P30 P31 Stéphane Girard 1, 2, Emmanuel Nivet 1, 2

P30
Assemblage moléculaire et fonctions du complexe polycystine
Aurélie Giamarchi1, Lise Rodat-Despoix1, Jizhe Hao1, Tomoko Obara2, Albert Ong3 et Patrick Delmas1.
1
CRN2M, UMR 6231 CNRS, IFR Jean-Roche, Université de la Méditerranée, Marseille.
2
Kidney Genetics Group, University of Sheffield Medical School, Sheffield, UK.
3
Department of Medicine, MetroHealth Medical Center, Cleveland, USA.
La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est la plus fréquente des néphropathies héréditaires.
Cette pathologie se caractérise par la présence de kystes volumineux conduisant, à terme à une insuffisance rénale. La
PKRAD est induite par la mutation des gènes, PKD1 et PKD2, codant respectivement pour la polycystine-1 (PC1), un
récepteur orphelin à 11 segments transmembranaires, et la polycystine-2 (PC2), un membre de la famille des canaux
TRP. Il a été proposé que ces deux protéines s’associent au sein d’un complexe multimoléculaire dans les cils primaires
des cellules épithéliales rénales. La perte de fonction de ces complexes est invoquée dans la PKRAD. Cependant les
fonctions des polycystines ainsi que les mécanismes moléculaires qui soutendent l’assemblage du complexe polycystine
restent encore mal connus. En utilisant différentes approches méthodologiques, nous avons mis en évidence la présence
d’un nouveau domaine coiled-coil situé dans l’extrémité C-terminale de PC2. La comparaison des séquences des PC2
présentes chez différentes espèces (homo, C. elegans, Tribolium, Schistosoma, etc..) montre que ce domaine coiled-coil
est conservé au cours de l’évolution, ce qui suggère qu’il joue un rôle fondamental dans les fonctions de PC2. Nous
montrons que ce domaine est responsable de l’homodimérisation de l’extrémité C-terminale de PC2 mais pas de
l’oligomérisation de la protéine entière. De plus, nous montrons que l’homodimérisation de la région C-terminale de PC2
est une étape indispensable pour la fixation de PC1 et la formation du complexe polycystine. La destruction du domaine
coiled-coil empêche l’assemblage du complexe mais n’altère pas la formation de canaux PC2 fonctionnels au niveau du
réticulum endoplasmique. En accord avec ces données, l’expression chez l’embryon de zebrafish d’ARN messagers
portant des mutations dans le domaine d’homodimérisation de PC2 induit des manifestations kystiques dans le
pronephros du zebrafish. Nos travaux indiquent donc que la dimérisation de l’extrémité C-terminale de la polycystine-2
est une étape essentielle qui participe à la reconnaissance de la polycystine-1 et à la formation du complexe PC1/PC2.
Les mutations affectant ce domaine entraînent la dissociation du complexe et, en conséquence, engagent les cellules vers
un phénotype prolifératif.
P31
Identification par microarray d’ADN, un mois après une lésion
excito-toxique, des molécules émises par
l’hippocampe qui sont potentiellement attractives pour les cellules souches olfactives
