Isolement et sélection des souches de bactéries lactiques

Transcription

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET
POPULAIRE
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche
Scientifique
Université d’ORAN Es Senia
Faculté des Sciences
Département de Biologie
Mémoire de Magistère
Option : Microbiologie Alimentaire et Industrielle
Intitulée
Isolement et sélection des souches de bactéries
lactiques productrices des métabolites
antibactériennes
Présentée par : BELARBI Fatima
Devant le jury
Mr. BELKHODJA Moulay
Président
Professeur, Université d’Oran Es-Sénia
Mr. AOUES Abdelkader
Examinateur
Mm. CHOUGRANI Fadela
Examinatrice
M.C.A, Université de Mostaghanem
Mr. BEKADA Ahmed
Examinateur
M.C.A, Université d’Oran Es-Sénia
Mr. BENSOLTANE Ahmed
Encadreur
2010-2011
REMERCIEMENT
Avant tout, je remercie Dieu le Tous Puissant de m’avoir donné
la force, le courage, la santé et la patience pour pouvoir
accomplir ce travail.
Au
terme
de
ce
travail,
mes
remerciements
au
Prof.
BENSOLTANE A. Pour la confiance que vous avez placée en
moi. Ses conseils judicieux m’ont permis de mener à bien ce
travail.
Je tiens bien sûr à remercier Prof. BELKHODJA M. d’voir
accepter de présider le jury de soutenance.
Je remercie Prof. AOUES A.K., Mr BEKADA A. et Mm
CHOUGRANI F. d’avoir accepté d’évaluer mon travail et de
l’investissement que cela représente.
Je remercie aussi tous ceux qui m’ont accompagnée pendant ces
années en dehors du laboratoire et qui ont été là quand j’en
avais besoin. Merci à mes parents de m’avoir permis de réaliser
mon rêve. J’espère que vous êtes fiers de moi. Akila votre amitié
aura été d’un soutien inestimable et j’essaierai d’être à l’avenir
plus disponible…
Résumé :
Les bactéries lactiques font naturellement partie de notre environnement et notre alimentation.
On reconnait depuis longtemps, aux bactéries lactiques la propriété de produire des substances
antimicrobiennes et sont utilisées dans la fermentation et la biopréservation des aliments.
La recherche de souches bactériennes lactiques productrices des substances antimicrobiennes
a été entreprise à partir du lait cru de chèvre et de vache.
L’isolement des bactéries lactiques à partir de lait cru de vache et de chèvre nous a permis
d’obtenir 53 souches (Gram positif, catalase négatif) qui ont purifiés et conservées.
L’étude des caractéristiques phénotypiques ; biochimiques et physiologiques (type
fermentaire, croissance en présence de NaCl : 4% et 6,5% , croissance à pH 9,6, tests de
croissance des différentes températures : 30°C et 45°C, étude de la thermorésistance, test de
croissance en milieu lait de Sherman, test d’hydrolyse de l’arginine (ADH), test d’hydrolyse
de l’esculine, production d’acétoїne, utilisation du citrate, production de CO2 à partir du
citrate, production des exopolysaccharides et le test de résistance à la vancomycine) a permis
d’identifier : 32% Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides, 53% Enterococcus
ssp, 12% Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis et 2% Lactobacillus
plantarum.
Les 53 souches ont été testées pour leur effet antibactérien à l’encontre de Staphylococcus
aureus ATCC 25923 et Escherichia coli ATCC 25922. L’interaction de nos souches lactiques
et les bactéries pathogènes a donné des résultats positifs pour toutes les souches, observés par
des zones d’inhibition.
Les souches du genre Leuconostoc (Ln), ont été retenues pour sa forte activité bactéricide,
notamment vis-à-vis de Staphylococcus aureus et Escherichia coli. En culture mixte, les deux
souches lactiques Ln10 et Ln14 diminuent considérablement la croissance de Staphylococcus
aureus et Escherichia coli après quelques heures d’incubation.
Mots-clés: Bactéries lactiques ; Leuconostoc ; Enterococcus ; Lactococcus ; Lactobacillus ;
Interaction ; Bactériocines ; activité antibactérienne ; lait de chèvre ; lait de vache.
