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LUCIA HELENA PACHECO RAMOS EDUARDO
EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO
DE VITAMINA A
HIDROSSOLÚVEL
SOBRE AS LESÕES E A
DISFUNÇÃO HEPÁTICA NA
COLESTASE OBSTRUTIVA:
estudo experimental em ratos jovens
LUCIA HELENA PACHECO RAMOS EDUARDO
EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DE
VITAMINA A HIDROSSOLÚVEL
SOBRE AS LESÕES E A DISFUNÇÃO
HEPÁTICA NA COLESTASE
OBSTRUTIVA:
estudo experimental em ratos jovens
Dissertação apresentada ao Curso de Pós Graduação em
“Fisiopatologia em Clínica Médica”- Área de
concentração: Metabolismo e Nutrição – Faculdade de
Medicina da Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho” - Campus de Botucatu, para obtenção
do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Cláudio Antonio Rabello Coelho
Botucatu
2002
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Sulamita Selma Clemente Colnago
Eduardo, Lúcia Hele na Pacheco Ramos.
Efeitos da administração de vitamina A hidromiscível sobre as lesões e a
disfunção hepática da colestase obstrutiva: estudo experimental em ratos
jovens / Lúcia Helena Pacheco Ramos Eduardo. – 2002.
Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade
Estadual Paulista, 2002.
Orientador: Cláudio Antonio Rabello Coelho
1. Fígado - Fisiopatologia
CDD 612.35
Palavras-chave: Vitaminas lipossolúveis: Colestase; Fígado; Estudo
experimental; Ratos; Vitamina A
Agradeço e ofereço este trabalho,
Aos
meus
pais,
José
e
Dorothy,
pelo
exemplo de vida e a quem devo tudo que sou.
Ao José Eliseu, que conservou a calma, o
sorriso e a esperança diante da dificuldades
e me mostrou com serenidade que juntos
podemos vencer.
Às minhas filhas, Juliane e Daniela, que dão
sentido aos meus sonhos e a certeza que
poderemos compensar as minhas ausências.
A Deus, que nunca, em nenhum lugar,
deixou de olhar por mim e de me
ensinar como vencer os obstáculos.
AGRADECIMENTOS
A realização deste trabalho e a concretização de um sonho, só foi
possível graças a colaboração de muitas pessoas. Manifesto minha gratidão a todas
elas e de forma particular:
Ao Prof. Dr. Cláudio Antonio Rabello Coelho, contribuidor de valor indiscutível na
Hepatologia, a quem devo orientação e estímulo.
Dra. Suzana de Souza Queiroz
Dr. Carlos Antonio Caramori
Dra. Kunie Iabuki Rabello Coelho
A Maria Lucia Sornas, Diretora do Núcleo de Gestão Assistencial-29-Marília, pelo
apoio, confiança e palavras de otimismo diante de minhas dificuldades.
A Secretaria de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina de Botucatu pela
receptividade e atenção.
Aos funcionários do Laboratório Experimental de Departamento de Pediatria da
Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP - Neusa, Paulo e Cristina pela
colaboração e disponibilidade na realização dos trabalhos laboratoriais.
Agradecimento especial, as Sras. Regina Moretto de Oliveira e Alvina Franco Ramos
pelo zelo e dedicação durante a fase experimental deste trabalho
Aos funcionários do Laboratório Experimental do Departamento de Clínica Médica
da Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP - José Carlos Georgete e Mário
Batista Bruno pelo atendimento pronto e constante das necessidades durante a fase
experimental do trabalho.
A Akemi Fuonke que, além de sua preciosa amizade, não poupou esforços em me
atender nas "dificuldades" com o computador.
As pessoas maravilhosas que conheci em Botucatu que se tornaram mais do que
grandes amigos.
A Sra Lourdes Dega Moretto pelo carinho de suas orações.
A minha grande amiga e companheira de luta do mestrado Marta Suzigan que soube
me dar apoio e esperança na conquista dos meus objetivos.
A Ana Paula Batochio e Sérgio pela amizade e apoio.
Aos meus grandes amigos, que mesmo a distância souberam compartilhar as minhas
angústias e sobretudo, a conquista: Rosângela, Altiva, Priscila, Marta, Doraci,
Fátima, Cristina, Fernanda, Telma, Elza, Ana, Fátima P. e Ruth.
Aos funcionários do Núcleo de Gestão Assistencial de Marília pelo apoio
"Um espírito satisfeito com o
presente evitará inquietar-se
com o futuro". (Horácio, Odes,
II,16,25)
i
SUMÁRIO
página
RESUMO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
LISTA DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
LISTA DE TABELAS - QUADROS - GRÁFICOS . . . . . . . . . . . . . .
.LISTA
..
DE ABREVIATURAS - SIGLAS - SÍMBOLOS . . . . . . . . . .
1. INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1. Colestase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2. Importância clínica da colestase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.1. Causas da colestase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . Consequências
..
1.3.
clínicas da colestase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 1.3.1. Consequências da retenção de constituintes da bile . . . . .
1.3.2. Consequências da diminuição ou ausência dos
componentes da bile no intestino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4. Modelos experimentais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5. Mecanismos da lesão hepática na colestase . . . . . . . . . . . . . . .
1.6. Mecanismos da lesão hepatocítica na colestase . . . . . . . . . . . .
1.6.1. Retenção de metais pesados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6.2. Retenção de ácidos biliares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.7. Estresse oxidante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.7.1. Estresse oxidante na patogenia da lesão hepática da
colestase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8. Vitamina A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9. Efeitos da colestase no metabolismo da vitamina A . . . . . . . . .
1.10. Relação entre a vitamina A e a fibrogênese hepática . . . . . . .
1.11. Alterações nutricionais na colestase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.12. Vitamina A no tratamento da colestase . . . . . . . . . . . . . . . . .
2. OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. MATERIAIS E MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1. Planejamento do experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.1.Primeira hipótese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.2. Segunda hipótese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.3. Terceira hipótese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2. Grupos Experimentais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1. Descrição dos grupos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3. Execução do experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
iii
vi
vii
viii
1
2
2
3
7
7
10
15
16
17
18
21
34
35
38
39
40
42
43
45
47
48
48
48
48
49
49
50
ii
3.3.1. Animais - Origem, manutenção, dieta e sacrifício . . . . . . .
3.3.2. Ligadura e ressecção do ducto biliar . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.3. Operação Simulada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.4. Administração de vitamina A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.5.Colheita de sangue e sacrifício . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.6. Observações e medidas realizadas durante o experimento
3.4. Técnica utilizada no sacrifício . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5. Estudos realizados após o sacrifício . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6 Análise dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.1. Métodos Estatísticos Descritivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.2.Métodos Estatísticos Inferenciais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Níveis séricos de vitamina A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mortalidade espontânea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mortalidade após a dose de pentobarbital . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Intensidade da fibrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Intensidade da Inflamação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Intensidade da proliferação ductal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5. RESUMO DOS RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Níveis séricos de vitamina A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mortalidade espontânea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mortalidade após pentobarbital . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fibrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Inflamação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Proliferação ductal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7. CONCLUSÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9. ANEXO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10. ABSTRACT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50
50
51
51
52
52
52
52
54
54
54
56
58
59
60
61
62
63
64
67
68
69
77
78
81
82
85
87
114
123
iv
EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DE VITAMINA A HIDROMISCÍVEL
SOBRE AS LESÕES E A DISFUNÇÃO HEPÁTICA NA COLESTASE
OBSTRUTIVA: estudo experimental em ratos jovens.
Na colestase crônica experimental obstrutiva em ratos, ocorre diminuição
progressiva do parênquima hepático e, consequentemente, prejuízo das funções
hepáticas. A absorção da vitamina lipossolúvel A, depende da presença de ácidos
biliares na luz intestinal e, assim, está prejudicada na colestase. A deficiência de
vitamina A prejudica as defesas antioxidantes, facilitando as lesões hepáticas
intermediadas por radicais livres. Além disso, a lesão do parênquima hepático
prejudica a síntese de proteínas ligadoras de retinol (R.B.P.), sua liberação para o
sangue e, em consequência, a liberação de V.A. das reservas hepáticas. Nosso
objetivo foi testar se a administração de vitamina A hidromiscível interfere com os
efeitos da colestase sobre a estrutura e a função do fígado. Para tanto, estudamos 1)
níveis séricos da V.A.; 2) mortalidade espontânea num período de 49 dias de
colestase; 3) mortalidade após administração de 0,5mg de pentobarbital/g de peso do
animal por via intra-peritoneal no 48o dia de colestase; 4) intensidade da fibrose e
inflamação hepáticas além da proliferação ductal em 134 ratos machos da raça
Wistar desmamados aos 21 dias e divididos em 6 grupos; conforme quadro abaixo:
GRUPO
SA 0
SA 50
SA 100
LA 0
LA 50
LA 100
Número de
animais
11
12
11
77
12
11
Número de animais utilizados por variável estudada
Níveis séricos
Mortalidade
Mortalidade após
Histologia
de V.A.
espontânea
Pentabarbital
10
10
10
10
10
10
10
10
10
77
10
11
11
12
11
11
12
11
10
10
10
10
10
10
A administração de V.A. foi iniciada no 21º dia de vida após a ligadura e ressecção
do ducto biliar (LA50 e LA100) ou cirurgia simulada (SA0, SA50 e SA100). Os
grupos LA 50, LA 100, SA 50 e SA 100 receberam por gavagem 50 e 100 U.I. de
V.A. (retinil palmitato) hidromiscível Roche por g de peso/dia, durante 48 dias. Os
animais do grupo LA0 e SA0 receberam solução salina em igual volume. No 69º dia,
foram sacrificados colhendo-se sangue para dosagem de V.A. Secções do fígado
foram coradas com hematoxilina e eosina e pelo método tricrômico de Masson e
foram medidas a intensidade da fibrose (critério de RUWART), da inflamação e da
proliferação ductal. Também foi estudada a mortalidade espontânea ocorrida durante
o experimento. Os resultados foram analisados pelo teste ANOVA com dois fatores
com comparação múltipla pareada pelo teste de Stewart-Newman-Keuls (S.N.K). As
freqüências da mortalidade foram comparadas entre si, duas a duas, pelo teste Exato
de Fisher. A colestase diminuiu o nível de V.A. no soro (p=0,002)
independentemente da dose de V.A. administrada; o nível de V.A no soro aumentou
com a administração de doses de 50 e 100 U.I. de V.A./g de peso do animal/dia em
relação aos que não receberam a vitamina (p<0,05), independentemente da presença
ou não de colestase. Não houve aumento dos níveis séricos de V.A. quando se passou
v
da dose de 50 para 100 U.I. (p>0,05). Não houve interação entre a dose de V.A. e a
colestase quanto ao nível sérico de V.A. (p=0,814). A mortalidade espontânea no
grupo LA0 foi de 87%, no grupo LA100, 9,1% e nos demais grupos (SA0, SA50,
SA100 e LA50), 0%. Mostraram diferenças significativas (p≤0,001) as comparações
entre os seguintes grupos: LA0 e LA50, LA0 e LA100 e LA0 e SA0. A mortalidade
após o pentobarbital no grupo LA0 foi de 100%, LA50, 17,0%, LA100, 9,1% e nos
grupos SA0,SA50 e SA100, 9,1 17,0 e 9,1% respectivamente e deram resultado
significativos (p≤0,001) as comparações entre os seguintes grupos LA0 e LA50, LA0
e LA100 e LA0 e SA0. A fibrose foi maior no grupo LA0 quando comparada com a
dos grupos LA50 e LA100 e SA0 (S.N.K.- p<0.05) e não houve diferença
significativa entre LA50 e LA100. A colestase causou inflamação, mas esta não foi
influenciada pela V.A. (p=0,132) nem houve interação entre V.A. e colestase
(p=0,134). A colestase associou-se a proliferação ductal que não foi observada nos
grupos sem colestase (p<0,001); a V.A. associou-se a diminuição de sua intensidade
nos animais com colestase (em LA50 e LA100 foi menor que em LA0 - p<0,05) mas
não ocorreu efeito maior com o aumento da dose (LA50 e LA 100, p>0,05).
Portanto, o uso de uma forma hidromiscível de V.A. além de ser melhor absorvida,
diminui a fibrose e a proliferação ductal decorrentes da colestase e protege a função
hepática.
vi
LISTA DE FIGURAS
Página
Conteúdo de vitamina A sérica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Intensidade da fibrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Intensidade da inflamação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Intensidade da proliferação ductal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
58
61
62
63
vii
LISTA DE TABELAS - QUADROS - GRÁFICOS
Página
Tabela 1 - Análise estatística descritiva (media, mediana, DP, CV e valores
máximo e mínimo) dos valores de vitamina A em U. I./dL. . . . . . . . . . . . . .
58
Tabela: 2 - Mortalidade espontânea - Proporção do número de ratos
mortos/número de ratos observados em cada grupo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
Tabela:3 Proporção do número de ratos mortos após a dose de
pentobarbital/ número de ratos observados em cada grupo. . . . . . . . . . . . . .
60
Tabela 4: Análise estatística descritiva (media, mediana, DP, CV e valores
máximo e mínimo) dos postos atribuídos por ordem crescente de
intensidade da FIBROSE por grupo de animais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
Tabela 5: Análise estatística descritiva (media, mediana, DP, CV e valores
máximo e mínimo) dos postos atribuídos por ordem crescente de
intensidade da INFLAMAÇÃO por grupo de animais.. . . . . . . . . . . . . . . . .
62
Tabela 6: Análise estatística descritiva (media, mediana, DP, CV e valores
máximo e mínimo) dos postos atribuídos por ordem crescente de
intensidade da PROLIFERAÇÃO DUCTAL por grupo de animais. . . . . . .
63
Quadro 1 - Mortalidade espontânea: Teste Exato de Fisher. . . . . . . . . . . . . .
59
Quadro 2 - Mortalidade após dose de Pentobarbital: Teste Exato de Fisher.
60
Gráfico 1 - Mortalidade espontânea em porcentagem por grupo
experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
Gráfico2 -. Mortalidade após dose de Pentobarbital . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
Quadro 3 - Ciclo malato-Aspartato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
Causas de colestase intra ou extrahepática- em crianças com menos de 4
meses e após os 4 meses de idade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
Grupos experimentais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
Resumo dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
viii
ABREVIATURAS- SIGLAS -SÍMBOLOS
>
<
=
+
α
β
µg/g
µg/ml
µmol/litro
ºC
HOCI
A.A.A.
A.A.A.R.
ANOVA
ATP
ATPase
Bid
Bcl-2
Bax
BPI
ClC.A.T.
Cm
CCl4
CEEA
CV
DP
Et al.
NF-κB
FADD
Fas
F.M.
g
G.A.B.A.
γGT
H+
H.E.
.
HOCI
IGF-I
IL1
IL6
L
Maior que
Menor que
Igual
Positivo
Negativo
Alfa
Beta
Micrograma/grama
Micrograma/mililitro
Micromol/litro
Graus centígrados
Ácido hipocloroso
Aminoácidos aromáticos
Aminoácidos de cadeia ramificada
Análise de Variância
Adenosine triphosphate (ing.) trifosfato de adenosina
Adenosinatrifosfatase
Promotor da apoptose
B-cell leukemia/lynphoma 2 gene (ing.)=Proteína reguladora da apoptose
Membro da família Bcl2
Bactericidal/Permeability-increasing Protein (ing.)= Proteína de aumento
da Permeabilidade Bactericida).
Íon cloro
Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos
Centímetros
Tetracloreto de carbono
Comissão de Ética em Experimentação Animal
Coeficiente de Variação
Desvio Padrão
Et alii (latim) = e outros
Nuclear Factor κB (ing) fator nuclear κB
Fas associated death domain(ing.)-região letal ativada pelo Fas
Receptor de morte celular
Faculdade de Medicina
Gramas
Ácido γ-aminobutírico
Gama glutamil transpeptidade
Íon hidrogênio
Hematoxilina e eosina
Äcido hipocloroso
Insulin -like growth factors (ing.)Fator de crescimento insulina símile
Interleukin-1 (ing.) interleucina 1
Interleukin-6 (ing.) interleucina 6
Ligadura do ducto biliar
ix
LA0
LA50
LA100
LDL
NADH
LPS
rHDL

Mg/d
Mg/dl
Mg/ml
ML/g
MPT
N
Pag.
RBP
RO..
ROO..
ROS
SNK
H2 O2
O -2
..
OH
PDGF
SAME
S
SA50
SA100
SOD
SNK
TIMP
TGF β
TNFα
TPGS
U.I.
UNESP
V.A.
VLDL
qsq
Grupo com ligadura do ducto biliar sem vitamina A
Grupo com ligadura do ducto biliar com 50 U.I. de vitamina A
Grupo com ligadura do ducto biliar com 100 U.I. de vitamina A
Low-density lipoprotein (ing.) Lipoproteína de baixa densidade
Nicotinamida adenina dinucleotídio
Lipopolysaccharide (ing.) Lipossacarídeos
reconstituted Hight-Density Lipoprotein (ing) Lipoproteína de alta
densidade reconstituída
Marca registrada
Miligrama/dia
Miligrama/ decilitro
Miligrama/ mililitro
Mililitro por grama
Mitochondrial permeability transition (ing.) Transição da permeabilidade
da mitocondria
Número da amostra
Página
Retinol binding protein (ing.) Proteína ligadora de retinol
Alkocy radical (ing.) Radical alcoxil
Peroxy radical (ing.) Radical peroxil
Reactive oxygen species (ing.) Espécies reativas de oxigênio
Teste Stwart-Newman-Keuls
Peróxido de hidrogênio
Anion superóxido
Radical hidroxil
Platelet derived growth factor (ing.) Fator de crescimento derivado das
plaquetas
S-adenosylmethionina
Operação simulada do ducto biliar
Grupo com operação simulada do ducto biliar com 50 U.I. de vitamina A
Grupo com operação simulada do ducto biliar com 100 U.I. de vitamina A
Superóxido dismutase
Teste de comparação múltipla de Stwart-Newman-Keuls
Tissue Inibitors Metalloproteinases (ing.) Inibidores tissulares das
metaloproteinases
Transforming grouth factor beta (ing.) Fator de crescimento transformante
beta
Tumor necrosing factor (ing.)= Fator de Crescimento Transformante Alfa
D-alpha-tocopheryl-polyethylene glycol-succinate (ing.) Vitamina E
Unidades Internacionais
Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho"
Vitamina A
Very low density lipoprotein (ing.) Lipoproteína de muito baixa densidade
Quantidade suficiente para...
1 - Introdução
2
1. INTRODUÇÃO
1.1 COLESTASE
Colestase
é
definida
como
toda
alteração
fisiopatológica
caracterizada pela diminuição ou ausência de fluxo biliar no duodeno (ERLINGER,
1999). A identificação da colestase varia de acordo com os meios utilizados. O
patologista ao observar cortes histológicos com o microscópio de luz, chama de
colestase o seguinte conjunto de lesões: presença de pigmentos biliares no citoplasma
dos hepatócitos e das células de Küpffer e trombos biliares canaliculares (sinais de
bilirrubinostase) e degeneração plumosa dos hepatócitos (sinal de colatoestase)
(FALLON, et al., 1993; BOYER et al., l986). O clínico identifica colestase por dados
de história e de exame físico - presença de icterícia, colúria , acolia ou hipocolia
fecais. Sob o ponto de vista da bioquímica–clínica, ela se caracteriza pelo aumento
dos níveis da bilirrubina conjugada no soro, da atividade sérica de fosfatase alcalina,
da γGT e da concentração do colesterol. O fisiologista identifica uma colestase
quando o clearance de substâncias eliminadas pela bile (p. ex. a inulina) está
diminuído. Para os radiologistas a colestase
contraste
na
colangiopancreatografia
é identificada quando há parada de
endoscópica
retrógrada
ou
colangiografia
transparietohepática.
1.2
IMPORTÂNCIA CLÍNICA DA COLESTASE
A colestase ocorre com frequência na prática clínica de crianças e
adultos (WATSON & GIACOIA, 1983). A colestase acomete uma em quinhentas
crianças com menos de dois anos, sendo a evolução para cirrose, quando ocorre,
mais rápida do que em adultos (MOWAT, 1987).
A importância da colestase em pediatria é acentuada pela ampla
variedade de causas congênitas e adquiridas que a podem causar, especialmente no
período neonatal e nos primeiros meses de vida.
1 - Introdução
3
1.2.1 CAUSAS DE COLESTASE
A síndrome colestática é multifatorial e pode ser desencadeada nas
diferentes etapas da formação da bile ou do fluxo biliar.
Uma variedade de causas podem induzir a colestase em crianças e
adultos. As crianças são particularmente vulneráveis à colestase em parte por
imaturidade dos mecanismos de formação da bile.
