0
0 0
-5 -5
55
1010
PLS1
PLS1
18.5%
-0.200
-0.150
-0.100
-0.050
18.5%
- 10-10
MN
- 15-15
0
0.000
0.050
-0.05
0.100
0.150
0.200
PLS1
18.5%
-0.1
MN
CF
CF
-0.15
CS
CS
- 20-20
-0.2
Figure 13 : Répartition des échantillons de raisin à Saint-Emilion par la régression multivariée PLS
en fonction des cépages, appliquée aux 190 buckets de l’analyse RMN de 54 extraits de
pellicules. A) représentation des échantillons de raisin, ‘Merlot noir’ (MN), ‘Cabernet-Sauvignon’
(CS) et ‘Cabernet franc’ (CF) collectés pendant 2 millésimes, sur les 3 parcelles. B) position des
buckets les plus significatifs de l’axe 1 (les buckets les plus significatifs sont identifiés dans le
Tableau 13).
Le premier axe (Tableau 13) est décrit du côté positif par des résonances dans le massif de
sucres. Le glucose semble intervenir (4.62 ppm) ainsi que la saccharose (5.42 ppm) et le fructose
(3.7, 3.98, 3.66). Du côté négatif, on note des résonances dans la zone des substances aromatiques
(>6 ppm), des acides aminés (2.38 ppm, proline), et dans la zone des sucres.
Le deuxième axe est expliqué par les sucres (glucose et saccharose) du côté positif et par
des acides aminés du côté négatif (isoleucine, GABA et proline).
150
Tableau 13 : Buckets les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet cépage après une
analyse PLS des données RMN des extraits de pellicules de raisin à Saint-Emilion. Sucres :
Glucose + Fructose + Saccharose
Variable
PLSLoading1 Variable
Fructose +
3.7
3.98
3.66
3.38
3.86
Glucose
Fructose +
Composé
inconnu
Glucose +
Fructose
Glucose +
Proline
Sucres
PLSLoading1
Composé
+0.151
3.10
inconnu
-0.168
Glucose
+0.147
3.50
+0.145
3.42
+0.144
3.90
+0.141
3.74
Glucose +
-0.163
Glucose
Glucose +
Saccharose
Sucres
-0.159
-0.153
-0.148
Fructose
Composé
4.62
inconnu
+0.132
Glucose
3.46
3.78
5.42
Sucres
Saccharose
Composé
+0.116
6.70
phénolique
-0.136
+0.112
5.26
Glucose
-0.135
+0.111
6.66
+0.110
2.38
Composé
5.94
inconnu
-0.141
4.14
Composé
phénolique
Proline
-0.129
-0.126
V.3.2. Profils métaboliques des acides aminés déterminés par la CLHP en fonction des cépages
La composition en acides aminés ne permet pas de distinguer les cépages (Figure 14,
Tableau 14). La variabilité provient principalement des facteurs environnementaux.
151
AA
6
MN
5
CF
4
4
CS
3
3
PLS26
PLS2
16.0%
16.0%
5
2
-4
-4
-2
-2
-3
-1
1
0
0
0
-1
-2
-3
arg
-0.4
Cabernet Franc
-0.3
PLS1
Cabernet Sauvignon
2
1
2
4
3
6
4
0
-0.2
-0.1
0
0.1
-0.2
17.2%
0
val
0.2
Merlot
2
1
PLS2
16.0% 0.4
B
0.2
0.3
Phe
PLS1
17.2%
-0.4
5
0.4
GABA
-1
-0.6
-2
Glu
-3
-0.8
-4
-4
Figure 14 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en
fonction des cépages, appliquée à l’analyse des acides aminés de 54 extraits de pulpes. A)
représentation des échantillons de raisin, ‘Merlot noir’ (MN), ‘Cabernet-Sauvignon’, (CS) et
‘Cabernet franc’ (CF) collectés pendant 2 millésimes, sur les 3 parcelles. B) position des acides
aminés les plus significatifs de l’axe 1 (Tableau 14).
