NOVA Lite™ Skin Antibody Primate Esophagus

NOVA Lite® Skin Antibody
708330
Primate Esophagus Autoantibody Screen Assay
Uniquement pour “Diagnostics In-Vitro“
Complexité de CLIA: Haut
Application
NOVA Lite® SA est un test par immunofluorescence indirecte pour la détection et la détermination semiquantitative des autoanticorps anti-peau dans le sérum humain. La présence d’anticorps anti-peau peut être
utilisée conjointement avec d’autres tests sérologiques et résultats cliniques afin d’aider au diagnostic de
maladies auto-immunes de la peau, surtout le pemphigus et la pemphigoïde.
Informations concernant le test
Le terme « autoanticorps anti-peau » décrit divers autoanticorps qui réagissent avec les composants des
surfaces de la peau et des muqueuses. Ces autoanticorps sont souvent présents chez les patients atteints
de maladies auto-immunes de la peau, surtout les cas de pemphigus et de pemphigoïde.
Les autoanticorps qui réagissent avec un antigène intercellulaire de la peau et des muqueuses sont détectés
dans presque tous les cas actifs de la maladie bulleuse pemphigus.1 Les titres de ces anticorps imitent
l’activité de la maladie et diminuent lorsque le traitement donne de bons résultats.2,3,4
La pemphigoïde bulleuse, une autre importante maladie auto-immune de la peau est caractérisée d’un point
de vue sérologique par la présence d’anticorps anti-zone membrane basale de la peau ou des muqueuses.
Les anticorps circulants anti-zone membrane basale sont présents chez 70 à 80 % des patients atteints de
pemphigoïde.5,6,7 Bien qu’il n’y ait pas une corrélation aussi flagrante entre la gravité de la maladie et le titre
dans les cas de pemphigoïde que dans les cas de pemphigus, il y a toutefois un certain rapport. Lors d’une
rémission, soit spontanée soit suite à un traitement, le nombre d’anticorps anti-zone de membrane basale
diminue, en général jusqu’à un niveau à peine perceptible.7 Dans la plupart des cas, une rechute sera
accompagnée de la réapparition des anticorps anti-zone membrane basale.
L’immunofluorescence indirecte est la méthode utilisée le plus souvent pour la détection des autoanticorps
anti-peau. Les substrats utilisés le plus souvent sont de fines coupes de peau de rongeur ou de primate et
des muqueuses avec une coupe d’oesophage de primate servant de substrat de choix.8,9,10 En plus du type
de substrat, d’autres facteurs essentiels à la performance du test de détection des anticorps anti-peau
comprennent : 1) le fixateur utilisé dans la préparation de la lame de substrat et 2) le rapport entre la
spécificité et la fluorescéine et la protéine (F/P) du conjugué étiqueté FITC qui est utilisé. Il a été établi que
certains fixateurs ou combinaisons de fixateurs peuvent détruire certains antigènes de la peau. Il est donc
recommandé de ne pas les utiliser. Le rapport F/P d’un conjugué détermine la sensibilité et le degré de
coloration du fond. La spécificité d’un conjugué est extrêmement importante. La grande majorité des
autoanticorps appartiennent à la sous-classe IgG. Il a été établi que lorsque des autoanticorps sont présents
chez des donneurs en bonne santé, ils appartiennent en principe aux sous-classes IgM et IgA et rarement
IgG.11 Les conjugués spécifiques au IgG sont par conséquent plus spécifiques à la maladie. Le substrat
choisi pour NOVA Lite® Skin Antibody est de préférence une coupe fixée d’oesophage de primate. Le
conjugué est l’IgG anti-humain purifié par affinité.
Principe du test
Dans la technique par immunofluorescence indirecte, les échantillons sont incubés avec l’antigène fixé sur la
lame et les anticorps non liés sont éliminés au lavage. Le substrat est incubé avec un conjugué fluorescéine
spécifique et le réactif non lié est ensuite éliminé au lavage. Lorsqu’ils sont vus à l’aide d’ un microscope
fluorescent, les échantillons ayant une réaction positive aux autoanticorps afficheront une fluorescence vert
pomme qui correspond aux zones de la cellule ou des noyaux où l’autoanticorps s’est lié.
Contenu du coffret
1.
2.
3.
Lames pour anticorps anti-épiderme (œsophage de primat), 8 puits par lame, avec dessiccateur
Conjugué anti-IgG-FITC humain (chèvre), fluorescéine marquée dans du tampon contenant du bleu
Evans et 0,09 % d’azide de sodium, 7 ml
Pemphigoïde Positif, 1 flacon de solution tampon contenant 0,09 % d’azide de sodium et du sérum
humain prédilué contenant des auto-anticorps anti-pemphigoïde, 0,5 ml
1
4.
