FertiCultTM IVF medium

FertiCultTM IVF medium
Cell culture medium for fertilization and in vitro culture of human embryos
up till 2 PN or alternatively until 4-cell stage when embryo transfer is
performed at this stage.
Document reference: FP09 I07 R01 C.1, Update: 05/01/2017
USED ABBREVIATIONS
ICSI
IntraCytoplasmatic Sperm Injection
IVF
In Vitro Fertilization
GENERAL INFORMATION / INTENDED USE
FertiCult IVF medium is a cell culture medium for washing and holding of human
oocytes, performing fertilization by IVF or ICSI and culture until 2 PN or alternatively
until 4-cell stage when embryo transfer is performed at this stage. The medium is
complete and needs no further additives. As with all IVF media, FertiCult IVF medium
has to be pre-incubated in a CO2 incubator with 5-6% CO2 for at least 4 hours,
but ideally overnight, before use (with lid opened). For professional use only.
COMPOSITION OF THE MEDIUM
FertiCult IVF medium is a ready-to-use bicarbonate-buffered balanced salt solution,
supplemented with glucose (5,55 mM), lactate, pyruvate, insulin (50 IU/l), and human
serum albumin (4g/liter). The product is also available with phenol red and/or
gentamicin (10mg/liter).
MATERIAL INCLUDED WITH THE KIT
Product code
FECU020
FECU050
FECU100
FECU020PHR
FECU050PHR
FECU100PHR
FECU020PHR_G
FECU050PHR_G
FECU100PHR_G
Product description
5 x 20ml FertiCult IVF medium
5 x 50ml FertiCult IVF medium
3 x 100ml FertiCult IVF medium
5 x 20ml FertiCult IVF medium with phenol red
5 x 50ml FertiCult IVF medium with phenol red
3 x 100ml FertiCult IVF medium with phenol red
5 x 20ml FertiCult IVF medium with phenol red and gentamicin
5 x 50ml FertiCult IVF medium with phenol red and gentamicin
3 x 100ml FertiCult IVF medium with phenol red and gentamicin
MATERIAL NOT INCLUDED WITH THE KIT
 Incubator at 37°C (5-6% CO2)
 Petri dishes (e.g. Falcon IVF culture dishes (BD), Nunc culture dishes for IVF
(Thermo Scientific)) and test tubes
 Mineral oil (e.g. FertiCult Mineral Oil)
 Laminar flow bench (ISO 5 environment) and microscope
PRODUCT SPECIFICATIONS
 Chemical composition
 pH: 7.20 - 7.50 (37°C – 6% CO2)
 Osmolality: 270 - 290 mOsm/kg
 Sterility: Sterile (SAL 10-3)
 Endotoxins: < 0.25 EU/ml
 Mouse Embryo Assay (blastocysts after 96h culture): ≥ 80% (48h exposure from
zygote stage)
 Use of Ph Eur or USP grade raw materials if applicable
 Certificate of analysis and MSDS are available upon request
PRE-USE CHECKS
 Do not use the product if it becomes discoloured (if medium contains phenol red),
cloudy, or shows any evidence of microbial contamination
 Do not use the product if seal of the container is opened or defect when the
product is delivered
STORAGE AND CONSERVATION
 Store FertiCult IVF medium without gentamicin between 2-25°C. Store FertiCult
IVF medium with gentamicin between 2-8°C. Once opened, store all products
between 2-8°C. Do not freeze. Keep away from (sun)light
 The product can be used safely up to 7 days after opening, when sterile
conditions are maintained and product is stored at 2-8°C. Stable after transport
(max. 5 days) at elevated temperature (≤ 37°C). Do not use after expiry date.
METHOD
MEDIUM PRE-EQUILIBRATION
Incubate the medium (in culture dishes or flasks with loosened screw tops) for at least
4 hours in a CO2 incubator at 37°C and 5-6% CO2. Ideally the medium should be preincubated overnight before use.
Important: Read the note on optimal pH, CO2 and atmospheric pressure below
carefully.
When pre-equilibration is performed in culture dishes, follow the instructions below:
 For micro-droplets: 6-8 droplets of 100-250µl of FertiCult IVF medium may be
dispensed around the 6 cm culture dish/well. The dish is then filled with 5-6 ml of
light mineral oil (e.g. FertiCult Mineral Oil). One oocyte is usually placed per
micro-droplet.
 Alternatively, the medium can also be used for fertilization in an open system
such as with the Falcon / Nunc dishes. About 1ml of medium is placed in each
well. A further 3ml is placed in the reservoir surrounding the wells. This helps to
maintain humidity as well as providing medium with which to wash the oocytes
and embryos. Up to 5 oocytes per dish/well may be cultured together.
