Livret de TP – Méthodes

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Université de Nice Sophia Antipolis- Livret de TP - Méthodes
Livret de TP – Méthodes
Licence Sciences de la Vie et de la Santé
LIVRET DE TRAVAUX PRATIQUES - METHODES
TABLE DES MATIERES
Bonnes pratiques de laboratoire.................................................................................................................................................3
Verrerie et matériel pour la mesure de volumes........................................................................................................................4
Pipetman ......................................................................................................................................................................................5
Dilutions simples - Dilutions en série..........................................................................................................................................6
Autres expressions courantes pour les solutions ......................................................................................................................7
Préparation de solution tampon..................................................................................................................................................8
Utilisation du pH-mètre ................................................................................................................................................................9
Spectrophotomètre ....................................................................................................................................................................10
Spectrophotométrie pratique.....................................................................................................................................................11
Electrophorèse...........................................................................................................................................................................12
Utilisation du microscope optique (= photonique)....................................................................................................................13
Recommandations pour les dessins d’observation .................................................................................................................14
Notes personnelles....................................................................................................................................................................16
2
BONNES PRATIQUES DE LABORATOIRE
- Mettre sa blouse
- elle protège des produits toxiques, corrosifs
- l’enseignant est responsable en cas d’accident aggravé par l’absence de blouse
Aucun étudiant ne peut-être accepté sans blouse en salle de TP
- Organiser son plan de travail :
- laisser un espace sans feuille ni crayon pour pouvoir manipuler librement.
- Organiser son travail :
- Lire le protocole avant de venir en TP
- Dans le cas de TP en binôme, répartir le travail équitablement entre les 2 personnes
- Noter et respecter les consignes de sécurité (travail sous hotte chimique, port de lunettes ou de gants
de protection) mettre les déchets toxiques dans les poubelles prévues à cet effet).
Lire les étiquettes des produits et connaître les symboles de toxicité :
er
Anciens pictogrammes (totalement remplacés au plus tard le 1 juin 2015)
Nouveaux pictogrammes (depuis le 20 janvier 2009)
3
VERRERIE ET MATERIEL POUR LA MESURE DE VOLUMES
Pour une mesure exacte, choisir l’instrument de plus petit volume qui permet de prélever la quantité
souhaitée en une seule fois.
Exemples : pour prélever 3 mL, utiliser une pipette de 5 mL, et non pas 3 fois une pipette de 1 mL, cela
multiplie par 3 l'erreur. Pour prélever 250 µL, utiliser le pipetman de 1000 µL ou P1000.
Eprouvettes : 25 mL, 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1 L.
Lire le volume à la base du ménisque
Pipettes : 2 mL ; 5mL ; 10 mL ; 25 mL, en verre ou en plastique.
Prélever à l’aide d’une propipette (ou poire d'aspiration)
Vider l ’air bille haut
Tenir toujours la pipette vers le bas (pour
Tenir toujours la pipette vers le bas (pour
éviter la remontée des produits dans la
éviter
la remont ée des produits dans la
poire
d'aspiration)
propipette ).
Aspirer bille centrale
Vider la solution bille
latérale
En cas de probl ème avec la « poire »
à
En cas de problème de fonctionnement,
PASFORCER.
FORCER.Demander
Demanderà
NENEPAS
l’enseignant
de replacer
les billes.
l'enseignant
de replacer
les billes.
Vider la poire (bille du haut)
Plonger la pointe de la pipette 1 à 2 cm dans le liquide à prélever.
Aspirer au moins le volume souhaité (bille centrale).
En cas d'excès, sortir la pointe de la pipette du liquide, l'appliquer sur la paroi et ajuster le volume en
pressant doucement la bille latérale. Le volume est lu en tenant la pipette verticale, et en plaçant le
ménisque à hauteur des yeux.
Délivrer le volume en appliquant la pointe de pipette sur la paroi du récipient (bille latérale). A la fin, une
goutte reste toujours dans la pipette. C’EST NORMAL et comptabilisé dans le volume prédéfini. Ne pas
chercher à l’évacuer.
Micropipettes ou "pipetmans" : 20 µL, 200 µL, 1000 µL. Voir fiche spécifique
AUTRES ELEMENTS DE VERRERIE COURANTE
Béchers : de 25 mL à 2 L. La graduation de ces récipients est approximative. Ils ne sont pas adaptés pour
mesurer un volume précis de solution. On les emploie pour faire des mélanges (avec agitateur magnétique),
des mesures (pH-mètre).
