TRILLIUM DIAGNOSTICS

Leuko64™
Dosage pour la détection de l'inflammation et des lésions tissulaires
TRILLIUM DIAGNOSTICS
i Informations sur le produit
h LK64-75 (75 tests) ;
V Pour diagnostic in vitro
LK64-250 (250 tests)
RÉSUMÉ ET PRINCIPE
L'expression du CD64 sur les neutrophiles est rapidement accrue, en quelques heures, in vitro et in vivo, par
les médiateurs de l'inflammation, comme l'interféron gamma et le G-CSF (1-3). Une modification identique est
observée en réponse à une infection ou à une lésion tissulaire documentée, ce qui indique de ce fait que la
mesure de l'expression du CD64 sur les neutrophiles est corrélée avec la présence de tels états pathologiques
chez l'être humain (4-8). Le dosage Leuko64 est constitué d'un mélange de trois anticorps monoclonaux
présentant des spécificités pour les clones 22 et 32,2 du CD64 et le clone Mac2-158 du CD163, d'une solution
de lyse de GR, et d'une suspension de perles fluorescentes pour la calibration de l'instrument et la
standardisation de l'expression du CD64 et du CD163 leucocytaire dans le sang humain.
APPLICATION
Les versions LK64-75 et LK64-250 de la trousse de dosage Leuko64 ont été conçues pour être utilisées
spécifiquement avec un cytomètre en flux.
DOMAINE D'APPLICATION
Le dosage Leuko64 a été conçu pour être utilisé dans le dosage des taux de CD64 neutrophile leucocytaire,
qui augmente en réponse à l'inflammation et aux lésions tissulaires. Le Trillium Leuko64 est destiné au
diagnostic In Vitro Diagnostic Use par du personnel formé et qualifié.
COMPOSANTS DU KIT
Réactif A - mélange d'anticorps monoclonaux murins (contient 0,1 % d'azide de sodium)
Réactif B - solution de lyse Trillium concentrée 10X (contient du chlorure d'ammonium et du sérum bovin
purifié
albumine)
Réactif C - suspension de perles en polystyrène de 5,2 µm marquées au StarFire Red et l'isothiocyanate de
fluorescéine (FITC) (contient 0,1 % d'azide de sodium et 0,01 % de Tween 20).
Logiciel Leuko64 - Utilisé pour analyser les fichiers listmode de cytométrie en flux et calculer les indices
CD64 sur les leucocytes.
REACTIFS ET MATERIELS NECESSAIRES MAIS NON INCLUS
Eau distillée
Cytomètre en flux
Tubes en polystyrène 12x75 jetables
Micropipette(s) capable(s) de distribuer 5 µl, 50 µl, et 1 ml
Mélangeur vortex
SPECIMEN
Le dosage Leuko64 ne nécessite que 50 µl de sang total prélevé sur anticoagulant. EDTA, héparine, citrate de
sodium ou ACD sont tous compatibles avec ce système d'analyse. Les échantillons demeurent acceptables
pendant 24 heures s'ils sont conservés à température ambiante (18-22°°C) ou pendant 48 heures s'ils ont été
réfrigérés (2-8°°C).
PRÉPARATION DU SPÉCIMEN
1 Diluez la solution de lyse Trillium 10X (Réactif B) au 1:10 en mélangeant 1 partie de Réactif B concentré à
9 parties d'eau distillée filtrée. Préparez un volume suffisant pour le nombre de tests prévus (1,0 ml est
nécessaire pour chaque échantillon). La solution de lyse Trillium diluée ou 1X est stable pendant 1
semaine à température ambiante (20-26 °C) ou 30 jours si elle est réfrigérée (2-8 °C).
2 La solution de lyse Trillium diluée doit être portée à une température comprise entre 20 °C et 37 °C pour
être utilisée. Une solution froide peut avoir pour conséquence une mauvaise lyse et des conditions de
dosage suboptimales
3 Etiquetez un tube en polystyrène 12 x 75 mm pour chacun des échantillons qui doit être analysé.
4 Pipetez 50 µl de Réactif A Leuko64 dans chaque tube étiqueté.
5 Pipetez 50 µl d'échantillon sanguin, sous anticoagulant, bien mélangé, ayant une numération leucocytaire
9
<25 x 10 cellules/l (diluez si nécessaire) dans le tube correspondant contenant le Réactif A, mélangez
doucement ou passez au vortex, puis incubez pendant 10 minutes dans l'obscurité et à température
ambiante (18-22°°C).
6 Ajoutez 1 ml de solution de lyse Trillium 1X (Réactif B dilué) à chaque tube et passez soigneusement au
vortex. Incubez pendant 15 minutes dans l'obscurité et à température ambiante. Des passages
intermittents au vortex améliorent la lyse.