Tableau 14 : Acides aminés les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet cépage
après une analyse PLS des données acides aminés extraits de pellicules de raisin Saint-Emilion.
Variable PLSLoading1 Variable PLSLoading1
Met
+0.345
Arg
-0.276
Val
+0.334
Gly
-0.104
GABA
+0.313
Thr
+0.301
Phe
+0.297
Ala
+0.288
Glu
+0.285
Ile
+0.250
Asn
+0.208
Lys
+0.202
V.3.3. Profils métaboliques des composés phénoliques déterminés par la CLHP en fonction des
cépages
Le profil phénolique sépare très clairement les 3 cépages, indépendamment du millésime et
des caractéristiques du sol. C'
est un résultat attendu car les métabolites secondaires du raisin sont
152
sous contrôle génétique (Forveille et al., 1996). Ce résultat confirme l'
efficacité de la méthode
employée et le pouvoir discriminant des composés phénoliques (Figure 15).
4
A
3
-4 -6
-2
-4
0.3
CS
2
0.2
PLS1
24.2
1
1
0.1
Pt3g-cou
0
0
2
-6
PLS2
15.6 0.4
B
MN
CF
PLS2
4
15.6%
3
0
-2
-1
-1
-2
-2
-3
-3
-4
-5
0
2
-4
-5
2
4 4
PLS1
24.2%
66
0.0
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
-0.1
0.0
-0.2
0.1
0.2
0.3
0.4
Pg3g-cou
-0.3
Merlot
-0.4
Cabernet franc
-0.5
Cabernet Sauvignon
Figure 15 : Répartition des échantillons de raisin par la régression multivariée PLS en fonction des
cépages, appliquée à l’analyse des composés phénoliques de 54 extraits de pellicules. A)
représentation des échantillons de raisin, Merlot noir’ (MN), ‘Cabernet-Sauvignon’, (CS) et
‘Cabernet franc’ (CF) collectés pendant 2 millésimes, sur les 3 parcelles. B) position des composés
phénoliques les plus significatifs de l’axe 1 (Tableau 15).
Les formes coumariques, acylées et la malvidine-3-gl sont les principales anthocyanes qui
participent à la discrimination de ces 3 cépages (Tableau 15). La malvidine-3-glucoside est un
marqueur du cépage ‘Cabernet-Sauvignon’, situé du côté négatif de l’axe 1 (Roggero, Archier et
Cohen, 1992).
Tableau 15 : Composés phénoliques les plus significatifs définissant l’axe 1, représentant l’effet
cépage après une analyse PLS des composés phénoliques extraits de pellicules de raisin provenant
de Saint-Emilion.
Variable PLSLoading1
Variable
PLSLoading1
Pt-3-gl-cou
+0.360
Mv-3-gl
-0.324
Dp-3-gl-cou
+0.355
Mv-3-gl-ac
-0.236
Pn-3-gl-ac
+0.300
isorhamnetine-3-gl
-0.214
Cy-3-gl-ac
+0.262
x7
-0.170
Cy-3-gl
+0.253
kaempferol-3-gl
-0.144
Pt-3-gl
+0.218
x9
-0.144
Pn-3-gl-cou
+0.209
Quercetine-3-gl
-0.133
153
Discussion
Cette étude permet d'
évaluer l'
effet du millésime et du sol sur un réseau étendu de parcelles
et un réseau restreint. Le réseau de 3 parcelles est établi dans le même domaine viticole, ce qui
permet d'
homogénéiser les variables culturales et climatiques. Les effets sont comparables entre les
2 réseaux et les conclusions générales sont les suivantes. L'
effet millésime sur les profils
métaboliques prime sur les autres sources de variation. Il est particulièrement significatif sur les
profils établis à partir des signaux RMN (Figure 1). L'
interprétation métabolique de ces profils n'
est
pas très facile car les signaux RMN (buckets) qui définissent le 1er axe discriminant sont
indifférenciés. On peux les ranger dans des classes de composés, sucres et composés phénoliques,
qui sont inconnus. Il est intéressant de noter que le millésime 2003, le plus extrême en terme
climatique, est situé entre les millésimes 2002 (humide) et 2004 (normal). Il n'
y a pas
d'
interprétation à cette observation. Le profil métabolique des composés phénoliques est bien
discriminant (Figure 3). Le millésime 2003 est très distinct des 2 autres. On note cependant que
2004 est plus proche de 2003 que de 2002. Ces rapprochements ne sont pas les mêmes si on
considère les profils d'
acides aminés (Figure 2). Le millésime 2003 est bien différencié, mais 2002
et 2004 sont confondus. Le profilage métabolique des raisins en fonction d'
un facteur de
l'
environnement dépend donc de la nature de métabolites, métabolites secondaires, terminaux, de
stress (composés phénoliques, proline...), ou métabolites intermédiaires ou d'
accumulation (sucres,
acides aminés, acides organiques).