A relação abaixo classifica as causas de colestase
conforme a
localização intra ou extrahepática da lesão, que inicia o processo antes e após os 4
meses de idade:
Causas extrahepáticas de colestase em crianças com menos de 4 meses de idade:
hAtresia de vias biliares
hCisto do colédoco
hColedocolitíase
hColangite esclerosante primária (forma neonatal)
hColangite infecciosa
hColangite associada à histiocitose de células de Langerhans
hPerfuração do colédoco
hEstenose congênita do colédoco
hTumor de vias biliares
ou de tecidos adjacentes comprimindo ou obstruindo as
vias biliares
Causas intrahepáticas de colestase em crianças com menos de 4 meses de idade:
hColestase fisiológica do recém nascido
hPrematuridade
hHipóxia e/ou isquemia hepática perinatal (JACQUEMIN et al., 1998; VAJRO et al.,
1997)
hInfeções congênitas
1 - Introdução
4
4 Sífilis
4 Toxoplasmose
4 Rubéola
4 Citomegalovírus
4 Herpes simples
4 Parvovírus B19
4 Herpes vírus tipo 6
4 Doença de Chagas
4 Listeriose
4 Hepatite de células gigantes com inclusões semelhantes a Paramixovírus
(HICKS et al., 2001)
hInfeções adquiridas
4 Bacterianas (endotoxinas)
4 Virais (vírus das hepatites A e B)
hDoenças metabólicas genéticas
4 Deficiência de α1- antitripsina
4 Galactosemia
4 Intolerância hereditária à frutose
4 Tirosinemia congênita
4 Síndrome de Zellweger
4 Erros inatos do metabolismo dos ácidos biliares
♦Deficiência da redutase 5β dos ?4 –3 - oxosteróide
♦Deficiência da isomerase/dehidrogenase dos esteróides 3β- hidroxi
?5 –C27
♦Deficiência de 7α hidroxilase dos oxiesteróides (SETCHELL et
al.,1998)
4 Hemocromatose neonatal (SIAFAKAS et al., 1997)
4Coagulopatia e hipoproteinemia congênitas associadas a hipertirosinemia
(KAWAI et al., 1998)
hColestases intrahepáticas familiares progressivas
1 - Introdução
5
4Tipo 1 - doença dos Byler (ARNELL et al., 1997; BULL et al., 1997;
JANSEN & MULLER, 1998; STRUTNIEKS & KAGAWALLA, 1997;
4Tipo 2 - deficiência de spgp -“sister protein of the P-glicoproteins”
(JANSEN & MULLER, 1998; STRAUTNIEKS & KAGAWALLA, 1997;
STRAUTNIEKS & BULL, 1998)
4Tipo 3 - deficiência de MDR3 “multidrug resistence factor number 3”
(BULL et al., 1998; DE VREE et al., 1998; JANSEN & MULLER, 1998;
HOLLAND,1998)
hColestase associada à nutrição parenteral total
hColestase por drogas administradas à mãe ou à criança - por exemplo
clorpromazina, cetoconazale
hColestase associada à incompatibilidade sanguínea materno fetal (por hipóxia ?;
por siderose hepática ?)
hColestase dos Índios Norte-Americanos
hColestase dos Esquimós da Groenlândia
hDoença de Aagenaes
hColestase intrahepática neonatal associada a siderose e esteatose hepática
(TAZAWA et al.,1998)
hColestase neonatal associada a displasia medular focal dos rins (BERGER et al.,
1998)
hColestase crônica com nefropatia tubulointersticial (MONTINI et al., 1997)
hHepatite neonatal idiopática, colestase neonatal benígna ou colestase transitória do
recém nascido
h Síndromes ductopênicos
4Síndrome de Alagille
4Ductopenia não sindrômica – por drogas, genética ?
Causas extrahepáticas de colestase em crianças com mais de 4 meses de idade e
em adultos:
hCisto do colédoco
hLitíase de vias biliares
1 - Introdução
6
hNeoplasias extrabiliares
hEstenose pós cirúrgica
hParasitoses - ascaridíase
hCompressão extrínseca
hColangite esclerosante primária
hNeoplasias do trato biliar
Causas intrahepáticas de colestase intrahepática em crianças com mais de 4
meses de idade e em adultos:
hColestases intrahepáticas ductais
4Doença de Caroli
4Cirrose biliar primária
4Colangite esclerosante
4Vírus da imunodeficiência adquirida
♦ Colangiopatia por Citomegalovírus
♦ Colangiopatia por Criptosporidium
4Doença enxerto versos hospedeiro
4Histiocitose de células de Langerhans
4Síndrome ductopênica idiopática do adulto
4Síndrome ductopênica tipo adulto por drogas
hColestase intrahepáticas hepatocítica
4Drogas
♦ Fenotiazinas
♦ Vasoconstritores
♦ Estolato de eritromicina
4Nutrição parenteral total
4Hipotireoidismo
4Induzida por sépses ou endotoxinas
4Hepatite alcoólica
4Colestase da gestação
4Choque
1 - Introdução
7
4Insuficiência cardíaca congestiva
4Colestase intrahepática benigna recorrente
4Hepatites virais A (hepatite colestática ou fase colestática de uma hepatite
bifásica), B e C
4Hepatites auto-imunes
4Sarcoidose
Fonte: Modificado de WHITINGTON,1996.
1.3
CONSEQUÊNCIAS
CLÍNICAS
DA
COLESTASE
(SÍNDROME COLESTÁTICA)
A colestase está associada a prejuízo de diferentes aspectos da
função hepática (REICHEN & SIMON, 1994).
As características clínicas da colestase resultam de complicações
atribuíveis direta ou indiretamente à diminuição do fluxo biliar por: 1) retenção pelo
fígado, sangue e outros tecidos de substâncias normalmente secretadas ou excretadas
na bile (ácidos biliares, bilirrubina, colesterol e elementos traço); 2) diminuição da
liberação da bile para o intestino, com diminuição intraluminal da concentração de
ácidos biliares levando a má absorção de triglicérides e de vitaminas lipossolúveis e
3) retenção de componentes da bile no fígado que pode progredir para lesão
hepatocelular, fibrose, cirrose, hipertensão portal e falência hepática.
1.3.1
CONSEQUÊNCIAS
DA
RETENÇÃO
DE
CONSTITUINTES DA BILE
1.3.1.1 Icterícia
A icterícia pode resultar de: 1) superprodução de bilirrubina; 2)
prejuizo na captação pelo hepatócito e no transporte da bilirrubina ao retículo
endoplasmático; 3) diminuição da atividade da glucoroniltransferase-UDP do
1 - Introdução
8
retículo endoplasmático; 4) limitação na excreção da bilirrubina glicoronidada pelos
canalículos biliares e via biliares e ainda por 5) absorção aumentada da bilirrubina na
luz intestinal.
Quando a concentração plasmática de bilirrubina excede 50 µmol/l
(3 mg/dl ), a coloração amarelada da conjuntiva, das membranas mucosas e da pele
aparecem (BERG et al., 1999).
1.3.1.2 Prurido
É um dos sintomas mais desagradáveis da colestase, afetando a
qualidade de vida dos pacientes. Ele se apresenta quase sempre de forma
generalizada e sua patogênese permanece controversa. Os sintomas podem variar de:
1) intensidade leve, não interferindo nas atividades normais do paciente, de
intensidade moderada, com relatos de distúrbios do sono, com exacerbação dos
sintomas à noite e em temperaturas mais quentes, de intensidade grave, levando
ocasionalmente ao suicídio, sendo indicação por si só de transplante hepático
(MADDREY & THIEL, 1988). Por causa do coçar incessante, a pele é lesada,
predispondo a infeções bacterianas secundárias (especialmente por estafilococos e
estreptococos), que podem deixar cicatrizes.
Até recentemente o prurido era atribuído à retenção de substâncias
normalmente encontradas na bile, no sangue e na pele (SCHMID, 1973; HERNDON,
1972). Em pacientes com colestase, a concentração de ácidos biliares no soro e na
pele estão frequentemente aumentados e o tratamento com colestiramina (uma resina
ligadora de ácidos biliares) é utilizada no tratamento dos casos leves e moderados.
Atualmente, o papel dos ácidos biliares tem sido questionado por
várias razões: 1) existe pouca correlação entre a intensidade do prurido e a
concentração de ácidos biliares na pele e no soro (GHENT et al., 1977); 2) a
colestiramina se liga a outros compostos incluindo vários esteróides e sua eficácia no
tratamento do prurido não é prova de que os ácidos biliares sejam os responsáveis
1 - Introdução
9
pelo prurido. Evidências mais recentes sugerem que um componente significante do
prurido seja de origem neurogênica central, possivelmente envolvendo o sistema
receptor de opióides estimulados por agonistas opióides, o que causa a sensação de
prurido (BERGASA & JONES,1993; BERGASA & JONES, 1995). A verdadeira
fonte do opióides pruridogênicos não é conhecida. É possível que uma pró-encefalina
seja produzida por ductulos proliferados em ratos com ligadura de colédoco
(BERGASA et al. 1995).
1.3.1.3 Xantomas
Xantomas são lesões decorrentes do depósito de colesterol na pele.
Xantelasmas são xantomas planos ou ligeiramente elevados vistos principalmente ao
redor dos olhos, nas palmas da mãos, abaixo do peito, no pescoço, no peito e nas
costas. Xantomas tuberosos aparecem no último estágio de hipercolesterolemia nas
áreas extensoras especialmente no pulso, nos cotovelos, nos tornozelos, nos joelhos e
nas nádegas. Ocasionalmente eles podem envolver os ossos ou nervos periféricos
(SOKOL, 1990a).
Os xantomas se desenvolvem quando a concentração lipídica sérica
total está elevada e a concentração de colesterol sérico excede 450 mg/100 ml (11,6
mmol/dl) por vários meses. Eles podem desaparecer quando os níveis de colesterol
diminuem, quando há desobstrução biliar, após o transplante hepático ou quando a
falência hepatocelular progride.
1.3.1.4 Colúria
A bilirrubina somente é excretada em quantidades significantivas
pelos rins quando existe um nível elevado de bilirrubina conjugada no plasma. Ela
não é detectada na urina de pessoas normais ou pacientes com hiperbilirrubinemia
não conjugada. A excreção de bilirrubina conjugada é dependente de sua fração no
1 - Introdução
10
plasma que não é ligada à proteína e portanto disponível para filtração glomerular.
Em condições normais sua fração corresponde a menos de 1% da bilirrubina total no
plasma. Devido à sua grande solubilidade na água, o pigmento é filtrado pelo
glomérulo renal. Quando a fração filtrada está aumentada, a bilirrubina não
reabsorvida pelos túbulos proximais leva à bilirrubinúria que é característica da
icterícia. A bilirrubina, por ação das bactérias intestinais se transforma em
urobilinogênio e em urobilina A passagem de urobilinogênio da circulação enterohepática para a circulação sistêmica pode ocorrer na vigência de excessiva excreção
de bilirrubina conjugada, da alteração da motilidade intestinal e nas doenças
hepatocelulares nas quais as excreção de urobilinogênio pode diminuir. Desta forma,
o aumento da bilirrubina conjugada e da urobilina que são excretadas na urina e no
suor explicam as manchas amareladas observadas nas roupas de pacientes com
colestase.
1.3.2 CONSEQUÊNCIAS DA DIMINUIÇÃO OU AUSÊNCIA DOS
COMPONENTES DA BILE NO INTESTINO
1.3.2.1 Esteatorréia
Em pacientes com doença hepática colestática perdas fecais de
gorduras maiores de 10 a 30g/dia, são raras.
A diminuição da concentração de ácidos biliares prejudica a
formação de micelas e leva à solubilização inadequada de gorduras e prejuízo na
absorção de vitaminas lipossolúveis.
1 - Introdução
11
1.3.2.2 Desnutrição
A diminuição da concentração de ácidos biliares e a consequente
má absorção de gorduras são responsáveis por uma considerável diminuição no
aproveitamento de energia da dieta e conseqüente desnutrição.
Outros fatores que contribuem para a desnutrição associada à
colestase incluem anormalidades no metabolismo dos aminoácidos (FREUND et al.,
1982; WIESDORF et al., 1987), do metabolismo da glicose (MUNRO et al., 1985),
anorexia (GOULET et al., 1987), aumento do metabolismo em repouso (GOULET et
al., 1987; PIETRO et al., 1989), infecções recorrentes (SOKOL, 1990), saciedade
antecipada ou vômitos secundários à compressão das vísceras abdominais pelo
aumento do fígado, do baço ou
por ascite (SOKOL, 1990b). A diminuição do
crescimento do cérebro (SOKOL, 1990b; WINICK & ROSSO, 1969); o retardo do
desenvolvimento mental (STEWART et al.,1988; STEWART et al.,1989) e a
diminuição da imunocompetência com aumento da suscetibilidade às infecções
(O’KEEFE et al., 1980) encontrados na colestase tem sido atribuídas à desnutrição.
1.3.2.3 Deficiência de ácidos graxos essenciais
A combinação da má absorção de ácidos graxos de cadeia longa e
ingestão energética inadequada podem levar a deficiência de ácidos graxos
essenciais. Na colestase crônica os ácidos graxos de cadeia longa são muito pouco
absorvidos.
Os ácidos graxos linoléico e linolênico podem ser oxidados como
fontes energéticas se a ingestão e a absorção calórica for inadequada. A deficiência
desses
ácidos
resulta
em
retardo
do
crescimento,
descamação
da
pele,
trombocitopenia e prejuízo na função imunológica (BARR et al., 1981; CALDWELL
et al., 1972; HANSEN et al., 1963; MARCUS, 1978; WENE et al., 1975).
1 - Introdução
12
1.3.2.4Deficiência de Vitaminas Lipossolúveis: (A, D, E, K)
A absorção das vitaminas lipossolúveis
A, D, E e K depende
essencialmente da presença de ácidos biliares na luz intestinal (MEZEI, 1984).
Quando a concentração intraluminal desses ácidos está abaixo da concentração
micelar crítica ocorre má absorção de vitaminas lipossolúveis:
1.3.2.4 Vitamina A
Além da absorção desta vitamina ser prejudicada quando a
secreção biliar é insuficiente, a síntese hepática e a liberação de proteínas ligadoras
de retinol podem estar prejudicadas em pacientes com lesão do parênquima hepático.
Em consequência, há prejuízo na liberação de vitamina A das reservas hepáticas e,
portanto, suprimento inadequado das necessidades teciduais. A deficiência de
vitamina A é encontrada na maioria dos pacientes com colestase crônica. Em
pacientes com colangite esclerosante primária a deficiência é de 43% (HARNOIS &
LINDOR, 1997). Sintomas e sinais de deficiência de vitamina A aparecem quando as
concentrações plasmáticas caem abaixo de 0,35 a 0,70 µmol/L (10 a 20 µg/ml) ou
quando a concentração hepática de retinoides é menor de que 5 a 10 µg/g de tecido.
Em crianças com doença hepática colestática crônica a deficiência pode se
manifestar por prejuízo da adaptação visual, xeroftalmia, queratomalácia, cegueira
noturna, retinopatia pigmentar, alterações dermatológicas (xerodermia), diminuição
da competência imunológica, diminuição da pressão intracraniana, diminuição da
velocidade de crescimento (EISENBERG et al. 1987).
1 - Introdução
13
1.3.2.6 Vitamina D
Os pacientes com colestase de longa duração ou doença
parenquimatosa hepática grave, apresentam níveis séricos baixos de vitamina D
devidos a sua má absorção intestinal. Uma pequena porcentagem destes pacientes
pode desenvolver osteomalácia que é caracterizada por dor e fragilidade óssea. A
etiologia da deficiência é multifatorial e pode ser agravada por deficiência na dieta,
pela exposição reduzida da pele ao sol, ou por perdas urinárias de metabólitos
hidrossolúveis. A ativação pode estar prejudicada na colestase, uma vez que a
icterícia pode interferir na sua metabolização pelos raios ultravioleta na pele
(SHERLOCK, 1989) e a lesão hepática pode prejudicar sua ativação (25
hidroxilação) (SOKOL, 1994). A absorção intestinal e os níveis séricos de cálcio são
baixos e o hiperparatireoidismo secundário leva a hipofosfatemia, o aumento de
fosfatase alcalina, à osteomalácia e a fraturas em adultos e em crianças, que tem seu
crescimento prejudicado (EISENBERG et al., 1987) e o raquitismo naquelas em
crescimento ativo. Em pacientes colestáticos, a osteoporose é a lesão predominante
e, geralmente, não responde à suplementação de vitamina D (SOKOL, 1994).
1.3.2.7 Vitamina E
As manifestações clínicas de deficiência de vitamina E em crianças
com doença colestática neonatal se caracterizam por degeneração neuromuscular
progressiva que pode se manifestar por ataxia, neuropatia periférica, fraqueza
muscular e oftalmoplegia dentro da primeira década de vida (GUGGENHEIM et al.,
1983; SOKOL, 1988). A síndrome neurológica é mais rara em adultos com colestase
e deficiência desta vitamina.
Por sua ação antioxidante, a carência desta vitamina na colestase,
diminui a capacidade de eliminação de radicais livres. A presença destes, leva a uma
1 - Introdução
14
reação em cadeia da peroxidação lipídica destruindo as bainhas de mielina
(MUNOZ, et al., 1987).
1.3.2.8 Vitamina K
A má absorção de vitamina K na colestase pode ocorrer dentro de 2
a 3 dias após o seu início e resulta numa diminuição da concentração sérica dos
fatores de coagulação II, VII , IX e X cuja síntese exige a presença dessa vitamina.
Conseqüentemente o tempo de protrombina aumenta e há tendência a hemorragias.
1.3.2.9 Acolia ou hipocolia fecal
O organismo humano excreta nas fezes quase que a totalidade dos
pigmentos biliares (acima de 260 mg/d) produzidos no intestino por ação das
bactérias intestinais sobre a bilirrubina. Uma pequena fração (0 a 4mg/d) é excretada
na urina na forma de uribilinogêneo (STOLL, 1982). A ausência ou diminuição
desses pigmentos no intestino faz com que as fezes dos pacientes com colestase se
apresentem descoradas inteiramente (acolia) ou tenham cor amarela-clara (hipocolia
fecal).
1.3.2.10 Translocação de bactérias e endotoxinas
Os ácidos biliares, por suas propriedades detergentes, exercem no
intestino uma ação de defesa físico-química contra microorganismos. Além disso,
tem sido postulado que a falta de sais biliares no intestino permite uma absorção
aumentada de endotoxinas que contribuem para as alterações hemodinâmicas e
renais que podem acompanhar a colestase. Experimentos com ratos demonstram que
os ácidos biliares protegem contra a translocação de bactérias, diminuem a formação
1 - Introdução
15
de endotoxinas e inativam vírus que tenham envoltório formado por lipoproteínas,
como os do grupo herpes (BERTOK, 1998).
1.4
MODELOS EXPERIMENTAIS
Modelos experimentais que simulam colestase humana têm sido
muito úteis na elucidação da diferentes etapas da patogênese da colestase
(REICHEN, l994). Várias técnicas para o desenvolvimento de colestase tem sido
descritas, sobretudo em ratos, baseada em: 1) obstrução aguda e completa do
colédoco (CAMERON & OAKLEY, 1932); 2) colestase induzidas por endotoxinas;
3) colestase induzida por etinilestradiol.
Estes modelos experimentais de colestase, resultam em prejuízo
funcional da captação hepatocelular, excreção canalicular e transporte de sais biliares
e de vários outros ânions orgânicos (BOSSARD et al., 1993; BOLDER et al., 1997;
TRAUNER et al., 1998):
Na colestase experimental por ligadura e resecção do colédoco em
ratos, observam-se as seguintes lesões à microscopia óptica: proliferação ductal,
fibrose produzindo um padrão de cirrose septal incompleta, inflamação e necrose
hepatocítica discretas.
Os vários modelos experimentais e as várias condições clínicas
associadas a colestase atuam através de mecanismos desencadeantes próprios de cada
etiologia ou modelo experimental e por fatores amplificadores comuns aos vários
mecanismos iniciadores. Os mecanismos amplificadores podem ser divididos em: 1)
retenção do colesterol e alteração na fluidez da membrana, 2) ação tóxica dos ácidos
biliares, 3) ação colestática dos ácidos biliares, 4) diminuição do "pool" e da
recirculação dos ácidos, 5) papel do cobre na lesão colestática, 6) papel do óxido
nitrico e 7) estresse oxidativo com produção de espécies reativas de oxigênio (ROS).
São considerados pró-oxidantes - ácidos tauroquenodeoxicólico e taurocólico,
diminuição de vitamina E, diminuição de selênio e antioxidantes - enzimas como a
1 - Introdução
16
dismutase do superóxido (SOD0, a peroxidase da glutationa e a catalase; alguns
metais como o selênio e o zinco e vitaminas A,C, E.
1.5 MECANISMOS DA LESÃO HEPÁTICA NA COLESTASE
A colestase resulta em várias lesões hepáticas, independentemente
de suas causas. As colestases agudas são caracterizadas, especialmente, pela:
retenção de pigmentos biliares no citoplasma dos hepatócitos e, às vezes, das células
de Küpffer (bilirrubinoestase, já referida no ítem 1.1 ) e formação de trombos
canaliculares (BIANCHI, 1983). Quando a colestase dura mais que algumas
semanas, características histopatológicas de colestase crônica podem ser observadas.
A lesão mais específica, neste caso é a presença de degeneração plumosa dos
hepatócitos, das células de Küpffer e das células ductais (colatoestase, também
referida no item 1.1). Observam-se, também, estase biliar periportal, acúmulo de
cobre e, com o tempo, fibrose periportal cujo estádio final é a cirrose biliar, na qual
nódulos parenquimatosos são envolvidos por traves fibrosas unindo os espaços
portais entre si (DESMET, 1979; SCHEUER, 1988). As lesões hepatocíticas
resultam
em
característica
diminuição
da
colestase
progressiva
crônica
do
é
parênquima
a
hepático.
proliferação
ductal,
Outra
lesão
observada,
característicamente na colestase obstrutiva experimental em ratos e em recémnascidos e lactentes jovens com obstrução extra-hepática e, ocasionalmente, em
certas causas intra-hepáticas. As conseqüências mais importantes para crianças com
colestase crônica, além das referidas acima (ítem 1.3 ) são as decorrentes da cirrose –
hipertensão portal cuja conseqüência mais grave é a hemorragia digestiva alta por
ruptura de varizes esofageanas, a mais freqüente causa de óbito desses pacientes. A
atresia biliar (ver 1.2.1) é a indicação mais importante de transplante hepático em
crianças.