Abstract :
Lactic acid bacteria are a natural part of our environment and our food. It has long recognized,
with the property of lactic acid bacteria produce antimicrobial substances and are used in
fermentation and food biopreservation.
The search for lactic acid bacteria strains producing antimicrobial substances has been taken
from the raw goat’s milk and cow’s milk.
The isolation of lactic acid bacteria from raw cow's milk and goat's allowed us to obtain 53
strains (Gram positive, catalase negative) were purified and stored.
The study of phenotypic characteristics, biochemical and physiological (fermentation type,
growth in the presence of 4% NaCl and 6.5%, growth at pH 9.6, the ability to grow at 30°C
and 45°C, survival after heating at 60°C for 30 min, growth in Sherman test milk, hydrolysis
of arginine (ADH) test, hydrolysis of esculin, production of acétoїne, citrate utilization, CO2
production from citrate, production of exopolysaccharides, testing for resistance to
vancomycin) has identified 32% Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides 53%
Enterococcus ssp, 12% Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis and 2%
Lactobacillus plantarum.
The 53 strains were tested for their antibacterial effect against Staphylococcus aureus ATCC
25923 and Escherichia coli ATCC 25922. All our lactic acid bacteria strains showed
antimicrobial activity against pathogenic bacteria, observed by zones of inhibition.
The strains of the genus Leuconostoc (Ln) have been selected for its strong bactericidal
activity, particularly toward Staphylococcus aureus and Escherichia coli. In mixed culture,
both strains Ln10 and Ln14 significantly decrease the growth of Staphylococcus aureus and
Escherichia coli after a few hours of incubation.
Keywords: Lactic acid bacteria ; Leuconostoc ; Enterococcus ; Lactococcus ; Lactobacillus ;
Interaction ; Bacteriocins ; antibacterial activity ; goat’s milk ; cow’s milk.
‫الملخص ‪:‬‬
‫بكتزَب حبيط انالكتُك هٍ خشء ؼبُؼٍ يٍ بُئتُب وغذائُب‪َ ،‬ؼهى يُذ قذَى انشيٍ أٌ هذِ انبكتزَب‬
‫نهب خبصُت إَتبج يىاد‬
‫يعبدة نهًُكزوببث فهٍ تستخذو فٍ انتخًُز و حفظ األغذَت‪ .‬إٌ انبحث ػٍ سالالث بكتُزَت يُتدت نهًىاد انًعبدة‬
‫نهًُكزوببث قذ تى ػهً يستىي حهُب انًبػش و انبقز انخبو‪.‬‬
‫ػشل بكتزَب حبيط انالكتُك يٍ حهُب انًبػش و انبقز انخبو قذ سًح نُب نهحصىل ػهً ‪ 53‬سالنت (يىخبت انصبغ ندزاو ‪،‬‬
‫سبنبت انكبتالس ) انتٍ تى تُقُتهب وتخشَُهب‪.‬‬
‫دراست انخصبئص انًظهزَت انبُىكًُُبئُت وانفُشَىنىخُت ( َىع انتخًُز ‪ ،‬انًُى فٍ وسػ َحتىٌ ػهً كهىرَذ انصىدَىو‬
‫بتزكُش‪ ٪ 4 :‬و ‪ ، ٪ 6،5‬انًُى فٍ ‪ ، 9،6 pH‬واختببراث ًَى فٍ دراخبث حزارة يختهفت ‪ 30‬و ‪ 45‬درخت يئىَت‪ ،‬دراست‬
‫انًقبويت انحزارَت ‪ ،‬اختببر انًُى فٍ انًتىسػ حهُب شُزيبٌ‪ ،‬اختببر تحهم األرخٍُُُ )‪ ،(ADH‬اختببر تحهم االَسكىنٍُ‬
‫‪ ،‬إَتبج ‪ ، acétoїne‬استخذاو انستزاث‪ ،‬إَتبج ‪ CO2‬يٍ انسُتزاث‪ ،‬إَتبج ‪ ، exopolysaccharides‬و اختببر انًقبويت‬
‫نهفبَكىيبَسٍُ) يكُُب يٍ تحذَذ‬
‫‪٪ 12 ، Eenterococcus ssp‬‬
‫‪٪ 53 ، Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides ٪ 32‬‬