Erlenmeyers : de 50 mL à 4 L. La graduation de ces récipients est approximative. On les emploie pour les
incubations de cultures sous agitation.
4
PIPETMAN
La micropipette, ou pipetman, permet de délivrer de façon
reproductible des microvolumes.
Elle renferme un mécanisme à piston très sensible à la
corrosion. Elle doit toujours être tenue verticalement afin
de ne pas faire entrer de liquide dedans.
Il existe différents modèles dont les plus courants sont :
Modèle
P20
P200
P1000
Cône adapté
Jaune
Jaune
Bleu
Gamme de volumes
1-20 µL
20-200 µL
100 µL à 1 mL (1000 µL)
Utilisation
Ajuster le volume désiré avec la molette de réglage
Exemples d'affichage du volume
P20
P200
P1000
0
2
5
1
4
7
0
3
8
2,5 µL
147 µL
380 µL
Placer le corps dans la paume de la main de façon à pouvoir presser le piston avec le pouce.
Placer à l'extrémité du pipetman un cône à usage unique adapté au modèle de pipetman (ne pas toucher
l'extrémité avec les doigts)
Presser le piston jusqu'à la première butée
Plonger le cône de quelques mm dans le liquide à prélever
Relâcher doucement le piston de façon à faire monter le liquide sans créer de bulles ou d'aérosol.
Placer le cône contre la paroi près du fond du tube ou de la surface où le liquide doit être apporté
Presser jusqu'à la première butée et marquer un temps
Si tout le volume n'est pas délivré, enfoncer un peu plus le piston
Retirer le pipetman du tube avant de relâcher le piston (doucement)
Enlever le cône soit à l'éjecteur, soit à la main en "dévissant" pour éviter les aérosols, sources de
contaminations (très important pour la PCR)
Précautions
Ne pas tenir par l'embout porte-cône : la chaleur de la main dilate l'air à l'intérieur et fausse le volume
prélevé.
Ne pas poser à plat ou tenir pointe en l'air une pipette avec le cône contenant du liquide : risque de corrosion
du mécanisme.
En cas d'aspiration accidentelle de liquide dans le corps du pipetman, ou de mauvais fonctionnement (le
liquide ne tient pas dans le cône lorsque le piston est relâché), avertir un enseignant.
5
DILUTIONS SIMPLES - DILUTIONS EN SERIE
Les dilutions augmentent le volume d'une solution en ajoutant du solvant, sans changer la quantité de
soluté. La dilution abaisse la concentration de soluté.
Pour visualiser cela, penser à un verre de sirop : le sirop est très concentré en sucre; le boire tel quel n'est
pas agréable. Si on met 1 cL de sirop dans un verre et qu'on ajoute 15 cL d'eau, on dilue ce sirop 16 fois (le
volume total devient 16 cL) et c'est beaucoup plus agréable à boire : le sucre est dilué 16 fois. Mais quand
on a bu tout le verre, on a avalé la même quantité de sucre que si on avait bu directement 1 cL de sirop pur.
La quantité de soluté n'est pas changée par la dilution.
La concentration peut avoir deux expressions :
Concentration molaire :
Concentration massique :
-1
C = n/V (exprimée en mol.L )
-1
C = m/V (exprimée en g.L )
1. Dilutions simples
Dans la plupart des protocoles expérimentaux, on doit préparer des solutions diluées de volume final Vf et de
concentration finale Cf à partir de solutions de concentration initiale Ci plus élevée (solutions "stocks" ou
solutions "mères"). Le raisonnement à tenir est que la quantité de soluté présente dans la solution finale
sera la même que celle à prélever dans la solution stock.
Cette quantité est
un nombre de moles
une masse
n = CV si C est une concentration molaire
m = CV si C est une concentration massique
Dans le cas d'une solution exprimée en concentration molaire, la quantité de soluté
ni = nf soit CiVi = CfVf
Ci : concentration initiale (disponible avant dilution)
Vi : volume initial (à prélever pour réaliser la dilution)
Cf : concentration finale (à atteindre après dilution)
Vf : volume final total (Vf = V diluant + Vi)
D'où le volume à prélever de solution stock
Vi = (CfVf)/Ci
Nomenclature : dilution - facteur de dilution
Le rapport Vi/Vf correspond à la dilution d. Dans l'exemple du sirop, d = Vi/Vf = 1/16. On a fait une dilution au
ème
1/16 .