1 - Introdução
1.6. MECANISMO
DA
LESÃO
HEPATOCÍTICA
17
NA
COLESTASE
A morte celular patológica no fígado tem sido tradicionalmente
referida como necrose, porém processos fisiopatológicos podem levar a lesão celular
e morte por apoptose bem como por necrose (WILLIE et al., 1980; PATEL &
GORES, 1995).
Na necrose ocorre ruptura da membrana citoplasmática enquanto
que a integridade da mesma é mantida durante a apoptose. Sob condições
fisiopatológicas o aumento do número de células sofrendo apoptose pode exceder a
capacidade fagocítica do fígado. Os fragmentos apoptóticos não fagocitados sofrem
necrose secundária e a subseqüente saída dos constituintes celulares podem provocar
uma resposta inflamatória. A elevação das aminotransferases séricas, um marcador
clínico de lesão hepática pode refletir apoptose aumentada bem como necrose no
fígado. Estes níveis também são elevados em modelos experimentais de apoptose
hepática como por exemplo após a injeção de fator de crescimento transformante
(TGF β) (MULLAUER, et al., 1996).
O entendimento do mecanismo molecular envolvido na morte
celular indica o papel central dos mitocôndrios e o mecanismo molecular comum na
mediação de apoptose e necrose.
A
apoptose
pode
ocorrer
tanto
fisiologicamente
quanto
patologicamente, enquanto que a necrose nunca é fisiológica (PATEL, 2000). A
morte celular na colestase tem sido atribuída à retenção de substâncias normalmente
excretadas na bile, em especial, metais pesados e ácidos biliares
1 - Introdução
18
1.6.1 RETENÇÃO DE METAIS PESADOS
1.6.1.1 Retenção de cobre
O cobre que é excretado normalmente, pela bile, nas fezes e na
urina, se acumula no fígado durante a colestase. Sua concentração no fígado pode ser
alta em doenças hepáticas como na doença de Wilson (ERLINGER, 1999) e na
cirrose infantil indiana (SOKOL & NARKEWICZ, 2001) Não existem evidências
conclusivas de que, na colestase, o acúmulo de cobre seja tóxico para o fígado. A
sobrecarga de cobre no fígado mantém um estado de inflamação crônica, fibrose
grave e, eventualmente, cirrose (STERLIEB, 1990). O acúmulo de cobre pode
promover a formação de espécies reativas de oxigênio, especialmente o mais reativo
deles, o radical hidroxila, depletando as enzimas antioxidantes como a peroxidase da
glutationa, a catalase e a dismutase do superóxido (TOGASHI et al., 1990). A
combinação da alta concentração do cobre e a depleção de enzimas antioxidantes
levam a lesão por radicais livres durante a colestase. O cobre acumulado em fígados
colestáticos (STERNLIEB, 1980) pode catalisar a reação de Haber-Weiss, que
converte
H2 O2
em
radicais
hidroxilas
livres,
extremamente
reativos
(HALLIWELL,1982). Estes atuam rapidamente e danificam os ácidos graxos
poliinsaturados, as proteínas ricas em radicais tiol e os ácidos nucléicos
(HALLIWELL, 1991). Em ratos com sobrecarga de acetato de cobre, numa
concentração dez vezes maior que a concentração hepática normal do metal,
ocorreram mudanças profundas na morfologia lisossomal. Estas mudanças estão
associadas a um aumento da peroxidação lipídica (MEYERS et al., 1993).
1.6.1.2 Retenção de manganês
O manganês é um elemento-traço excretado principalmente na bile
(HAMBIDGE, 1993) e se acumula no fígado de crianças com atresia biliar
1 - Introdução
19
(BAYLISS et al.,1995). A ação tóxica mais importante do manganês se dá sobre o
sistema nervoso central (PLAA et al., 1982). Ratos tratados com altas doses de
manganês e bilirrubina desenvolveram colestase (AYOTTE & PLAA, 1988). É
recomendada a restrição de manganês nas soluções utilizadas na nutrição parenteral
total para bebês e para crianças com colestase (FARREL et al.,1982; HAMBIDGE,
1993; SINATRA, 1984).
1.6.1.3 Retenção de alumínio
A mais importante via de eliminação do alumínio absorvido é a
excreção biliar (WILLIAMS et al., 1986), sendo possível que a colestase leve ao seu
acúmulo no fígado (ANDERSEN et al., 1979) e parece ter efeito hepatotóxico em
altas doses (KLEIN et al., 1986).
O aluminío é encontrado em antiácidos, como contaminante da
nutrição parenteral total (KLEIN et al. 1982a; KLEIN et al., 1982b) e em outros
produtos utilizados na nutrição parenteral total como, por exemplo, soluções de
gluconato de cálcio, de albumina e de fosfato de potássio (SEDMAN et al., 1985;
MILLINER et al., 1985). O uso de medicamentos que contenham alumínio deve ser
evitado em pacientes com colestase, a menos que o uso seja absolutamente
necessário ou que se venha a conhecer melhor seu metabolismo e o seu potencial
hepatotóxico.
1.6.1.4 Sobrecarga de Ferro
O acúmulo intra-hepático de ferro pode levar, através do aumento
de oxidação dos lipídios da membrana, a ineficiência funcional das organelas
subcelulares (mitocondrios, microssomos, lisossomos), e conseqüentemente, lesão
celular (BACON & BRITTON, 1990). O Ferro parece ser o mais eficiente metal de
transição na formação catalítica de espécies reativas de oxigênio, através da Reação
1 - Introdução
20
de Fenton e de Haber-Weiss. Por estas vias, o metal pode iniciar a peroxidação
lipídica enzimática ou não enzimática, propagando o processo propriamente dito e
favorecendo a neutralização dos hidroperóxidos com conseqüente formação de
radicais livres peroxil (ROO. ) e alcoxil (RO.), (HALLIWELL & GUTTERIDGE,
1989). O grau de propagação da quebra oxidativa dos lipídios da membrana
decorrentes do excesso de ferro mostram diferenças quantitativas e qualitativas
daquelas provocadas por outros compostos pró-oxidantes, como por exemplo na
presença de tetracloreto de carbono (CCl4 ). A produção relativamente alta de
malonaldeído e baixa produção de hidroxialquenóis (incluindo 4-hidroxinonenal)
correlaciona-se com a citotoxicidade exercida pelo excesso de ferro em pequenas
dosagens. Mas, a baixa atividade necrogênica não significa necessariamente pequeno
grau de perigo. Em modelos experimentos in vivo e em humanos, o acúmulo anormal
do metal ferro no fígado é atualmente caracterizado em ambos, por baixa citólise e
também
fibroesclerose
progressiva
levando
eventualmente
num
subgrupo
de
pacientes, a cirrose e até mesmo carcinoma hepatocelular (POLI, 2000).
Em ratos alimentados com dieta enriquecida com ferro por várias
semanas, a concentração de ferro não heme aumentou 50-100 vezes o normal num
período de tempo relativamente curto (2-4 meses). Evidências consistentes in vivo
foram obtidas da peroxidação lipídica microssomal e mitocondrial em termos de
aumento de dienos conjugados (BACON et al., 1989).
A associação entre deposição de ferro hepático e aumento da
peroxidação lipídica no modelo relatado acima é inequívoco. Além disso, um
correlação significante entre acúmulo de ferro e deposição de colágeno I também foi
demonstrada (POLI, 2000).
Poucos estudos independentes tem fornecido provas consistentes da
associação do aumento do ferro e peroxidação lipídica no plasma de pacientes com
hemocromatose (PETERS et al.,1985). A análise imunohistoquímica de biópsias
hepáticas deste tipo de pacientes, tem demonstrado que uma grande estimulação
também ocorre no tecido hepático. Atualmente o desenvolvimento de fibrose
hepática e cirrose na hemacromatose genética é influenciada por vários fatores,
1 - Introdução
21
incluindo consumo de álcool, o que agrava a doença, muito provavelmente pelo
favorecimento da absorção do ferro ao nível do enterócito (MAZZANTI et al.,1987).
A sobrecarga de ferro primária ou secundária pode exercer efeitos
pró-fibrogênicos e mesmo pró-carcinogênicos no fígado, por manter uma condição
de estresse oxidativo.
1.6.2 RETENÇÃO DE ÁCIDOS BILIARES
Um grande número de hipóteses para explicar como o prejuízo do
fluxo biliar leva à lesão hepática têm sido propostas, mas a maioria dos
pesquisadores acredita que o acúmulo dos ácidos biliares hidrofóbicos no hepatócito
seja o fator chave envolvido (GREIN et al., 1972; BALISTRELI et al., 1996). Sua
citotoxidade está relacionada às propriedades detergentes e à hidrofobicidade de cada
um deles. O potencial hepatotóxico dos ácidos biliares em ordem decrescente é:
ácido litocólico > deoxicólico > quenodoxicólico > cólico> ursodeóxicólico. A
sulfatação e conjugação de ácidos biliares reduz sua hepatotoxidade, pois aumenta a
afinidade pela água, facilitando a eliminação pela urina e pelas fezes.
Nos últimos vinte anos o estudo da morte celular causada pela
retenção de ácidos biliares na colestase centrou-se, inicialmente, na sua relação com
a necrose e, mais recentemente com a apoptose.
1.6.2.1 ÁCIDOS BILIARES E NECROSE
A necrose causada por ácidos biliares foi atribuída, principalmente
à sua ação detergente, além de outros mecanismos:
1) Propriedades detergentes (GREIN et al., 1972; COMBETTES
et al., 1988). Embora os ácidos biliares se acumulem no fígado durante a colestase é
improvável que os níveis observados nesses casos, sejam suficientes para que sua
1 - Introdução
22
atividade detergente lese as membranas celulares. Além disso sua toxicidade pode
ser observada mesmo abaixo da concentração micelar crítica (REICHEM, 1994).
2) Mudanças na homeostase do cálcio intracelular (SPIVEY et al.;
1993) - Provavelmente por sua ação detergente, os ácidos biliares aumentam a
permeabilidade
das
membranas
das
organelas,
especialmente
do
retículo
endoplásmico, liberando íons cálcio para o citosol. Nesse compartimento ativam
proteases dependentes do cálcio e a quinase da proteína c que atuam como
mensageiros secundários para a morte celular (SCHOLMERICH et al., 1996;
PATEL et al., 1998).
3) Aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) Este aumento e o conseqüente estresse oxidante na colestase é um dos fatores que
pode levar a lesão celular (KRÄHENBÜHL et al., 1995a; SINGH et al., 1992;
SOKOL et al., 1993). A hipótese oxidativa para explicar parte da lesão colestática,
ganhou sustentação por um série de observações pertinentes ao aumento da
peroxidação lipídica encontrado no sangue de crianças com colestase crônica
(LUBRANO, 1989). Uma peroxidação significativa dos lipídios da membrana foi
demonstrada em hepatócitos isolados e mitocondrios hepáticos seguida à exposição a
ácidos biliares hidrofóbicos (SPIVEY et al., 1993). De LANGE & GLAZER, 1990
utilizando uma concentração milimolar de ácidos biliares demonstraram, num
sistema in vitro, que estes podem inibir a peroxidação (ação antioxidante) em baixas
concentrações de lipídios insaturados enquanto que, em concentrações aumentadas,
os ácidos biliares podem promover a peroxidação lipídica. DAHM (1988)
demonstrou que o ácido litocólico, que é monohidroxilado e, portanto, altamente
hidrofóbico aumentou oito vezes (32-100µmol/L) a liberação de superóxido a partir
de leucócitos polimorfonucleares após preparação com um éster de forbol.
Concentrações similares de ácidos dihidroxilados, embora em concentrações
maiores, causaram um aumento bem menor de superóxido; o ácido cólico produziu
um
aumento
mínimo
na
geração
de
superóxido.
Diferentes
observações
experimentais corroboram a idéia de que a peroxidação lipídica contribui para a lesão
na colestase: 1) a detecção de peroxidação lipídica em mitocrondios isolados de ratos
1 - Introdução
23
com ligadura de colédoco (SOKOL et al., 1991b); 2) há diminuição das defesas
antioxidantes no fígado de ratos com ligadura de colédoco (SINGH et al., 1992) e 3)
o possível efeito pró-oxidante de ácidos biliares em hepatócitos isolados (SOKOL et
al., 1993). Evidências clínicas da geração de radicais livres durante a colestase
incluem: 1) aumento dos níveis plasmáticos de eritrócitos e peróxidos lipídicos no
plasma de crianças com colestase crônica (LEMMONNIER et al., 1987; LUBRANO
et al., 1989), 2) o efeito nocivo da dieta com alto teor de gordura e dos produtos
finais da peroxidação lipídica em crianças com colestase crônica. O conteúdo de
gordura da dieta, parece influenciar a composição lipídica das frações subcelulares
da membrana do hepatócito (KOOLS et al., 1989). Havendo aumento dos ácidos
graxos polinsaturados, os substratos para a peroxidação lipídica estarão aumentados,
consequentemente, existirá uma propensão aumentada para a peroxidação lipídica,
elevação da fosfatase alcalina sérica e aumento da concentração de bilirrubina
(DEEMS et al., 1989). A manipulação de substâncias antioxidantes e pró-oxidantes
da dieta pode modular o grau da lesão hepática por radicais livres durante a colestase
(SOKOL, 1992); a suplementação com vitamina E de crianças com colestase e
deficiência dessa vitamina foi associada a diminuição da concentração dos níveis
séricos de ácidos biliares, sugerindo uma redução da lesão hepática com reversão da
deficiência antioxidante (SOKOL, 1986).
4) Prejuízo na cadeia de transporte mitocondrial - Observou-se que
os ácidos biliares interferem no transporte de elétrons e na fosforilação oxidativa dos
mitocôndrios (LEE & WHITEHOUSE, 1965); há produção aumentada de ROS o que
pode agravar a lesão mitocondrial pois lesam proteínas e membranas lipídicas dessas
organelas, perturbam sua função e, em especial, interferem com a cadeia de
transporte
de
elétrons,
enzimas
da
matriz
mitocondrial
e
β
oxidação
(KRÄHENBUHL et al., 1994b; SOKOL, 1995).
Outra forma de liberação de ROS pelos ácidos biliares é por sua
ação sobre os neutrófilos e os macrófagos, que são frequentemente encontrados no
infiltrado inflamatório do trato portal em fígados colestáticos de humanos e de ratos
com ligadura do colédoco, (KONTOURAS et al., 1984; SCHEUER, 1980). A
1 - Introdução
24
produção de radicais livres por macrófagos isolados de fígado de ratos com colestase
acompanha o aumento da produção de prostaglandinas E2 , caracterizando uma
resposta inflamatória (ADACHI et al., 1992). Em ratos com colestase obstrutiva, as
defesas antioxidantes estão prejudicadas pela redução: a) da concentração de
vitamina E no plasma por má absorção decorrente da falta de ácidos biliares no
intestino delgado; b) das atividades das enzimas peroxidase e transferase da
glutationa no fígado; c) da catalase; d) do selênio no sangue; e) da glutationa total
hepática; f) da dismutase do superóxido e ubiquinona 9 e ubiquinona 10 (SING et al.,
1992;
BEYER,
1990;
HALLIWELL,
1991).
As
enzimas
antioxidantes
contrabalançam a geração de radicais livres. TOGASHI et. al. (1990) demonstraram
que
a
atividade
destas
enzimas
estão
diminuídas
nas
doenças
hepáticas,
possivelmente aumentando a suscetibilidade do fígado à lesão por radicais livres de
oxigênio. A combinação de ácidos biliares, acúmulo de cobre e a depleção das
enzimas antioxidantes leva à lesão do fígado por radicais livres durante a colestase.
1.6.2.2 ÁCIDOS BILIARES E APOPTOSE
O estresse oxidante tem um papel chave na apoptose induzida por
sais biliares (YERUSHALMY et al.,2001). PATEL e colaboradores (1994) usando
cultura
de
hepatócitos
de
ratos
tratados
com
ácidos
biliares
hidrofóbicos
(glicoquenodeoxicólico e glicodeoxicólico) demonstraram mudanças morfológicas
clássicas de apoptose.
A apoptose é um processo fisiológico que contribui para a
renovação celular. Desta forma uma certa proporção de células no fígado estão
constantemente sofrendo apoptose (BURSCH et al., 1990). A apoptose é raramente
reconhecida em secções histológicas em razão da rapidez com que as células
apoptóticas são removidas ou eliminadas (BHATHAL et al., 1985). As células
epiteliais biliares apoptóticas são raramente observadas em razão do seu tamanho
pequeno e a rapidez que são secretadas na bile. Na apoptose das células estreladas
hepáticas (FRIEDMAN, 1999) ocorre uma perda seletiva das células com alta
1 - Introdução
25
expressão dos inibidores tissulares das metaloproteinases (TIMP). A perda seletiva
desta população reduz a inibição das colagenases intersticiais, aumentando a
degradação da cicatriz e apressando a volta a histologia normal.
Há evidências de que o estresse oxidativo contribua para a apoptose
induzida por sais biliares (PATEL & GORES, 1997) - durante a colestase ácidos
biliares em concentrações acima das fisiológicas se acumulam dentro do hepatócito,
distribuem-se
nas
membranas
celulares,
incluindo
a
membrana
interna
dos
mitocondrios onde promovem a geração de radical oxigênio e a conseqüente
peroxidação lipídica.
A peroxidação lipídica por estresse oxidativo é amplamente
reconhecida como um mecanismo indutor da apoptose. Atualmente sabe-se que
baixos níveis de estresse oxidativo com peroxidação lipídica podem resultar em
apoptose. A via bioquímica mais precisa na qual a peroxidação lipídica por produtos
desse estresse resulte em apoptose ou quando o estresse oxidativo é um mecanismo
sinalizador da fase de ocorrência da apoptose permanece obscura (JACOBSON,
1996).
Os ácidos biliares hidrofóbicos estimulam a geração de espécies
reativas de oxigênio em hepatócito isolados, cultura de hepatócitos primários e
mitocondrios purificados de ratos.
O aumento da MPT (transição da permeabilidade da mitocondria)
está associado ao aumento dos mitocondrios, ao colapso do potencial de membrana,
a redução da fosforilação oxidativa, a ruptura da membrana externa dos
mitocondrios, a liberação do citocromo C e a geração de espécies reativas de
oxigênio (LEMASTERS et al., 1998). Ácidos biliares hidrofóbicos induzem a MPT
em mitocôndrias hepáticas e em cultura de hepatócitos primários (BOTLA et al.,
1995; SOKOL, 1999).
Outros estudos revelam o papel para a ativação e translocação da
quinase da proteína c, cuja associação com o aumento do magnésio e ativação de
proteínas endonucleases causam cisão do DNA nuclear (KUROSAWA et al., 1999).
1 - Introdução
26
Alternativamente, tem sido proposto que a indução das MPT por si
só podem aumentar a produção de ROS a partir da cadeia respiratória através da
liberação do citocromo c mitocondrial (LIU et al., 1996) o que então, prejudica a
transferência de elétrons do complexo III e IV da cadeia respiratória. Tem sido
proposto que a cisão do Bid (promotor da apoptose) pela caspase 8 ativada, pode
translocar para a mitocôndria e estimular a liberação do citocromo c (pela indução da
MPT ou por outro mecanismo). É possível que este sinal intracelular estimulado pela
ativação do receptor de morte celular - Fas esteja também envolvido na liberação do
citocromo c. A perturbação resultante da transferência de elétrons pode ter o mesmo
efeito como a inibição direta da atividade do complexo III pelos ácidos biliares,
promovendo um escape de elétrons no complexo III ubiquinona e geração de
superóxido. O aumento de ROS pode sucessivamente causar oxidação crítica dos
tióis localizados nos poros de transição de permeabilidade, causando posteriormente
a MPT com subseqüente liberação do citocromo c dos mitocrondios.
O estresse oxidante desempenha um papel crítico na apoptose
induzida pelos ácidos biliares. Três vias nas quais os ácidos biliares podem iniciar a
apoptose hepatocelular tem sido identificadas:
1) Ativação da apoptose - Recentemente, várias mecanismos de
ação celular tem sido propostos para explicar o envolvimento dos ácidos biliares na
apoptose incluindo o receptor de morte celular (Fas). A apoptose hepatocítica parece
ser iniciada pela ativação do Fas (FAUBION et al., 1999). A oligomerização do Fas
que é um receptor de superfície da transmembrana celular que pode mediar a
apoptose e pertence aos receptores da família do TNF (fator de necrose tumoral) com
subseqüente recrutamento do FADD (Fas associated death domain)-região letal
ativada pelo Fas - pela ação dos sais biliares, resulta na ativação de proteases da
cisteína, referida como caspases, especialmente caspase 8. A caspase 8 atua no
núcleo e ativa a apoptose pela cisão da caspase 3 e a ativação da catepsina B
(SALVESEN & DIXIT, 1997). A ativação do ligando do receptor de morte Fas, tem
sido
mostrado
em
cultura
de
hepatócitos
expostos
a
concentrações
de
glicoquenodeoxicólico que causa apoptose. A ativação deste receptor de morte,
1 - Introdução
27
presumivelmente leva a subseqüente ativação das caspase-8, catepsina B, e atraem
caspases efetoras (3 e 9) que participam da característica fragmentação celular da
apoptose. Os sais biliares tóxicos (glicoquenodeoxicolato e glicodeoxicolato)
induzem apoptose diretamente nos hepatócitos (PATEL et al., 1994) ativando o Fas.
Este estimula o FAAD, que ativa a caspase 8 e apoptose subsequente através da cisão
do Bid e por translocação para dentro da mitocôndria ou por ativação direta das
caspases efetoras distais;
2)
Alterações
mitocondriais
-
Perturbações
da
membrana
mitocondrial são importantes características da apoptose induzida por ácidos biliares.