‫‪ Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis‬و ‪ ٪ 2‬يٍ‬
‫‪.Lactobacillus plantarum‬‬
‫‪ 53‬سالنت اختبزث بسبب تأثُزهب انًعبد نهبكتُزَب ظذ ‪ Staphylococcus aureus ATCC 25923‬و ‪Escherichia‬‬
‫‪ .coli ATCC 25922‬انتفبػم بٍُ سالالتُب و انبكتُزَب انًسببت نأليزاض‪ ،‬أػؽب َتبئح إَدببُت ندًُغ انسالالث انًهحىظت‬
‫ػٍ ؼزَق يُبؼق انتثبُػ ‪.‬‬
‫تى اختُبر سالالث يٍ خُس‬
‫)‪ Leuconostoc (Ln‬نُشبؼهب انقىي ظذ اندزاثُى‪ ،‬السًُب ظذ‬
‫‪Staphylococcus‬‬
‫‪ aureus‬و ‪ .Escherichia coli‬فٍ وسػ يختهػ‪ ،‬انسالنتٍُ ‪ Ln10‬و ‪ Ln14‬أخفعتب ًَى ‪Staphylococcus aureus‬‬
‫و ‪ Escherichia coli‬بؼذ بعؼت سبػبث يٍ انحعبَت‪.‬‬
‫الكلمات المفتاحية‬
‫‪:‬‬
‫بكتزَب حبيط انالكتُك‬
‫‪،Lactococcus ،Eenterococcus ،Leuconostoc ،‬‬
‫‪ ،Lactobacillus‬انتفبػم‪ ،Bactériocines ،‬حًط انالكتُك‪ ،‬انُشبغ انًعبد نهبكتُزَب‪.‬‬
Liste des abréviations :
ADH : Arginine dihydrolase
ADN : Acide désoxyribonucléique
ARN : Acide ribonucléique
°C : Degré Celsius
CO2 : dioxyde de carbone
g : Gramme
h : Heure
ml : millilitre
min : minute
mm : millimètre
NaCl : Chlorure de sodium
pH : Potentiel d’hydrogène
ppm : Partie pour million
p/v : poids par volume
μl : microlitre
v/v : volume par volume
UFC : Unité Formant Colonie
Liste des figures :
N° Figure
Figure (I) 1
Figure (I) 2
Figure (I) 3
Figure (I) 4
Figure (I) 5
Figure (I) 6
Figure (I) 7
Figure (I) 8
Figure (I) 9
Figure (I) 10
Figure (I) 11
Titre
Principales voies assurant le transport et le métabolisme du glucose par
les bactéries lactiques (Desmazeaud et De Roissart, 1994).
Schéma montrant l’arbre phylogénique des bactéries lactiques y
compris des genres apparenté (Axelsson, 2004)
Morphologie de A: Lactobacillus casei and B: Lactobacillus
acidophilus (Examen en microscopie électronique, 7000 ×) Photo
Bottazzi Vittorio
Morphologie en microscopie électronique de Streptococcus
thermophilus (Liebefeld, 2002)
Morphologie en microscopie électronique de Lactococcus lactis
subsp. “diacetylactis” (Teuber et Geis, 2006)
Fixation des Leuconostocs sur les moules en grès-vernissé.
(Examen en microscopie électronique de balayage, 11 500×).
Photo Micheline Rousseau - Christiane Le Gallo
INRA - C.R. Jouy-en-Josas
Morphologie en microscopie électronique de Pediococcus sp
Photo Sylviane Lemarinier (Université de Caen)
Morphologie en microscopie électronique de Bifidobacterium animalis
Structure de la reutérine, 3-hydroxypropanal (Axelsson, 2004)
Séquence et structure de lantibiotiques de type A (nisin) et B
(mersacidin) (Dortu et Thonart, 2009)
Mode d’action des bactériocines de bactéries lactiques (Paul et al.,
2005)
Figure(II) 1
Figure(II) 2
Figure(II) 3
Protocole d’isolement des souches lactiques
protocole de la fermentation des hydrates de carbones
Les différentes méthodes utilisées pour la recherche de substances
antimicrobienne.
Figure(III) 1
Aspect macroscopique sur milieu MRS des souches; Leuconostoc (A),
Lactococcus (B), Lactobacillus (C) et Enterococcus (D) sur milieu M17
après 24h d’incubation.