Stéphane Girard
Féron 1*
1, 2
, Emmanuel Nivet
1, 2
, Delphine Stephan 1, François.S Roman
2*
, François
1. Laboratoire de Neurobiologie des Interactions Cellulaires et Neuro-physiopathologie (NICN), CNRS UMR 6184.
Faculté de Médecine nord de Marseille, Bd Pierre Dramard 13916, Marseille cedex 20, France
2. Laboratoire de Neurobiologie des Processus Mnésiques, CNRS UMR 6149. Université de Provence 3, place Victor
Hugo 13331 Marseille cedex, France
* Co-superviseurs
Le système nerveux central est sujet à de nombreuses pathologies aux conséquences souvent dramatiques pour
le patient. Les traitements limitant les dommages liés à ces maladies étant peu nombreux, il est envisagé de mettre en
place des stratégies curatives basées sur la thérapie cellulaire. Au rang des candidats les plus prometteurs, figurent les
cellules souches adultes de la muqueuse olfactive. Précédemment, dans un modèle murin de perte cellulaire
hippocampique induite par l’injection d’un agoniste glutamatergique (acide iboténique), nous avons montré que ces
cellules, une fois greffées dans la zone lésée, i) se différencient en neurones ii) améliorent le fonctionnement des réseaux
neuronaux hippocampiques défectueux et iii) favorisent la récupération des capacités mnésiques des souris lésées. Nous
avons également observé que ces cellules migrent spécifiquement vers les zones cérébrales lésées lorsqu’elles sont
transplantées dans i) l’hémisphère controlatéral non lésé ii) le liquide céphalo-rachidien ou encore iii) le sang. Ces flux
migratoires remarquables ont également lieu lorsque la greffe est réalisée un mois après la lésion, durée incompressible
pour des greffes autologues. Les mécanismes moléculaires sous-jacents ne sont pas connus mais des facteurs libérés au
niveau de la zone de lésion et associés aux processus inflammatoires sont fortement suspectés. Afin de déterminer
l’identité de ces molécules, nous avons réalisé, à l’aide de microarrays d’ADN, une étude destinée à comparer le
transcriptome d’hippocampes sains et d’hippocampes lésés. Nous montrons qu’un mois après la lésion les hippocampes
lésés sont toujours le lieu de réactions immunes et inflammatoires. Trois cytokines connues pour leur propriété chimioattractive – CCL2, CXCL10 et ostéopontine - ont été identifiées. La présence de récepteurs pour ces cytokines à la
surface des cellules souches olfactives est actuellement évaluée
P32
Functional consequences of animal-to-animal variation in circuit parameters.
Jean-Marc GOAILLARD
How different are the neuronal circuits for a given behavior across individual animals? To address this question, we
measured multiple cellular and synaptic parameters within individual preparations to see how they correlate with circuit
function, using neurons and synapses within the pyloric circuit of the stomatogastric ganglion (STG) of the crab Cancer
borealis. There was considerable preparation-to-preparation variability in the strength of two identified synapses, in the
amplitude of a modulator-evoked current, and in the expression of six ion channel genes. Nonetheless, across
preparations we found strong correlations among these parameters and attributes of circuit performance. These data
illustrate the importance of making multidimensional measurements from single preparations to understand how
variability in circuit output is related to the variability of multiple circuit parameters.
P33
La vitamine D accroît l’axogenèse, améliore la ventilation consécutive à une fatigue musculaire et diminue
l’hyper-réflexie chez des rats paraplégiques
Yatma Gueye1, John Bianco1,2, Tanguy Marqueste2, Michel Khrestchatisky1, Patrick Decherchi2*, François Féron1*
1. Neurobiologie des Interactions Cellulaires et Neurophysiopathologie, UMR CNRS 6184, Institut Fédératif de
Recherche Jean ROCHE (IFR 11), Faculté de Médecine (secteur Nord), Université de la Méditerranée (Aix-Marseille II),
Marseille, France.
2. Institut des Sciences du Mouvement : Etienne-Jules MAREY, UMR CNRS 6233, Parc Scientifique et technologique
de Luminy, Université de la Méditerranée (Aix-Marseille II), Marseille, France.
* Co-superviseurs
Après lésion de la moelle épinière, des processus tels que i) l’inflammation, ii) la neurodégénération iii) la
formation de la cicatrice gliale iv) et une régénération limitée des axones sont des phénomènes observés dans le site de
lésion. L’objectif est de trouver une molécule, si possible approuvée par la FDA, qui soit capable de limiter ces
processus délétères. Précédemment nous avions montré que la vitamine D présente des propriétés i)
immunomodulatrices, ii) neuroprotectrices, iii) anti-mitotique et iv) neurorégénératrices. Dans une étude utilisant un
modèle de lésion de nerf périphérique de rat nous avions montré que la vitamine D augmente significativement i)
l’axogenèse et le diamètre des fibres axonales et ii) améliore la réponse des fibres sensitives aux métabolites tels que le
KCl et l’acide lactique (Chabas et al, 2008).