Considera-se que o mitocôndrio desempenha um papel crítico na indução da
apoptose celular, funcionando como executora central. As evidências para tal ação
são demonstradas pelas seguintes observações: 1) a perda do potencial da membrana
antecede outras características de apoptose em várias células; 2) as proteínas
citoplasmáticas da família das Bcl-2 que regulam as funções de apoptose, pelo menos
em parte, através da ligação e interação com as membranas mitocondriais: 3) a
liberação do citocromo c, que é um fator indutor de apoptose, para dentro do citosol,
onde ativa as caspases efetoras distais. A importância de alterações na
permeabilidade transitória da mitocondria (MPT) tem sido destacada ultimamente
(YERUSHALMY et al., 2001). A MPT se caracteriza por um aumento rápido da
permeabilidade da membrana mitocondrial a solutos de baixo peso molecular,
causado pela abertura de um canal composto de: 1) um translocador de adenina
nucleotídio na membrana interna; 2) um canal de ânions dependente de voltagem, na
membrana externa e 3) a ciclofilina D mitocondrial (LEMASTERS et al., 1998). Os
ácidos biliares induzem o MPT através da produção de ROS - os ácidos biliares
estimulam diretamente a geração pela cadeia respiratória mitocondrial de ROS, por
prejudicarem o transporte de elétrons na cadeia respiratória (promovem o escape de
elétrons no sítio de interação do complexo III ubiquinona aumentando a formação de
superóxido e espécies reativas de oxigênio mais tóxicos). liberação para o citosol do
citocromo c. Rodrigues et al (1998) observaram o efeito citoprotetor do ácido
ursodeoxiclólico, um ácido biliar hidrofílico, que na colestase pode estar relacionada
com sua capacidade de inibir a MPT.
1 - Introdução
28
3) Translocação de Bax - Os ácidos biliares podem ativar a
tranlocação de Bax - uma proteína pró apoptótica - para os mitocondrios, onde
funcionam como um canal para também liberar citocromo c para o citosol onde ativa
as caspases efetoras distais, 3 e 9 (YERUSHALMI et al., 2001). Esta via intracelular
atribuída à ação dos ácidos biliares é semelhante àquela observada em outros
modelos de apoptose, nos quais o Bax estimula a liberação do citocromo c da
mitocôndria o qual se liga ao Apaf-1 (fator ativador de proteases efetoras da
apoptose), que ativa em seguida a caspase-9, resultando na subseqüente ativação de
caspases distais (NARITA et al., 1989; GREEN & KROEMER, 1998).
Em hepatócitos humanos, a apoptose induzida por sais biliares
pode ser evitada pelo ácido biliar hidrofílico tauroursodeóxicolato e também por um
composto antioxidante hepatoprotetor – S-adenosylmethionina (SAME).
A inibição da MPT com bloqueadores específicos tais como a
ciclosporina A melhora a ativação das caspases e apoptose em vários sistemas
celulares (KROEMER & REED, 2000).
Em resumo, a retenção dos ácidos biliares é o principal fator da
lesão hepatocítica na colestase que atua principalmente pela liberação de espécies
reativas de oxigênio e pelo estimulo direto à apoptose.
1.6.2.3 MECANISMOS DA FIBROSE HEPÁTICA NA COLESTASE
A fibrose hepática pode resultar de diversas formas de lesão aguda
ou inflamação. Estudos da morfologia da lesão fibrótica hepática enfatizam o
acúmulo da matriz extra-celular, a transformação de células estreladas para
miofibroblastos ativos, a redução dos lipídios da células estreladas e do retinol total
hepático (BLOMHOFF et al., 1991). O processo que leva à fibrose é semelhante ao
processo de cicatrização, incluindo as fases subsequentes à lesão celular (reparação
celular): inflamação aguda, síntese dos componentes da matriz extra-celular colágena
e não colágena. Se uma agressão inicial persiste, os mecanismos de reparação tissular
1 - Introdução
29
tenderão a se prolongar, aumentando a fibrose tissular que se torna predominante
sobre a regeneração hepatocelular. A substituição da matriz subendotelial normal por
um tecido cicatricial é acelerada pelas células estreladas hepáticas através da
secreção da colagenase tipo IV também chamada de gelatinase A (FRIEDMAN,
1999). Os componentes da matriz extra-celular na fibrose são os mesmos das
condições normais, porém em quantidades muito aumentadas e com distribuição
anatômica diferente e, talvez, em proporções diferentes (SCHUPPAN, 1993).
Diferentes tipos de células hepáticas têm a capacidade de sintetizar
os componentes da matriz extra-celular (FRIEDMAN, 1999), modular o crescimento
celular, a migração de células móveis, a expressão de genes e outras funções
celulares importantes, interagindo diretamente com moléculas de adesão celular e,
indiretamente, pela retenção de biomoléculas mitogênicas nas suas formas ativas e
inativas (SCHUPPAN, 1993). O que desencadeia a atividade destas células para a
produção de matriz extra-celular ou para a sua degradação, são sinais moleculares
representados por diferentes polipeptídeos liberados por vários tipos celulares,
principalmente por linfócitos e macrófagos.
As células de Küpffer ativadas liberam espécies reativas de
oxigênio, mediadores imunológicos e fatores quimiostáticos que aumentam a
resposta inflamatória (SAUER et al., 1995). As células endoteliais também
desempenham um papel importante. Na colestase experimental, elas liberam
rapidamente um pulso de fibronectina para dentro do espaço de Disse. Uma das
isoformas de fibronectina, chamada de fibronectina EIIIA, facilita a ativação de
células estreladas. Desta forma, o início da fibrose pode ser atribuído as células
endoteliais. Estas células tem uma expressão de colágeno aumentada durante a fase
inicial da lesão hepática (MAHER & McGUIRE, 1990), embora sua contribuição
seja quantitativamente menor e qualitativamente diferente quando comparada com a
das células estreladas.
Uma das características mais importantes da fibrogênese hepática é
a ativação de células estreladas hepáticas após uma lesão. Esta ativação parece ser
provocada por três estímulos: deposição rápida de fibronectina, liberação de
1 - Introdução
30
estímulos solúveis pelas células de Küpffer e liberação de espécies reativas de
oxigênio. As células estreladas são consideradas as principais produtoras de matriz
extra-celular na fibrose hepática (PINZANI, 1995). Sua população se expande após
uma lesão hepática e contribuem para a reparação da lesão, remodelando a matriz
extra-celular. Na lesão hepática aguda, ocorre uma expansão na população e
aquisição de características dos miofibroblastos semelhantes à musculatura lisa pelas
células estreladas (MATHEW et al., 1994).
Na lesão hepática crônica as células se diferenciam em células
semelhantes aos miofibroblastos com marcada expressão para α actina de
musculatura lisa e ocasionalmente expressão para desmina. A diferenciação é
gradual, ocorrendo um estágio intermediário no qual elas são chamadas “células de
transição” e é regulada por uma intrincada cadeia de comunicação intercelular entre
células estreladas e células de Küpffer ativadas (macrófagos hepáticos), hepatócitos
danificados, plaquetas , células inflamatórias e endoteliais, envolvendo citoquinas e
mediadores não peptídeos, tais como espécies de oxigênio reativo, eicosanóides e
acetaldeído (HAUTEKEETE, 1997; KAWADA, 1997
As células estreladas ativadas produzem uma grande quantidade de
colágeno tipo I e tipo III (constituintes da chamada matriz fibrilar), substituindo
gradualmente as fibras colágenas normalmente existentes no espaço de Disse (matriz
subendotelial normal) e entre as placas celulares de hepatócitos. A produção de
colágeno dos tipos I e II parece predominar sobre a síntese do colágeno tipo IV e de
outros componentes da matriz extra-celular. Além disso, produzem o fator de
crescimento transformante (TGF-β 1 ) que desencadeia o processo de fibrose hepática.
Na lesão tecidual hepática provocada, como por exemplo, na
administração de CCL4 em ratos ou hepatite viral aguda não complicada em
humanos, a ativação de células estreladas bem como de outras células parenquimais
implica em uma interação complexa dentre os componentes da matriz extra-celular,
citoquinas, fatores de crescimento, polipeptídios e outros mediadores solúveis. Neste
contexto, a quiomiotaxia e proliferação das células estreladas e outras células
produtoras de matriz extra-celular, representam um evento chave na restauração de
1 - Introdução
31
uma rede de matriz extra-celular indispensável para a correta reparação tecidual.
Neste estádio “reversível” de ativação, as células estreladas podem também
contribuir junto com as células endoteliais sinusoidais para a regeneração
hepatocelular pelo suprimento de fatores solúveis como o fator de crescimento
hepatocítico (HGF) (MAHER, 1993).
Estudos realizados nos anos recentes tem enfatizado vários
aspectos importantes, relacionados ao início da ativação da células estreladas. O
primeiro elemento importante diz respeito à interrupção do padrão normal da matriz
extra-celular que se segue a lesão tecidual hepática e inflamação aguda.
A perda da adesão com os vários elementos constituintes da matriz
extra celular semelhantes a membrana basal, no espaço de Disse, é provavelmente o
que determina um marcado aumento das propriedades de síntese e proliferação das
células estreladas hepáticas (PINZANI & MILANI, 1998). Outro importante aspecto
relacionado à iniciação da ativação diz respeito à exposição das células estreladas aos
mediadores solúveis que podem afetar seu potencial de síntese e/ou proliferação.
Estes mediadores, genericamente definidos como mediadores “inflamatórios” podem
estar presentes por tempo limitado ou presentes de forma crônica de acordo com a
natureza, extensão e repetição da lesão parenquimal. As citoquinas constituem a
maior classe de mediadores responsáveis pela “ativação” de células estreladas
hepáticas in vitro e in vivo. Elas são divididas em a) citoquinas mitogênicas - fator de
crescimento transformante α (TGF α), fator de crescimento derivado das plaquetas
(PDGF), interleucina 1 (IL1), fator de necrose tumoral α
(TNFα), fator de
crescimento semelhante à insulina (IGF) e b) citocinas fibrogênicas (fator de
crescimento transformante β (TGFβ) e interleucina 6 (IL6). Adicionalmente a sua
função mitogênica (estimulação da proliferação celular) e propriedades fibrogênicas
(indução da matriz protéica) elas também apresentam uma característica chave da
ativação das células estreladas incluindo a perda de vitamina A, estímulo de
migração,
aumento
da
contratilidade
celular,
indução
da
matriz
das
metaloproteinases e inibidor tecidual da metaloproteinases (TSUKAMOTO, 1999).
Estudos experimentais consolidados indicam que dois fatores de crescimento
1 - Introdução
32
polipeptídios, chamados de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e
fator de crescimento transformante β- 1 (TGF- β) contribuem muito para o papel
fibrogenético das células estreladas hepáticas
(PINZANI & MILANI, 1998). O
papel patogênico do PDGF tem sido demonstrado em vários doenças fibrogênicas,
incluindo glomerulosclerose, fibrose pulmonar e aterosclerose (NAGAOKA et al.,
1990; ROSS, 1993).
O TGF-β é um fator de crescimento multifatorial com propriedades
estimuladoras e inibidoras na proliferação e/ou diferenciação celular, tendo sido
demonstrado claramente associado com a fibrose hepática. Diferentes tipos de
células que sintetizam TGF-β, possuem receptores altamente específicos e são
considerados
moléculas
reguladoras
fundamentais
atuando
por
mecanismos
autócrinos e parácrinos.
Seus efeitos nos fibroblastos, miofibroblastos e pericitos se
caracterizam por aumento da síntese e deposição dos componentes da matriz extracelular (RAGHOW et al., 1987), além de retardar a degradação destes componentes.
Por esta razão, é considerado o fator chave no processo de reparação tecidual e no
desenvolvimento de lesões fibrogênicas. Quando a lesão hepática crônica não é
acompanhada por abundante infiltrado inflamatório, outras substâncias solúveis
podem manter a ativação de células estreladas hepáticas através de outras vias que
são específicas para um tipo particular de lesão (PINZANI & MILANI, 1998).
Outras substâncias como por exemplo o acetaldeído, o principal
metabólito do álcool, pode produzir a transcrição genética e síntese de diferentes
componentes da matriz extra-celular nas células estreladas ativadas (MOSHAGE et
al., 1990; CASINI et al., 1991).
Os produtos da peroxidação lipídica gerados pela exposição ao
etanol ou produção aumentada de ferro (PIETRANGELO et al., 1994), podem
perpetuar a ativação das células. Como já foi mencionado, aldeídos produzidos pela
peroxidação lipídica podem exercer ação fibrogênica direta sobre as células
estreladas ativadas (PAROLA et al, 1993). PAROLA et al. (1996) utilizando o
1 - Introdução
33
modelo de ligadura de colédoco em ratos, observou que o desenvolvimento de lesão
crônica do fígado estava associada com o início da peroxidação lipídica, apontada
pela detecção de compostos carbonil como o 4-hidroxinonenal (HNE) e dialdeído
malônico e desta forma contribuindo para a ativação e a síntese de colágeno pelas
células estreladas.
É portanto, possível, que em função do acúmulo de ácidos biliares,
estes possam indiretamente afetar a produção da matriz extra-celular por induzir
peroxidação lipídica do tecido hepático (PINZANI, 1998).
1.6.2.4.MECANISMOS DE PROLIFERAÇÃO DUCTAL NA COLESTASE
O
bloqueio
completo
ou
incompleto
da
secreção
biliar,
especialmente quando causado por doenças dos ductos biliares intra e extra-hepáticos
está associado a reação ductular. Este têrmo também se refere ao aumento do perfil
ductular na periferia do trato portal que se extende gradualmente por todo trato
periportal. O aumento número de estruturas ductulares é acompanhada por edema e
infiltração de leucócitos polimorfonucleados neutrofílicos (colangiolite) e fibrose. O
aumento nas estruturas ductulares é devida a proliferação ativa de ductulos préexistentes (especialmente na obstrução mecânica) ou por metaplasia ductular de
hepatócitos da zona acinar 1 (predominante nos casos de obstrução completa do
fluxo biliar) (DESMET, 1986).
A proliferação ductal é a lesão hepática mais proeminente em ratos
com colestase por obstrução experimental do colédoco (CAMERON & OAKEY,
1932), e está usualmente associada a fibrose portal progressiva. Níveis elevados de
ácidos biliares após ingestão de ácidos biliares estimulam a proliferação ductal
(ALPINI et al.,1999)
1 - Introdução
34
1.7 ESTRESSE OXIDANTE
Radicais livres são gerados pelo metabolismo celular em condições
fisiológicas ou em decorrência de processos patológicos. São potencialmente tóxicos,
tendo como alvos principais as proteínas, lipídios insaturados e ácidos nucléicos,
com os quais formam ligações covalentes irreversíveis, levando à inativação ou
destruição de enzimas, perturbações funcionais da membrana celular e alterações nas
cadeias dos ácidos nucléicos. Na maioria das doenças humanas há formação
aumentada de radicais livres, secundária ao processo da doença primária, agravandoas (NEUSCHWANDER-TETRI, 1996). Existem razoáveis evidências para sugerir
que reações de radicais livres resultem em contribuição significativa aos processos
patológicos,
tais
como:
envelhecimento,
carcinogênese,
aterosclerose,
artrite
reumatóide, algumas formas de síndrome de desconforto respiratório agudo, lesão
por reoxigenação e dano isquêmico ou traumático do sistema nervoso central
(HALLIWELL,l991). A produção de radicais livres se realiza através de várias
reações em cadeia que, partindo de radicais pouco tóxicos, como o ânion superóxido
O-2 , leva à formação de substâncias altamente reativas como o .OH, .HOCI, H2 O-2 .
Radicais peróxido e aldeídos citotóxicos podem também causar graves prejuízos nas
proteínas das membranas incluindo seus receptores e enzimas associadas.
O organismo foi equipado com mecanismos de equilíbrio entre
oxidantes e antioxidantes (BAST, 1991). Existem enzimas que funcionam como
bloqueadores desses processos, tais como a dismutase de superóxido (SOD), a
catalase e a peroxidase da glutationa, que eliminam ou previnem a formação de
radicais livres (HALLIWELL, 1985; ARTHUR et al., 1985). Elas são caracterizadas
por um conteúdo altamente específico e atuam de maneira complementar no
envolvimento
do
metais
na
catálise
incluindo
o
cobre,
zinco,
manganês
(GUTTERIDGE, 1994), selênio; ferro (heme). As defesas antioxidantes também
incluem moléculas que reagem diretamente com os radicais livres, dentre elas a
bilirrubina ou queladores de metais ionizados como a carmosina e creatinina, o ácido
úrico e as vitaminas A, C e E (DeLANGE & GLAZER, 1990).
1 - Introdução
35
A retenção primária ou secundária de metais pesados e ácidos
biliares pode exercer efeitos pró-fibrogênicos e mesmo pró-carcinogênicos no fígado,
por manter uma condição de estresse oxidativo.
1.7.1 ESTRESSE OXIDANTE NA PATOGENIA DA LESÃO HEPÁTICA DA
COLESTASE
O mecanismo da doença colestática do fígado ainda não é bem
compreendido. Embora exista um grande número de hipóteses para explicar como o
prejuízo do fluxo biliar leva à lesão hepática (ATTILI et al., 1986), a maioria dos
pesquisadores acreditam que o acúmulo dos ácidos biliares no hepatócito é o fator
chave envolvido (GREIN et al., 1972; (SCHÖLMERICH et al., 1984).Estes efeitos
resultam das propriedades detergentes dos sais biliares (SCHARSCHMIDYT et al.,
1981; GREIN et al., 1972; COMBETTES et al., 1988; REICHEM, 1994); alterações
na homeostase do cálcio intracelular, lesão mitocondrial e depleção de ATP
intracelular.
Outro mecanismo pelo qual a colestase pode levar a lesão celular e
a promoção da fibrogênese hepática, é o “estresse oxidante” (KRÄHENBÜHL et al,
1995a; SINGH, 1992; SOKOL,1993). O aumento da produção de espécies reativas
de oxigênio (ROS) e o conseqüente estresse oxidante na colestase (SOKOL, 1991b).é
um dos fatores que pode levar a lesão celular (KRÄHENBÜHL et al., 1995a; SINGH
et al., 1992; SOKOL et al., 1993). A hipótese oxidativa para explicar parte da lesão
colestática, ganhou sustentação por um série de observações pertinentes ao aumento
da peroxidação lipídica encontrado no sangue de crianças com colestase crônica
(LUBRANO et al., 1989). Tem sido proposto que outras propriedades dos ácidos
biliares hidrofóbicos são responsáveis pela citotoxicidade. A lesão hepática por
radicais livres, particularmente a dos lipídios das membranas, pode ocorrer durante a
colestase e a manipulação de substâncias antioxidantes e pró-oxidantes da dieta pode
modular o grau dessa lesão.
1 - Introdução
36
DAHM & HEWETT (1988), demonstraram que ácidos biliares
hidrofóbicos (ácido litocólico, ácido quenodeóxicólico e ácido deóxicólico)
estimulam a liberação de superóxido a partir de leucócitos polifomorfonucleados
preparados com éster de forbol. Estes ácidos, quando se acumulam durante a
colestase ultrapassando a capacidade de proteínas a que estão ligados (PATEL &
GORES, 1997) tem a capacidade de induzir a ativação de neutrófilos gerando
espécies de oxigênio. Os neutrófilos são comumente vistos no infiltrado
inflamatório do trato portal em fígados colestáticos de humanos e em ratos com
ligadura de colédoco sendo desta forma possível que espécies reativas de oxigênio
derivados de neutrófilos possam contribuir para a lesão hepática (KONTOURAS et
al., 1984; SCHEUER, 1980). A ação dos ácidos biliares sobre os macrófagos,
aumentam a produção de mediadores inflamatórios como os leucotrienos, o TNF α,
as interleucinas e o TGFβ (SCHÖLMERICH & STRAUB, 1992).
O cobre acumulado em fígados colestáticos (STERNLIEB, 1980)
pode catalizar a reação de Haber-Weiss, que converte H2 O-2 em radicais hidroxilas
livres
que
são
extremamente
reativos
(HALLIWELL,1982).
Estes
atuam
rapidamente e danificam os ácidos graxos poliinsaturados, proteínas ricas em radicais
tiol e ácidos nucléicos (HALLIWELL, 1991).
O ferro da mesma forma que o cobre é capaz de catalizar a reação
para a produção de radicais hidroxilas livres à partir de ânion superóxido e água
oxigenada.
Evidências clínicas da geração de radicais livres durante a colestase
incluem o aumento dos níveis plasmáticos de eritrócitos e peróxidos lipídicos
LEMMONNIER et al.,1987; LUBRANO et al., 1989). Além disso, suplementação
com vitamina E de crianças com deficiência, foi associada com diminuição da
concentração os níveis séricos de ácidos biliares, sugerindo uma redução da lesão
hepática com reversão da deficiência antioxidante (SOKOL et al., 1986).
Evidências experimentais constatam o efeito nocivo da dieta com
altos teores de gorduras. Esta parece influenciar a composição lipídica das frações
1 - Introdução
37
subcelulares da membrana do hepatócito (KOOLS et al., 1989). Havendo aumento
dos ácidos graxos poliinsaturados, os substratos para a peroxidação lipídica estarão
aumentados,
havendo
consequentemente
uma
propensão
aumentada
para
a
peroxidação lipídica, elevação da fosfatase alcalina sérica e da concentração de
bilirrubina (DEEMS et al., 1989).