5.
6.
7.
Contrôl Négatif, 1 flacon de solution tampon contenant 0,09 % d’azide de sodium et du sérum humain
prédilué ne contenant aucun auto-anticorps anti- pemphigoïde, 0,5 ml
Concentré de PBS II (40x), suffisant pour 1000 ml
Milieu de montage, 0,09 % d’azide de sodium, 7 ml
Lamelles couvre-objet
Avertissements
1.
2.
3.
4.
Tout le matériel d'origine humaine utilisé pour la préparation des contrôles a été testé et trouvé
négatif lors de la recherche d'anticorps anti-VIH, anti-antigène de surface de l'Hépatite B et anti-Virus
de l’Hépatite C à l'aide de tests approuvés par la FDA. Cependant, aucune méthode ne peut donner
une garantie complète quant à l'absence de VIH, de VHB, du VHC ou d'autres agents infectieux. En
conséquence, tous les sérums humains de contrôle doivent être manipulés avec les mêmes
précautions que celles utilisées pour un matériel potentiellement infectieux.12
L´azide de sodium (NaN3) est utilisé comme conservateur. NaN3 est un poison et il est toxique en cas
d´ingestion et de contact avec les yeux et la peau. Eviter de l´exposer aux bases, métaux ou autres
composants, réagissant avec les acides. Après l´évacuation des réactifs, laver à grande eau afin
d´éviter des dépôts dans les canalisations.
Lors de la manipulation de ces produits, utiliser les équipements de protection personnelle
appropriés.
Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées immédiatement. Respecter les règlements en
vigueur concernant l´élimination des déchets.
Précautions
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Ce test est destiné à un usage diagnostic in vitro.
Toute substitution par d´autres réactifs que ceux fournis dans le coffret entraîne des variations de
résultats.
Un lavage incomplet ou insuffisant du liquide dans les puits des lames entraînent des imprécisions et
un bruit de fond élevé.
L'adaptation totale ou partielle de ce test aux automates de traitement d'échantillons ou de distribution
de réacifs pourrait fournir des résultats différents de ceux obtenus par une méthode manuelle.
Chaque laboratoire a la responsabilité de valider les limites raisonnables dans lesquels les résultats
seront acceptés.
La variation des facteurs suivants influence la performance du test : la température des réactifs au
démarrage du test, la puissance de la lampe du microscope, la précision et la reproductibilité du
pipetage, le degré du lavage et la durée de l'incubation. Une grande attention est requise pour obtenir
des résultats précis et reproductibles.
Au cours du temps, le conjugué anti-IgG humain pourrait changer de couleur à cause de son
exposition à la lumière. Toutefois, ce changement de couleur n'affecte pas la performance du test.
Il est recommandé de suivre strictement le protocole. Chaque modification est au risque de
l´utilisateur.
Conditions de conservation
1.
2.
Conserver tous les réactifs du coffret entre 2 - 8°C. Ne pas congeler. Les réactifs sont stables jusqu´à
la date limite d’utilisation dans des conditions de stockage et d’utilisation conformes.
La solution de tampon diluée reste stable quatre semaines à 2 - 8°C.
Echantillons
Ce test doit être réalisé avec du sérum comme échantillon. L´addition d´azide ou d´autres conservateurs aux
échantillons peut affecter le bon déroulement de la procédure. Les sérums contaminés par des agents
microbiens, prétraités par la chaleur ou contenant des particules visibles ne doivent pas être utilisés. Les
sérums ou échantillons hémolysés ou lipémiques sont à éviter.
2
Après prélèvement, le sérum doit être séparé du culot. Le document H18-A2 du CLSI (NCCLS) recommande
les conditions suivantes de conservation: 1) Conserver les échantillons à température ambiante pas plus de 8
heures. 2) Si le test ne peut pas être fait dans les 8 heures, conserver les échantillons à 2 - 8°C. 3) Si le test
ne s’effectue pas dans les 48 heures ou si on doit envoyer les échantillons, les congeler à –20°C ou à plus
basse température. Bien agiter les échantillons décongelés.