Les effets sols, à l'
échelle d'
une région viticole, sont peu visibles (Figures 4, 5, 6), quel que
soit le type de métabolite. La variabilité liée au millésime masque les autres sources de variabilité.
L'
analyse des profils métaboliques sur le réseau de 3 parcelles à Saint-Emilion a permis de
montrer que cet effet sol peut être détecté par les profils métaboliques. Malgré l'
échantillonnage
plus restreint sur le petit réseau, il a été possible de révéler des effets sol par l'
analyse RMN en
présence d’un effet millésime (Figure 10). Mais il existe une très forte interaction entre la nature du
sol et les caractéristiques hydriques du millésime. Les parcelles à faible réserve utile sont d'
autant
mieux individualisées que le millésime est sec. D'
autre part, l'
observation des groupes de profils
RMN et acides aminés montre que le sol argileux peut être individualisé. Il ne semble pas que ce
soit les caractéristiques hydriques qui soient en cause car la réserve utile de ce sol est intermédiaire
entre celle du sol sableux et celle du sol graveleux. Il se rapproche du sol graveleux avec une
réserve utile faible. Par ailleurs, l'
alimentation azotée des raisins évaluée par la teneur en azote
aminé de moûts rapproche les sols argileux et sableux (Tableau 10). Ces observations semblent
indiquer que l'
effet argile sur les profils métaboliques est spécifique de la nature de ce sol et pas
simplement de sa réserve utile et/ou de sa capacité à fournir de l'
azote à la vigne. La texture
argileuse est caractérisée par une conductivité hydraulique et une activité de minéralisation de la
154
matière organique modérée (Rawls et al., 1982). On peut penser que ces caractères participent à la
typicité des raisins produits sur ce type de sol.
L’effet génétique étudié sur les trois cépages rouges les plus cultivés dans le Bordelais a été
très bien discriminé avec le profil des composés phénoliques. Les trois cépages ont été séparés. La
profil RMN a permis de discriminer le ‘Cabernet franc’, tandis que ‘Merlot noir’ et ‘cabernetSauvignon’ ont été mélangés, ce dernier présentant une grande diversité. Le profil des acides
aminés n’a pas permis de discriminer les trois cépages.
Le profil métabolique s'
avère un outil intéressant pour comparer des lots de raisins produits
en conditions viticoles, donc soumis à une variabilité des facteurs du milieu difficile à appréhender
de façon synthétique. Le profil RMN permet une discrimination des millésimes intéressante. Les
profils métaboliques ciblés comme les acides aminés et les composés phénoliques apportent des
informations complémentaires différentes du fait de la nature de chacun des processus
métaboliques qui sont impliqués.
155
CONCLUSIONS
156
CONCLUSIONS
Dans le présent travail, la détermination de profils métaboliques de pellicules et pulpes de
raisins a été réalisée afin de comprendre les effets de l’environnement sur la composition du raisin.