Nous avons par la suite choisi de transposer cette étude au système nerveux central. En utilisant un modèle rat
de compression de la moelle épinière au niveau thoracique nous avons administré oralement de la vitamine D3 aux doses
de 50 UI/kg/jour ou 200 UI/kg/jour. Trois mois plus tard, des enregistrements électro-physiologiques (onde M, réflexe
H, fréquence de ventilation) nous ont permis d’évaluer l’efficacité thérapeutique de la vitamine D. Comparés aux
animaux contrôles, lésés et non supplémentés, les animaux traités à la vitamine D présentent une augmentation
significative de leur i) capacité ventilatoire et ii) une diminution de l’hyper-réflexie, observée après un traumatisme de la
moelle épinière. L’analyse histologique des tissus nous a également permis de montrer que la vitamine D favorise la
régénération axonale, avec notamment une augmentation statistiquement significative du nombre de fibres dans les
parties distale et centrale de la lésion.
Notre étude apporte les premières preuves d’une efficacité thérapeutique dans la réparation de la moelle épinière
lésée. Des études complémentaires, portant notamment sur les mécanismes d’action, sont nécessaires pour envisager
d’éventuels essais cliniques.
Référence
Chabas JF, Alluin O, Rao G, Garcia S, Lavaut MN, Risso JJ, Legré R, Magalon G, Khrestchatisky M, Marqueste T,
Decherchi P*, Féron F* (2008) Vitamin D2 potentiates axon regeneration. J. Neurotrauma, 25(10):1247-1256
P34
La transcription circadienne du gène de la prolactine dans la lignée somatolactotrope GH4C1 implique des
cofacteurs rythmiques de protéines de remodelage de la chromatine
Guillaumond F2, Boyer B1, Guillen S1, Kuhn L3, Garin J3, Belghazi M4, Bosler O1, Becquet D1, Franc JL1, FrançoisBellan AM1
1
CRN2M, UMR 6231 CNRS-Université Aix-Marseille II, III, Marseille ; 2 CNRS FRE 3094, Université de Nice-Sophia
Antipolis, Nice ; 3Plateforme EDyP-Service, Grenoble ; 4 Centre d’Analyse Protéomique, IFR Jean-Roche Marseille
Le gène de la prolactine (PRL) est exprimé de manière circadienne à l’intérieur des cellules lactotropes. La séquence
promotrice de ce gène ne contient pourtant pas d’élément de régulation directe par l’oscillateur circadien (séquence
canonique de type E-Box). Notre étude vise à caractériser les mécanismes moléculaires permettant à l’oscillateur
hypophysaire de contrôler la rythmicité circadienne du gène PRL. Pour ce faire, des lignées somatolactotropes GH4C1
exprimant de façon stable le gène rapporteur luciférase sous le contrôle du promoteur humain de la PRL ont été établies
et les éléments de régulation de ce promoteur impliqués dans les oscillations circadiennes ont été identifiés par
mutagenèse dirigée. Les ligands endogènes de ces séquences régulatrices ont été identifiés par bioinformatique, EMSA,
ChIP et isolement sur colonne d’affinité suivi d’une identification en spectrométrie de masse ou en western blot. Nous
montrons que les oscillations circadiennes du promoteur PRL dépendent à la fois d’une séquence de régulation noncanonique de type E-box et d’un des deux sites de régulation (P2) du facteur de transcription Pit-1 présents dans cette
région du promoteur. Nous avons identifié le facteur HLTF (helicase like transcription factor), une protéine de la famille
Swi/Snf (complexes de remodelage de la chromatine), comme le ligand endogène de cette E-Box. HLTF contrôle le
promoteur PRL en régulant les effets de Pit-1 sur son site P2. Ni HLTF, ni Pit-1 ne présentent une expression
circadienne. En revanche, certains partenaires de HLTF identifiés par spectrométrie de masse (sfpq, RBM14, p54nrb and
hnRNP U) s’expriment de façon circadienne dans l’hypophyse de souris avec un pic précédent de 2h celui de la PRL. Le
mécanisme qui permet la rythmicité circadienne de la PRL implique donc le recrutement rythmique de cofacteurs
associés à des protéines de remodelage de la chromatine. Ce mécanisme pourrait permettre aux oscillateurs circadiens de
contrôler la rythmicité de gènes cibles dépourvus de séquence de régulation directe pour les gènes de l’horloge.
P35
La protéine kinase CK2 régule l’assemblage des canaux sodiques au segment initial de l’axone.