Os mitocondrios são outra fonte de radicais livres. Sokol e
colaboradores (1995) mostraram que neles os ácidos biliares levam à produção
daqueles radicais que, lesando proteínas e membranas lipídicas dessas organelas
(SOKOL,1991b; OETTING-DEEMS,1993), perturbam sua função, em especial
interferem com a cadeia de transporte de elétrons, enzimas da matriz mitocondrial e
β oxidação. A atividade de vários complexos enzimáticos da cadeia de transporte de
elétrons, de enzimas localizadas na matriz mitocondrial e a β oxidação mitocondrial
estão diminuídas em ratos com ligadura e secção de colédoco (SINGH et al.,1992;
KRÄHENBÜHL et al., 1994), em decorrência da lesão de suas proteínas e lipídios.
Confirmando esses achados, ADACHI et al. (1992) mostraram
além de aumento na produção de radicais livres, aumento na produção de
prostaglandinas E2 , por macrófagos isolados de fígado de ratos com colestase. Em
ratos com colestase obstrutiva, as defesas antioxidantes estão prejudicadas pela
redução: a) da concentração de vitamina E no plasma por má absorção decorrente da
falta de ácidos biliares no intestino delgado; b) das atividades das enzimas
peroxidase e transferase da glutationa no fígado; c) da catalase; d) do selênio no
sangue; e) da glutationa total hepática; f) ubiquinona 9 e ubiquinona 10 que são
eficientes antioxidantes (SING et al.,1992; BEYER, 1990).
As enzimas antioxidantes: peroxidase da glutationa, a catalase e a
dismutase do superóxido (HALLIWELL, 1991) contrabalançam a geração de
radicais livres. A atividade destas enzimas está diminuída em fígados colestáticos,
aumentando ainda mais a susceptibilidade do fígado à lesão por radicais livres
(TOGASHI et al., 1990).
1 - Introdução
38
Os ácidos biliares são antioxidantes efetivos em concentrações
fisiológicas, porém podem aumentar a peroxidação lipídica em concentrações
aumentadas de lipídios insaturados (DELANGE & GLAZER, 1990). Atualmente
sabe-se que baixos níveis de estresse oxidativo com peroxidação lipídica podem
resultar em apoptose (WILLIE et al., 1990)
A extensa peroxidação lipídica é afetada por vários fatores que
incluem não somente a relação lipídio/proteína, do colesterol ligado a membrana e do
estado redox da vitamina E ligada a membrana, mas também da disponibilidade das
defesas antioxidantes.
1.8. VITAMINA A
A vitamina A (retinol, ácido retinóico e seus derivados) está
relacionada com importantes funções biológicas, tais como: visão, reprodução,
crescimento, diferenciação celular, morfogênese e desenvolvimento embrionário
(OLSON, 1984; FURUSHO et al., 1998; BOWMAN et al., 1990; KATO et al.,
1992). As propriedades antioxidantes de carotenóides, que são precursores da
vitamina A, conferem um papel protetor destes sobre as membranas biológicas que
parece ser complementar ao da vitamina E.
Os retinóides exercem profundos efeitos na proliferação celular,
diferenciação e apoptose o que os torna agentes promissores no tratamento do câncer
( BACHMAIR et al., 2000).
A vitamina A intervém em muitos outros processos fisiológicos,
incluindo a resposta imunológica, o paladar, a audição, o apetite. Quase todos eles
dependem da diferenciação celular.
Tem sido demonstrado que os retinóides são moduladores da
expressão de uma variedade de genes codificadores de: 1) fator de crescimento; 2)
receptores do fator de crescimento; 3) componentes de sinais de trasdução; 4)
protooncogênese e 6) fator de transcrição de moléculas (LOTAN, 1994).
1 - Introdução
39
Em função do efeito da vitamina A na proliferação e diferenciação
de células epiteliais, têm aumentado as evidências dos possíveis efeitos desta
vitamina na integridade e recuperação dos epitélios na doença colestática envolvendo
lesão do ducto biliar, como por exemplo: atresia biliar, cirrose biliar primária e
colangite esclerosante primária (SOKOL, l994).
1.9 EFEITOS DA COLESTASE NO METABOLISMO DA VITAMINA A
Várias perturbações no metabolismo hepático de vitamina A estão
presentes na doença colestática crônica. Em condições desfavoráveis, a vitamina
lipossolúvel A, pode sofrer interferência na sua absorção. Especialmente na vigência
da colestase, uma diminuição do fluxo biliar adequado para solubilização
intraluminal de ácidos graxos ingeridos, resultará numa diminuição na sua absorção
(REICHEN & SIMON, l994). A deficiência de vitamina A tem sido observada em 35
a 69 % de crianças com esta condição (BOOK et al., 1984).
A má absorção pode ser agravada em crianças e adultos, pela baixa
ingestão de alimentos que contenham vitamina A, tais como produtos lácteos, órgãos
internos, folhas e vegetais verdes e amarelos, frutas. Além disso, se houver má
nutrição protéica, deficiência de zinco ou função de síntese hepática deprimida, a
secreção de proteína ligadora de retinol (RBP) é diminuída, levando a baixos níveis
plasmáticos
de
retinol,
prejudicando
a
liberação
deste
para
tecidos-alvo
(MOBARHAN et al., 1981; McCLAIN et al.,1979).
A avaliação do status da vitamina na colestase é dificultado por
uma má correlação entre concentrações sérica e hepática de vitamina A. Geralmente,
níveis séricos abaixo de 20 µg/dL correlaciona-se com estoques hepáticos deficientes
da vitamina. Por outro lado, Amedee-Manesme et al. (1987) demonstraram que
níveis plasmáticos de retinol menores que 20 µg/dL poderiam estar associados com
concentrações hepáticas normais de vitamina A em crianças colestáticas. Em
crianças com colestase crônica, níveis sérico acima de 20 µg/dL, que são
habitualmente considerados normais, poderiam estar associados com níveis de
1 - Introdução
40
vitamina A abaixo de 20 µg/dL por quilo de peso do fígado, um valor indicativo de
deficiência.
A detecção da deficiência de vitamina A em pacientes com
colestase é importante pois pode levar a xeroftalmia, queratomalácia e lesão
irreversível da córnea, cegueira noturna e retinopatia pigmentar. Embora os sinais de
lesão ocular sejam raros em crianças com colestase crônica, o potencial para o
prejuízo da visão existe. Além disso, a deficiência pode determinar um risco maior
de infecção e todas as manifestações atribuídas a falta desta vitamina.
1.10 RELAÇÃO ENTRE A VITAMINA A E A FIBROGÊNESE HEPÁTICA
As células estreladas perisinusoidais têm, ao mesmo tempo, a
capacidade de armazenar vitamina A e de se transformar em miofibroblastos (WISSE
et al., 1996). Cerca de 80 a 90% dos retinóides na forma de ésteres de retinil do
organismo, estão armazenados no citoplasma destas células em gotículas de gordura.
As células estreladas são a fonte primária da matriz extra-celular, não somente em
fígados normais (WAKE,1980) mas também em fígados doentes (KENT et al.,
1977). Na intoxicação pela vitamina A, hipertrofia, proliferação de células estreladas
e transformação em células semelhantes aos miofibroblastos podem levar à
hipertensão portal não cirrótica, fibrose e cirrose (HAUTEKEETE, 1997).
Os
níveis
hepáticos
de
vitamina
A
são
positivamente
correlacionados com a ingestão dietética. Sua baixa concentração no fígado, pode ser
resultado da perda excessiva do retinol nas fezes em consequência da má absorção de
gorduras ou por defeitos específicos na sua absorção.
Em condições fisiológicas, as células estreladas têm um papel
central na regulação da homeostase de retinóides; expressam receptores específicos
para proteína ligadora de retinol (retinol binding protein – RBP), uma proteína de
ligação de retinol na sua superfície celular e captam o complexo RBP-retinol por
endocitose mediado por receptor. Em condições patológicas, quando há estímulo
1 - Introdução
41
para a produção de fibrose, estas células perdem retinóides e sintetizam grandes
quantidades
de
componentes
da
matriz
extra-celular,
incluindo
colágeno,
proteoglicanos e glicoproteínas adesivas (SENOO et al., 1998).
Experimentos in vitro têm mostrado que a vitamina A tem uma
ação direta na permeabilidade de organelas como os lisossomos de ratos ou
mitocrondios hepáticos e em cultura de tecido ósseo.
KNOOK et al. (1995) estudaram a relação entre a vitamina A e a
fibrose hepática em ratos submetidos a intoxicação pelo CC14. Dependendo do
tempo de administração, a vitamina A pode aumentar ou reduzir a fibrose - quando
presente durante o tratamento com CC14 a el são de células parenquimais e fibrose
são aumentadas, enquanto que após tratamento com vitamina A, a fibrose foi
bastante reduzida. A fibrose aumentada foi também encontrada em ratos com baixos
níveis de retinol hepático.
SEIFERT et al. (1995) utilizando administração oral de beta
caroteno (pró vitamina A), em ratos submetidos a tratamento com CC14, observaram
diminuição significativa do conteúdo hepático de hidroxiprolina e fibrose hepática
mais leve, quando comparada com a de ratos não tratados com beta caroteno. Assim
a administração de beta caroteno previne a perda de retinóides na lesão hepática
provocada pelo CCl4 e poderia ser utilizado na terapêutica da fibrose hepática, sem
os efeitos tóxicos das formas mais ativas de vitamina A.
Um
estudo
recente sugeriu que os efeitos divergentes na
fibrogênese estão relacionadas a ação diversa dos isômeros; em cultura de células
estreladas, o ácido retinóico trans inibiu significativamente a síntese de pró-colágeno
tipo I, III e IV, fibronectina, laminina enquanto que o ácido retinóico 9-cis causou
um aumento no RNAm para o pró-colágeno (HELLEMANS et al, 1999).
O retinol modula a resposta imune através da atuação sobre os
macrófagos e neutrófilos que tem dramáticos efeitos na toxidade de alguns
compostos. O retinol administrado em ratos antes de substâncias hepatotóxicas
prepara as células de Küpffer para o estado ativado. Isto pode ocorrer em parte, como
1 - Introdução
42
resultado de um aumento dos mediadores químicos como o fator de necrose tumoral
(tumor necrosis factor –TNF) das células de Küpffer. As substâncias hepatotóxicas
provocam a ativação destas células, liberando espécies reativas de oxigênio,
mediadores imunes e fatores quimiotáticos que levam ao aumento da resposta
inflamatória. Esta intensificação acentua a lesão hepatocítica (SAUER et al., 1995).
1.11 ALTERAÇÕES NUTRICIONAIS NA COLESTASE
O fígado desempenha um papel importante na digestão, absorção,
armazenagem e metabolismo de vários micronutrientes. A deficiência de vitaminas e
minerais pode ser resultante de interferências com alguns ou todos estes processos.
Além disso, uma ingestão dietética diminuída e anorexia podem contribuir muito
para a má nutrição. Sem dúvida, a ingestão dietética diminuída é a causa mais
importante das deficiências de vitaminas e sais minerais entre os pacientes com
colestase.
A diminuição da concentração intraluminal de ácidos biliares na
doença colestática, resulta em interferências nas fases da digestão, absorção,
armazenamento e metabolismos de vários nutrientes. Na doença hepática ocorre uma
diminuição dos micronutrientes tais como o folato, riboflavina, nicotinamida, ácido
pantotênico, vitamina B6 , vitamina B12 , vitamina A, zinco e cobalto. As razões da
diminuição na armazenagem parece ser complexa - por diminuição do espaço para
armazenagem devido a deposição de tecido fibroso; por infiltração gordurosa e por
degeneração hepatocelular parecem importantes. Pode ocorrer também defeitos
específicos na captação de micronutrientes vindos ou liberados da circulação. Ainda
assim, no pacientes com doença hepática, prejuízo no metabolismo das vitaminas e
minerais pode resultar em aumento da perda de nutrientes, aumento da demanda de
nutrientes ou inabilidade para utilizar e transportar um nutriente mesmo quando há
suprimento adequado destes - "desnutrição funcional".
1 - Introdução
43
1.12 VITAMINA A NO TRATAMENTO DA COLESTASE
A suplementação rotineira de compostos de vitamina A para
prevenir a deficiência têm sido recomendada por vários grupos. Todavia, um
recomendação ideal para monitorar a reposição, bem como proteger contra a
toxicidade ainda não são concordantes. Um grupo francês recomenda injeção
intramuscular de 100.000 U.I. (33.000 µg) de retinil palmitato numa preparação
aquosa a cada 2 meses por pelo menos 6 meses em paciente que apresentem
deficiência (ALLAGILE, 1985). Esta forma de vitamina A requer dados de pesquisa
que ainda não estão totalmente documentados sobre a toxicidade e a eficácia do
suplemento em número significante de pacientes tratados por esta via.
Outros pesquisadores recomendam dose oral elevada de ésteres de
vitamina A (25.000-50.000 U.I. por dia), embora exista pouca documentação sobre a
adequação e eficácia deste tratamento (BALISTRERI,1985).
Durante a colestase, o uso da vitamina E numa preparação solúvel
em água, chamada TPGS (D-alpha-tocopheryl-polyethylene glycol-1000 succinate),
aumenta a absorção de outras moléculas lipossolúveis como a ciclosporina (SOKOL
et al,. 1991) e a vitamina D (ARGAO et al, 1990). Desta forma, a co-administração
oral de suplemento de vitamina A e TPGS pode ser um meio de melhorar a
solubilização e conseqüentemente, a absorção de vitamina A durante a colestase,
particularmente aqueles que estão sob de reposição da vitamina E. A administração
destas duas vitaminas poderia excluir a necessidade de injeção intra-muscular de
vitamina A resultando em uma dose oral menor de vitamina A (como por exemplo
5.000-20.000 U.I./dia). Esta estratégia para reposição oral está sob investigação. A
preparação múltipla contendo 5.000 U.I. de vitamina A e TPGS, administrada duas
vezes por dia, para crianças com colestase crônica poderá proporcionar a dose de
vitamina A adequada (10.000) por dia.
1 - Introdução
44
As doses de vitamina A prescritas para crianças com colestase
crônica (25.000-50.000 U.I. por dia) podem causar hepatoxicidade, considerando a
variabilidade individual, se adequadamente absorvida.
Considerando a má absorção de vitamina A na colestase e o papel
de sua deficiência no agravamento da lesão hepática, nos propusemos a estudar o
possível efeito hepatoprotetor da administração de vitamina A hidromiscível no
modelo esperimental de colestase por obstrução do colédoco em ratos jovens.
1.13 APRESENTAÇÃO DO PROBLEMA
A má-absorção de vitamina A na colestase resulta em deficiência
dessa vitamina e, assim em prejuízo das defesas anti-oxidantes. Como os radicais
livres são intermediários na morte celular e na fibrose e como a vitamina A parece
inibir a ativação das células estreladas e assim, diminuir a fibrose hepática, nos
propusemos estudar os efeitos da administração de uma forma hidromiscível de
vitamina A em ratos jovens com colestase obstrutiva por dupla ligadura e secção do
colédoco. Para avaliar os efeitos sobre a lesão hepática foi feita uma determinação
semi-quantitativa da intensidade de fibrose, inflamação e proliferação ductal. Para
avaliar os efeitos sobre o aproveitamento da vitamina A hidromiscível na presença de
colestase e da lesão hepática decorrente foram feitas determinações da vitamina A
sérica. Os efeitos da colestase e da administração vitamina A hidromiscível sobre a
manutenção da função hepática foram medidos por meio da mortalidade espontânea
e após pentobarbital.
2 - Objetivos
2.
46
OBJETIVOS
O trabalho apresentado teve como objetivo, testar as seguintes
hipóteses:
PRIMEIRA HIPÓTESE
A administração de vitamina A hidromiscível interfere nos efeitos
da colestase sobre o nível sérico de vitamina A.(retinil palmitato).
SEGUNDA HIPÓTESE
A administração de vitamina A hidromiscível interfere com os
efeitos da colestase na função hepática.
TERCEIRA HIPÓTESE
A administração de vitamina A hidromiscível interfere com os
efeitos da colestase na lesão hepática.
3 -Material e Métodos
48
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 PLANEJAMENTO DO EXPERIMENTO
3.1.1 PRIMEIRA HIPÓTESE
A administração de vitamina A hidromiscível interfere nos efeitos da
colestase sobre o nível sérico de vitamina.
3.1.1.1 Variáveis Independentes
Presença ou não de colestase
Quantidade de vitamina A hidromiscível administrada
3.1.1.2 Variáveis Dependentes
Níveis séricos de vitamina A
3.1.2 SEGUNDA HIPÓTESE
A administração de vitamina A hidromiscível interfere com os efeitos da
colestase na função hepática.
3.1.2.1 Variáveis independentes
Presença ou não de colestase
Quantidade de vitamina A administrada
3.1.2.2 Variáveis dependentes
Mortalidade Expontânea
Mortalidade após a administração de pentobarbital
3.1.3. TERCEIRA HIPÓTESE
A administração de vitamina A hidromiscível interfere nos efeitos da
colestase na lesão hepática.
3.1.4.1 Variáveis independentes
Presença ou não de colestase
Quantidade de vitamina A administrada
3.1.4.2 Variáveis dependentes
Intensidade da fibrose
Intensidade da Inflamação
Intensidade da Proliferação ductal
3 -Material e Métodos
49
3.2. GRUPOS EXPERIMENTAIS:
Foram incluídos no experimento 134 ratos divididos em 6 grupos;
conforme quadro abaixo:
GRUPO
SA 0
SA 50
SA 100
LA 0
LA 50
LA 100
Número de
animais
11
12
11
77
12
11
Número de animais utilizados por variável estudada
Níveis séricos
Mortalidade
Mortalidade após
Histologia
de V.A.
espontânea
Pentabarbital
10
10
10
10
10
10
10
10
10
77
10
11
11
12
11
11
12
11
10
10
10
10
10
10
3.2.1 Descrição dos Grupos
GRUPO LA 0: ligadura e secção do ducto no 21ºdia de vida e sacrifício no 69º dia
de vida. Administração diária de solução salina, por gavagem, no volume de 0,5 ml/g
de peso.
GRUPO LA 50: ligadura e ressecção do ducto biliar no 21ºdia de vida e sacrifício
no 69º dia de vida. Administração diária de vitamina A hidromiscível Roche após o
procedimento cirúrgico, por gavagem, no volume de 50 U.I./g de peso.
GRUPO LA 100: ligadura e ressecção do ducto biliar no 21ºdia de vida e sacrifício
no 69º dia de vida. Administração diária de vitamina A hidromiscível Roche após o
procedimento cirúrgico, por gavagem, no volume de 100 U.I./g de peso.
GRUPO SA 0: operação simulada no 21º dia de vida e sacrifício no 69º dia de vida.
Administração diária de solução salina após o procedimento cirúrgico, por gavagem,
no mesmo volume que os grupos anteriores.
GRUPO SA 50: operação simulada no 21º dia de vida e sacrifício no 69º dia de vida.
Administração diária de vitamina A hidromiscível Roche após o procedimento
cirúrgico, por gavagem, no volume de 50 U.I./g de peso.
GRUPO SA 100: operação simulada no 21º dia de vida e sacrifício no 69º dia de
vida. Administração diária de vitamina A hidromiscível Roche após o procedimento
cirúrgico, por gavagem, no volume de 100 U.I./g de peso.
3 -Material e Métodos
50
3.3 EXECUÇÃO DO EXPERIMENTO
3.3.1 Animais - Origem, manutenção, dieta e sacrifício
Os animais, da raça Wistar, foram acasalados no Biotério de
Pesquisa do Laboratório de Pediatria, da Faculdade de Medicina de Botucatu. Após o
nascimento, foram alocados em ninhadas de seis filhotes machos para cada fêmea até
o momento de desmame (vinte e um dias após o nascimento). Durante o período de
desmame até o sacrifício, foram alimentados “ad libitum” com ração isenta de
Vitamina A produzida no Biotério (ver anexo 1). A ingestão e sobras de ração foram
avaliadas diariamente. Os animais foram colocados em gaiolas de plástico, mantidos
a uma temperatura ambiente de 21 a 24 ºC, com o controle de umidade e ciclo de luz
claro e escuro de doze horas. Todos os animais usados no estudo foram alimentados,
anestesiados e sacrificados de acordo com as recomendações do “Guide care and use
of experimental animais” (1984) do Conselho Canadense de Cuidado Animal.
O sacrifício foi realizado no 69º dia de vida, sob anestesia de éter
etílico e exsanguínação através de punção cardíaca.
O protocolo descritivo do estudo usando modelo experimental com
animais foi submetido e aprovado pela CEEA - COMISSÃO DE ÉTICA NA
EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL - Instituto de Biociências - UNESP - BOTUCATU
(anexo 2).
3.3.2
Ligadura e ressecção do ducto biliar
A ligadura e ressecção do ducto biliar foi realizada segundo a
técnica descrita por CAMERON & OAKLEY (1932) com algumas modificações.
Os animais dos grupos LA0, LA50 e LA100 foram submetidos a
anestesia superficial por inalação de éter etílico e colocados em decúbito dorsal
horizontal na mesa cirúrgica. Em seguida foi realizada a tricotomia da parede
abdominal anterior e realizada a incisão da pele na linha mediana, desde o apêndice
3 -Material e Métodos
51
sifóide até a sínfese pubiana, expondo as camadas musculares e a linha alba. A
parede da linha alba sofreu incisão de igual tamanho. O peritônio foi aberto com
tesoura e foram expostos os órgãos abdominais. O bordo do fígado foi rebatido para
trás e o duodeno abaixado expondo-se assim o ducto biliar. Foi dissecado o ducto
biliar desde abaixo da entrada do último ducto lobar até a sua porção distal, próxima
ao duodeno, seguida por dupla ligadura, sendo as ligaduras colocadas o mais
proximal e o mais distalmente possível. A porção do ducto biliar entre as ligaduras
foi ressecada. Terminados os procedimentos, a parede abdominal foi fechada com
sutura contínua.