Nous avons étudié les effets du climat, en utilisant des échantillons issus de trois millésimes, 2002,
2003 et 2004, du type de sol, par rapport à l’alimentation hydrique des sols, déterminée par
l’analyse du δ13C, l’effet du microclimat des grappes (température et lumière) et l’effet cépage.
Trois cépages rouges (‘Cabernet-Sauvignon’, ‘Cabernet franc’ et ‘Merlot noir’) et un cépage blanc
(‘Sauvignon’), ont été étudiés. Différents outils analytiques ont été utilisés pour l’acquisition des
profils. Nous avons utilisé la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN
1
H) et la chromatographie liquide haute performance (CLHP) des composés phénoliques et des
acides aminés pour la caractérisation de lots de raisins. Ensuite nous avons appliqué des méthodes
statistiques multivariées (l’analyse en composantes principales, ACP et l’analyse par régression
partielle, PLS) pour discriminer différents lots de raisins par rapport à leur composition
biochimique.
1) Comparaison de trois types de profils métaboliques: RMN 1H, CLHP des composés
phénoliques, CLHP des acides aminés, appliqués à des extraits de pulpe et de pellicule de
raisin
Analyse RMN 1H d’extraits hydro-alcooliques bruts
L’analyse des extraits de raisins par RMN 1H s’est montrée efficace pour discriminer des
lots échantillonnés en différents vignobles dans le Bordelais. C’est une méthode rapide qui permet
d’avoir beaucoup d’informations sur la composition biochimique des raisins, principalement sur les
sucres, les acides aminés et les acides organiques. La technique ne détecte que les composés les
plus abondants du raisin. Des protons des composés phénoliques peuvent être détectés, mais le
signal est faible et les composés ne sont pas identifiés en RMN 1D en raison de leur complexité.
Dans la gamme des métabolites primaires, beaucoup de résonances (buckets)
discriminantes des effets millésime, sol ou climat ont été identifiées. Dans la zone de 3,2 à 4,5
ppm, le spectre présente de nombreuses résonances attribuées aux sucres les plus abondants
(glucose, fructose et saccharose). Certaines de ces résonances contribuent à la discrimination entre
les différents groupes que nous avons étudiés. Compte tenu de l’abondance des sucres, on peut
penser qu’il s’agit de glucose, fructose ou de saccharose. Cette hypothèse est confirmée si par
ailleurs d’autres résonances identifiées des sucres (fructose : 4,10 ppm, glucose : 4,64 ppm,
saccharose : 5,42 ppm…) participent à la discrimination. Cette zone du spectre peut comporter des
157
signaux d’acides aminés et d’acides organiques. Dans la zone entre 0,8 à 3,0 ppm, toutes les
résonances majeures ont été identifiées et attribuées à des acides aminés et des acides organiques.
En revanche, aucune résonance n’a pu être identifiée dans la zone entre 5,5 et 8,8 ppm. Nous les
avons attribuées aux composés phénoliques du raisin, mail il faudra effectuer leur identification
pour confirmer cette hypothèse. Un travail d’identification détaillée des signaux reste à faire pour
exploiter de façon ciblée toutes les informations contenues dans ces spectres. La technique RMN
1
H permet donc à la fois des comparaisons de raisins ciblées sur une vingtaine de métabolites
primaires et non ciblée d’approche globale. L’efficacité de la RMN pour la comparaison
qualitative, appliquée à des extraits bruts est limitée, car elle est peu sensible aux métabolites
secondaires (phénoliques). La purification des extraits pourrait améliorer les performances de la
technique, mais on perdrait les avantages de la simplicité de la méthode qui permet de traiter de
nombreux échantillons. Inversement, l’évolution des techniques d’extraction et de mesure
permettant d’éviter le remplacement des protons de l’eau par du deutérium (extraction directe à
l’aide d’un mélange méthanol-tampon deutéré puis séquence de pré-saturation, Le Gall et al. 2003)
apporterait une simplification méthodologique intéressante et permettrait des mesures rapides en
routine sur de nombreux échantillons.