Procédure
Matériel fourni
10
1
1
1
1
1
1
8-puit sur lames de anticorps anti-épiderme
7 ml Conjugué anti-IgG FITC humain
0,5 ml Pemphigoïde Positif
0,5 ml contrôle négatif des systèmes IFA
25 ml Concentré de PBS II (40x)
7 ml de Milieu de montage
10 Lamelles couvre-objet
Autre matériel nécessaire non fourni
Micropipettes pouvant distribuer un volume de 15 à 1000 µl
Eau distillée ou déionisée
Pissettes ou pipettes Pasteur
Chambre humide
Récipient de 1 l (pour diluer le PBS II)
Bocal Coplin
Microscope à fluorescence avec excitatrice de 495 nm et filtre interférentiel de 515 nm
Méthode
Préparation du test
1.
2.
3.
Amener tous les réactifs et échantillons à la température ambiante (20-26oC) et bien les mélanger
avant de les utiliser.
Diluer le concentré PBS II : IMPORTANT : diluer le concentré PBS II 1:40 en ajoutant le contenu de
la bouteille de concentré PBS II à 975 ml d’eau distillée ou déionisée et bien mélanger. Le tampon
PBS II est utilisé pour diluer les échantillons des patients et comme tampon de lavage. Le tampon
dilué peut être conservé jusqu’à 4 semaines à une température comprise entre 2 et 8° C.
Diluer les échantillons des patients :
a.
Dépistage initial : diluer les échantillons des patients 1:10 avec la solution tampon PBS II
diluée (c’est-à-dire, ajouter 100 µl de sérum à 900 µl de solution tampon PBS II).
b.
Titrage : diluer en série en double à partir de la dilution de dépistage initiale pour tous les
échantillons positifs en utilisant la solution tampon PBS II (c’est-à-dire 1:20, 1:40, ... 1:2560).
Exécution du test
1.
2.
Préparer de la lame substrat : laisser la lame pour le substrat atteindre la température ambiante
avant de la retirer de sa pochette. Étiqueter la lame à l’aide d’un crayon et la placer dans une
chambre humide adéquate. Ajouter une goutte (70 à 90 µl) du contrôle positif non dilué et du Contrôl
négatif respectivement sur les puits 1 et 2. Ajouter une goutte (70 à 90 µl) de l’échantillon du patient
sur les puits restants.
Incubation de la lame substrat : incuber la lame pendant 30 + 5 minutes dans une chambre humide
(un essuie-tout humide placé à plat au fond d’un récipient de plastique ou de verre fermé permet de
maintenir les conditions d’humidité appropriées). Ne pas laisser le substrat se dessécher pendant
la procédure d’analyse.
3
3.
4.
5.
6.
Lavage de la lame substrat : après l’incubation, utiliser une pissette de plastique ou une pipette
pour éliminer le sérum en rinçant délicatement avec la solution tampon PBS II diluée. Orienter la lame
et le flot de solution tampon PBS II de façon à minimiser le débordement des échantillons entre les
puits. Ne pas diriger le flot directement dans les puits sous peine d’abîmer le substrat. Si
désiré, placez les lame dans une fiole de Coplin d'amortisseur dilué de PBS II pendant jusqu'à 5
minutes.
Addition du conjugué fluorescent : éliminer l’excès de la solution tampon PBS II en secouant la
lame. Replacer la lame dans la chambre humide et recouvrir immédiatement chaque puits d’une
goutte de conjugué fluorescent. Incuber la lame pendant 30 + 5 minutes.
Laver de la lame : répéter l’étape 3.
Montage de la lame substrat : les procédures pour le montage d’une lame à l’aide de lamelles
couvre-objet varient d’un laboratoire à un autre ; toutefois, la procédure suivante est recommandée :
a.
Placer une lamelle couvre-objet sur un essuie-tout.
b.
Appliquer le milieu de montage en une ligne continue sur le bord inférieur de la lamelle
couvre-objet.
c.
Éliminer l’excès de la solution tampon PBS II et placer le bord inférieur de la lame contre le
bord de la lamelle couvre-objet. Abaisser avec précaution la lame sur la lamelle couvre-objet
de façon à ce que le milieu de montage coule vers le bord supérieur de la lame sans former
de bulles d’air.
Contrôle de qualité
Le Pemphigoïde Positif et le contrôle négatif du système IFA devraient être testés sur chaque lame afin d’être
certain que tous les réactifs et toutes les procédures ont été exécutées de façon appropriée. Un contrôle
supplémentaire adéquat peut être préparé en utilisant des portions aliquotées d’échantillon de sérum humain
provenant d’un groupe de personnes et en les conservant à < -70oC. Pour que les résultats des tests soient
valides, tous les critères cités ci-dessous doivent être remplis. Si certains critères ne sont pas remplis, les
résultats du test devraient être considérés comme invalides et l’analyse doit être répétée.