3.3.3 Operação Simulada
Os animais dos grupos SA0, SA50 e SA100 foram submetidos aos
mesmos procedimentos descritos para os grupos LA0, LA50 e LA100. Após a
exposição e dissecção do ducto biliar, os fios correspondentes à dupla ligadura foram
passados em torno do ducto biliar, porém sem o procedimento da amarração e
ressecção. Os fios foram retirados e o ducto biliar mantido intacto. O fechamento foi
feito da mesma forma que a operação anterior.
3.3.4 Administração de vitamina A hidromiscível
Os animais dos grupos LA 50, LA 100, SA 50 e SA 100 receberam
50 e 100 U.I. por g de peso de Vitamina A Hidromiscível Roche , respectivamente,
administrados por gavagem por 48 dias, iniciando no dia seguinte após os
procedimentos cirúrgicos. Os animais do grupo LA0 e SA0 receberam solução salina
em igual volume.
3 -Material e Métodos
52
3.3.5 Colheita de sangue e sacrifício
Todos os animais dos grupos foram sacrificados no 69º de vida (48
dias após a cirurgia de ressecção do ducto biliar e operação simulada). Foram
anestesiados por inalação com éter etílico e, seguindo os mesmos procedimentos da
técnica descrita para o acesso ao ducto biliar (item3.2.2), sacrificados por
exsanguinação através da punção cardíaca. O sangue colhido foi encaminhado para a
dosagem sérica da vitamina A.
3.3.6 Observações e medidas realizadas durante o experimento
3.3.6.1 Mortalidade espontânea
A frequência de mortalidade espontânea foi medida pelos óbitos
ocorridos desde uma semana até 48 dias após o procedimento cirúrgico.
3.3.6.2 Mortalidade após dose de pentobarbital
Um dia antes do sacrifício (68 dias), foi administrada uma dose de
0,5 mg/g/peso corporal, de Pentobarbital a 3%, e avaliada a mortalidade.
3.4 ESTUDOS REALIZADOS APÓS O SACRIFÍCIO
3.4.1 Métodos Bioquímicos
No momento do sacrifício foram coletados 5 ml de sangue por
punção cardíaca para exame bioquímico: dosagem da concentração de vitamina A no
soro expressa em µg/dL, utilizando-se a técnica modificada de Bessey-Lowry
3 -Material e Métodos
53
(dosagem de retinol sérico. A sala de cirurgia permaneceu protegida da luz, sendo
somente utilizada lâmpada amarela para permitir a realização destes procedimentos.
3.4.2 Métodos Histológicos
O fígado do animal foi dissecado, examinado e pesado. Um
fragmento de 0,3 a 0,5 cm será retirado do lóbulo esquerdo no sentido longitudinal e
colocado em formol a l0% v/v em salina, e encaminhado ao Laboratório do
Departamento de Patologia para inclusão em parafina, realização de microsecções,
colocação em lâminas e coloração pelos métodos de H.E. (hematoxilina e eosina) e
tricrômico de Masson. Para cada animal foram realizados 2 cortes. Para avaliar a
intensidade das lesões histológicas, as lâminas de todos os animais foram analisadas
individualmente e de maneira aleatória, sem que o observador tivesse conhecimento
de qual grupo o animal pertencia. Na avaliação da fibrose foi atribuído o escore de
Ruwart (RUWART, 1989) a cada animal de acordo com os seguintes critérios: 0
normal ou discreto aumento de colágeno; 1- aumento de colágeno sem formação de
septos porém com formação de expansões estelares portais ou fibrose pericelular; 2aumento do colágeno com septos incompletos; 3- aumento do colágeno com septos
finos. Para avaliar a intensidade da inflamação foi atribuído o valor 0 para a ausência
de células inflamatórias, valor 1 para presença de células inflamatórias em menos de
um terço do trato portal (proliferação discreta), valor 2 - presença de células
inflamatórias de um terço a dois terços do trato portal (moderada), e valor 3, com a
presença de células inflamatórias em mais de dois terço do trato portal (intensa).
Foram também avaliadas a proliferação ductal atribuindo a cada animal escores da
seguinte forma: 0 - proliferação ausente , 1- proliferação discreta restrita à área
portal, 2 proliferação moderada acompanhando o septo portal e 3- proliferação
intensa, acompanhando os septos.
3 -Material e Métodos
54
3.5 ANÁLISE DOS RESULTADOS
3.5.1 Métodos Estatísticos Descritivos
Para resultados de cada variável em cada tratamento foram
calculados indicadores de tendência central (média e medianas) e medidas de
dispersão (desvio padrão, coeficiente de variação, valores extremos e amplitude de
variação).
Os resultados de cada variável nos diferentes tratamentos foram
comparados entre si pela análise de variância com dois fatores (fator 1 - ligadura ou
não; fator 2 - vitamina A ou não).
3.5.2
Métodos Estatísticos Inferenciais
Os resultados da variável contínua estudada (vitamina A) foram
submetidos à verificação da normalidade e da igualdade de variância das amostras.
Se estas condições fossem satisfeitas seria aplicada o teste de variância para dois
fatores (administração de vitamina A ou não e presença de colestase ou não). Este
teste considera as diferenças associadas a cada fator, independente do efeito do outro,
bem como a interação dos dois fatores. Como não houve igualdade de variância e a
distribuição das amostras não foi normal, os valores foram substituídos pelo seu
número de ordem e a eles foi aplicada a análise de variâncias com dois fatores. No
caso de variáveis ordinais (intensidade da fibrose, inflamação e proliferação ductal),
a análise de variância com dois fatores foi aplicada aos números de ordem
Havendo interação significante (p<0.05) entre os fatores seria
realizada comparação múltipla pareada pelo teste de Stewart-Newman-Keuls (SNK),
identificando-se os grupos que apresentassem diferenças significantes entre si. A
diferença seria considerada significativa se o p do erro alfa fosse <0,05..
3 -Material e Métodos
No
caso
de
variáveis
nominais
55
(mortalidade espontânea e
mortalidade pelo pentobarbital), as freqüências foram comparadas entre si, duas a
duas, pelo teste exato de Fisher. A diferença seria considerada significativa se p do
alfa fosse <0,05.
Todos os procedimentos estatísticos foram realizados utilizando-se
o programa SigmaStat versão 2.0.
4 - Resultados
4.
57
RESULTADOS
Em
seguida,
apresentaremos
os
resultados
das
variáveis
dependentes analisadas, segundo a seguinte ordem:
NÍVEIS SÉRICOS DE VITAMINA - pág. 58
A
administração
de
vitamina
A
hidrossolúvel
durante
o
experimento elevou significativamente os níveis séricos de vitamina A tanto nos
animais controle quanto nos animais com colestase.
MORTALIDADE ESPONTÂNEA - pág. 59
Houve diferença estatísticamente significativa entre a proporção de
mortalidade do grupo com colestase e os grupos controles.
MORTALIDADE APÓS DOSE DE PENTOBARBITAL - pág. 60
Houve diferença estatísticamente significativa entre a proporção de
mortalidade após a dose de pentobarbital entre os grupos com colestase e os grupos
controles.
INTENSIDADE DA FIBROSE - pág. 61
Houve efeito da vitamina A sobre a fibrose na presença de
colestase, mas não na sua ausência. Houve efeito da colestase na presença e ausência
da vitamina A.
INTENSIDADE DA INFLAMAÇÃO - pág. 62
Houve diferença estatísticamente significativa da intensidade da
inflamação entre os grupos com colestase que receberam a vitamina A (p=<0,001).
INTENSIDADE DA PROLIFERAÇÃO DUCTAL - pág. 63
Houve diferença estatísticamente significativa da intensidade da
proliferação ductal entre os grupos com colestase que receberam a vitamina A
(p=<0,001).
4 - Resultados
58
NÍVEIS SÉRICOS DE VITAMINA A
Tabela 1: Análise estatística descritiva (media, mediana, DP, CV e valores máximo e
mínimo) dos valores de vitamina A em U. I./dL.
SA 0
35.730
34.000
22.283
62.365
69.900
3.900
10
Média
Mediana
DP
CV(%)
Máximo
Mínimo
N
SA 50
669.680
628.150
524.775
78.362
1765.000
58.200
10
SA 100
716.100
667.000
556.206
77.672
1889.300
132.000
10
LA 0
19.030
17.500
11.960
62.848
46.600
3.900
10
LA 50
329.120
144.650
518.497
157.537
1716.500
27.200
10
LA 100
406.790
203.900
417.865
102.723
1221.300
31.100
10
LA0 - ligadura do ducto biliar sem a vitamina; LA50 - ligadura do ducto biliar e administração de 50 U.I. de vitamina A/g de
peso animal/dia ; LA100 - ligadura do ducto biliar e administração de 100 U.I. de vitamina A /g de peso animal/dia; SA0 operação simulada sem a vitamina A; SA50 - operação simulada com 50 U.I. de vitamina A/g de peso animal/dia; SA100 operação simulada com 100 U.I. de vitamina A/g de peso animal/dia; DP - desvio padrão; CV - coeficiente de variação)
ANÁLISE DE VARIÂNCIA COM DOIS FATORES:
As diferenças nos valores das medianas entre os diferentes níveis de L/S é
significantemente maior do que se poderia esperar, sem levar em conta os efeitos do
diferentes níveis de V.A. Existe uma diferença estatísticamente significativa
(F=10.312, p<0,002).
As diferenças nos valores das medianas entre os diferentes níveis de V.A. é
significativamente maior do que se poderia esperar, sem levar em conta os efeitos
das diferenças em L/S. Existe diferença estatísticamente significativa (p<0,001). Para
identificar os grupos que diferem entre si foi aplicado o teste de comparação múltipla
pareada pelo método de Stwart-Newman-Keuls (SNK).
Os efeitos de diferentes níveis de L/S não dependem de qual nível de V.A. está
presente. Não há uma interação estatísticamente significativa entre L/S e V.A.
(p=0,814)
2000
níveis séricos de vitamina A
1500
SNK
A0 (LA0 e SA0)x A50 (LA50 e SA50) s.
A0 (LA0 e SA0)x A100 (LA100 e SA100) s.
A50 (LA50 e SA50)x A100 (LA100 e SA100) n.s.
1000
500
0
SA0
SA50
SA100
A
LA0
LA50
LA100
administração
de
vitamina
A
hidrossolúvel
durante
o
experimento elevou significativamente os níveis séricos de vitamina A tanto nos
animais controle quanto nos animais com colestase.
4 - Resultados
59
MORTALIDADE ESPONTÂNEA
Tabela 2: Mortalidade espontânea - Proporção do número de ratos mortos/número
de ratos observados em cada grupo.
GRUPOS
SA0
SA50
SA100
LA0
LA50
LA100
PROPORÇÃO
0/10
0/10
0/10
67/77
0/10
1/11
PORCENTAGEM
0,0 %
0,0 %
0,0%
87,0 %
0,0 %
9,1 %
Gráfico 1: Mortalidade espontânea em porcentagem por grupo
Experimental
87
100
SA0
SA50
SA100
LA0
LA50
LA100
80
%
60
40
20
0
0
0
0
9,1
0
Quadro 1: Mortalidade espontânea: Teste Exato de Fisher
LAO
LA 5O
LA 100
SA0
SA50
SA100
-
p≤ 0,001
s.
p≤ 0,001
s.
p≤ 0,001
s.
-
-
-
-
p=1,000
n.s.
-
p≤ 0,001
s.
-
-
-
-
P=1,000
n.s.
-
p=1,000
n.s
p=1,000
n.s.
-
p=1,000
n.s
-
LAO
LA 50
LA 100
SA0
SA50
SA100
Houve diferença estatísticamente significativa entre a proporção de
mortalidade do grupo com colestase e os grupos controles.
4 - Resultados
60
MORTALIDADE - Após dose de pentobarbital (0,5mg/g/peso)
Tabela 3: Proporção do número de ratos mortos após a dose de pentobarbital/
número de ratos observados em cada grupo.
GRUPOS
SA0
SA50
SA100
LA0
LA50
LA100
PROPORÇÃO
1/11
2/12
1/11
11/11
2/12
1/11
PORCENTAGEM
9,1 %
17,0 %
9,1 %
100,0 %
17,0 %
9,1 %
Gráfico 2: Mortalidade após a dose de pentobarbital em
porcentagem por grupo experimental
100
100
SA0
80
SA50
60
SA100
LA0
40
20
9,1
17
17
9,1
LA50
9,1
LA100
0
Quadro 2: Mortalidade após dose de pentobarbital: Teste Exato de Fisher
LAO
LAO
LA 50
LA 100
SA0
SA50
SA100
LA 5O
-
LA 100
SA0
SA50
SA100
p≤ 0,001
s.
p≤ 0,001
s.
p≤ 0,001
s.
-
-
-
p=1,000
n.s.
-
p=1,000
n.s.
-
-
-
-
p=1,000
n.s.
-
p=1,000
n.s.
p=1,000
n.s.
-
p=1,000
n.s.
-
Houve diferença estatísticamente significativa entre a proporção de
mortalidade após a dose de pentobarbital entre os grupos com colestase e os grupos
controles.
4 - Resultados
61
INTENSIDADE DA FIBROSE
Tabela 4: Análise estatística descritiva (media, mediana, DP, CV e valores máximo e
mínimo) do escore de Ruwart para FIBROSE por grupo de animais.
SA 0
SA 50
SA 100
LA 0
LA 50
LA 100
Média
0
0
0
2.7
2.1
1.7
Mediana
0
0
0
3.0
2.0
1.5
DP
0
0
0
0.67
0.74
0.83
CV(%)
0
0
0
24.81
35.23
48.82
Máximo
0
0
0
3.0
3.0
3.0
Mínimo
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
N
10
10
10
10
10
10
(LA0 - ligadura do ducto biliar sem a vitamina; LA50 - ligadura do ducto biliar e 50 U.I. de vitamina
A ; LA100 - ligadura do ducto biliar e 100 U.I. de vitamina A; SA0 - operação simulada sem a
vitamina A; SA50 - operação simulada com 50 U.I. de vitamina A; SA100 - operação simulada com
100 U.I. de vitamina A; DP - desvio padrão; CV - coeficiente de variação)
ANÁLISE DE VARIÂNCIA COM DOIS FATORES:
As diferenças nos valores das medianas entre os diferentes níveis de L/S é
significantemente grande para excluir a possibilidade de que não se devam à variação
nos níveis de V.A.. Existe uma diferença estatísticamente significante (p=<0,001).
As diferenças nos valores das medianas entre os diferentes níveis de V.A. é
significativamente maior do que se poderia esperar, sem levar em conta os efeitos
das diferenças em L/S. Existe diferença estatísticamente significante (p=0,015). Para
identificar os grupos que diferem entre si foi aplicado o teste de comparação
múltipla.
Os efeitos de diferentes níveis de L/S dependem de qual nível de V.A. está presente.
Há uma interação estatisticamente significativa entre L/S e V.A. (p=<0,015).
4
escore ruwart
3
2
1
0
SA0
SA50
SA100
LA0
LA50
LA100
SNK
S (SA0, SA50 e SA100) x L (LA0, LA50 e LA100) s.
Houve efeito da vitamina A sobre a fibrose na presença de
colestase, mas não na sua ausência. Houve efeito da colestase na presença e ausência
da vitamina A.
4 - Resultados
62
INTENSIDADE DA INFLAMAÇÃO
Tabela 5: Análise estatística descritiva (media, mediana, DP, CV e valores máximo
e mínimo) por um escore numérico de intensidade da INFLAMAÇÃO dos animais
de cada grupo.
Média
Mediana
DP
CV(%)
Máximo
Mínimo
N
SA 0
0
0
0
0
0
0
10
SA 50
0.5
0
1.08
216.00
3.0
0
10
SA 100
0
0
0
0
0
0
10
LA 0
2.2
2.0
0.79
35.90
3.0
1.0
10
LA 50
1.8
2.0
0.63
42.00
3.0
1.0
10
LA 100
1.5
1.0
0.97
64.67
3.0
0
10
(LA0 - ligadura do ducto biliar sem a vitamina; LA50 - ligadura do ducto biliar e 50 U.I. de vitamina A ; LA100 - ligadura do
ducto biliar e 100 U.I. de vitamina A; SA0 - operação simulada sem a vitamina A; SA50 - operação simulada com 50 U.I. de
vitamina A; SA100 - operação simulada com 100 U.I. de vitamina A; DP - desvio padrão; CV - coeficiente de variação)
ANÁLISE DE VARIÂNCIA COM DOIS FATORES:
As diferenças nos valores das medianas entre os diferentes níveis de L/S é
significantemente grande para excluir a possibilidade de que não se devam à variação
nos níveis de VA. Existe uma diferença estatísticamente significativa (p=<0,001).
Para identificar os grupos que diferem entre si foi aplicado o teste de comparação
múltipla.
As diferenças nos valores das medianas entre os diferentes níveis de V.A. é
significativamente maior do que se poderia esperar, sem levar em conta os efeitos
das diferenças em L/S. Não existe diferença estatísticamente significativa
(p=0,0172).
Os efeitos de diferentes níveis de L/S não dependem de qual nível de V.A. está
presente. Não há uma interação estatisticamente significativa entre L/S e V.A.
(p=<0,128).
4
intensidade da inflamação
3
2
1
0
SA0
SA50
SA100
LA0
LA50
LA100
SNK
S (SA0, SA50 e SA100) x L (LA0, LA50 e LA100) s.
Houve diferença estatísticamente significativa da intensidade da
inflamação entre os grupos com colestase que receberam a vitamina A (p=<0,001).
4 - Resultados
63
INTENSIDADE DA PROLIFERAÇÃO DUCTAL
Tabela 6: Análise estatística descritiva (media, mediana, DP, CV e valores máximo
e mínimo) por um escore numérico de intensidade da PROLIFERAÇÃO DUCTAL
dos animais de cada grupo.
Média
Mediana
DP
CV(%)
Máximo
Mínimo
N
SA0
0
0
0
0
0
0
10
SA 50
0.4
0
0.97
242.5
3.0
0
10
SA 100
0
0
0
0
0
0
10
LA 0
2.4
2.5
0.70
29.17
3.0
1.0
10
LA 50
2.0
2.0
0.67
33.50
3.0
1.0
10
LA 100
1.2
1.0
0.63
52.5
2.0
0
10
(LA0 - ligadura do ducto biliar sem a vitamina; LA50 - ligadura do ducto biliar e 50 U.I. de vitamina A ; LA100 ligadura do ducto biliar e 100 U.I. de vitamina A; SA0 - operação simulada sem a vitamina A; SA50 - operação
simulada com 50 U.I. de vitamina A; SA100 - operação simulada com 100 U.I. de vitamina A; DP - desvio
padrão; CV - coeficiente de variação)
ANÁLISE DE VARIÂNCIA COM DOIS FATORES
As diferenças nos valores das medianas entre os diferentes níveis de L/S é
significantemente maior do que se poderia esperar, sem levar em conta os efeitos do
diferentes níveis de V.A.. Existe uma diferença estatísticamente significativa
p<0,001). Para identificar os grupos que diferem entre si foi aplicado o teste de
comparação múltipla pareada pelo método de Stwart-Newman-Keuls (SNK).
As diferenças nos valores das medianas entre os diferentes níveis de V.A. é
significativamente maior do que se poderia esperar, sem levar em conta os efeitos
das diferenças em L/S. Existe diferença estatísticamente significativa (p<0,005).
Os efeitos de diferentes níveis de L/S dependem de qual nível de V.A. está presente.
Há uma interação estatísticamente significativa entre L/S e V.A. (p=0.021).
4
intensidade da proliferação
3
2
1
0
SA0
SA50
SA100
LA0
LA50
LA100
SNK
L (LA0, LA50 e LA100) x S (SA0, SA50 e SA100) s.
Houve diferença estatísticamente significativa da intensidade da
proliferação ductal entre os grupos com colestase que receberam a vitamina A
(p=<0,001).
5 - Resumo dos Resultados
65
5. RESUMO DOS RESULTADOS
VARIÁVEL
CONCLUSÃO
Níveis séricos de vitamina A A administração de vitamina A hidromiscível
durante o experimento elevou significativamente os
níveis séricos de vitamina A tanto nos animais
controle quanto nos animais com colestase.
A0 (LA0 e SA0) x A50 (LA50 e SA50) s.
A0 (LA0 e SA0) x A100 (LA100 e SA100) s.
A50 (LA50 e SA50) x A100 (LA100 e SA100) n.s.
Mortalidade espontânea
Mortalidade após dose de
pentobarbital
Houve
diferença
estatísticamente
siginificativa
entre a proporção de mortalidade dos grupos com
ligadura quando comparados com seus controles.
Teste exato de Fisher
LA0xLA50 - p≤0,001 s.
LA0xLA100 - p≤0,001 s.
LA0xSA0 - p≤0,001 s.
LA50xLA100 - p=1,000 n.s.
LA50xSA50 - p≤0,001 s..
LA100xSA100 - p=1,000 n.s.
SA0xSA50 - p=1,000 n.s.
SA0xSA100 - p=1,000 n.s.
SA50xSA100 - p=1,000 n.s.
Houve diferença estatísticamente significativa entre
a proporção de mortalidade após a dose de
pentobarbital entre os grupos com colestase e os
grupos controles. Teste exato de Fisher
LA0xLA50 - p≤0,001 s..
LA0xLA100 - p≤0,001 s..
