MALADIES DES LAGOMORPHES DE LA LISTE B MYXOMATOSE

SECTION 2.8.
MALADIES DES LAGOMORPHES DE LA LISTE B
CHAPITRE 2.8.1.
MYXOMATOSE
RÉSUMÉ
La myxomatose est une maladie du lapin européen due au virus myxomateux, un membre de la
famille des Poxviridae. Le diagnostic de la myxomatose, ses caractéristiques cliniques mises à
part, fait appel à l’isolement et à l’identification du virus ou à la mise en évidence de ses antigènes.
La présence d’une réponse immunitaire humorale autorise un diagnostic rétrospectif de la forme
subaiguë de la maladie, et peut permettre une estimation de la prévalence de l’infection dans une
population de lapin. La maladie est caractérisée classiquement par le développement de lésions
cutanées nodulaires des plus évocatrices.
Identification de l’agent pathogène : Lors de la présence de lésions cutanées sur un cadavre de
lapin, la présence de l’antigène viral peut être révélée par un test d’immunodiffusion utilisant un
fragment de lésion. Des cultures en couche monocellulaire de cellules de rein de lapin, inoculées à
partir de lésions, développent un effet cytopathogène caractéristique des poxvirus. La présence du
virus peut alors être confirmée par immunofluorescence et examen au microscope électronique en
coloration négative.
L’identification de l’infection, par inoculation de lapins avec des prélèvements suspects, est plus
longue mais demeure précieuse pour confirmer la présence d’un virus infectieux et évaluer sa
pathogénicité.
Épreuves sérologiques : La mise en évidence et le titrage des anticorps spécifiques apparaissant
au cours de l’infection naturelle ou à la suite de la vaccination, est réalisée par la méthode
classique de fixation du complément ou par la méthode immuno-enzymatique (ELISA) récemment
développée, plus sensible et non affectée par les facteurs pro- ou anti-complémentaires. La
difficulté réside dans l’obtention de prélèvements de sang à partir de membres représentatifs d’une
population. Ce problème peut être résolu en récoltant sur du papier filtre du sang séché qui sera
plus tard élué et examiné en immunofluorescence indirecte ou en ELISA. Des prélèvements en
tubes microcapillaires peuvent aussi être utilisés en ELISA.
Des tests d’immunodiffusion qualitative en gélose permettent de révéler à la fois les antigènes et
les anticorps humoraux.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
Des vaccins à virus vivants préparés à partir du virus du fibrome de Shope ou de virus myxomateux
modifié sont disponibles pour l’immunisation des lapins.
A. INTRODUCTION
La myxomatose est une maladie virale du lapin européen (Oryctolagus cuniculus) due au virus myxomateux, un
membre de la famille des Poxviridae. Ce virus possède un tropisme caractéristique pour la peau, responsable de
la forme cutanée nodulaire, ou révèle un tropisme oculo-respiratoire conduisant à une forme non-myxomateuse. Il
frappe les lapins de tous âges et, les souches, de virulence variable, induisent des lésions inflammatoires de la
peau pouvant se généraliser et aboutir à la mort de l’animal par inanition ou suite à des surinfections
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bactériennes. Le virus est transmis entre lapins par l’intermédiaire d’insectes piqueurs tels que les puces ou les
moustiques. Une transmission directe par contact est possible, bien que plus limitée, dans les populations
étroitement confinées.
Un myxome primaire apparaît au point d’inoculation au bout de 2 à 5 jours, suivi par une conjonctivite (qui signe
une infection systémique), une inflammation de la région ano-génitale et le développement de lésions cutanées
secondaires en diverses régions du corps. Dans la forme oculo-respiratoire, la lésion primaire est en général une
macule inflammatoire rosée précédant un catarrhe oculo-nasal. Les souches virulentes peuvent tuer un lapin en
10 à 15 jours. La manipulation du virus myxomateux ne présente aucun risque, ce dernier ne se transmettant pas
à l’homme.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Dans la mesure où les signes de la maladie deviennent plus discrets avec l’atténuation des souches de virus,
l’envoi de prélèvements au laboratoire devient de plus en plus nécessaire. Les différentes techniques disponibles
varient dans leur capacité à détecter le virus myxomateux dans les lésions myxomateuses typiques, dans
l’œdème des paupières ou des organes génitaux. Lors de lésions atypiques, ces techniques permettent de
différencier l’infection due au virus myxomateux de celle due au virus du fibrome de Shope.
1.