L'inverse de d, Vf/Vi est le facteur de dilution f. Dans le même exemple, f = Vf/Vi = 16. Le sirop est dilué d'un
facteur 16.
2. Dilutions en série ou dilution en progression géométrique
On peut être amené à faire des dilutions très grandes, par exemple pour dénombrer les bactéries présentes
dans une culture. On compte le nombre de colonies formées à partir d'une dilution sur une boîte de milieu
gélosé. On peut au maximum isoler entre 1000 et 10000 colonies sur gélose. Une culture saturée peut
9
5
contenir plus de 10 bactéries par mL. Il faut donc la diluer au moins d'un facteur 10 (100 000). On a le
choix entre :
- Prélever 1 mL de culture et la diluer dans 100 000 mL de milieu (100 litres !)
- Prélever 0, 00001 mL(un centième de microlitre !) de culture et la diluer dans 1 mL
- Faire des dilutions en série
Les deux premières options sont inapplicables (consommation de milieu, problème de récipients pour la
première, imprécision des pipettes pour la seconde).
La dilution en série est un moyen pratique et fiable pour réaliser une grande dilution. On dilue la solution S0
d'un facteur f choisi pour obtenir la solution S1, puis on dilue S1 du même facteur f pour obtenir S2 et on
répète cela jusqu'à atteindre la dilution souhaitée. Le facteur de dilution final est le produit des facteurs de
dilution de chaque étape.
n
C1=C0/f, C2=C1/f, C3=C2/f etc… d'où C n=C0/f
Dans l'exemple des bactéries, on réalise classiquement des dilutions en série d'un facteur 10 (1 volume de
ème
ème
ème
solution à diluer + 9 volumes de diluant). Les dilutions successives 1/10
, 1/100
, 1/1000
etc…sont
ainsi facilement obtenues.
6
3. Réalisation pratique d’une dilution en série
Préparer le tableau de dilutions avant de commencer les manipulations
Annoter les tubes soigneusement
Mettre dans chaque tube un volume identique de solvant
Ajouter dans le tube 1 le volume de solution Vdil préalablement défini en plongeant uniquement l’extrémité
du cône dans le solvant.
Homogénéiser soit par 3 aspirations–refoulements à la pipette, soit par retournement du tube bouché, soit
par agitation (vortex) en évitant la formation de bulles ou de mousse.
Sans changer de cône, reprendre dans le tube 1 le volume de solution Vdil et le délivrer dans le tube 2
comme précédemment.
Homogénéiser.
Reprendre dans le tube 2 le même volume de solution Vdil et le délivrer dans le tube 3.
Procéder ainsi jusqu’au dernier tube de la gamme de dilutions.
Cette méthode ne nécessite pas de changer de cône à chaque pipetage bien que l'on aille des solutions les
plus concentrées vers les plus diluées car on considère que l'erreur sur le volume est négligeable. De plus,
cette erreur est reproduite à l'identique à chaque dilution. Ainsi, la progression géométrique est assurée.
Pour déposer les dilutions, partir de la plus diluée et procéder sans changer de cône.
Exemple de tableau de dilutions d'une culture bactérienne saturée
Nom de la
Solution
S0
S1
S2
S4
S5
S6
S7
S8
S9
Volume de
solvant (mL)
9
9
9
9
9
9
9
9
Volume de
solution
ajoutée (mL)
Solution
ajoutée
S0
S1
S2
S4
S5
S6
S7
S8
1
1
1
1
1
1
1
1
Dilution par
rapport à S0
1
ème
1/10
ème
1/100
ème
1/1000
ème
1/10000
ème
1/100000
ème
1/1000000
ème
1/10000000
ème
1/100000000
Bactéries/mL
9
10
8
10
7
10
6
10
5
10
4
10
3
10
2
10
10
AUTRES EXPRESSIONS COURANTES POUR LES SOLUTIONS
Le pourcentage. Une solution à 2% correspond à 2g de soluté pour 100mL de solvant.