Analyse par CLHP d’extraits polyphénoliques bruts
Les polyphénols de la pellicule et de la pulpe sont généralement les composés les plus
discriminants. Dans les analyses discriminantes sur un grand nombre d’échantillons (3 millésimes),
ils ont expliqué plus efficacement la variabilité que les autres profils métaboliques (RMN, acides
aminés).
Dans cette étude nous n’avons considéré que les anthocyanes et les flavonols dosés dans
des extraits éthanoliques bruts. Nous disposons de nombreuses informations sur ces métabolites
secondaires du raisin. Ils sont particulièrement sensibles aux facteurs de l’environnement. Les
teneurs en anthocyanes sont affectées par la lumière, la température et la nutrition azotée de la
vigne. Les teneurs en flavonols sont affectées par la lumière et la température. Parmi les autres
composés phénoliques des raisins, les tanins ont fait l’objet de nombreuses recherches du fait de
leur importance organoleptique (Moutounet et al., 1996, Brossaud et al., 1998). Ces travaux ont
conclu à une faible incidence des conditions culturales sur les paramètres structuraux des tanins.
C’est pourquoi ils n’ont pas été retenus comme marqueurs dans notre étude. Par ailleurs, les
méthodes d’analyse qui font intervenir des réactions d’hydrolyse ne se prêtent pas à des analyses
de routine. Cependant, il existe des indications sur une coordination entre la synthèse et
l’accumulation des tanins et celle des anthocyanes (Downey et al., 2003). Compte tenu de nos
158
résultats sur la variabilité des anthocyanes, il sera utile de réévaluer la variabilité des tanins en
fonction des conditions environnementales.
Analyse par CLHP des acides aminés libres
Le profil des acides aminés libres des raisins est basé sur 20 acides aminés identifiables et
dosables. Ces acides aminés sont des intermédiaires dans des voies métaboliques, synthèse des
acides aminés, des protéines, des polyphénols. Certains sont accumulés pour assurer des fonctions
de transport et de stockage (aspartate, glutamate, glutamine, arginine). Enfin, ils assurent des
fonctions métaboliques en réponse à des situation de stress hydrique, anoxique, lumière…(proline,
GABA, leucine, valine, thréonine). Le profil d’acides aminés libres des raisins offre donc
théoriquement la possibilité de décrire qualitativement des état physiologiques variés liés à la
nutrition carbonée et azotée des raisins ainsi qu’à des facteurs environnementaux inducteurs de
signaux de stress (stress hydrique, thermique, pathogènes…). Dans ce travail nous observons que
les profils d’acides aminés fournissent les profils les moins discriminants pour les situations que
nous avons comparées. Les acides aminés les plus souvent discriminants sont l’arginine, la proline,
le GABA, la glycine, la sérine et des acides aminés branchés (leucine, valine…). L’interprétation
de ces profils est encore très limitée du fait de la complexité des mécanismes qui déterminent les
teneurs et du manque de connaissances sur le métabolisme du raisin. Une analyse discriminante
ciblée des acides aminés, identifiés comme significatifs dans ce travail, en fonction de leur rôle,
pourrait probablement améliorer la sélectivité des profils. On pourrait traiter séparément les acides
aminés associés à la nutrition et au stockage de l’azote, et ceux qui peuvent être associés à la
réponse aux stress.