Identification de l’agent pathogène
Une portion de lésion est excisée à l’aide de ciseaux et débarrassée de l’épiderme et de la couche superficielle
du derme. Elle est lavée en solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) additionné d’antibiotiques
comme défini ci-dessous, puis broyée et homogénéisée à une dilution de 1 g de tissu pour 4,5 à 9,0 de PBS. Les
cellules sont rompues par 2 cycles de congélation-décongélation, ou par ultrasonication, afin de libérer les virions
et les antigènes. Cette suspension est centrifugée pendant 5 à 10 min à 1 500 g. Le surnageant est utilisé pour
les épreuves.
a)
Culture
L’isolement du virus en culture de cellules peut utiliser des cultures primaires de cellules de rein de lapin
(RK), ou des cellules établies en lignée continue, telle que la lignée RK-13, en milieu essentiel minimum
(MEM) contenant 5 % de sérum de veau, 100 Unités Internationales (UI)/ml de pénicilline ; 100 µg/ml de
streptomycine ; 100 µg/ml de gentamycine ; 50 UI/ml de nystatine (mycostatine) ; et 5 µg/ml d’amphotéricine
(fungizone). L’inoculum est représenté par le surnageant de l’homogénat de lésion ou par du jetage oculorespiratoire repris en Opti-MEM additionné de 2 % de sérum de veau et d’antibiotiques. L’inoculum est retiré
de la couche de cellules au bout de 2 h. Les cellules sont rincées avec un faible volume de milieu puis
recouvertes de milieu d’entretien (Opti-MEM).
Un effet cytopathogène (ECP) typique des poxvirus (10) se développe en 24 à 48 h (à 37°C et 5 % de CO2),
mais avec certaines souches, il peut être plus lent et n’apparaître qu’au bout de 7 jours. Des groupes de
cellules voient leur cytoplasme confluer et forment des syncytia de taille variable, renfermant de 2 à
50 noyaux et même rassemblant jusqu’à une centaine de noyaux, selon la souche de virus. Le noyau de
certaine cellule présente des altérations, la chromatine formant des agrégats basophiles de taille et en
nombre variables, donnant à la culture un aspect en peau de léopard. Les inclusions intracytoplasmiques
éosinophiles, lorsqu’elles sont présentes, demeurent discrètes. Les cellules infectées s’arrondissent, se
contractent, deviennent pycnotiques puis se lysent et se détachent de leur support (verre ou plastique). A la
longue, toutes les cellules seront infectées et la couche monocellulaire se détache complètement.
Le virus du fibrome de Shope produit tout d’abord des foyers d’accumulation de cellules arrondies qui
prolifèrent et s’empilent (10). A la périphérie, les cellules récemment infectées montrent de légères
modifications nucléaires et des inclusions cytoplasmiques acidophiles nombreuses et précoces. La couche
cellulaire est détruite en plusieurs jours.
b)
Méthodes immunologiques
Les tests d’immunodiffusion en gélose (IDG) sont de réalisation facile et rapide – les résultats peuvent être
obtenus en 24 h. Les plaques de gélose sont préparées avec de l’agar Noble (0,6 g), de l’éthylène diamine
tétra-acétique (EDTA) (2,5 g), du chlorure de sodium (4,5 g), et de l’eau distillée (500 ml) contenant du
thiomersal (merthiolate) à 1/100 000. L’antisérum standard (voir ci-dessous) et l’échantillon à tester sont
placés dans des puits opposés de 6 mm de diamètre, séparés de 5 mm. Une autre technique consiste à
déposer un fragment de lésion directement sur la gélose, à 5 mm d’un disque de papier filtre imprégné de
l’antisérum. Des lignes de précipitation, habituellement jusqu’à 3, apparaissent en 48 h, indiquant la
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présence d’antigènes viraux myxomateux. Une ligne unique apparaît lors de réaction hétérologue avec le
virus du fibrome de Shope.