Téléphone : 1-207-945-0900 i Télécopie : 1-207-942-0346 i [email protected] i www.trilliumdx.com
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Dosage pour la détection de l'inflammation et des lésions tissulaires
Ajoutez 5 µl de perles Leuko64 (Réactif C) à chaque tube, passez au vortex et analysez sur un cytomètre en flux en utilisant la
configuration de l'instrument et le protocole d'analyse indiqué ci-dessous. Les échantillons préparés doivent être maintenus à 2-8 °C,
et protégés de la lumière jusqu'à ce qu'ils soient analysés. L'analyse doit être réalisée dans les 6 heures qui suivent la coloration.
Les instruments Beckman Coulter XL et FC500 doivent présenter les paramètres des protocoles d'acquisition sélectionnés dans l'ordre
suivant :
101
102
103
CD64 FITC
5
1000
800
600
Forward Scatter
400
0
100
200
200
300
Number
150
Number
100
50
0
0
100
400
500
200
Bead_Red (FL3)
150
100
50
0
TRILLIUM
Bead_PE
Bead_FITC
600
200
3
4
• FALS
• log dispersion latérale
• log, FITC
• log, PE
• log PMT pour le signal à 685 nm
Mettez en position OFF tous les paramètres de compensation.
Analysez la suspension de perles et procédez aux réglages suivants sur les histogrammes à paramètre unique (voir diagramme) :
• Le centre du pic sur l'axe FL1 (FITC) doit se trouver à la fin de la deuxième décade de l'intensité de fluorescence.
• Le centre du pic sur l'axe FL2 (PE) doit se trouver à ~20 (le premier repère dans la deuxième décade de l'intensité de
fluorescence).
• Le centre du pic sur l'axe FL3 doit se trouver au milieu de l'échelle dans la deuxième décade.
Number
DIAGNOSTICS
CONFIGURATION DU CYTOMETRE EN FLUX
Avant d'analyser votre premier spécimen, un protocole d'acquisition doit être configuré sur le cytomètre en flux. Les perles Leuko64
(Réactif C) servent de calibrateur pour les paramètres de tension et de gains de l'instrument. Afin que le logiciel automatique
fonctionne de façon appropriée, il est impératif de respecter exactement les étapes suivantes.
1 Préparez un tube de polystyrène 12x75 contenant 5 µl de perles Leuko64 (Réactif C) dans 0,5 ml de solution de lyse Trillium 1X
(Réactif B dilué au 1:10 avec de l'eau distillée filtrée). Ceci sera utilisé pour établir la tension PMT et les paramètres de dispersion.
2 En mode acquisition de votre cytomètre (utilisateurs Beckman Coulter XL ou FC500, voir ci-dessous), configurez 4
histogrammes à 2 paramètres :
• FS (lin) vs SS (log)
• CD64 FITC vs SS (log)
• CD163 PE vs SS (log)
• CD163 PE vs CD64 FITC
et 3 histogrammes à paramètre unique :
• FL1 - CD64 FITC
• FL2 - CD163 PE
• FL3 (ou PMT avec une configuration du filtre capable de détecter à 685 nm)
104
100
101
102
CD163 PE
103
104
100
101
102
FL3-Height
103
104
100
101
102
103
104
Side Scatter
Sur l'histogramme FS vs log SS, la population des perles doit être positionnée au début de la troisième décade sur le log du signal de
la dispersion latérale et sur le canal 85-100 sur le signal de la dispersion vers l'avant ou à angle faible (sur 256 canaux, utilisez le canal
20-25).
6
Le seuil permettant d'exclure les plaquettes et les débris de globules rouges doit être défini sur log SS à l'aide de lymphocytes. Le
discriminateur sur log SS doit être défini pour se situer juste à la gauche de la population des lymphocytes.
7 Les paramètres Acquisition et Stockage doivent être réglés pour permettre le recueil de 50 000 événements non sélectionnés. Le
réglage de la résolution sur 1024 est généralement recommandé, mais il est obligatoire lors de l'utilisation de cytomètres Beckman
Coulter Cytomics™ FC500 ou BD Biosciences FACSCanto™.
8 Enregistrez les paramètres et le modèle d'acquisition. Répétez les étapes 5-8 avec tout nouveau lot de Leuko64 ou après une
intervention d'entretien sur l'instrument.
ANALYSE DU FICHIER LISTMODE
Installez le logiciel Leuko64™ QuantiCALC inclus sur le MacIntosh ou le PC qui sera utilisé pour l'analyse des données. Pour
l'analyse des données listmode suivez les instructions conviviales qui se trouvent dans le fichier d'aide du logiciel. REMARQUE : le
logiciel est spécifique du lot et les protocoles d'utilisation sont spécifiques du mode de l'instrument. Vous serez invité à
vérifier que la sélection est correcte.
tl H
Y CL+
MANIPULATION ET STOCKAGE
Conservez les flacons à la verticale, bien fermés, à 2-8°°C quand ils ne sont pas en cours d'utilisation. Les flacons non ouverts sont
stables jusqu'à la date de péremption indiquée sur chacun d'entre eux et sur la fiche de dosage. Évitez de procéder sans nécessité à
des cycles de réchauffement et de refroidissement. Protégez le produit de la congélation, de températures supérieures à 30° °C et
d'un séjour prolongé à température ambiante (18-26°°C) ou d'une exposition à la lumière.