Le facteur de concentration. Une solution mère notée 50x doit être diluée 50 fois pour être utilisée.
7
PREPARATION DE SOLUTION TAMPON
- Choix du tampon :
Une solution acide faible/base faible, acide fort/base faible ou acide faible/base forte, sera tamponnée si le
pH de la solution est proche de la valeur du pKa du couple acido-basique utilisé.
Pour préparer une solution tampon on choisira donc un couple acide/base dont le pKa est proche de la
valeur tampon qui nous intéresse.
* Concrètement, il faut utiliser un couple acide/base dont le pKa ne s’écarte pas de plus d’1 unité du
pH de la solution tampon à obtenir.
* La concentration des tampons doit être comprise entre 0,1 et 10M. Pour simplifier, on pourra
préparer des solutions tampon à 1M et les diluer à la concentration choisie avant utilisation.
- Pour une solution tampon acide, on choisit classiquement
+
Le couple CH3COOH/CH3COO Na , de pKa = 4,8
- Pour se rapprocher du pH physiologique, on choisit classiquement
Le couple NaH2PO4/Na2HPO4, de pKa = 6,86
Le couple Tris/HCl, de pKa = 8,1
- Dans les cas d’une solution d’acide faible et de sa base conjuguée, on aura une solution tampon
pour nA=nB ou C AVA=CBVB. Il est donc possible de déterminer les volumes de l’acide et de la base à mettre
d’après l’équation d’Henderson-Hasselbach :
pH = pKa+log [B]/[A]
Il a été ainsi défini les volumes suivants de NaH2PO4 1M et de Na2HPO4 1M à mélanger à 900 mL d'H2O
pour obtenir 1L de solution tampon 0,1M :
pH final
6,2
6,6
6,8
7,0
7,2
7,4
7,8
Volume de Na2HPO4 (mL)
17,8
35,2
46,3
57,7
68,4
77,4
89,6
Volume de NaH2PO4 (mL)
82,2
64,8
53,7
42,3
31,6
22,6
10,4
- Dans le cas d’une solution acide faible/base forte ou acide fort/base faible, il s’agira d’ajuster le pH à
l’aide de l’acide ou la base appropriée.
* Exemple pour préparer 500 ml de tampon Tris 1M pH 7,2 (pKa = 8,1 ; les tampons Tris ont un pH variant
généralement de 7 à 9). PM tris = 121,14.
* Prélever Vfinal(L) * Molaritéfinale(mol/L) * PMtris (g/L) = 0,5 * 1 * 121,14 = 60,57 g de Tris base
* Dissoudre dans un becher le Tris dans la moitié du volume final souhaité (250 ml) à l’aide d’eau distillée.
* Ajuster le pH à l’aide d’une solution d’HCl 1 N.
* Transvaser en éprouvette graduée et ajuster le volume à 500 ml à l’aide d’H2O distillée.
8
UTILISATION DU PH-METRE
Un pH-mètre est un voltmètre dédié à la mesure du pH des solutions aqueuses. Il est constitué d’un boîtier
électronique qui indique la valeur du pH et d'une sonde renfermant 2 électrodes que l'on plonge dans la
solution aqueuse dont on veut mesurer le pH. Ces deux électrodes sont à l'intérieur d'un tube de verre
+
microporeux, ce qui permet aux ions H3O de diffuser de la solution mesurée vers l'intérieur de la sonde. Les
électrodes d’un pH-mètre sont fragiles. La sonde doit toujours être immergée dans une solution aqueuse.
Avant et après utilisation, la sonde est conservée immergée dans une solution de forte salinité
(généralement KCl).
Principe : Le pH-mètre mesure la différence de potentiel ΔE entre une électrode de potentiel constant
(l'électrode de référence) et une électrode dont le potentiel dépend du pH (l'électrode de verre ou de
mesure). La différence de potentiel est une fonction affine décroissante du pH :
ΔE = a – b.pH
où a et b sont des constantes qui dépendent de la nature des électrodes, des solutions dans lesquelles elles
sont immergées et de la température. Les valeurs de a et b sont ajustées par l'étalonnage du pH-mètre.
L'appareil calcule et affiche directement la valeur du pH : pH = (a-ΔE)/b
Utilisation : Elle se fait en 3 temps.
er
1 temps : étalonnage en température.