Les épreuves d’immunofluorescence indirecte (IFI) peuvent être appliquées sur les cultures à partir de
24 h d’incubation. Les épreuves d’IFI révèlent la multiplication intracytoplasmique du virus mais ne peuvent
distinguer le virus myxomateux de celui du fibrome. L’inoculation de cellules d’embryon de poulet
(trypsinisées à 11 jours d’incubation) n’entraîne pas d’ECP mais est propice à la détection des antigènes
viraux par immunofluorescence.
c)
Microscopie électronique
La microscopie électronique en coloration négative peut être appliquée à un fragment de lésion cutanée. La
technique est simple et rapide, donnant des résultats en 1 h. Environ 1 mm3 de tissu est disposé sur un
verre de montre et 3 gouttes d’eau distillée sont ajoutées. Après 1 à 2 min à la température ambiante une
grille de microscopie électronique revêtue de formvar et de carbone est posée sur le liquide. Après 1 min,
l’excès de liquide est éliminé délicatement à l’aide d’un papier filtre et, immédiatement une goutte d’une
solution aqueuse à 2 % de molybdate d’ammonium, pH 7,0 ; est déposée sur la grille. Au bout de
10 secondes, l’excès de liquide est absorbé à l’aide d’un papier filtre et la grille est prête pour l’examen au
microscope électronique. Lors d’examen positif, des particules typiques de poxvirus peuvent être vues mais
cette méthode ne permet pas de différencier le virus myxomateux de celui du fibrome.
d)
Tests d’inoculation
L’inoculation d’un lapin par voie intradermique permet aussi d’identifier le virus grâce à ses caractéristiques
pathogènes, à savoir son tropisme cutané (forme nodulaire) et oculo-respiratoire (forme non myxomateuse).
Elle doit être évitée si possible, mais présente l’avantage de permettre d’apprécier la virulence en fonction
du type d’inflammation des lésions (local ou généralisé), de l’étendue des lésions et du temps de survie,
ainsi que de distinguer le virus du fibrome (avec une simple lésion fibromateuse locale) du virus
myxomateux (capable d’entraîner une infection généralisée chez l’adulte). On choisira des lapins
domestiques pesant environ 2 kg, non vaccinés et chez lesquels on vérifiera préalablement l’absence
d’anticorps (10).
L’inoculum peut être le surnageant d’une lésion homogénéisée (avec antibiotiques) ou le produit d’une
culture. Un volume de 0,1 à 0,2 ml est injecté par voie intradermique à la face postérieure de l’oreille ou
dans la région dorso-lombaire préalablement débarrassée de ses poils. L’inoculum peut faire l’objet
d’injections de dilutions sériées en tampon salin à raison de un site par dilution. Une lésion primaire
apparaîtra au point d’injection en 2 à 5 jours, suivie d’une conjonctivite. En utilisant 5 sites par dilution il est
possible de calculer une dose infectieuse 50 % (DI50). Si l’animal survit, la maladie peut être confirmée par
la sérologie 15 jours plus tard.
2.
Épreuves sérologiques
Les anticorps apparaissent en 8 à 13 jours. Lors de formes non létales ou après vaccination, le titre atteint un
sommet entre 20 à 60 jours ; il décline ensuite et les anticorps deviennent indétectables au bout de 6 à 8 mois en
l’absence de ré-infection (données correspondant à la fixation du complément [FC]) (12).
Diverses épreuves sérologiques peuvent être utilisées, mais la FC, l’IFI et la méthode immuno-enzymatique
(ELISA) (dans l’ordre de sensibilité croissante) sont les épreuves les plus appropriées pour les échanges
internationaux et les autres applications. Ces épreuves réclament des antigènes et antisérums standards.
L’antigène peut être préparé à partir de la souche Lausanne ou d’une souche antigéniquement rattachée,
produites sur lapins ou culture de cellules.
•
Préparation des réactifs standards
Des lésions myxomateuses sont prélevées sur lapins, 6 à 7 jours après inoculation, puis homogénéisées en
tampon véronal à la dilution de 1/5. L’antigène est le surnageant obtenu après centrifugation. Une activité
anti-complémentaire éventuelle est supprimée par addition de 0,6 % de chloroforme. Le liquide antigénique
peut être stocké à –30°C ou –70°C ou utilisé directement en FC après titrage à l’aide d’un antisérum
standard.
L’antigène peut être préparé à partir de culture sur cellules de lignée RK-13. Le virus est récolté sous la
forme d’une suspension de cellules, 48 h après infection, puis centrifugé. Le liquide surnageant est recueilli.
Le dépôt cellulaire est homogénéisé (délicatement) ou ultra-soniqué (pendant 3 min en continu ou pendant
5 min à raison de 50 % d’impulsions de 100 watts), resuspendu et recentrifugé, puis le surnageant est
ajouté au précédent. L’ensemble des surnageants constitue l’antigène qui est stocké à –20°C ou –70°C
pour être conservé. Il est titré en cultures cellulaires avant son utilisation en séroneutralisation virale (SN).