Aspect des Colonies des souches sur milieu MRS Leuconostoc (A) et
Lactobacillus (B), lactocoques(C) sur Elliker, Enterococcus (D) sur
milieu M17 après 24h d’incubation (vue sous une loupe)
Observation microscopique de la souche Lactobacillus (A),
Leuconostoc (B), lactocoques (C) et Enterococcus (D) après coloration
de Gram (G x100).
Distribution du pourcentage des isolats lactiques
Croissance en présence de 6.5% NaCl pour les souches S1, S2, S3 et
S4 (Enterococcus).
Figure(III) 2
Figure(III) 3
Figure(III) 4
Figure(III) 5
Page
9
10
13
14
15
16
17
18
24
26
30
37
41
45
47
48
48
49
50
Figure(III) 6
Figure(III) 7
Figure(III) 8
Figure(III) 9
Figure(III) 10
Figure(III) 11
Figure(III) 12
Figure(III) 13
Figure(III) 14
Figure(III) 15
Figure(III) 16
Figure(III) 17
Figure(III) 18
Figure(III) 19
Figure(III) 20
Figure(III) 21
Croissance en milieu gélosé à l’esculine (A : en tubes, B : en boite de
pétri) après 24h d’incubation. T : témoin, L3; L5; S5; S8 ; S11 :
Enterococcus
Résultat de la recherche de l’acétoїne. T : témoin, L1; L2; L9; L11 :
Lactococcus
Croissance en milieu lait de Sherman à 1%. T : témoin, L4; L5; L9;
L2 : Lactococcus
Résultat de production de dextrane par la souche Ln16 (Leuconostoc)
sur milieu MSE.
Test de type fermentaire des souches : L5 ; L6 ; L7 (Lactococcus),
Ln6 ; Ln8 ; Ln10 (Leuconostoc)
Résultat de la production du CO2 à partir du citrate.
T : témoin, Ln3; Ln12; Ln13; Ln15; Ln16 : Leuconostoc
Résultat de test du citratase sur milieu KMK. A: méthode de mutipoint
et B: la méthode des stries. Ln1; Ln2; Ln3; Ln4; Ln5; Ln6; Ln7;
Ln8; Ln9; Ln10: Leuconostoc (cit+), Lb1:Lactobacillus (cit-)
Résultat de dégradation de l’arginine. T : témoin, Lb1 (Lactobacillus),
S21; S22; S23 (Enterococcus)
Résultat de la fermentation des hydrates de carbones de la souche Ln1:
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides (A) et la souche L2:
Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis (B)
Résultat du profil fermentaire de la souche: Lactobacillus plantarum
Lb1 sur la galerie API 50 CHL après 48h d’incubation
Résultat du profil fermentaire de la souche: Leuconostoc
mesenteroides subs mesenteroides Ln5 sur la galerie API 50 CHL
après 48h d’incubation
Aspect macroscopique des bactéries pathogènes après 24h d’incubation
A: Staphylococcus aureus ATCC 25923 sur milieu Chapman
B: Escherichia coli ATCC 25922 sur milieu Héktoine
Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par les souches
de Ln2, Ln3, Ln12, Ln13 (Leuconostoc mesenteroides subs
mesenteroides) contre E. coli (A) et Staphylococcus aureus (B)
Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par des souches
de Ln14, Ln15, Ln16, Ln17 (Leuconostoc mesenteroides subs
mesenteroides) contre E. coli (A) et Staphylococcus aureus (B)
Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par des souches
de Ln1, Ln6, Ln10 Ln10 (Leuconostoc mesenteroides subs
mesenteroides) et L2 (Lactococcus lactis subsp lactis biovar
diacetylactis) contre E. coli (A) et Staphylococcus aureus (B)
Inhibitions obtenues par la méthode Barefoot et Kaenhammer
(1983) par des souches de Ln1, Ln2, Ln3, Ln11 (Leuconostoc
mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis de S. aureus
50
51
51
52
52
53
53
54
59
63
64
67
68
68
69
72
Figure(III) 22
Figure(III) 23
Figure(III) 24
Figure(III) 25
Figure(III) 26
Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS
tamponnée à pH 6,1 par des souches de Ln13, Ln14, Ln15, Ln16
(Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis de
Staphylococcus aureus (A) et E. coli (B)
Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS
tamponnée à pH 6,1 par des souches L2 (Lactococcus lactis subsp
lactis biovar diacetylactis) et Ln10, Ln11 (Leuconostoc
mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis de Staphylococcus
aureus.