Sur les modèles manuels, on entre la valeur de température à laquelle se font les mesures (généralement, la
température de la salle). Les pH-mètres modernes possèdent une sonde de température installée dans la
sonde de verre et font cet étalonnage automatiquement.
ème
2
temps : étalonnage en pH (à l'aide de 2 ou 3 solutions commerciales de pH fixé, encadrant le pH que
l'on souhaite mesurer.
Rincer la sonde à l'eau distillée, et assécher l'excès d'eau à l'aide d'un papier absorbant. Immerger la sonde
dans la première solution d'étalonnage (par exemple pH = 10) sous agitation magnétique. Attendre que la
valeur de pH se stabilise et régler manuellement à 10.
Répéter ces opérations avec les solutions de pH = 7 et pH = 4.
ème
3
temps : mesure de la solution, ajustement du pH
Rincer la sonde à l'eau distillée, et assécher l'excès d'eau à l'aide d'un papier absorbant. Immerger la sonde
dans la solution que l'on souhaite mesurer ou ajuster, sous agitation magnétique. Après stabilisation de la
valeur affichée par le pH-mètre, ajouter l’acide ou la base petit à petit à l’aide d’une pipette pasteur. Attendre
la stabilisation de la valeur mesurée avant d’ajouter une autre quantité d’acide/base.
Attendre environ 5 min pour considérer le dernier pH obtenu comme définitif.
En fin de mesure, la sonde est lavée à l'eau distillée et replacée dans la solution de KCl pour être
conservée.
Transvaser la solution en préparation dans une éprouvette graduée et ajuster au volume final souhaité avec
de l’eau distillée.
9
SPECTROPHOTOMETRE
Absorption de la lumière par les solutions - Absorbance
Le spectre électromagnétique a été divisé en 6 gammes de longueur d’onde différentes en fonction des
domaines d’utilisation. Le spectre visible comprend les longueurs d'onde comprises entre 400 nm et 800 nm.
Au-dessous de 400 nm, ce sont les ultra-violets (UV), au-dessus de 800 nm, ce sont les infra-rouges (IR).
La radiation électromagnétique est associée à un champ magnétique oscillant et un champ électrique de
forme sinusoïdale, d’énergie E = hν = h.c/λ
(h = constante de Planck, c = vitesse de la lumière, λ = distance entre 2 oscillations ou longueur d'onde)
Lorsqu’une radiation associée à une certaine énergie rencontre une molécule, la molécule peut absorber
cette énergie. Son organisation (atomes constituants, types de liaisons chimiques, présence d'électrons
délocalisés) détermine quelles énergies elle peut absorber.
Ainsi, certaines molécules en solution absorbent une partie du spectre visible : on les voit colorées. Elles
réfléchissent les longueurs d’onde non absorbées. D'autres, comme l'ADN ou certaines protéines, absorbent
dans l'UV. La solution paraît incolore.
On utilise cette propriété d'absorption pour mesurer leur concentration à l'aide d'un spectrophotomètre.
Principe : Une source de lumière (blanche pour le visible, lampe à mercure pour l'UV) traverse un dispositif
qui sélectionne une longueur d'onde λ. Le faisceau de lumière monochromatique d'intensité I0 traverse
l'échantillon. Un capteur transforme l'intensité lumineuse sortante I en signal électrique. Un analyseur
mesure le signal électrique et affiche la valeur de l'absorbance.
L'absorbance ou densité optique (DO) est définie par A = log10 (I0/I). C'est une grandeur logarithmique,
sans dimension. Le tableau ci-dessous indique quelques correspondances entre A et I0/I.
Absorbance (A)
% de lumière transmise (I0/I x 100)
0
100%
1
10%
Pour une solution donnée, on détermine la longueur d'onde
d’absorption maximale λ max à laquelle on effectuera la mesure
grâce à la réalisation d'un spectre d'absorption : la solution est
soumise à un faisceau dont on fait varier la longueur d'onde. Le
profil d'absorption d'une solution de protéines a l'allure suivante :
On mesurera donc la concentration des protéines à 280 nm.
10
2
1%
SPECTROPHOTOMETRIE PRATIQUE
L'intensité de la lumière diminue exponentiellement au fur et à mesure qu'elle traverse l'échantillon.