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Pour l’anti-sérum standard, un lapin adulte, à sérologie négative, est vacciné avec une souche atténuée de
virus myxomateux ou avec le virus du fibrome de Shope. Après 3 à 4 semaines, ce lapin est inoculé avec un
extrait de lésion due à la souche Lausanne du virus. Le sérum, obtenu 3 semaines plus tard, est titré en FC.
Si le titre atteint ou dépasse 1/640, l’animal est saigné et son sérum stocké à –20°C.
•
Titrage des réactifs standards
i)
Inactiver l’antisérum standard pendant 30 min au bain-marie à 56°C. Il n’existe pas de sérum standard
international, mais des sérums standards internes au laboratoire doivent être préparés et titrés selon
une échelle appropriée, en utilisant la FC. Après cela, la méthode suivante est utilisée pour
standardiser les lots d’antigène ;
ii)
Faire des dilutions en série, de raison deux, du sérum standard en tampon calcium/magnésium/véronal
(CMV), pH 7,2, de 1/2 à 1/4096, dans une plaque de micro-titrage à 96 cupules à fond rond, une
cupule par dilution, sous le volume de 25 µl, dans chaque ligne ;
iii)
Utilisant des tubes, faire des dilutions de raison deux de l’antigène en tampon CMV, de 1/10 à 1/1280 ;
iv)
Ajouter 25 µl par cupule de la même dilution de l’antigène, (prélevés dans les tubes) à chacune des
dilutions sur une ligne de la plaque, verticalement de 1/10 à 1/1280 ;
v)
Ajouter 25 µl (6 unités H50 [50 % d’hémolyse]) par cupule de complément ;
vi)
Incuber la plaque couverte d’un film de plastique, pendant 1 h à 37°C ou 14 h à 4°C.
vii)
Ajouter 50 µl par cupule du système hémolytique (2,5 % de globules rouges [GR] de mouton et un
volume égal de sérum anti-GR de mouton, les deux en CMV) ;
viii) Couvrir de nouveau la plaque et incuber pendant 30 min à 37°C ;
ix)
Lire la plus haute dilution de l’antigène donnant une hémolyse complète (H100) avec la plus haute
dilution du sérum standard. Il y a 1 unité antigénique (AgU) dans 25 µl de cette dilution de l’antigène.
Les tests de SN (12) peuvent être réalisés dans des plaques de micro-titrage pour culture de cellules, à fond
plat, selon la méthode virus constant/sérum variable utilisant 100 DICT50 (Dose Infectieuse Culture de Tissu
50 %) de virus.
Les tests de FC (12) sont effectués en tubes ou en plaque de micro-titrage (4) par les méthodes
conventionnelles, en retenant 100 % ou 50 % d’hémolyse. C’est, à l’heure actuelle, la méthode de
référence.
a)
Test de fixation du complément
i)
Titrer le complément en tubes à hémolyse, en présence de 1 AgU, afin de déterminer l’unité H50 ;
ii)
Inactiver les sérums témoins positif et négatif au bain-marie pendant 30 min à 56°C ;
iii)
Faire des dilutions de raison deux, du sérum à tester et des sérums témoins, en CMV, de 1/4 à 1/1024,
en utilisant une plaque micro-titrage à 96 cupules à fond rond, à raison de 25 µl par cupule. Utiliser la
première cupule pour la dilution 1/4 initiale et la seconde comme témoin sérum (contrôle du pouvoir
anti-complémentaire à la dilution du 1/4). Préparer les cupules contrôles de l’antigène, du complément
et des GRs (2 cupules pour chacun) ;
iv)
Ajouter 1 AgU dans 25 µl par cupule (à l’exception des cupules témoins du sérum, du complément et
des GRs), puis, ajouter 6 H50 de complément dans 25 µl par cupule (à l’exception du témoin GRs) ;
v)
Incuber les plaques recouvertes d’un film plastique, pendant 14 h (durant la nuit) à 4°C ;
vi)
Ajouter 50 µl de système hémolytique par cupule ;
vii)
Couvrir à nouveau les plaques et incuber pendant 30 min à 37°C ;
viii) Préparer une échelle de témoins d’hémolyse H100, H75, H50, H25 à partir des témoins complément
(H100) en tampon CMV ;
ix)
Lire, après centrifugation ou sédimentation passive à 4°C. Le titre des sérums testés est exprimé par la
plus haute dilution du sérum donnant au moins 50 % d’inhibition de l’hémolyse ;
x)
Un sérum négatif doit donner une inhibition de l’hémolyse < 50 %, à la dilution du 1/4.