AVERTISSEMENT
Tous les composants de ce kit contiennent de l'azide de sodium (<0,1 % p/ v). Ce produit chimique est un composé toxique et
dangereux quand il est combiné à des acides ou des métaux. Manipulez en prenant les précautions appropriées. Les solutions
contenant de l'azide de sodium doivent être éliminées de façon appropriée.
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Dosage pour la détection de l'inflammation et des lésions tissulaires
CONTROLE QUALITE DU PRODUIT
Les performances et la spécificité des réactifs contenus dans ce kit ont été testées à l'aide des méthodes de contrôle qualité interne
de Trillium. La fabrication de ce produit a été faite dans le respect de directives de système qualité et de fabrication conformes aux
normes FDA QSR et ISO 13485:2003.
LIMITATIONS DU PRODUIT
Une conservation et une utilisation appropriées de ce produit, comme indiqué ci-dessus, sont nécessaires à l'obtention de
performances optimales. Un mélange incomplet du flacon de Réactif C avant emploi rend invalide l'aliquote qui a été prélevée ainsi
que le matériel qui reste dans le flacon. Le protocole de l'instrument approprié et le numéro de lot du kit doivent être sélectionnés lors
du lancement du logiciel afin de permettre une analyse précise des données listmode.
CARACTERISTIQUES DES PERFORMANCES
TM
Chaque laboratoire doit établir une ou plusieurs plages de référence acceptables pour chacun des lots de Leuko64 . Il est prévu que
la moyenne du laboratoire de l'indice PMN CD64 pour des échantillons sanguins normaux soit ≤1,00. Les plages prévues pour les
indices Monocyte CD64 et CD163 n'ont pas été établies.
RÉFÉRENCES
Davis BH. (2005) Improved Diagnostic Approaches to Infection/Sepsis Detection. Expert Rev Mol Diag, 5, 193-207.
Schiff, D., Rae, J., Martin, T., Davis, B., Curnutte, J. (1997) Increased phagocyte CD64 expression and improved Fc-receptor mediated phagocytosis following in vivo
recombinant human interferon- treatment of normal human subjects. Blood 90, 2987-94.
3 Petroni, K.C., Shen, L., Guyre, P.M. (1988) Modulation of human polymorphonuclear leukocyte IgG Fc receptors and Fc receptor-mediated functions by IFN-gamma and
glucocorticoids. J. Immunol 140, 3467-72.
4 Davis, B.H., Bigelow, N.C., Curnutte, J.T., Ornvold, K. (1995) Neutrophil CD64 expression: Potential diagnostic indicator of acute inflammation and therapeutic monitor of
interferon- therapy. Lab Hematol 1, 3-12.
5 Guyre, P.M., Campbell, A.S., Kniffin, W.D., Fanger, M.W. (1990) Monocytes and polymorphonuclear neutrophils of patients with streptococcal pharyngitis express increased
numbers of type I IgG Fc receptors. J Clin Invest 86, 1892-1.
6 Herra, C.M., Keane, C.T., Whelan, A. (1996) Increased expression of Fc gamma receptors on neutrophils and monocytes may reflect ongoing bacterial infection. Journal of
Medical Microbiology 44, 135-40.
7 Davis BH and Bigelow NC (2005) Comparison of neutrophil CD64 expression, manual myeloid immaturity counts, and automated hematology analyzer flags as indicators of
infection or sepsis. Lab Hematol 11:137- 47.
8 Leino, L., Sorvajarvi, K., Katajisto, J., Laine, M., Lilius, E., Pelliniemi, T., Rajamaki, A., Silvoniemi, P., Nikoskelainen, J. (1997) Febrile infection changes the expression of IgG
Fc receptors and complement receptors in human neutrophils in vivo. Clin Exp Immunol 107, 37-43.
9 Qureshi SS, Lewis SM, Gant V.A.,Treacher D, Davis BH, Brown KA (2001) Increased distribution and expression of CD64 on blood polymorphonuclear cells from patients with
the systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Clin Exp Immunol 128:258-265.
10 US Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration. 29 CFR Parts 1910. 1030, Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens; Final Rule. Federal
Register 235:64175-82. 1991.
11 US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication (NIH) 93-8395.Washington: US Government
Printing Office. 1993.
DIAGNOSTICS
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TRILLIUM
MARQUES COMMERCIALES
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Le logiciel Leuko64™ QuantiCALC est soumis à un copyright et a été co-développé par VERITY SOFTWARE HOUSE • Topsham, Maine, USA •
www.vsh.com
et TRILLIUM DIAGNOSTICS, LLC • Brewer, Maine, USA • www.trilliumdx.com
FACSCanto™ est une marque commerciale de BD Biosciences • San Jose, CA, USA • www.bdbiosciences.com
Cytomics FC500™ et XL™ sont des marques commerciales de Beckman Coulter, Inc • Brea, CA, USA • www.beckman.com
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PO Box 67
Brewer, Maine, USA 04412
Téléphone : 1-207-945-0900
Télécopie :
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