Cette absorption dépend du nombre de molécules de la substance absorbante présentes dans le trajet
lumineux.
L'absorbance est directement proportionnelle à la concentration c. C'est la loi de Beer-Lambert .
A = log10 (I0/I) = ε.l.c
-1
-1
ε = Coefficient d'extinction molaire, spécifique de la substance absorbante. ε est exprimé en M cm
l = longueur du trajet optique dans la cuve (exprimé en cm)
c = Concentration de la substance absorbante (exprimée en moles/L)
Application
Utilisation des cuvettes
Choisir le type de cuvette adapté à la longeur d'onde :
quartz pour les ultra-violets (190 - 400 nm), verre ou plastique pour le visible (400 nm - 800 nm)
Tenir la cuvette par les faces dépolies, jamais par les faces transparentes (les traces de doigts faussent la
lecture).
Manipuler avec précaution : cuvette quartz = 50 €, cuvette verre = 20 €, cuvette plastique = 0,1 €
Remplir la cuvette avec le volume adapté et enlever les bulles d'air: le faisceau lumineux doit traverser un
milieu homogène. Bien s'assurer que le niveau du liquide est suffisant pour que le faisceau passe sous le
ménisque.
Mesure
Spectrophotomètre monofaisceau : la mesure se fait en 2 temps.
1. réglage du zéro ou "blanc". On mesure l'absorbance de l'ensemble {cuvette + solvant} sans le soluté
puis on donne à l'absorbance correspondante la valeur zéro : Acuvette+solvant = 0
2. mesure de l'échantillon {cuvette + solvant + soluté}. L'appareil indique une absorbance Aéchantillon
Aéchantillon = Acuvette + solvant + soluté
Aéchantillon = Acuvette+solvant + Asoluté .Comme on a donné la valeur zéro à Acuvette+solvant
Aéchantillon = Asoluté
Spectrophotomètre bi-faisceau : un second faisceau identique au premier traverse une cuvette contrôle
contenant le solvant seul. L'absorbance affichée est directement la différence Aéchantillon – Acontrôle = Asoluté
Veiller à toujours se placer dans la gamme des absorbances entre 0,1 et 1
!
La loi de Beer-Lambert ne s’applique que pour des solutions faiblement concentrées. Pour une
solution donnée, le domaine de concentration où cette loi s'applique doit être défini en réalisant une gamme
étalon : on mesure l'absorbance d'une série de solutions de concentrations croissantes connues. Le
domaine de validité correspond aux valeurs pour lesquelles l'absorbance croît de façon linéaire avec la
concentration.
Détermination de concentration d'une solution inconnue
On réalise d'abord une courbe d'étalonnage du spectrophotomètre à partir de solutions de concentration
croissante de l'espèce à déterminer, couvrant l'intervalle d'absorbance de 0 à 1.
On mesure l'échantillon inconnu soit pur, soit dilué d'un facteur connu afin de se trouver dans la gamme
d'absorbance 0,1<A<1 et on en déduit sa concentration en se reportant à la courbe d'étalonnage.
11
ELECTROPHORESE
Principe
L'électrophorèse est une technique de séparation de molécules en solution basée sur leur différence de
mobilité dans un champ électrique. Un mélange de molécules est soumis à un champ électrique, ce qui
entraîne la migration des molécules chargées. La vitesse de migration dépend de plusieurs paramètres :
charge, masse, forme, nature du support, pH, température).
Supports d'électrophorèse
L'électrophorèse utilise un support solide, chimiquement inerte vis-à-vis des espèces que l'on désire séparer.
Il doit avoir les propriétés d'un tamis moléculaire et maintenir les molécules en place pour les révéler en fin
d'expérience.
Les plus courants sont les gels d'agarose et les gels de polyacrylamide qui ont supplanté les supports papier
ou acétate de cellulose. Sur ces derniers, la migration a lieu à la surface du support imbibé d'une pellicule de
solution tampon. Dans les gels d'agarose et de polyacrylamide, la migration s'effectue dans l'épaisseur du
gel, ce qui offre une plus grande capacité et une meilleure séparation.