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b)
Épreuve d’immunofluorescence indirecte
L’épreuve d’IFI (7) est réalisée sur culture de cellules d’embryon de poulet obtenue en plaque de microtitrage à cupules à fond plat : 200 µl de suspension cellulaire, diluée à 1/1 000 dans le milieu de culture, sont
distribués dans toutes les cupules et une couche confluente de cellules est produite en 24 h. Le milieu est
alors éliminé et 100 µl de suspension virale contenant 100 DICT50 sont ajoutés dans chaque cupule. Après
2 h d’incubation, 100 µl de MEM contenant 2 % de sérum de veau est ajouté. Après 48 h d’incubation, les
plaques sont lavées avec du PBS et fixées à l’acétone renfermant 15 % d’eau, pendant 30 min à –20°C. Les
plaques sont ensuite séchées à 37°C pendant 15 min. Les plaques peuvent dès lors être stockées à –30°C
ou –70°C pendant 3 mois. Les sérums sont soumis à l’épreuve d’IFI utilisant des IgG anti-lapin conjugués à
de l’isothiocyanate de fluorescéine. Les résultats peuvent être exprimés de façon qualitative avec des
sérums dilués au 1/10 ou au 1/20, ou de façon quantitative en utilisant des dilutions sériées des sérums.
c)
Épreuve immuno-enzymatique (ELISA)
Un test ELISA récemment développé (6) utilise un virus myxomateux semi-purifié (souche française
T1 hyper virulente, antigéniquement rattachée à la souche Lausanne) produite en cellules RK-13. Le virus
est récolté sous la forme d’une suspension de cellules 48 h après infection, puis centrifugé. Le dépôt
cellulaire est homogénéisé en TL20 (20 mM Tris, pH 8,6, 150 mM de NaCl et EDTA 1 mM), rompues au
broyeur de Poter et centrifugé à 1 200 g à 4°C, pendant 10 min.
Le surnageant est déposé sur un volume égal d’un coussin de sucrose à 36 % en TL20 et centrifugé à
200 000 g pendant 2 h dans un rotor SW 41 à 4°C. Le culot est repris dans 4 à 12 ml de TL20 et de
nouveau déposé sur un coussin de sucrose à 36 %.
Le nouveau culot est repris dans 1 ml de TL20 et centrifugé en un gradient de saccharose 30 à 60 % à
200 000 g pendant 3 h. Le disque viral est recueilli, dilué dans 10 ml de TL20 puis centrifugé à 130 000 g
pendant 1 h pour concentrer le virus.
Le culot est repris dans 0,2 ml de TL20 et quantifié par la méthode de Bradford (réaction colorimétrique avec
le bleu brillant de Comassie) (3) ou par spectrophotométrie (les protéines virales représentent environ
3/5 des protéines totales). La préparation peut être stockée à –30°C avant utilisation.
i)
Sensibiliser les plaques ELISA pendant 16 h (une nuit à 37°C) avec 1 µg par cupules, de protéines
virales dans 100 µl de PBS, pH 7,6, en laissant une colonne comme blanc (c’est à dire traitée avec le
seul PBS). A noter que les différents lots d’antigène présentent une activité variable et doivent être
titrés contre des sérums standards afin de sélectionner l’antigène donnant la plus haute densité
optique (DO) ;
ii)
Après 3 lavages en PBS, bloquer les sites de liaison encore libres par une incubation pendant 1 h à
37°C en présence de gélatine en PBS (25 mg/ml) ;
iii)
Laver la plaque 3 fois en PBS-0,01 % Tween 20, et ajouter 100 µl de dilutions sériées, de raison deux,
du sérum en PBS-Tween. Ajouter des sérums témoins négatif et positif dans chaque plaque ;
iv)
Après 60 min d’incubation à 37°C et 3 lavages en PBS-Tween, ajouter 100 µl d’une dilution en
PBS-Tween d’un sérum de chèvre anti-IgG de lapin (classiquement au 1/3 000) conjugué à de la
phosphatase alcaline, pendant 1 h à 37°C ;
v)
Après 4 lavages en PBS-Tween, ajouter en tant que substrat, 100 µl de p-nitrophényl phosphate
disodique à la concentration de 1 mg/ml dans 10 % de diéthanolamine ;
vi)
Après 12 min à l’obscurité, à température ambiante, la réaction enzymatique est arrêtée par adjonction
de 50 µl d’une solution 2 N de NaOH ;
vii)
Lire les Densités Optiques (DO) à l’aide d’un spectrophotomètre, à 405 nm de longueur d’onde ;
viii) Exprimer le titre du sérum testé par l’inverse de la plus haute dilution pour laquelle la DO est 3 fois
supérieure à celle enregistrée avec le sérum témoin négatif.