LA0xSA0 - p≤0,001 s..
LA50xLA100 - p=1,000 n.s.
LA50xSA50 - p=1,000 n.s.
LA100xSA100 - p=1,000 n.s.
SA0xSA50 - p=1,000 n.s.
SA0xSA100 - p=1,000 n.s.
SA50xSA100 - p=1,000 n.s.
5 - Resumo dos Resultados
66
Continuação
Intensidade da Fibrose
Intensidade da
Inflamação
Intensidade da Proliferação
ductal
A presença de colestase relacionou-se com uma
maior íntensidade de fibrose entre o grupo com
ligadura quando comparados com os controles.
V.A. dentro dos ligados: SNK
A0xA100 s.
A0xA50 n.s.
A50xA100 n.s.
V.A. dentro dos simulados
A50xA100 n.s.
A500xA0 n.s.
A0xA100 n.s.
LxS dentro do nível A0 s.
LxS dentro do nível A50 s.
LxS dentro do nível A100 s.
A presença de colestase se relacionou com maior
intensidade da inflamação entre os grupos com
ligadura quando comparados com os controles, mas
não demonstramos interferência da vitamina A. SNK
LxS s.
A presença de colestase se relacionou com maior
íntensidade de proliferação ductal entre os grupos
com ligadura quando comparados com os
controles.SNK
LxS s.
Comparações para V.A.:
V.A. dentro dos ligados:
A0xA100 s.
A0xA50 n.s.
A50xA100 s.
V.A. dentro dos simulados
A50xA100 n.s.
A50xA0 n.s.
A0xA100 n.s.
LxS dentro do nível A0 s.
LxS dentro do nível A50 s.
LxS dentro do nível A100 s.
6 - Discussão dos Resultados
68
6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
NÍVEIS SÉRICOS DE VITAMINA A
O nível de vitamina A no soro aumentou com a administração de
doses de 50 e 100 U.I./g de peso do animal/dia em relação aos que não receberam
vitamina. O nível sérico foi menor nos grupos com colestase obstrutiva do que nos
controles. Não houve interação entre a dose administrada e o efeito da colestase
sobre o nível sérico da vitamina A. Neste caso, o erro β foi de 0,95, o que sugere que
outra experiência com um maior número de observações poderia demonstrar essa
interação.
A observação de níveis séricos mais baixos de vitamina A no grupo
com colestase, sem administração de vitamina A hidromiscível, pode ser explicada
pela má absorção de vitamina A da dieta decorrente da ausência de bile no intestino,
além da má nutrição protéica, deficiência de zinco e da função de síntese hepática
diminuída. Estes dois últimos fatores resultam na diminuição da síntese de RBP e,
assim em níveis mais baixos de retinol no sangue.
A observação de que a administração de vitamina A hidromiscível
nos ratos com colestase associou-se a níveis séricos mais elevados de vitamina A do
que os níveis de ratos com colestase é explicada pela melhor absorção desse
preparado. Entretanto os ratos com colestase e administração de vitamina A
hidromiscível não chegaram a apresentar níveis séricos de vitamina A semelhantes
aos dos controles. Esta observação pode ser devida aos dois fatores mencionados
acima (má-absorção, deficiência de zinco e prejuízo na síntese proteica incluindo a
de RBP).
A observação de que não houve aumento dos níveis séricos de
vitamina A quando se passou da dose de 50 para 100 U.I./g de peso do animal/dia
poderia ser explicado pela ativação do catabolismo da vitamina A na presença de
concentrações hepáticas elevadas de retinol (LEO, 1989), que seria um mecanismo
homeostático visando proteger, em parte, o organismo dos efeitos tóxicos de doses
elevadas da vitamina A (GUILAND & LEQUEU, 1995).
6 - Discussão dos Resultados
69
MORTALIDADE ESPONTÂNEA
A mortalidade tem sido utilizada como critério de avaliação da
lesão hepatocítica em vários modelos experimentais.
Kimmings et al. (1999) utilizou a mortalidade para estudar o
aumento da susceptibilidade à endotoxinemia em ratos com ligadura do ducto biliar e
observou uma redução na mortalidade de 75 % para 8% tratando estes animais com
BPI (bactericidal/permeability-increasing protein - proteína de aumento da
permeabilidade bactericida).
Sewnath et al (2000) utilizou a mortalidade para estudar os efeitos
da infusão de lipoproteína de alta densidade reconstituída - rHDL (reconstituted
hight-density lipoprotein) no resultado da resposta inflamatória induzida por
lipopolissacárides em ratos com colestase. A infusão de rHDL resultou em aumento
da sensibilidade e em mortalidade de 88% no grupo de animais com ligadura do
ducto biliar e que recebeu rHDL; 44% no grupo ligado e que recebeu solução salina;
25% no grupo simulado e que recebeu rHDL e 0% no grupo simulado e que não
recebeu rHDL.
Harry et al. (1999) utilizou a mortalidade para estudar a
sensibilidade
de
ratos
com
ligadura
do
colédoco
à
administração
de
lipopolissacárides.
Ito et al (2000) utilizou a mortalidade para estudar o efeito de
baixas doses de lipoproteínas em ratos com obstrução do ducto biliar comum.
No nosso experimento a vitamina A hidromiscível protegeu os
animais dos efeitos lesivos da colestase - a mortalidade foi maior no grupo com
colestase que não recebeu vitamina A (LA0 - 87%) do que nos grupos com colestase
e com vitamina A (LA50 - 0%; LA100 - 9,1%). Os animais do experimento
provavelmente morreram por encefalopatia hepática já que não foram encontrados
nos mesmos sinais de hemorragia ou de infecção.
6 - Discussão dos Resultados
70
A encefalopatia hepática pode resultar de disfunção hepática aguda,
disfunção hepática crônica ou de shunt porto-sistêmico.
Embora a patogênese da encefalopatia hepática não esteja
completamente esclarecida, vários mecanismos têm sido propostos. O consenso geral
é de que a encefalopatia hepática reflita anormalidades neurofisiológicas/metabólicas
ao invés de uma lesão estrutural do cérebro. A encefalopatia tem sido
tradicionalmente considerada secundária ao acúmulo de produtos tóxicos que não são
metabolizados pelo fígado. Evidências mais recentes sugerem que a encefalopatia
ocorre por:
1) Aumento da osmolaridade no cérebro por hiperamoniemia e
aumento na produção de glutamina; o aumento da osmolaridade leva a edema
cerebral com aumento da pressão intracraniana e hipoxia cerebral.
Níveis de amônia no sangue arterial estão elevados em 90% dos
pacientes com encefalopatia hepática; entretanto, alguns pacientes com encefalopatia
grave apresentam níveis normais ou elevação limítrofe dos níveis de amonia arterial
(FERENCI,1992; LOCKWOOD,1979). Por outro lado níveis elevados de amoniemia
foram detectados em crianças sem sinais clínicos de encefalopatia, quatro ou cinco
vezes acima do normal. Entretanto, a maioria dos fatores precipitantes da
encefalopatia (hemorragia gastro-intestinal, por ruptura de varizes esofageanas ou de
varizes gástricas ou por gastropatia congestiva; septicemia, pelo aumento do
catabolismo proteico ou pela hipotensão arterial, hipocaliemia – que aumenta a
produção de amônia pelo rim – secundaria ao uso de diuréticos, de laxantes ou a
paracentese; desidratação, que diminui a perfusão hepática) resultam ou poderiam
resultar em hiperamoniemia. O aumento da amônia no sangue pode ser consequência
do prejuízo da transformação hepática de amônia em uréia, de shunts portosistêmicos intra e extra-hepáticos e da perda muscular, que frequentemente
acompanha a doença hepática crônica, com conseqüente catabolismo proteico
(SCHAFER,1990). Outro fator da hiperamoniemia, neste caso, seria a diminuição da
captação de amônia pela síntese de glutamina a partir do glutamato pela glutamina
6 - Discussão dos Resultados
71
sintetase muscular que é um mecanismo normal para remoção de amônia
extrahepática (MARLISS, 1971).
O metabolismo da glutamina no cérebro também parece estar
relacionada com a patogenia da encefalopatia hepática. Há produção aumentada da
glutamina no cérebro a partir da amônia pela enzima glutamina sintetase dos
astrócitos (ALBRECHT, 2001). Na insuficiência hepática aguda, a ação osmótica da
glutamina acumulada parece ser responsável em grande parte pelo edema cerebral
que leva a prejuízo do fluxo sangüíneo, hipóxia e alteração na homeostase iônica.
(ALBRECHT, 2001). Na insuficiência hepática crônica, não acompanhada de edema
cerebral, o transporte aumentado de glutamina do cérebro para a periferia acelera a
passagem pela barreira hemato-encefálica de aminoácidos aromáticos, que são
transformados em metabólitos diretamente responsáveis pela encefalopatia hepática
(ver abaixo); além disso, a síntese aumentada de glutamina, com diminuição de
glutamato, contribui para o prejuízo do metabolismo energético cerebral como
explicado a seguir.
2) Comprometimento do metabolismo energético
Normalmente, o cérebro utiliza quase que exclusivamente a glicose
para suprir sua demanda energética. A oxidação da glicose é quase completa, com
pouca produção de lactato. Quando a concentração de amônia está aumentada, a
produção de lactato e a relação NADH/NAD+ estão aumentadas e o pH do cérebro,
diminuído (HINDFELT, 1997). Essas alterações podem ser explicadas por
desconexão entre a glicólise e o ciclo dos ácidos tricarboxílicos-(C.A.T.). Dois
mecanismos podem explicar essa desconexão: interferência no ciclo malato-aspartato
e inibição do complexo dehidrogenase do α-cetoglutarato. As perturbações
metabólicas decorrentes do bloqueio do C.A.T. são agravadas pelo estímulo da
glicólise também observado na encefalopatia hepática.
Interferência no ciclo malato-aspartato - Parece resultar da
diminuição de glutamato nos neurônios. Vários estudos mostraram que o mesmo está
diminuído nas síndromes hiperamoniêmicas (COOPER & PLUM, 1987). Essa
6 - Discussão dos Resultados
72
diminuição resultaria da síntese aumentada de glutamina a partir do glutamato e da
amônia (HINDFELT et al.. 1997) A queda de glutamato nos mitocondrios leva a
diminuição na produção de aspartato (Reação 1 do quadro 3). A conseqüente
diminuição da passagem de aspartato para o citoplasma diminui sua transformação
em oxaloacetato (reação 2 do quadro 3) e portanto na produção de malato (reação 3
da figura x) e na sua passagem para os mitocôndrios. Assim, há diminuição na
redução de NAD para NADH (reação 4 do quadro 3). Esta produção diminuída de
NADH leva à diminuição da transferência de H+ para a cadeia respiratória (reação 5
do quadro 3) com a conseqüente diminuição na produção de ATP.
Inibição do complexo α-cetoglutarato dehidrogenase Essa inibição
ocorre pela diminuição da produção de NAD pela diminuição do ciclo malato
aspartato
Estímulo da glicólise O excesso de amônia estimularia a
fosfofrutoquinase 1 e, assim a glicólise. Como esta está desconectada do C.A.T.
ocorre produção aumentada de lactato, aumento, no citosol da relação NADH para
NAD+ e aumento do pH.
Evidentemente,
durante
uma
hiperamonemia
moderada
os
distúrbios no metabolismo energético são discretamente afetados. Todavia, durante a
hiperamoniemia grave a produção de ATP a partir do ciclo da glicólise é limitada e
não é acompanhada do ritmo diminuído da produção de ATP devido à diminuição do
C.A.T. Os fosfatos altamente energéticos declinam com a disfunção cerebral
contínua. Várias evidências sugerem que o metabolismo energético cerebral pode
adaptar-se por um tempo limitado à intoxicação crônica por amônia (KOSENKO,
1993).
6 - Discussão dos Resultados
73
QUADRO 3 - CICLO MALATO ASPARTATO
Citoplasma
Mitocôndria
Aspartato
α- Cetoglurato
Aspartato
1
α- Cetoglurato
2
Oxalo acetato
Glutamato
Glutamato
NADH
4
Malato
O2
5
NAD
Cadeia de
elétrons
H2 O + ATP
Oxalo acetato
Malato
3
NAD
NADH
3) alterações da função dos neurotranmissores
A produção de substâncias neurotóxicas e neuroativas podem levar
ao deslocamento de neurotransmissores das terminações pré sinápticas. Os
neurotransmissores presentes em excesso na encefalopatia hepática incluem o ácido
γ-aminobutírico (G.A.B.A.), amônia, amino-ácidos e seus produtos (mercaptanas,
produtos da transformação do triptofano, a octopamina, derivada dos amino-ácidos
aromáticos e fenóis), a serotonina, a histamina e as catecolaminas, glutamato e
aspartato, ácidos graxos de cadeia intermediária e fenóis. Estas substâncias estão
elevadas no fluído cerebroespinal de pacientes com encefalopatia (BORG, 1982).
Estes neurotransmissores atuam como inibidores e estimulantes das ligações
sinápticas no cérebro.
6 - Discussão dos Resultados
74
Neurotransmissores G.A.B.A.érgicos.
Existem dois tipos de receptores G.A.B.A.. O tipo A é
positivamente modulado pelos barbitúricos (que prolongam o tempo de abertura do
canal) e os benzodiazepínicos (drogas usadas como ansiolíticos, que aumentam a
frequência com que os canais se abrem, hiperpolarizando sinapses de células
inibitórias). O receptor G.A.B.A é formado por várias cadeias, cinco subunidades que
revestem o canal por onde passa o Cl-. Cada cadeia é constituída por uma proteína,
com seis domínios em α-hélice no interior da membrana. Barbitúricos e
benzodiazepínicos se ligam a centros ativos diferentes do receptor, os primeiros no
interior da membrana e o segundo na porção extracelular do receptor (RAW & HO,
2000). Os receptores de G.A.B.A no cérebro estão ligados a um canal de cloro que,
aberto, permite o influxo de íons cloreto dentro do neurônio causando polarização do
neurônio pós sináptico (WONG, 1993). Os benzodiazepínicos aumentam a resposta
do canal de cloreto controlado pelo G.A.B.A. ao G.A.B.A.
Postulou-se que o G.A.B.A, o principal neurotransmissor inibidor,
derivado da medula óssea, acumular-se-ia no sangue, atravessaria a barreira hematoencefálica e atuaria nos receptores pós sinápticos do G.A.B.A. Não existem
evidências convincentes de que o excesso de G.A.B.A por si só seja diretamente
responsável pela encefalopatia hepática (MORONI, 1987). Concentrações de GABA
no fluído cerebroespinal e no plasma não se correlacionam com a clínica ou
gravidade das alterações no E.E.G. na encefalopatia hepática de pacientes com
cirrose. Os benzodiazepínicos exercem seus efeitos no sistema nervoso central
interagindo com sítios de ligação de alta afinidade no complexo receptor de G.A.B.Abenzodiazepínicos (BUTTERWORTH, 1992). Estimulantes endógenos anormais dos
receptores de benzodiazepínicos seriam originados no intestino (ou por estarem
presentes em vegetais da dieta ou por síntese pelas bactérias intestinais) não seriam
desintoxicados no fígado lesado-o extensamente (BASILE, 1991). Há muitas
evidências (BASILE,1991a; BAKTI, 1987; BASILE, 1991b) de que o aumento em
sua concentração ou em sua disponibilidade contribuam para a encefalopatia hepática
– antagonistas dos receptores benzodiazepínicos como o fumazenil revertem as
6 - Discussão dos Resultados
75
anormalidades neurológicas e do E.E.G. em animais e humanos com encefalopatia
hepática (BANSKY,1989). Em particular o N-desmetyldiazepam tem sido isolados
no soro, fluído espinal e cérebro de pacientes com falência hepática (BASILE, 1990:
BASILE 1991a)
Transmissores Dopaminérgicos
A noradrenalina e a dopamina são neurotransmissores importantes
no cérebro. Os falsos neurotransmissores incluem o G.A.B.A., a octopamina, a
histamina, a serotonina, a feniletanolamina. Algumas destas substâncias são
sintetizadas a partir da tirosina e tiramina. Estas substâncias competem com o
neurotransmissor normal catecolamina, deslocando-o, e desta forma prejudicando a
neurotransmissão dopaminérgica no cérebro de pacientes com encefalopatia hepática
(FISCHER, 1971). Níveis elevados de prolactina em pacientes com cirrose e
encefalopatia hepática tem sido documentada e pode refletir um baixo nível de
dopamina.
Desequilíbrio entre Aminoácidos Aromáticos e Aminoácidos de
Cadeia Ramificada
Os pacientes com cirrose apresentam desequilíbrio nos níveis do
cérebro e plasma de metionina e aminoácidos aromáticos - (A.A.A.) fenilalanina,
tirosina e triptofano comparada com aminoácidos de cadeia ramificada - (A.A.C.R.) leucina, isoleucina e valina. A relação entre A.A.A. e A.A.C.R. correlaciona-se com
a gravidade das mudanças histológicas no fígado e não com o grau da encefalopatia.
Esse desequilíbrio pode, em parte, ser explicado pelo desequilíbrio entre insulina e
glucagon. Como os A.A.A. e os A.A.C.R. competem pelos mesmos transportadores
da barreira hemato-encefálica, a captação de A.A.A. aumenta, promovendo a síntese
de falsos neurotransmissores (octopamina e feniletanolamina), os quais competem
com a noradrenalina e dopamina endógenas (FISCHER,1971).
6 - Discussão dos Resultados
76
Ácidos Graxos e Serotonina
O fígado normal metaboliza ácidos graxos absorvidos no intestino.
Assim na insuficiência hepática seus níveis estão elevados no sangue e no cérebro.
Entretanto, o papel exato dos ácidos graxos na encefalopatia hepática é
desconhecido. Em modelos animais, ácidos graxos de cadeia curta (butírico, valérico
ou capróico) diminuem a atividade cerebral. Altas concentrações de ácidos graxos de
cadeia curta têm sido detectadas na encefalopatia hepática; entretanto, o nível de
ácidos graxos não se correlaciona com a gravidade da encefalopatia (ZIEVE, 1981).
Os ácidos graxos podem inibir a atividade da ATPase dependente de sódio e de
potássio nos microssomos cérebrais. Também, ácidos graxos de cadeia longa
deslocam triptofano da albumina, aumentando o nível de triptofano livre o que leva a
síntese aumentada de serotonina, um conhecido depressor da consciência. A
renovação da serotonina cerebral está aumentada na encefalopatia hepática;
entretanto não se sabe se está associada com um aumento da função serotoninérgica
(MARDINI, 1993).
Mercaptanas
Mercaptanas (metanotiol e dimetildissulfito) são formados a partir
de aminoácidos que contenham enxôfre. São neurotóxicos e o metanotiol pode
potencializar a toxicidade da amônia (ZIEVE, 1974).
Permeabilidade da Barreira Hemato-Encefálica
As alterações da barreira hemato-encefálica podem existir na
encefalopatia hepática; entretanto este não é um distúrbio generalizado (KNUDSEN,
1993). Esta permeabilidade aumentada pode permitir o acesso de substâncias tóxicas
ao cérebro. As alterações na permeabilidade hemato-encefálica são uma possível
consequência da hiperamoniemia
secundária a cirrose hepática (GRIPPON, 1986).
O aumento de aminoácidos neutros que atravessam a barreira tem sido observado na
encefalopatia hepática.
6 - Discussão dos Resultados
77
A importância de uma ligação entre os distúrbios metabólicos e
sistemas de transporte indicam a patogênese multifatorial da encefalopatia hepática.
A Vitamina A intraperitoneal diminui a lesão hepática, o nível de
aminotransferase séricas e a concentração de bilirrubina não conjugada em ratos com
obstrução do ducto biliar comum (KARAN, 1996). Esse afeito pode ser devido à sua
ação antioxidante (SENOO & WAKE, 1985; AYDEMIR et al., 2000; DAWSON,
2000). Portanto, o efeito protetor contra a mortalidade no nosso experimento pode
ser devido à ação anti-oxidante da vitamina A que exerce essa função pois sua forma
hidromiscível facilita sua absorção na colestase.
MORTALIDADE APÓS PENTOBARBITAL
A
vitamina
A
hidrossolúvel
diminuiu
a
mortalidade
por
pentobarbital em ratos jovens com colestase obstrutiva - a mortalidade após 0,5 mg/g
de pentobarbital por via intraperitoneal no grupo LA0 foi de 100%, de 17% no grupo
LA50 e de 9,1%.no grupo LA100.
A capacidade de desintoxicação hepática está diminuída na
colestase. O efeito protetor da vitamina A pode ser devido à modulação, pela
vitamina A, da atividade de desintoxicação do pentobarbital através do sistema
enzimático relacionado ao citocromo P450. As enzimas relacionadas ao citocromo
P450 são responsáveis pela ativação e desintoxicação de endobióticos ou
xenobióticos (CONNEY, 1967). A vitamina A é um dos fatores que podem
modificar este sistema enzimático em ratos. Vários estudos tem demonstrado que a
deficiência de vitamina A reduziu o peso do fígado, o conteúdo e a atividade das
enzimas relacionadas ao citocromo P450 (GUPTA, 1989). Por outro lado, quando os
animais foram alimentados com dieta suplementada com vitamina A a atividade das
isoenzimas do citocromo P450 aumentaram (MURRAY, 1981). A lesão hepatocítica
da colestase induzida pela ligadura do ducto biliar leva a diminuição destas
isoenzimas do citocromo P-450 (TATHEISHI, 1998) e afetam diretamente o
6 - Discussão dos Resultados
78
metabolismo de certas drogas além de contribuir para a diminuição do clearence
hepático destas na doença hepática grave.