Christophe Leterrier1,2, Aline Bréchet1,2, Marie-Pierre Fache1,2, Anna Brachet1,2, Géraldine Feracci2,4, Agnès Baude3,
Marie Irondelle1,2, Sandrine Pereira1,2 et Bénédicte Dargent1,2
1- Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité Mixte de Recherche 641, Marseille F-13916, France
2- Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine Secteur-Nord, Institut Fédératif de Recherche 11, Marseille F13916, France
3- Université de la Méditerranée, Centre National de la Recherche Scientifique, Unité Mixte de Recherche 6231,
Marseille F-13916, France
4- Centre d'Analyse Protéomique de Marseille, Marseille F-13916, France
La génération et la propagation des potentiels d’action le long de l’axone requièrent l’accumulation de canaux
potassiques au segment initial axonal (SIA) et aux nœuds de Ranvier. Nous avons découvert que le motif de liaison à
l’ankyrine du canal Nav1.2 qui dirige son accumulation au SIA dépend de l’état de phosphorylation de résidus sérine
(S1112, S1123, S1124, S1126) phosphorylable par la protéine kinase CK2. Grâce à des expériences de résonnance
plasmon de surface, nous avons montré que la phosphorylation de ces résidus par la CK2 renforce l’interaction entre les
canaux Nav et l’ankyrine. De plus, la protéine CK2 est enrichie au segment initial et aux nœuds de Ranvier in vivo, et
apparaît très tôt lors de l’assemblage de ces compartiments. Ceci permet d’expliquer la concentration sélective des
canaux Nav au SIA par interaction renforcée avec l’ankyrine G présente au SIA, tandis que l’interaction avec l’ankyrine
B présente tout le long de l’axone reste faible. Finalement, l’inhibition chimique de la CK2 provoque un désassemblage
du SIA de neurones jeunes ou matures. La mise au point de méthode moléculaire d’inhibition (ARN interférence) nous
permet à présent de disséquer finement ce nouveau rôle de la CK2 au SIA.
P36
Puces à protéines à finalité biomédicale : application au diagnostic du botulisme
Christian LEVEQUE1,2, Géraldine FERRACCI2, Séverine MARCONI1, Yves MAULET1, Michel Popoff3 et Michael
SEAGAR1
1
INSERM UMR641,2 CAPM/biocapteurs, Institut Jean Roche
CNR Anaérobies et botulisme, Unité Bactéries anaérobies et toxines Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris
Cedex 15
3
Les neurotoxines botuliques (BoNTs) A, B et E constituent une classe de toxines parmi les plus dangereuses
pour l’homme. Elles possèdent une activité endoprotéasique contre les protéines SNARE provoquant un blocage de la
transmission synaptique. L’intoxication provoque des paralysies potentiellement létales en absence d’assistance
respiratoire. Le diagnostic de laboratoire repose actuellement sur un test in vivo chez la souris. Notre objectif est de
développer un test in vitro permettant d’identifier l’activité enzymatique de ces neurotoxines dans des prélèvements
environnementaux ou humains répondant en particulier à un besoin de diagnostic d’urgence.
Nous utilisons un biocapteur optique basé sur la résonance plasmonique de surface pour immuno-détecter de
façon rapide et sensible la présence des substrats clivés par l’une des trois BoNTs. Trois anticorps monoclonaux antisubstrats dirigés contre les antigènes natifs et recombinant ont été générés et deux formats de test expérimentés. Dans le
premier format (puce à anticorps) les neurotoxines sont préincubées avec leurs susbtrats et les substrats clivés quantifiés
lors de l’injection sur les anticorps anti-SNARE. Dans la deuxième approche (puces à antigènes) les solutions contenant
les neurotoxines sont injectées sur les substrats immobilisés et le taux de clivage mesuré à l’aide des anticorps antisubstrats clivés.
Les seuils de détection dans des milieux d’incubation optimisés peuvent atteindre 10 fM pour une durée de test
de l’ordre de 3 heures (soit 10 fois plus sensible et rapide que le test in vivo) et 1 pM pour un test de 10 minutes.