1.
Le Pemphigoïde Positif doit être > 3+.
2.
Le contrôl négatif doit être négatif.
Interprétation des résultats
Réaction négative. Un échantillon est considéré négatif si la coloration spécifique des zones intercellulaires,
de la zone de membrane basale ou d’autres structures est égale ou inférieure à celle du contrôle négatif. Les
échantillons peuvent afficher divers degrés de coloration de fond en raison des anticorps hétérophiles ou
d’autres réactions spécifiques en raison des anticorps anti-réticuline, anti-nucléaires, anti-endomysium ou
anti-muscle lisse.
Une réaction positive pour les anticorps anti-intercellulaires et anti-zone de membrane basale. Un
échantillon peut être considéré positif si une coloration spécifique de zones intercellulaires ou de membrane
basale des muqueuses oesophagiennes a été observée.
Déterminer le grade ou l’intensité de la fluorescence à l’aide des critères suivants :
4+
Fluorescence éclatante vert pomme
3+
Fluorescence vive vert pomme
2+
Fluorescence positive bien visible
1+
La fluorescence spécifique la plus basse permettant de différencier clairement la coloration
des zones de membranes intercellulaires ou basales de la fluorescence naturelle
Limites du test
1.
2.
La présence d’autoanticorps anti-épidermes évoque certaines maladies cutanées bulleuses autoimmunes mais ne doit pas être considérée comme un diagnostic. Le résultat obtenu avec les
autoanticorps doit être analysé conjointement avec d’autres résultats sérologiques ou de biopsie ainsi
qu’avec les antécédents cliniques du patient.
En plus des autoanticorps anti-épidermes, d’autres autoanticorps peuvent réagir avec le substrat de
l’œsophage. Il s’agit, entre autres, des autoanticorps anti-nucléaires (ANA), anti-mitochondries (AMA),
anti-muscle lisse et anti-muscle squelettique. La présence de ces anticorps doit être notée, confirmée
et titrée sur d’autres substrats approuvés.
4
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Il est important de noter que, suite aux lésions tissulaires, certains patients souffrant de brûlures
produisent des anticorps faiblement réactifs qui se lient également aux zones intercellulaires. Ces
anticorps dits « semblables au pemphigus » produisent une coloration faible et irrégulière des
muqueuses, sont de caractère transitoire et ne réagissent pas à la peau des patients in vivo.13, 14, 15
Étant donné que la muqueuse œsophagienne peut contenir certaines substances de groupe sanguin,
des isoanticorps des groupes sanguins anti-A et anti-B peuvent réagir avec l’œsophage.16 Le motif de
réactivité peut, chez certains patients, être similaire au motif observé avec les autoanticorps
intercellulaires anti-pemphigus (bien que l’anticorps anti-groupe sanguin colore également les
capillaires sanguins dans la musculature de la section œsophagienne). La réactivité due à l’anticorps
anti-groupe sanguin peut être résorbée avec de l’antigène au groupe sanguin.17
Une gamme de facteurs externes influencent la sensibilité du test y compris le type de microscope à
fluorescence utilisé, la puissance et l’âge de l’ampoule, le grossissement utilisé, le système de
filtration et l’observateur.
Si un filtre passe bande est utilisé au lieu d’un filtre interférentiel 515, on observera une coloration
artéfactuelle accrue.
Utiliser uniquement un crayon pour étiqueter les lames. L’utilisation d’un instrument autre qu’un
crayon risque de causer une coloration artéfactuelle.
Tous les bocaux Coplin utilisés pour laver les lames doivent être exempts de résidus de colorants.
L’utilisation de bocaux de Coplin contenant des résidus de colorants risque de causer une coloration
artéfactuelle.
Les résultats obtenus à l´aide de ce test devront être corrélés avec les signes cliniques et d´autres
tests sérologiques.
Les performances du coffret pour les échantillons autres que les sérums n’ont pas été établies.
Performances
Un substrat NOVA Lite® Skin Antibody fut utilisé pour tester les patients atteints des maladies de la peau
pemphigus et pemphigoïde ainsi que chez 100 donneurs de sang choisis au hasard. Les résultats sont
fournis ci-dessous :
Groupe de patients
Pemphigus
Pemphigoïde
Normaux
Nombre
24
18
100
Nombre de positifs
intercellulaires zone de la membrane basale
20
0
0
12
0
0
5
Références
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
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6
Fabricant:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
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628330FRA
December 2012
Revision 17
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