In the open system, paraffin oil is not necessary, but sometimes a 1ml layer of
mineral oil may be added over the medium in the inner well. When using such an
open system the incubator must be humidified.
Fertilization by IVF or ICSI
After equilibration of the medium, the prepared dishes are ready for use. During
oocyte collection, oocytes are identified in the follicular aspirates and then washed
before placing into the wells or droplets in the dish. After oocyte collection, oocytes
will be checked and may be rewashed, before then being placed into fresh
droplets/wells for overnight culture. Generally, within 6 hours of oocyte collection,
oocytes will be inseminated by IVF or ICSI with prepared sperm and then left
overnight in the incubator. For IVF, 1 oocyte is usually placed with about 10 000
sperm cells per pre-equilibrated micro-droplet. When the open system is used, 5
oocytes per dish or well are usually fertilized with about 100 000 sperm cells per well.
FERTILIZATION CHECK AND FURTHER EMBRYO CULTURE
The presence of 2 pro-nuclei (2PN) is checked 16-20 hrs after fertilization. Once
embryos have been identified by the presence of 2PN, they are preferably placed into
fresh dishes containing a fresh embryo culture medium (e.g GAIN Medium, FertiPro
N.V.).
Alternatively, when using FertiCult IVF medium until 4-cell stage, it is recommended
to transfer the embryo after identification of 2 PN to a fresh droplet of FertiCult IVF
medium. Dishes should be prepared as described above, equilibrated overnight, after
which they will be ready to receive the newly fertilized embryos.
Note: Test tube culture is now rare, but for those still using this method, place 1ml of
FertiCult IVF medium in each tube and then follow the same procedure as for Falcon
or Nunc dishes.
FertiCult IVF medium is not intended for embryo transfer, so embryos should be
transferred in a specific medium for embryo transfer, e.g. GAIN Medium.
NOTE ON OPTIMAL PH, CO2 AND ATMOSPHERIC PRESSURE.
For optimal embryo culture, FertiCult IVF medium should be used at a pH of 7.207.35. Different factors like the CO2 concentration in the incubator and atmospheric
pressure (which decreases at higher altitudes) have an effect on the pH after
equilibration in the incubator1.
Therefore, we strongly advise to measure the pH under culture conditions with 5-6%
CO2 in the incubator in order to determine the CO2 concentration settings of the
incubator which result in an optimal pH of 7.20-7.35.
WARNINGS AND PRECAUTIONS
Standard measures to prevent infections resulting from the use of medicinal products
prepared from human blood or plasma include selection of donors, screening of
individual donations and plasma pools for specific markers of infection and the
inclusion of effective manufacturing steps for the inactivation/removal of viruses.
Despite this, when medicinal products prepared from human blood or plasma are
administered, the possibility of transmitting infective agents cannot be totally
excluded. This also applies to unknown or emerging viruses and other pathogens.
There are no reports of proven virus transmissions with albumin manufactured to
European Pharmacopoeia specifications by established processes. Therefore, handle
all specimens as if capable of transmitting HIV or hepatitis. Always wear protective
clothing when handling specimens. Always work under strict hygienic conditions (e.g.
LAF-bench, ISO Class 5) to avoid possible contamination, even when FertiCult IVF
medium contains gentamicin.
BIBLIOGRAPHY/BIBLIOGRAPHIE
1 Conaghan J (2014). pH control in the embryo culture environment. In: Quinn P,
editors. Culture media, solutions, and systems in Human ART: Cambridge University
Press. P. 142-154.
TECHNICAL SUPPORT
FertiPro N.V. ▪ Industriepark Noord 32 ▪ 8730 Beernem ▪ Belgium
Tel +32 (0)50 79 18 05 ▪ Fax +32 (0)50 79 17 99
URL: http://www.fertipro.com ▪ E-mail: [email protected]
FertiCultTM IVF medium
Milieu de culture cellulaire pour fertilisation et culture in vitro d’embryons
humains, jusqu’au stade 2PN ou jusqu’au stade 4-cellules lorsque le
transfert d’embryons est effectué à ce stade.
Référence du document : FP09 I07 R01 FR C.1 Mise à jour : 05/01/2017
ABRÉVIATIONS UTILISÉES
ICSI
Injection Intra Cytoplasmique de Sperme
FIV
Fécondation In Vitro
INFORMATIONS GÉNÉRALES
Le milieu FertiCult IVF est une formulation prête à l’emploi pour le lavage et de
préparation des ovocytes humains, la fertilisation par FIV et ICSI et la culture jusqu’au
stade 2PN ou au stade 4-cellules lorsque le transfert d’embryons est effectué à ce
stade. Le milieu est complet et ne nécessite pas d’additifs.