2) Les facteurs influençant la composition des raisins
Les résultats montrent que l’effet du climat est le facteur le plus marquant pour la
discrimination de lots de raisins. Cela est vérifié lorsque l’on compare des raisins issus de trois
millésimes. Les facteurs pluviométrie et température sont très importants pour la composition des
raisins. Par rapport à l’effet type de sol, évalué selon l’alimentation hydrique, les trois types de
profils métaboliques (RMN, composés phénoliques et acides aminés) ont été peu discriminants. Le
profil RMN a permis de montrer une variabilité des raisins dans le millésime 2003, classé comme
sec et chaud. L’effet cépage a été discriminant avec le profil des composés phénoliques. Il est
connu que le facteur génétique joue un rôle important sur la composition phénolique des raisins
(Hrazdina, Parsons et Mattick, 1984). La RMN a été moins efficace pour séparer les trois cépages,
159
mais avec une faible discrimination entre le ‘Cabernet franc’ et les autres. Les acides aminés sont
peu discriminants.
Lorsque l’on évalue la composition des raisins dans un millésime, la RMN 1H a été très
efficace pour discriminer les raisins issus de différents types de sol. Les composés responsables ont
été les sucres, les acides aminés et les acides organiques.
L’effet microclimat a été évalué avec les trois profils métaboliques. Les effets lumière et
température influencent la composition des raisins. Les profils RMN, composés phénoliques et
acides aminés se sont montrés, séparément, efficaces pour la discrimination entre des raisins
exposés ou à l’ombre. Lorsque nous avons comparé entre elles les variables les plus significatives
issues des trois profils, les composés phénoliques déterminés sur la pellicule des raisins ont été les
plus significatifs pour discriminer entre les deux lots de baies de raisins.
3) CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES
Les profils métaboliques permettent de séparer très clairement des groupes de raisins issus
de différents millésimes. Toutes les classes de métabolites étudiées, sucres, acides organiques,
acides aminés et polyphénols permettent de séparer les millésimes. On observe cependant que les
acides aminés sont moins discriminants. Le millésime 2003, chaud et sec, est bien individualisé. Le
fait que l’effet millésime est mis en évidence sur une large gamme de métabolites permet de
supposer que les composés à intérêt œnologique (tanins, précurseurs d’arôme…) seront modifiés
de façon similaire en fonction des millésimes. Cependant, il s’agit d’une hypothèse qui devra être
validée quand des techniques analytiques précises et rapides de ces composés seront disponibles.
Les profils métaboliques séparent plus difficilement les types de sols lorsqu’on les applique
à des situations variées (réseau étendu de parcelles). Il y a une très forte interaction entre le régime
hydrique du millésime et l’effet sol. Le lien se trouve dans la réserve utile en eau. Les sols à faible
réserve utile se différencient d’autant plus que le millésime est sec. Cependant, l’effet sol ne se
limite pas à la réserve utile. Sur le réseau expérimental restreint à Saint-Emilion nous observons
une différenciation des profils des acides aminés en fonction de la texture des sols.
Les profils polyphénoliques séparent très clairement les cépages cultivés sur des sols et
sous des climats différents (millésimes). Les profils RMN et acides aminés qui s’adressent à des
métabolites intermédiaires ne sont pas discriminants. Les profils RMN ou acides aminés seront
donc intéressants pour caractériser des raisins d’origine variée et définir un millésime ou un terroir.
L’usage des polyphénols doit tenir compte de la spécificité variétale bien que ces composés soient
160
très caractéristiques du climat général et local. Il faudra étudier les éventuelles interactions entre
l’effet cépage et les effets des facteurs de l’environnement.
L’application combinée de ces méthodes analytiques et chimiométriques contribuera à la
caractérisation qualitative des raisins cultivés en conditions viticole, en permettant d’évaluer des
degrés de similitudes ou de différences par rapport à des standards conservés dans une base de
données. Ces informations apportent des connaissances sur la composition et la qualité des raisins.
Ces méthodes ouvrent la possibilité d’étudier en détail les incidences des conditions
environnementales et de leurs variations sur la qualité du raisin. Ces études étaient limitées jusqu’à
présent par leur caractère multifactoriel : facteurs du milieu naturel ou modifiés par le viticulteur,
et de la réponse des raisins. Ces résultats contribuent au progrès de la viticulture raisonnée et à une
meilleure appréciation de la qualité de la vendange.
161
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