A ação hepatoprotetora da vitamina A, na colestase, se deve à sua
ação antioxidante, eliminando espécies reativas de oxigênio e, assim à consequente
proteção de estruturas celulares contra o efeito necrotizante ou apoptótico dos ácidos
biliares (DRISKEL, l995).
FIBROSE
Nossos resultados mostraram que os ratos com colestase que
receberam a vitamina A, nos níveis A50 e A100 apresentaram menor intensidade de
fibrose que a do grupo com colestase que não recebeu a vitamina - LA0. Nos grupos
controles que receberam a vitamina A (SA50 e SA100) não houve ocorrência de
fibrose. A vitamina A protege, no modelo estudado, o fígado das lesões da colestase.
Nas doses empregadas a vitamina A não causou fibrose (não houve diferença
estatísticamente significativa entre os grupos SA0, AS 50 e SA100).
As células estreladas perisinusoidais têm, ao mesmo tempo, a
capacidade de armazenar vitamina A e de se transformar em miofibroblastos (WISSE
et al., 1996). Cerca de 80 a 90% dos retinóides na forma de ésteres de retinil do
organismo, estão armazenados no citoplasma destas células em gotículas de gordura.
As células estreladas são a fonte primária da matriz extra-celular, não somente em
fígados normais (WAKE,1980) mas também em fígados doentes. Na intoxicação
pela vitamina A, hipertrofia, proliferação de células estreladas e transformação em
células semelhantes aos miofibroblastos podem levar à hipertensão portal não
cirrótica, fibrose e cirrose (HAUTEKEETE, 1997). Uma redução do retinol hepático
em processos fibróticos do fígado associa-se a acúmulo da matriz extra-celular, a
redução dos lipídios das células estreladas e a transformação de células estreladas em
miofibroblastos ativos (BLOMHOFF et al., 1991). Esse acúmulo da matriz extracelular decorre de sua síntese por diferentes tipos de células hepáticas (FRIEDMAN,
1999), estimuladas por diferentes polipeptídeos liberados principalmente por
6 - Discussão dos Resultados
79
linfócitos e macrófagos. (ver acima ítem 1.6.2.3). Dentre aquelas células hepáticas,
as células estreladas são consideradas as principais produtoras de matriz extra-celular
na fibrose hepática (PINZANI, 1995); Na lesão hepática crônica as células estreladas
se diferenciam em células semelhantes aos miofibroblastos com marcada expressão
para α actina de musculatura lisa e ocasionalmente expressão para desmina. A
diferenciação é gradual, ocorrendo um estágio intermediário no qual elas são
chamadas de “células de transição” e é regulada por uma intrincada cadeia de
comunicação destas células com as células de Küpffer ativadas (macrófagos
hepáticos), hepatócitos danificados, plaquetas, células inflamatórias e endoteliais,
envolvendo citoquinas e mediadores não peptídeos, tais como espécies de oxigênio
reativo, eicosanóides e acetaldeído (HAUTEKEETE, 1997; KAWADA, 1997). Na
colestase experimental, as células estreladas são ativadas em miofibroblastos por
ação das fibronectinas (em especial a fibronectina EIIIA) liberadas rapidamente pelas
células endoteliais no espaço de Disse. Assim, as células endoteliais parecem ser
responsáveis pelo desencadeamento da fibrogênese. Além do estímulo pela
fibronectina, a ativação das células estreladas parece ser desencadeada por
mediadores solúveis produzidos pelas células de Küpffer e pela liberação de espécies
reativas de oxigênio (MATHEW et al., 1994). Esta liberação de espécies de oxigênio
reativas também pode decorrer do acúmulo de ácidos biliares, devido à colestase.
Assim, estes podem, indiretamente afetar a produção da matriz extra-celular
(PINZANI, 1998).
Embora hajam muitas evidências de que os retinóides modulem de
forma importante a ativação das células estreladas (DAVIS, et al., 1990 ; DAVIS et
al.,1993), os resultados de diferentes experiências têm sido conflitantes, ora
mostrando efeito estimulante na ativação e na produção de colágeno pelas células
estreladas (OKUNO, et al., 1997) ora mostrando efeito contrário (MIZOBUCHI, et
al., 1998; SENOO, 1985).
Na colestase crônica, que não se acompanha por infiltrado
inflamatório abundante, outras substâncias como os ácidos biliares podem manter a
ativação de células estreladas hepáticas através de outras vias específicas (PINZANI
6 - Discussão dos Resultados
80
& MILANI, 1998). O acúmulo de ácidos biliares, pode afetar, indiretamente, a
produção da matriz extra-celular por induzir peroxidação lipídica no tecido hepático
(PINZANI, 1998; GREIN et al. 1972; BALISTRELI, et al 1996 ; SING et al., 1992;
SOKOL et al.1991b; PAROLA et al.,1996).
Na colestase, os mecanismos de defesa contra radicais livres estão
prejudicados tanto pelas lesões mitocondriais causadas por ácidos biliares quanto
pela falta de fatores antioxidantes, como as vitaminas A e E (ARTHUR,1985;
KRÄHENBÜHL, 1995) pela sua má absorção decorrente da colestase (SINGH et al.,
1992). O uso de vitamina A hidromiscível corrige essa deficiência e evita suas
conseqüências.
Em outro tipo de lesão hepática crônica, a intoxicação por CC14 , o
retinil palmitato administrado após o tratamento com CC14 resulta na remoção de
septos fibrosos enquanto que, ratos deficientes em vitamina A antes da administração
do CC14 , apresentaram fibrogênese aumentada, após administração do mesmo
(KNOOK et al. 1995). Resultados semelhantes foram obtidos por SEIFERT et al.
(1995) usando β-caroteno. Assim, parece que a vitamina A, inibindo a transformação
de células estreladas em miofibroblastos, diminui a síntese de colágeno. Isto é
corroborado pelo achado de que células estreladas de ratos tratados com CC14 e
vitamina A não apresentavam in vitro síntese de colágeno (SHIRATORI et al.,
1987).
Considerando que o retinol modula a resposta imune através da
atuação sobre os macrófagos e neutrófilos agravando a lesão (fibrose) por CC14 em
ratos imunocompetentes e diminuindo a mesma em camundongos imuno-deficientes
(HOOSER et al. 1994) o nosso achado de que a vitamina A diminuí a fibrose parece
sugerir que ratos colestáticos são imuno-deficientes. De fato Karan et al. (1996)
mostraram que a deficiência imunológica (hipofunção do sistema fagocítico
mononuclear) de ratos com colestase obstrutiva é corrigida pela vitamina A. O
retinol administrado em ratos antes de substâncias hepatotóxicas prepara as células
de Küpffer para o estado ativado. Isto pode ocorrer em parte, como resultado de um
aumento dos mediadores químicos como o fator de necrose tumoral (tumor necrosis
6 - Discussão dos Resultados
81
factor –TNF) produzido pelas células de Küpffer. As substâncias hepatotóxicas
provocam a ativação destas células, liberando espécies reativas de oxigênio,
mediadores imunes e fatores quimiotáticos que levam ao aumento da resposta
inflamatória. Esta intensificação acentua a lesão hepatocítica (SAUER et al., 1995).
Como os radicais livres estimulam a fibrose ativando as células
estreladas (ElSISI,1993), a ação antioxidante da vitamina A (SEIFERT,1995)
poderia explicar o efeito observado. Além disso, a diminuição da lesão hepatocítica
da colestase pela vitamina A (KARAN,1995) também explicaria a diminuição da
fibrose observada, já que a lesão hepatocítica desencadeia a fibrose. É possível,
também, que a reposição das perdas de retinóides, que ocorre durante a ativação de
células estreladas, possa reverter ou diminuir essa ativação (LI & FRIEDMAN,
1999) e, consequentemente suprimir o potencial destas células para a fibrogênese
hepática (KNOOK, 1995).
Nas
nossas
condições
experimentais
(uso
retinil
palmitato
hidromiscível tipo 100 Roche nas doses 50 e 100 U.I. por g de peso em colestase
obstrutiva crônica em ratos jovens) a vitamina A inibiu a fibrose hepática.
INFLAMAÇÃO
Houve diferença estatísticamente significativa entre os grupos L/S
(p=<0,005) em relação à intensidade da inflamação mas não demonstramos
interferência da vitamina A.
A inflamação está presente em todas as formas de fibrose hepática
com exceção da fibrose hepática por sobrecarga de ferro. O infiltrado inflamatório
pode liberar moléculas nocivas incluindo as proteinases, radicais livres de oxigênio
ou podem ter efeitos indiretos via liberação de fatores solúveis conhecidos como
linfocinas ou citoquinas, algumas das quais são conhecidas por ativar as células
estreladas. Esta ativação em experimentos in vivo é caracterizada por: 1)
proliferação; 2) liberação do conteúdo de vitamina A citoplasmático; 3) indução de
6 - Discussão dos Resultados
82
receptores funcionais para o PDGF e TGFβ; 4) expressão da α actina de musculatura
lisa, uma proteína citoplasmática característica dos miofibroblastos e 5) síntese de
citoquinas fibrogênicas e inflamatórias (MAHER, et. al.1992).
As substâncias hepatotóxicas provocam a ativação destas células,
liberando espécies reativas de oxigênio, mediadores imunes e fatores quimiotáticos
que levam ao aumento da resposta inflamatória. Esta intensificação acentua a lesão
hepatocítica (SAUER et al., 1995).
Como a adminstração de vitamina A hidrossolúvel resultou em
diminuição da fibrose mas não em diminuição da inflamação e seu efeito deve ser
devido à ação antioxidante sugerimos que os radicais livres de oxigênio devem atuar
mais na patogênese da fibrose do que naquela da inflamação
PROLIFERAÇÃO DUCTAL
Os
significativamente
ratos
maior
que
com
nos
ligadura
controles.
apresentaram
Houve
proliferação
diferença
ductal
estatísticamente
significativa entre os grupos L/S (p=<0,005). Os ratos que receberam a dose maior
de vitamina A (100 U.I./g de peso corporal) apresentaram menor proliferação ductal
do que os que receberam dose menor de vitamina A (50 U.I./g de peso corporal) do
que os que não receberam vitamina A
Em ratos com colestase por obstrução experimental do colédoco
(CAMERON & OAKEY, 1932) a proliferação ductal é a lesão hepática mais
notável, e está usualmente associada a fibrose portal progressiva. Dois problemas
relacionados com esta associação são: papel da proliferação e dos ácidos biliares na
fibrogênese (PINZANI,1998). A extensa proliferação ductal observada na periferia
dos espaços-porta é atribuída (PINZANI,1998) à proliferação de ductos biliares préexistentes e/ou a metaplasia ductal. Esta consiste na transformação de placas de
hepatócitos em estruturas ductais e parece ser o mecanismo predominante nos
processos colestáticos crônicos. Alternativamente à metaplasia ductal, tem sido
6 - Discussão dos Resultados
83
proposta (OMORI, 1997), como origem da proliferação ductal na colestase, a
transformação preferencial de células ovais em células ductais. As células ovais são
originadas das células tronco e podem dar origem tanto a células ductais quanto a
hepatócitos (THOGEIRSON, 1999). A proliferação ductal é acompanhada de
profundas
modificações
nas
células
mesenquimais
adjacentes
e
na
matriz
extracelular. Não está claro se a metaplasia ductular leva a alterações das células
mesenquimais e da matriz extra-celular, ou se essa é a alteração primária. Este
quadro parece ser, potencialmente, um processo de duas mãos, podendo, em certas
circunstâncias, predominar em um ou outro sentido. Assim, nas doenças obstrutivas
biliares predominaria o primeiro, enquanto que na neoformação ductal observada nas
faixas fibróticas das cirroses não biliares predominaria o segundo sentido, e a
deposição de fibrose seria o fator primário.
Na proliferação ductal, a interação entre as células estreladas
hepáticas ativadas e a deposição de matriz extra-celular são mantidos pelos seguintes
mecanismos (PINZANI, 1998): 1) liberação do fator de crescimento derivado de
plaquetas (PDGF) e do TGF-β pelas células de Ito que, atuando sobre os receptores
específicos de outras células estreladas ativadas (ação autócrina), estimulariam a
deposição por essas células da matriz extra-celular; 2) a liberação desses e de outros
fatores como a endotelina-1 e a proteína quimiotática de monócitos pelas células
ductais proliferantes; 3) os sinais intra-celulares, para mobilidade e proliferação,
desencadeados pela interação de componentes modificados da matriz extra-celular,
com receptores formados por integrinas, o que desencadeia sinais intra-celulares que
resultam na proliferação e aumento da mobilidade das células estreladas hepáticas.
As células ductais proliferadas contribuem nesse processo, secretando fator de
crescimento derivado de plaquetas – PDGF, que estimulará receptores específicos
das células estreladas hepáticas ativadas (PINZANI, 1998).
Em função do efeito da vitamina A na proliferação e diferenciação
de células epiteliais, têm aumentado as evidências dos possíveis efeitos desta
vitamina na integridade e recuperação dos epitélios na doença colestática envolvendo
6 - Discussão dos Resultados
84
lesão do ducto biliar, como por exemplo: atresia biliar, cirrose biliar primária e
colangite esclerosante primária (SOKOL, 1994).
A vitamina A hidromiscível em altas doses sugere que a
proliferação ductal pode ser devida à produção aumentada de radicais livres.
A fibrose da colestase é, até certo ponto, dissociada da proliferação
ductal pois a dose menor de vitamina A (50 U.I./100gde peso do animal) diminuiu a
fibrose mas não a proliferação ductal.
7 - Conclusões
86
7. CONCLUSÕES
A administração de uma forma hidromiscível de vitamina A na
colestase obstrutiva atenua a fibrose hepática, proliferação ductal e a função hepática.
8 - Referências Bibliográficas
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9 - Anexos116
Fórmula da Ração Especial do Laboratório Experimental do Departamento de
Pediatria
Componentes
Caseína
Sacarose
Fibra
Mistura Salina (ver fórmula 1)
Mistura Vitamínica (ver fórmula 2)
Benzoato de Sódio
Óleo de Milho
Amido de milho qsp
Fonte: (Lajolo; Fox, 1960)
gramas em 100 g de ração
18
10
4
4
1
0,1
8
100
9 - Anexos117
Fórmula 1: Mistura Salina
Componentes
Fosfato de Tricálcio
Carbonato de Cálcio
Fosfato de Sódio
Cloreto de Potássio
Cloreto de Sódio
Sulfato de Magnésio
Sulfato de Manganês
Citrato Férrico
Carbonato de Zinco
Sulfato de Cobre
Iodeto de Potássio
Fonte: (Lajolo; Fox, 1960
gramas em 100 g de mistura salina
47,300
16,600
11,600
11,300
6,600
5,000
0,417
0,333
0,217
0,017
0,017
9 - Anexos118
Fórmula 2: Mistura vitamínica
Componentes
Colina
Ácido Ascórbico
Ácido Paraminobenzóico
Niacina
Vitamina E
Vitamina K
Pantotenato de Cálcio
Piridoxina
Riboflavina
Piridoxina
Ácido Fólico
Biotina
Cianocobalamina
Ergocalciferol
Sacarose qsq 1000g
gramas em 100 g de mistura vitamínica
200
100
10
5
5
2
2
0,5
0,5
0,5
0,2
0,03
0,03
0,003
9 - Anexos119
Valores da concentração de vitamina A no soro expressa em µg/dL, substituídos
pelos Rank.
animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
SA0
13,50
5,50
1,50
13,50
28,50
28,50
8,00
21,00
19,50
17,50
SA50
50,00
24,00
25,50
44,00
46,00
59,00
55,00
54,00
34,00
42,00
SA100
35,50
38,00
32,00
40,00
52,00
49,00
56,00
53,00
45,00
60,00
LA0
10,00
22,00
3,50
13,50
8,00
3,50
11,00
5,50
1,50
8,00
LA50
31,00
17,50
19,50
23,00
43,00
35,50
37,00
41,00
58,00
13,50
LA100
16,00
47,00
28,50
28,50
39,00
57,00
33,00
48,00
25,50
51,00
9 - Anexos120
Escore dos postos atribuídos por ordem crescente de intensidade da FIBROSE, por
grupo de animais (Ruwart).
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
SA0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
SA50
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
SA100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
LA0
3
1
3
3
3
3
3
2
3
3
LA50
2
2
3
2
1
1
2
3
3
2
LA100
3
1
2
1
2
1
2
3
1
1
9 - Anexos121
Valores atribuídos por ordem crescente de intensidade da Inflamação, por grupo de
animais.
animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
LA0
2
2
2
1
3
3
3
1
3
2
LA50
2
2
3
2
1
1
2
2
1
2
LA100
2
0
3
1
1
3
1
2
1
1
SA0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
SA50
0
2
3
0
0
0
0
0
0
0
SA100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
9 - Anexos122
Valores atribuídos por ordem crescente de intensidade da proliferação ductal, por
grupo de animais.
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
SA0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
SA50
0
1
3
0
0
0
0
0
0
0
SA100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
LA0
2
1
3
2
3
3
3
2
2
3
LA50
2
2
3
2
1
1
2
3
2
2
LA100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
124
EFFECTS OF VITAMIN A ADMINISTRATION ON INJURY AND
HEPATIC DISFUNCTION IN OBSTRUCTIVE CHOLESTASIS - an
experimental study in young rats.
In experimental chronic obstructive cholestasis there is a progressive atrophy of the
hepatic parenchima and, therefore, an impairment in hepatic function. Cholestasis is
frequently associated with deficiency of the fat-soluble-vitamins A,D,E,K because
the intraluminal solubilization and absorption of ingested lipids requires an adequate
bile flow. The hepatic dammage secondary to biliary obstruction impairs the hepatic
sinthesis and delivery of retinol binding protein (RBP). In consequence, there is an
impairment in the delivery of V.A. from the hepatic stores and its supply to the target
tissues. Its deficiency diminishes the antioxidative potential enhancing liver
dammage mediated by oxygen free radicals. Our aim was to analyse the effects of
two factors: 1) cholestasis and 2) the administration of an hidromiscible V.A. and
their interaction using male 21 days old Wistar rats submited to double ligature and
ressection of the common bile duct or sham-operated as regards 1) the serum levels
of V.A., 2) espontaneous mortality; 3) mortality after pentobarbital; 3) intensity of
hepatic fibrosis, inflamation and ductal proliferation. We studied 134 animals in 6
treatment groups as below:
No of rats/variable of study
Serum
Group
Espontaneous Mortality after
Histologia
levels of
mortality
pentobarbital
V.A.
SA 0
11
10
10
11
10
SA 50
12
10
10
12
10
SA 100
11
10
11
11
10
LA 0
77
10
77
11
10
LA 50
12
10
10
12
10
LA 100
11
10
11
11
10
st
The administration of V.A. was started at the 21 day of life after common duct
ligation (BDL) or sham operation. The LA 50, LA 100, SA 50, SA 100 groups
received 50 or 100 IU of water soluble V.A. Roche (retinil palmitate)/g/day/, by
gavage for 48 days. The animals from the groups LA0 and SA0 received saline
intead of V.A. at the 68th day of life, they received 50mg/Kg of pentobarbitone
sodium intraperitonally and was studied the mortality. At the 69th it was also
sacrificed by taking blood for serum V.A. determination. Sections of liver were
stained with haematoxylin and eosin and Masson's trichromic and the intensity of
fibrosis was measured using the Ruwart's score and that of inflamation and ductal
proliferation using a score from o to 4. It was also studied spontaneous mortality
during the experiment. The results were analysed by the two ways ANOVA test with
multiple comparisons by the Stewart-Newman-Keuls test. The rates of spontaneous
and pentobarbital induced mortality were compared between them, in pairs, by the z
test after Yates correction. Cholestasis decreased the serum level of V.A. in serum
(p=0,002) independently of the dose of V.A., the serum level of V.A. increased with
the administration of doses of 50 and 100 IU./g, weight of the animal/day in relation
of those that had not received the vitamin (p<0,05), independently of the presence or
No of
rats
125
not of cholestasis. There was no increase in the serum level of VA when the dose
was increased from 50 to 100.IU (p=0,05). There was no interaction between the
dose of vitamin A and cholestasis as regards the serum level of V.A. (p=0,814). The
spontaneous mortality in the LA0 group was 87%, in the LA100 group, 9,1% and in
the other groups (SA0, SA50, SA100 and LA50) it was 0%; there was a significant
difference (p≤0,001) between the following groups: LA0 and LA50, LA0 and SA0,
LA50 and SA50, SA0 and SA50, SA50 and SA100. The mortality after
pentobarbitone in LA0 group was 100%, LA50, 17,0%, LA100 9,1% and in the
groups SA50 and SA100, 9,1- 17,0 and 9,1% respectively. And there was a
significant difference (p≤0,001) between the following groups: LA0 and LA50, LA0
and LA100, LA0 and SA0. The fibrosis was more intense in the LA0 group than in
the LA50, LA100 and SA0 groups (SNK-p<0,05) and there was no significant
difference between LA50 and LA100. The cholestasis caused inflamation (p≤0,001),
but it was not influenced by the V.A. dose (p=0,132) and there was no interaction
between vitamin A and cholestasis (p=0,134). Ductal proliferation was associated
with cholestasis (p<0,001). V.A. was associated with a decrease in its intensity in
animals with cholestasis (in the groups LA50 and LA100 it was less intense than in
A0 - p<0,05) but its effect did not increased with an increase in the V.A. dosis (LA50
and LA 100, p>0,05). Therefore the administration of a hidromiscible preparation of
V.A. increases its absortion but apparently does not prevent the impairment caused
by cholestasis in its metabolism, preserves the hepatic function and protects the liver
against dammage due to cholestasis.