La croissance de Staphylococcus aureus dans le lait à 37°C en
présence de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp
mesenteroides Ln10
La croissance de Staphylococcus aureus dans le lait à 37°C en
présence de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp
mesenteroides Ln14
La croissance d’Escherichia coli dans le lait à 37°C en présence de la
souche Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14
73
74
75
75
76
Liste des tableaux :
N° Tableau
Tableau (I) 1
Tableau (I) 2
Tableau (I) 3
Tableau (I) 4
Tableau (I) 5
Tableau (I) 6
Tableau (I) 7
Tableau (I) 8
Tableau (I) 9a
Tableau (I) 9b
Tableau(II) 1
Tableau(III) 1
Tableau(III) 2
Tableau(III) 3
Tableau(III) 4a
Tableau(III) 4b
Tableau(III) 4c
Tableau(III) 5a
Tableau(III) 5b
Tableau(III) 6a
Tableau(III) 6b
Tableau(III) 7
Tableau(III) 8
Titre
Caractère physique du lait cru (Larpent J-P. et al., 1997)
Composition moyenne des laits de chèvre, vache et de femme par
100ml (Pellerin, 2001)
Flore indigène du lait cru (Lamontagne et al, 2002)
Critères différentiels des trois groupes de Lactobacilles (Sharpe, 1981;
Kandler et Weiss, 1986)
Les différentes caractéristiques de bactéries lactiques (Axelsson,
2004)
Principaux produits issus de la fermentation des bactéries lactiques
(Penaud, 2006)
Liste non exhaustive et séquences de bactériocines appartenant à la
classe II (Dortu et Thonart, 2009)
Liste des bactériocines appartenant à la classe III (Klaenhammer,
1993; Riley et Wertz, 2002)
Indique les différentes classes de bactériocines I et IIa produiten par
les bactéries lactiques et leur spectre d’activité (Chen et Hoover,
2003).
Indique les différentes classes de bactériocines I et IIa produiten par
les bactéries lactiques et leur spectre d’activité (Chen et Hoover,
2003).
Milieux l’isolement des bactéries lactiques (Badis et al, 2004)
Page
3
4
Critères d'identification des isolats lactiques du groupe de
Leuconostocs.
Critères d'identification des isolats lactiques du groupe : Lactocoques,
Lactobacilles et Enterocoques.
Critères d'identification des isolats lactiques du groupe
d’Entérocoques.
Profils fermentaires des isolats
Profils fermentaires des isolats par les galeries API 50CHL
Profils fermentaires des isolats par les galeries API 50CHL
Spectre d’activité antimicrobienne des souches lactiques par la
méthode de Fleming (1975)
méthode de Fleming (1975)
méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS tamponnée à pH 6,1
Résultats de dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure
et mixte avec Leuconostoc mesenteroides Ln10.
55
7
12
20
21
27
28
31
32
36
56
57
60
61
62
65
66
70
71
73
annexe
Tableau(III) 9
Tableau(III) 10
Résultats de dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure
et mixte avec Leuconostoc mesenteroides Ln14.
Résultats de dénombrement d’Escherichia coli en culture pure et
mixte avec Leuconostoc mesenteroides Ln14.
annexe
annexe
Sommaire :
Remerciements
Résumé
Sammary
‫الملخص‬
Liste des abréviations
Liste des figures
Liste des tableaux
I.