La mise en évidence des anticorps spécifiques du virus myxomateux par ELISA s’est révélée une méthode
hautement sensible et spécifique pour les études cinétiques lors d’infection expérimentale (2). L’évaluation
du test a montré sa grande valeur dans le cadre du diagnostic au sein de populations de lapins (6).
Pour les enquêtes épidémiologiques, l’IFI et l’ELISA indirecte peuvent aussi être réalisées en utilisant du
sang séché sur papier buvard ou papier filtre. Des disques sont découpés à l’aide d’un emporte pièce de
bureau et 2 disques sont placés dans chaque cupule à laquelle on ajoute 100 µl de PBS pour extraire le
sérum. La dilution est d’environ 1/30 et celle-ci peut être utilisée dans une autre cupule pour le test (7). Des
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Chapitre 2.8.1. — Myxomatose
prélèvements de sang récoltés en tubes capillaires revêtus d’anticoagulant peuvent être utilisés pour
l’ELISA. Le prélèvement est rincé dans la solution de dilution pour obtenir la dilution requise (11).
d)
Test d’immunodiffusion en gélose
Le test d’immunodiffusion en gélose (IDG) (15) est qualitatif et peut révéler l’antigène ou l’anticorps. La
gélose est préparée comme décrit ci-dessus (Section B.1.) et 6 ml sont versés dans une boite de Pétri de
10 cm de diamètre. Deux bandes de papier filtre contenant, l’une l’antigène et l’autre le sérum standard, et
des disques imprégnés à l’aide des sérums à tester, sont disposés sur la surface de la gélose (les disques
alignés entre les 2 bandes). Les plaques de gélose sont incubées en atmosphère humide à 37°C et lues
après 24 à 48 h. Trois lignes de précipitation doivent apparaître. Si les sérums testés contiennent l’anticorps,
au moins une des trois lignes est infléchie vers la bande contenant l’antigène ; si non elle reste droite. Si les
sérums renferment l’antigène, au moins une ligne est infléchie vers la bande contenant le sérum standard.
Le test peut aussi être réalisé de façon plus conventionnelle en plaçant les réactifs liquides dans des puits
creusés dans la gélose.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS
BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Deux types de vaccin à virus vivant sont utilisés contre la myxomatose : un vaccin hétérologue préparé avec le
virus du fibrome de Shope (5, 9, 14), et un vaccin homologue préparé avec une souche atténuée de virus
myxomateux (1, 8, 13, 16-18). Ils sont injectés par voie sous-cutanée ou intradermique.
Récemment un nouveau virus myxomateux recombinant exprimant une protéine de capside du virus de la
maladie hémorragique du lapin (RHDV, Rabbit Haemorrhagic Disease Virus) et conférant une double protection
contre la myxomatose et le RHDV (2) a été développé, mais il n’est pas encore commercialisé.
Les prescriptions concernant la production de vaccins vétérinaires sont données au Chapitre I.1.7., « Principes de
production de vaccins vétérinaires ». Les prescriptions données ici et dans le Chapitre I.1.7. ont une portée
générale et peuvent être complétées par des exigences nationales ou régionales.
Un lot de semence primaire du virus doit être défini et utilisé selon le système lot-semence. Son origine,
l’historique des passages qu’elle a subi et ses caractéristiques doivent être enregistrés et conservés.
1.
Gestion des semences virales
a)
Caractéristiques de la semence virale
Les virus utilisés sont le virus du fibrome ou le virus myxomateux. Les souches du virus fibromateux sont
habituellement la souche originale Shope OA (1932), la souche Boerlage ou des souches étroitement
apparentées. Les souches de virus myxomateux sont modifiées par passages sur œufs embryonnés de
poulet, cellules de rein de lapin à température décroissante ou sur cellules d’embryon de poulet. Les
souches ont, en général, subi plusieurs clonages.
b)
Méthode de culture
Les souches de virus du fibrome sont maintenues par passage sur lapins exempts d’organismes
pathogènes spécifiques (EOPS) ou sur des lapins non vaccinés issus d’un élevage reconnu sans
myxomatose. La peau du dos de lapins adultes en bonne santé est rasée, puis on inocule en différents
points une suspension à 1 % de matériel virulent. Les fibromes sont pleinement développés en 8 à 10 jours.