Le choix du support est dicté par la nature des molécules à séparer. Les gels forment un tamis moléculaire
tridimensionnel. Les molécules progressent dans les espaces libres du tamis. Plus ces molécules sont
encombrantes, plus leur progression est difficile et lente. Au-delà d'un encombrement, toute migration est
impossible : c'est la limite supérieure de séparation. Au contraire, les très petites molécules passent
librement les pores et sont mal séparées. On adaptera le maillage ou la réticulation du tamis en fonction des
tailles de molécules que l'on veut séparer.
Exemples
Molécule
Taille
Type de
gel
%
ADN
1-20 kb
0,5-5 kb
0,1-2 kb
Agarose
0,8%
1%
2%
Protéines
30-500
1-100
pb
pb
Polyacrylamide
4%
8%
40-400
kDa
7,5%
20-200
10-100
kDa
kDa
Polyacrylamide
10%
12%
2-40
kDa
15%
Mise en œuvre
Le gel est préparé dans un tampon adapté et coulé à l'état liquide sur un support adapté : horizontal pour
l'agarose, vertical pour le polyacrylamide. Un peigne destiné à former les puits de dépôt est mis en place et
laissé jusqu'à solidification du gel. Il est alors retiré et le gel est placé dans une cuve, remplie de tampon et
munie de deux électrodes reliées à un générateur. Les échantillons sont déposés ainsi qu'une référence (ou
marqueur de taille). L'électrophorèse est lancée en faisant passer un courant adapté (ampérage, voltage)
pendant une durée déterminée. Le gel est démonté, coloré pour révéler les molécules d'intérêt et
photographié.
Exemples de gel : Système pour protéines
Système pour ADN
12
UTILISATION DU MICROSCOPE OPTIQUE (= PHOTONIQUE)
oculaire
tube optique
tourelle
objectif
potence
platine
valet
vis macrométrique
vis micrométrique
ouverture diaphragme
diaphragme
lumière
réglage lumière
alimentation
socle
1. Préparation du microscope
- Placer la potence du microscope face à soi.
- Brancher l’alimentation.
- Vérifier que le plus petit objectif (x4 ou x10 selon le modèle) est placé sous le tube optique.
- Allumer la lampe (en tournant le bouton de réglage de la lumière).
2. Mise en place de la préparation microscopique
- Placer la préparation microscopique sur la platine (lamelle vers le haut)
- Fixer la préparation avec les valets.
- Placer la zone à observer au centre de la platine (au dessus de la lumière).
3. Mise au point
- Regarder à travers le ou les oculaires tout en remontant lentement la platine avec la vis macrométrique
jusqu’à ce que l’image soit nette.
- Régler les oculaires à sa vision (pour modèles binoculaires) : régler l'écartement et faire la netteté avec
l'oculaire fixe, puis mettre au point l'autre oculaire avec la bague de réglage.
- Affiner la mise au point avec la vis micrométrique.
- Régler l’intensité de la lumière et le contraste en tournant le diaphragme.
4. Augmenter le grossissement
- Faire tourner les objectifs jusqu’à obtenir le grossissement désiré.
- Affiner la mise au point.
5. Pour calculer le grossissement
Multiplier le grossissement de l’oculaire par celui de l’objectif.
5. A la fin de la séance
- Baisser la platine.
- Remettre les objectifs sur la position de plus faible grossissement.
- Eteindre la lampe.
- Débrancher l’alimentation.
- Recouvrir le microscope avec sa housse.
13
RECOMMANDATIONS POUR LES DESSINS D’OBSERVATION
Choisir un papier à grain fin, de type papier “machine”, format A4. Tout doit être réalisé au crayon HB taillé.
Mettre le nom, le prénom et le groupe sur chaque feuille.
Toujours mettre une page de garde : page de « sommaire » du TP, comprenant le titre du TP, les titres des dessins
et d’éventuelles précisions que vous souhaitez voir figurer.
Ne mettre qu’un dessin par page (le recto verso est autorisé).
LE TITRE
Le titre doit être centré et comporter :
- la nature de la représentation : dessin, schéma, etc.
- la nature de l’observation : coupe transversale, coupe longitudinale, morphologie générale, phase
particulière (ex. sporulation mitotique) ou directement nom de ce qui est observé (ex : zygospore),
- les noms de genre et d’espèce (sp. si l’espèce n’est pas connue) soulignés
NB : La première lettre du premier terme (le nom de genre) s'écrit en majuscule et tout le reste en minuscules, ainsi
que le groupe de l'organisme considéré (ex : Polypodium vulgare (Filicopsida), ou Polypodium sp. (Filicopsida)).