Comme pour tous les milieux de FIV, le milieu FertiCult IVF doit être pré incubé dans
un incubateur CO2 avec 5-6 % CO2 pendant au moins 4 heures, si possible une
nuit, avant emploi (couvercle ouvert). Usage professionnel uniquement.
COMPOSITION DU MILIEU
Le milieu Ferticult IVF est un milieu prêt à l’emploi et tamponné au bicarbonate,
supplémenté en glucose (5.55mM), lactate de sodium, pyruvate de sodium, insuline
(50IU/l), et sérum albumine humaine (4g/litre). Le milieu est aussi disponible avec du
rouge de phénol et/ou de la gentamicine (10mg/litre).
MATÉRIEL CONTENU DANS LE KIT
Code produit
Description produit
FECU020
5x 20 ml de milieu FertiCult IVF
FECU050
5 x 50 ml de milieu FertiCult IVF
FECU100
3 x 100 ml de milieu FertiCult IVF
FECU020PHR
5 x 20 ml de milieu FertiCult IVF avec rouge de phénol
FECU050PHR
5 x 50 ml de milieu FertiCult IVF avec rouge de phénol
FECU100PHR
3 x 100 ml de milieu FertiCult IVF avec rouge de phénol
FECU020PHR_G
5 x 20 ml de milieu FertiCult IVF avec rouge de phénol et gentamicine
FECU050PHR_G
5 x 50 ml de milieu FertiCult IVF avec rouge de phénol et gentamicine
FECU100PHR_G
3 x 100 ml de milieu FertiCult IVF avec rouge de phénol et gentamicine
MATÉRIEL NON INCLUS DANS LE KIT
 Incubateur à 37 °C (5-6% de CO2)
 Boîtes de Petri (p. ex. Falcon boîtes de culture pour FIV (BD), boîtes de culture
Nunc pour FIV (ThermoScientific)) et éprouvettes
 Huile minérale (p. ex. Huile minérale FertiCult)
 Hotte à flux d’air laminaire (environnement ISO 5) and microscope
SPÉCIFICATIONS DU PRODUIT
 Composition chimique
 pH : entre 7,20 - 7,50 (37°C – 6% CO2)
 Osmolarité : 270 - 290 mOsm/kg
 Stérilité : stérile (SAL 10-3)
 Endotoxines : < 0.25 EU/ml
 Test MEA de survie embryonnaire (blastocystes après 96h) : ≥ 80 % (après 48 h
d’exposition à partir du stade zygote)
 Utilisation de produits de la pharmacopée européenne (Ph Eur) ou américaine
(USP) le cas échéant
 Certificat d’analyse et fiches de sécurité disponibles sur demande
VÉRIFICATIONS AVANT UTILISATION
 Ne pas utiliser le produit en cas de décoloration (si le milieu contient du rouge de
phénol), trouble ou s’il présente des signes de contamination microbienne.
 Ne pas utiliser le produit si le scellé du contenant est rompu ou défectueux à la
livraison du produit.
INSTRUCTIONS DE STOCKAGE
 Conserver le milieu FertiCult IVF sans gentamicine entre 2-25°C. Conserver le
milieu FertiCult IVF avec gentamicine entre 2-8°C. Après ouverture, conserver
toutes milieux entre 2-8°C. Ne pas congeler. Tenir à l’abri de la lumière (du
soleil).
 Après ouverture du flacon, le produit peut être utilisé en toute sécurité jusqu’à 7
jours si les conditions de stérilité sont respectées et si le produit est conservé
entre 2-8°C. Stable après transport (maximum 5 jours) à température élevée ( ≤
37°C). Ne pas utiliser une fois la date de péremption dépassée.
MÉTHODE
PRÉ-ÉQUILIBRATION DU MILIEU
Incuber le milieu (en boîtes de culture ou en flacon avec bouchon desserré) pendant
au moins 4 heures dans un incubateur CO2 à 37°C et 5-6% de CO2. Il est préférable
d’incuber le milieu pendant la nuit avant utilisation.
Importante : Lire la note concernant les conditions optimales quant au pH, CO2 et à la
pression atmosphérique ci-dessous.
Après le pré-équilibration dans les boîtes de culture, suivre les instructions cidessous :
 Pour les microgouttelettes : pipeter 6-8 gouttes de 100-250 µl de milieu FertiCult
IVF en rond dans une boîte de culture de 6 cm. La boîte est ensuite rempli avec
5-6 ml d’huile minérale légère (p.ex.FertiCult Mineral Oil). Généralement, un seul
ovocyte est placé par microgoutte.
 Le milieu permettra aussi l’utilisation dans les systèmes ouverts tels que les
boîtes Nunc ou Falcon. Placer environ 1 ml de milieu dans chaque puit. Placer
3 ml de milieu dans le réservoir situé autour des puits. Cela permettra de
maintenir une certaine humidité et un milieu pour laver les ovocytes et les
embryons. Jusqu’à 5 ovocytes par boîte/ puit peuvent être mis en culture
ensemble.