Les lapins sont alors sacrifiés et les tumeurs prélevées aseptiquement puis homogénéisées en eau distillée.
La suspension est stockée à –30°C ou –70°C avec 50 % de glycérine tamponnée ou diluée à 5 % en
solution protéinée. La production du virus fibromateux peut être aussi réalisée en lignée cellulaire de derme
de lapin.
Le virus myxomateux est produit sur culture de cellules d’embryon de poulet obtenu d’élevages reconnus
exempts d’organismes pathogènes spécifiques, ou sur lignées de cellules sensibles (lignée de cellules
dermiques de lapin).
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
i)
Identité
Les caractéristiques antigéniques spécifiques du virus fibromateux sont vérifiées en AGID utilisant des
sérums anti-fibrome et anti-myxome.
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Chapitre 2.8.1. — Myxomatose
L’identité du virus myxomateux est confirmée par un test de neutralisation sur cellules RK-13 ou tout
autre lignée cellulaire sensible en utilisant un anti-sérum monospécifique.
ii)
Pureté
Le lot de semence primaire doit être exempt de bactéries, de champignons, de mycoplasmes et de
contamination virale.
iii)
Innocuité
Les échantillons destinés aux essais d’innocuité doivent provenir d’un lot produit selon le protocole de
fabrication. La dose à utiliser contiendra le titre ou l’activité maximum établi(e) par le fabricant (titre
disponible).
Plusieurs tests sont effectués, au stade du lot de semence primaire, afin de démontrer différents
aspects de l’innocuité. L’innocuité à 10 fois la dose normale doit être révélée. De même, il est
nécessaire de rechercher la dissémination du virus parmi les animaux vaccinés, la capacité du virus
vaccin de diffuser de l’animal vacciné vers des animaux contacts et de mettre en évidence une
réversion possible de la virulence de la souche vaccinale lors de passages en série chez le lapin.
La pathogénicité du virus du fibrome est évaluée par inoculation de lapins avec des dilutions sériées
des surnageants issus de la centrifugation de préparations tumorales. Les aspects macroscopiques et
histopathologiques ainsi que l’évolution des fibromes sont notés périodiquement sur des lapins EOPS.
(De nombreux passages en série sur le lapin peuvent induire une mutation vers la souche
inflammatoire IA, qui produit des lésions sévères beaucoup plus inflammatoires que néoplasiques).
Le pouvoir pathogène résiduel du virus myxomateux est évalué par inoculations intradermiques chez
des lapins EOPS ou des sujets non vaccinés indemnes de myxomatose. Ces lapins ne doivent pas
développer plus qu’une réaction locale, accompagnée parfois de petites lésions secondaires sur la tête
mais qui disparaissent en quelques jours.
Pour ces 2 souches, la température rectale et le poids doivent être enregistrés en tant que paramètres
supplémentaires.
iv)
Efficacité
Différents essais doivent être conduits à partir de lots représentatifs du produit fini contenant le titre ou
l’activité minimum. L’effet protecteur est démontré de la façon suivante :
Au moins 10 lapins adultes reçoivent une dose de vaccin « fibrome », et 3 lapins servent de témoins
non vaccinés. Après 14 jours, tous les lapins sont inoculés par voie intradermique dans la paupière,
3
avec une souche de virus myxomateux (exemple : inoculum de 0,1 ml contenant 10 DI50 [dose
infectieuse médiane]). Durant les 21 jours suivants, les témoins succombent à la myxomatose, et au
moins sept des dix sujets vaccinés doivent ne présenter aucun signe de généralisation de l’infection.
De la même façon, le vaccin « myxome » est évalué chez 10 lapins et 3 sujets contrôles. Après
14 jours, tous les lapins sont éprouvés avec une quantité suffisante d’une souche virulente (exemple :
3
0,1 ml de la souche Lausanne renfermant 10 DI50). Après 21 jours, sept des dix lapins doivent survivre
tandis que les témoins doivent avoir succombé à la myxomatose.
Le fabricant aura établi un titre ou une activité minimum tenant compte de la perte d’activité durant la
période de conservation.
2.
Méthode de fabrication
Le virus du fibrome est produit suite à des inoculations multiples du virus semence dans la peau du dos d’un
certain nombre de lapins. La production peut aussi être réalisée en lignée cellulaire de derme de lapin. Seul le
second (éventuellement le troisième) passage peut être utilisé si l’on veut éviter une modification du virus.