Cette très grande sensibilité nous a permis de détecter la BoNT/B à des concentrations de l’ordre du
picomolaire dans des milieux alimentaires ainsi que dans les sérums provenant de patients atteints de botulisme de type
B (11/11). Ces résultats montrent pour la première fois qu’un test in vitro pourrait potentiellement remplacer le test in
vivo pour le diagnostic du botulisme.
1- A label-free biosensor assay for the detection of botulinum neurotoxin B in food and human serum, 2009, Ferracci G., Marconi S., Mazuet C., Jover E., Seagar M. , Popoff M.,
Lévêque C., (soumis pour publication)
2- A protein chip membrane-capture assay for botulinum neurotoxin activity, 2008, Marconi S., Ferracci G., Berthomieu M., Kozaki S., Miquelis R., Boucraut J., Seagar M., Lévêque C.
Toxicol Appl Pharmacol., 233, 439-446
3- Synaptic vesicle chips to assay botulinum neurotoxins, 2005, Ferracci G., Miquelis R., Kozaki, S., Seagar M., Lévêque C. Biochem. J. 391, 659-666
4- Real time analysis of intact organelles using surface plasmon resonance, 2004, Ferracci G., Seagar M., Courageot J., Miquelis R., Lévêque C., Anal. Biochem. 334, 367-375
P37
Implication du canal sodique Nav1.9 dans la physiopathologie de la douleur inflammatoire
Lolignier S3, Padilla F1, Maingret F1, Gabriac M1, Busserolles J2, Luccarini P2, Dallel R2, Eschalier A3 et Delmas P3
1
UMR 6231, Centre de Neurobiologie et Neurophysiologie de Marseille, Faculté de médecine Nord, IFR Jean Roche,
13916 Marseille
2
EMI 216 INSERM/UA, Laboratoire de Neurobiologie de la Douleur Trigéminale, UFR d'odontologie, 11 Bd Charles
de Gaulle, 63000 Clermont-Ferrand
3
UMR INSERM 766, Laboratoire de Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la Douleur, Université d'Auvergne, 28
pl. H.Dunant, 63001 Clermont-Ferrand
La perception douloureuse est exacerbée lors d'un processus inflammatoire et provoque l'apparition d'un syndrome
d'hypersensibilité. Les mécanismes impliqués dans cette hypersensibilité sont méconnus, mais de nombreuses données
suggèrent l'implication des canaux ioniques voltage-dépendants et en particulier du canal Nav1.9. Des tests
comportementaux ont été réalisés chez des souris sauvages et des souris Nav1.9-/-. L'inflammation aiguë a été mesurée
par le test au formol. L'inflammation sub-aiguë suite à une injection intraplantaire de carragénine a été quantifiée par les
tests de sensibilité mécanique (Von Frey) et de sensibilité thermique (immersion de la patte à 46°C). L'expression du
canal Nav1.9 a été quantifiée chez les souris sauvages par RT-PCR et par immunohistochimie dans les ganglions
rachidiens innervant la patte ipsilatérale 24h après le début de la réaction inflammatoire. Les souris knock-out pour le
canal Nav1.9 montrent une diminution signification de la douleur lors d'une inflammation aiguë par rapport aux souris
sauvages. En condition d'inflammation sub-aiguë, nous observons une diminution des seuils de douleur mécanique et
thermique pour les souris Nav1.9-/- comparativement à la souche sauvage. Toutefois, il n'y a pas de différence au niveau
de l'œdème de la patte. En conclusion, le canal Nav1.9 est impliqué dans la douleur ressentie lors d'un processus
inflammatoire aiguë, ainsi que dans l'hypersensibilité mécanique et thermique induite par une inflammation sub-aiguë.
Le canal ionique voltage-dépendant Nav1.9 apparaît donc comme une cible pharmacologique intéressante pour traiter ce
type de douleur.
P38
La βIV-spectrine et 14-3-3 interagissent de façon dépendante de la CAMKII.
Aurélie Lonigro et Jérôme Devaux
CRN2M, UMR 6231, CNRS-Université de la Méditerranée-Université Paul Cézanne, IFR Jean Roche, Marseille.