Avec les systèmes ouverts, il n’y a pas besoin d’huile de paraffine, mais il est
parfois possible d’ajouter une couche de 1 ml d’huile minérale par-dessus le
milieu dans le puit intérieur. En cas d’utilisation d’un tel système ouvert,
l’incubateur doit être humidifié.
FERTILISATION PAR FIV OU ICIS
Après l’équilibration du milieu, les boîtes préparées sont prêtes à l’emploi. Au cours
de la collecte des ovocytes, les ovocytes sont repérés dans le liquide d’aspiration
folliculaire, puis lavés avant d’être placés dans les puits ou dans les gouttelettes dans
la boîte (selon le cas). Lorsque la collecte des ovocytes est terminée, les ovocytes
seront vérifiés et pourront subir un second lavage avant d’être placés dans des
gouttelettes/puits neufs pour être mis en culture pendant une nuit.
En général, 6 heures après la collecte des ovocytes, les ovocytes seront inséminés
par FIV ou ICSI avec le sperme préparé et laissés dans l’incubateur pour la nuit. Pour
une FIV, un ovocyte est placé en culture avec environ 10 000 spermatozoïdes par
microgouttelette pré-équilibrée. En utilisant le système ouvert, 5 ovocytes seront
fertilisés avec 100 000 spermatozoïdes par boîte ou par puit.
CONTRÔLE DE FERTILISATION ET CULTURE D’EMBRYONS
La présence de 2 pronucléi (2PN) est contrôlée 16-20 heures après fécondation.
Lorsque les embryons ont été repérés par la présence de 2PN, ceux-ci sont
préférablement placés dans des boîtes neuves contenant un milieu de culture
d’embryons frais (p.ex. GAIN Medium, FertiPro N.V.).
En utilisant le milieu FertiCult IVF jusqu’au stade 4-cellules, il est recommandé de
transférer les embryons après avoir été repérés par la présence de 2PN, dans une
gouttelette fraîche de milieu FertiCult IVF. Les boîtes doivent être préparées comme
décrit ci-dessus, équilibrées pendant la nuit, pour être prêtes à l’emploi pour des
embryons fraichement fécondés.
NB. La culture en éprouvette est rare de nos jours, mais pour ceux qui continuent à
utiliser cette méthode, placer 1 ml de milieu FertiCult IVF dans chaque tube et suivre
ensuite la même procédure que celle pour les boîtes Falcon ou Nunc.
Le milieu FertiCult IVF n’est pas prévu pour le transfert des embryons, il faut un milieu
spécifique pour le transfert des embryons, p.ex. GAIN Medium.
NOTE SUR LES CONDITIONS OPTIMALES QUANT AU PH, CO2 ET À LA
PRESSION ATMOSPHÉRIQUE
Pour une culture optimale d’embryon, utiliser le milieu FertiCult IVF avec un pH de
7.20-7.35. Les différentes éléments comme la concentration de CO2, dans
l’incubateur et la pression atmosphérique (qui réduit sur les altitudes plus hautes) ont
tous un effet sur le pH après l’équilibration dans l’incubateur1.
Nous conseillons donc vivement de mesurer le pH dans des conditions de culture
avec 5-6% CO2 dans l’incubateur pour déterminer les environs de la concentration de
CO2 dans l’incubateur qui se résulte dans un pH optimale de 7.20-7.35.
AVERTISSEMENTS ET MESURES DE SÉCURITÉ
Les mesures standard pour prévenir les infections résultant de l’utilisation de
médicaments préparés à partir de sang ou de plasma humains incluent la sélection
des donneurs, la recherche de marqueurs spécifiques d’infection sur les dons
individuels et les mélanges de plasma et l’inclusion d’étapes de fabrication efficaces
pour l’inactivation/élimination virale. Toutefois, lorsque des médicaments préparés à
partir de sang ou de plasma humains sont administrés, la possibilité de transmission
d’agents infectieux ne peut être pas totalement exclue. Ceci s’applique également aux
virus inconnus ou émergents et autres agents pathogènes. Aucune transmission de
virus n’a été rapportée avec l’albumine fabriquée conformément aux spécifications de
la pharmacopée européenne selon les procédés établis. Il faut manipuler les
spécimens dans les conditions prévues pour les agents susceptibles de transmettre le
VIH ou l’hépatite.Il convient de toujours porter des vêtements de protection lors de la
manipulation des spécimens. Il faut veiller à toujours travailler dans les conditions
d’hygiène stricte (par exemple, poste de travail avec de laminaire classe ISO 5) pour
éviter une éventuelle contamination, même si le milieu FertiCult FIV contient du
gentamicine.