L’homogénat de fibrome produit peut être stocké en congélation ou être utilisé immédiatement. Après clarification
par centrifugation, le surnageant est mélangé à un stabilisant contenant des antibiotiques et réparti en ampoules
ou flacons pour être lyophilisée. Du kaolin peut être ajouté en tant qu’adjuvant (40 mg/ml), dans ce cas le vaccin
sera injecté par voie sous-cutanée.
Le virus du myxome est produit en cellules d’embryon de poulet (obtenu d’oeufs EOPS) ou en lignée cellulaire
sensible, en limitant le nombre de passages à un maximum de 5. Le virus est récolté après 2 à 6 jours. La
suspension virale peut être conservée à –70°C. Le vaccin est préparé par dilution en proportions spécifiées de la
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Chapitre 2.8.1. — Myxomatose
préparation virale avec un stabilisant pour lyophilisation. Après homogénéisation, le produit est distribué en flacon
de lyophilisation, ces derniers étant scellés sous vide ou en atmosphère d’azote stérile.
Chacun de ces virus peut être aussi produit en cellules RK-13.
3.
Contrôles en cours de fabrication
Le titre de virus du fibrome est obtenu en calculant la DI50 suite à l’inoculation intradermique de dilutions sériées
du surnageant clarifié, en plusieurs sites (par exemple 5) sur au moins 6 lapins. Une dilution d’une préparation de
référence de virus fibromateux est aussi inoculée sur chaque lapin pour s’assurer d’une réponse conforme à
l’inoculation. Le titre peut aussi être calculé en lignée cellulaire de lapin. Dans l’un et l’autre cas, le titre doit être
corrélé à l’activité requise par le test d’efficacité, voir Section C.1.c.
L’identité du virus myxomateux est vérifiée en cellules RK. Le titrage de chaque virus peut aussi être réalisé en
cellules RK-13 DICT50.
La recherche de contaminants viraux est effectuée par ensemencement de cellules Vero en couche
monocellulaire confluente. Le vaccin, ajusté à l’équivalent de 20 doses/ml, est neutralisé avec un volume égal de
sérum hyperimmun monospécifique pendant 30 min à 37°C. Le mélange est filtré à travers une membrane de
0,22 µm et des volumes de 1 ml sont inoculés dans 5 flacons de culture de cellules. Ceux-ci sont gardés en
observation pendant 7 jours. Après récolte, les cellules sont suspendues dans le milieu et soumises à plusieurs
cycles de congélation-décongélation, suivis d’une centrifugation et d’une filtration, puis le filtrat est inoculé en
culture cellulaire fraîche et observé pendant 7 jours. On ne doit relever aucun signe d’ECP et aucune
hémadsorpbtion de GR de poulet.
4.
Contrôles des lots
a)
Stérilité
Les tests de stérilité et d’absence de contaminants biologiques peuvent être trouvés au Chapitre
I.1.5., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ».
b)
Innocuité
Après réhydratation, 10 doses de vaccin fibrome lyophilisé sont injectées par voie sous-cutanée chez
3 lapins sensibles qui sont mis en observation pendant 21 jours. Les réactions locales doivent être légères
sans généralisation ni effet sur l’état de santé général.
Le vaccin Myxome est testé en utilisant 10 doses injectées par voie intradermique dans les oreilles de
3 lapins sensibles maintenus en observation pendant 21 jours. Le myxome primaire doit demeurer limité.
c)
Activité
L’activité du lot est déterminée par mesure du contenu viral. Des dilutions en série du vaccin sont inoculées
en culture de cellules sensibles. Une dose de vaccin doit contenir au moins le titre minimum établi dans la
Section C.1.c.
Si la souche vaccinale n’est pas adaptée aux cultures, un test d’efficacité sera conduit (voir Section C.1.c.).
d)
Durée de l’immunité
Plusieurs groupes de 10 lapins sensibles sont vaccinés. Un groupe est éprouvé par infection virulente
(comme dans le test d’efficacité du lot), à 1, 2, 3, etc., mois post-vaccination, pour le virus du fibrome, et à
1, 3, 6, et 9 mois, pour le virus du myxome. La durée de l’immunité est déduite du temps durant lequel au
moins sept des dix lapins se révèlent résistants à l’infection.
e)
Stabilité
Les titres du virus vaccin sont déterminés périodiquement jusqu’à 3 mois après le temps de conservation
revendiqué, sur au moins 3 lots de vaccin.
5.
Contrôles du produit fini
a)
Innocuité
Voir Section C.4.b.
b)
Activité
Voir Section C.4.c.
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Chapitre 2.8.1. — Myxomatose
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