- la méthode d’observation (observé à l’œil nu, à la loupe binoculaire, au microscope optique).
- L’origine de la lame: préparation commerciale, préparation personnelle.
Exemples : Dessin d’observation d’une coupe transversale dans un rhizome de Polypodium vulgare (Filicopsida) au
microscope optique. Préparation personnelle.
Dessin d’observation de la morphologie générale d’un Polypodium sp. (Filicopsida) à l’œil nu.
LE DESSIN
Toujours centrer le dessin
S’efforcer d’observer dans le microscope « en même temps » que l’on dessine, et non alternativement (pas 5 min
d’observation puis 5 min de dessin).
Afin de bien voir les contours cellulaires et l’épaisseur des parois, il est nécessaire de faire varier constamment la
mise au point avec la vis micrométrique, ainsi que le contraste à l'aide du diaphragme.
Respecter les proportions entre les différentes parties du dessin
Concernant la représentation des cellules :
- Au faible grossissement, jouer sur l’épaisseur du trait de crayon pour représenter les parois plus ou moins épaisses
- Au fort grossissement, représenter les parois épaissies par deux traits distincts (un trait pour la limite interne et un
pour la limite externe), la paroi ayant toujours une épaisseur constante (sauf cas particulier)
Dessiner les cellules d'épithélium bien collées les unes aux autres (pas de vide entre elles). Ne pas faire chevaucher
les parois des cellules. Représenter chaque cellule indépendamment de sa voisine
Ne pas oublier d’indiquer une partie des parois voisines et de leurs épaississements éventuels en limite de votre
dessin, pour montrer que ce n’est pas une limite naturelle, mais un “extrait” du tissu comme si vous l’aviez coupé avec
une paire de ciseaux.
NE PAS GRISER NI HACHURER ! Autrement dit, ne pas représenter les ombres ou les zones plus sombres dans les
tissus ou cellules en grisant ou hachurant des zones
LES LEGENDES
Ne pas croiser les flèches.
Les flèches sont des traits simples, horizontaux (sauf si c’est impossible), à la règle, ne se terminant pas par "->".
Placer les légendes en dehors du dessin (en général à droite),
Les légendes doivent êtres brèves mais précises et complètes, écrites lisiblement, bien orthographiées et
horizontalement (prenez l’habitude de glisser sous votre feuille de papier une feuille quadrillée).
LE GROSSISSEMENT / L’ECHELLE
Grossissement (microscope, loupe binoculaire):
Dans le titre ou en dessous du titre, mentionner l’oculaire et l’objectif. Ex : G = oc. 10 x obj. 40
Echelle (microscope, loupe binoculaire, œil nu):
1) Mesurer la taille réelle :
- S’il s’agit d’une observation à l’œil nu, mesurer précisément la taille de l’objet dessiné.
- S’il s’agit d’une observation au microscope :
14
o Soit l’objet dessiné est visible à l’œil nu, et peut être mesuré directement à la règle sur la lame.
o Soit l’objet n’est pas visible à l’œil nu, dans ce cas lors de l’observation au microscope, glisser une
pointe de porte-mine (critérium) dont la largeur est connue (en général 0,7 mm, voir ce qui est écrit
sur le porte-mine) entre la lame et l’objectif – si l’espace est suffisant entre lame et objectif ! Ne
pas forcer pour ne pas risquer d’abîmer l’objectif. Evaluer la taille réelle de l’objet.
2) Mesurer la taille du dessin
3) Placer l’échelle. Deux types d’échelles :
- Barre d’1 cm, au dessus de laquelle on fait figurer à combien de cm dans la réalité correspond 1 cm sur le
dessin.
- Barre correspondant à un chiffre rond (1 cm, 10 µm, 50 µm…).
réalité
dessin
5,5 cm
3,5 cm
Réalité (cm)
5,5
?
1
1,6 cm
Dessin (cm)
3,5
1
X
? = 5,5/3,5 = 1,6 cm (à écrire sur la barre)
ou 1 cm
X = 3,5/5,5 = 0,6 cm (taille de la barre)
BILAN et exemple.
15
NOTES PERSONNELLES
16

Livret de TP – Méthodes

Transcription

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