Dans les axones myélinisés, les potentiels d’action sont générés au niveau du segment initial des neurones et se
propagent le long de l’axone de façon saltatoire de nœuds de Ranvier en nœuds de Ranvier. L’ankyrine-G et la βIVspectrine sont deux protéines d’ancrage indispensables pour l’agrégation et la stabilisation des canaux ioniques au niveau
des segments initiaux et des nœuds de Ranvier. L’ankyrine-G interagit avec les canaux sodiques dépendants du voltage
(Nav) et KCNQ2, et ancre ces canaux au cytosquelette d’actine via la βIV-spectrine. Afin de révéler de nouveaux
partenaires de la βIV-spectrine, nous avons réalisé un screen en double hybride chez la levure en utilisant la région cterminale de la βIV-spectrine comme appât. Cette étude a identifié 14-3-3η comme partenaire de la βIV-spectrine. Nous
avons identifié un motif consensus de type -RSXSPXP- dans la région c-terminale de la βIV-spectrine et observé que 143-3η interagit avec ce motif. L’interaction entre la βIV-spectrine et 14-3-3η est régulée par la phosphorylation par la
kinase dépendante du calcium/calmoduline de type II (CAMKII). Les isoformes 14-3-3β, γ, et ε sont aussi exprimés dans
le système nerveux et interagissent avec la βIV-spectrine. Dans les neurones hippocampaux, les isoformes 14-3-3η, β, γ,
et ε sont cytosoliques et ne présentent pas de compartimentalisation particulière. Toutefois, la co-expression avec la βIVspectrine permet le recrutement des isoformes 14-3-3 aux segments initiaux. Les isoformes 14-3-3 sont connues pour
jouer un rôle important dans l’adressage membranaire de certains canaux potassiques. Nous avons démontré qu’ils
interagissent avec le domaine cytosolique des canaux KCNQ2/KCNQ3. En Conclusion, nos travaux ont identifié un
nouveau partenaire de la βIV-spectrine qui pourrait jouer un rôle important dans l’adressage des canaux ioniques
axonaux.
P39
On the mechanisms of Nav1.9 channel upregulation
François Maingret1, Bertrand Coste1, Patrick Delmas1
1
CRN2M, UMR 6231, Equipe Canaux ioniques et transduction sensorielle
A variety of different Na+ channel subunits (Nav) are expressed in the subset of primary afferent neurons involved in the
generation of pain sensation. Among them Nav1.9 is selectively expressed in nociceptive dorsal root ganglion (DRG)
neurons and in C- and Aδ-fibers innervating the cornea, the lip skin and the dental pulp. Nav1.9 channel give rise to a
prominent persistent Na+ current with slow activation kinetics at subthreshold voltages. We have previously shown that
the concerted action of inflammatory mediators, including bradykinin, prostaglandin E2, histamine, norepinephrine and
ATP, up regulates Nav1.9 channel activity and lowers threshold for excitability, which likely contributes to nociceptor
hyperexcitability during inflammation. In the present study we have investigated the mechanisms leading to Nav1.9
channel up regulation. In control experiments (patch pipette solution containing 130 mM CsCl, 4 mM ATP, 0.4 mM
GTP), Nav1.9 current amplitude remains small and relatively stable over 30 min recording. The up regulation of Nav1.9
current is achieved by substituting either GTP with GTPγ-S (a non hydrolysable analogue of GTP) or CsCl with CsF (30
mM) in the patch pipette solution. In both conditions Nav1.9 current is up regulated several minutes after breakthrough,
(respectively 11.5 ± 2.1 min, n=8 and 8.7 ± 2.6 min, n=15). Interestingly, we show that Nav1.9 channel activity is also
up regulated when ATP is omitted in the patch pipette solution. However the up regulation of Nav1.9 current occurs
more slowly compared to both CsF and GTPγ-S conditions (20 ± 1.5 min after breakthrough, n=9). We have shown that
the up regulation of Nav1.9 channel resulted from a negative shift of activation curve. The up regulation of Nav1.9
current is transient as a decrease of current amplitude follows the increase. The current amplitude which declined at the
holding potential (-100 mV) could be recovered by changing the holding potential to more hyperpolarized levels. We
have demonstrated that the down regulation of Nav1.9 current was induced by promoting nav1.9 channel into slowinactivated states and resulted from a negative shift of the slow inactivation.