Revue de littérature
Introduction ............................................................................................................................. 1
1. Lait ....................................................................................................................................... 3
1.1 Présentation générale ....................................................................................................... 3
1.2 Lait de chèvre ................................................................................................................... 4
1.3 Lait de vache .................................................................................................................... 4
1.4
Microflore du lait .......................................................................................................... 6
1.4.1 Flore contaminante ................................................................................................... 6
1.4.2
Flore indigène ou originelle ................................................................................... 7
2. Les bactéries lactiques ....................................................................................................... 7
2.1 Définition ......................................................................................................................... 8
2.2 Caractéristiques principales des bactéries lactiques ........................................................ 8
2.3 Classification des bactéries lactiques ............................................................................. 10
2.4 Les différents genres ...................................................................................................... 11
2.4.1 Lactobacillus ......................................................................................................... 11
2.4.2 Carnobacterium .................................................................................................... 13
2.4.3 Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus et Vagococcus ................................... 14
2.4.4 Leuconostoc, Oenococcus et Weissella ................................................................. 16
2.4.5 Aerococcus, Pediococcus et Tetragenococcus ...................................................... 17
2.4.6 Bifidobacterium ..................................................................................................... 18
2.5 Méthodes d’identification des bactéries lactiques ......................................................... 19
2.5.1 Méthodes classiques .............................................................................................. 19
2.5.2 Méthodes moléculaires .......................................................................................... 20
2.6 Bactéries lactiques et fermentation alimentaire ............................................................ 21
2.7 Bactéries lactiques et santé humaine ............................................................................. 22
2.8 Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques ............................................... 22
2.8.1 Les acides organiques ............................................................................................ 22
2.8.2 Le peroxyde d’hydrogène ...................................................................................... 23
2.8.3 Le dioxyde de carbone ........................................................................................... 24
2.8.4 Le diacétyl .............................................................................................................. 24
2.8.5 La reutérine ............................................................................................................ 24
2.8.6 Les bactériocines .................................................................................................... 25
II.
2.8.6.1
Classification des bactériocines ..................................................................... 25
2.8.6.2
La production des bactériocines et sa régulation ........................................... 28
2.8.6.3
Les mécanismes d’action des bactériocines ................................................... 29
2.8.6.4
Spectre d’activité des bactériocines ............................................................... 30
2.8.6.5
Les applications des bactériocines dans l’industrie alimentaire .................... 32
Matériel et méthodes
1. Provenance des échantillons ........................................................................................... 35
2. Souches utilisées .............................................................................................................. 35
2.1 Souches pathogènes ........................................................................................................ 35
2.2 Souches de référence....................................................................................................... 35
3. Isolement et culture de la flore lactique ........................................................................ 35
4. Purification et conservation des souches ........................................................................ 36
5. Identification des isolats .................................................................................................. 36
5.1 Critères morphologiques ................................................................................................ 36
5.1.1 Caractérisation macroscopique ............................................................................. 36
5.1.2 Caractérisation microscopique .............................................................................. 36
5.2 Critères physiologiques et biochimiques ....................................................................... 38
5.2.1 Test de la catalase ................................................................................................ 38
5.2.2
Croissance à différentes températures .................................................................. 38
5.2.3 Type fermentaire ................................................................................................. 38
5.2.4 Croissance dans des conditions hostiles ............................................................... 38
5.2.4.1 La culture à pH 9,6 et celle en présence de NaCl : 4% , 6,5% ....................... 38
5.2.4.2 Croissance sur le lait bleu de Sherman (1937) ................................................ 39
5.2.5
La thermorésistance ............................................................................................. 39
5.2.6
Hydrolyse de l’arginine (ADH) ........................................................................... 39
5.2.7
Hydrolyse de l’esculine ....................................................................................... 39
5.2.8
Production d’acétoїne .......................................................................................... 39
5.2.9
Utilisation du citrate ............................................................................................. 40
5.2.10 Production de CO2 à partir du citrate ................................................................... 40
5.2.11 Fermentation des hydrates de carbones ............................................................... 40
5.2.12 Identification par la galerie API 50CHL ............................................................. 42
5.2.13 Production de dextrane ........................................................................................ 43
5.2.14 Vancomycine-résistance ..................................................................................... 43
6. Etude de l’activité antibactérienne des souches ............................................................ 43
6.1 Méthode de double couche (méthode de Fleming et al., 1975) ..................................... 43
6.2 Méthode des puits (méthode de Barefoot et Kaenhammer, 1983) ................................. 44
6.3 Inhibition due à l’acide lactique ..................................................................................... 44
6.4 Etude de l’évolution de la croissance en culture mixte .................................................. 46
III. Résultats
1. Identification des isolats .................................................................................................. 47
1.1 Critères morphologiques ................................................................................................ 47
1.2 Critères physiologiques et biochimiques ....................................................................... 49
1.3 Identification des espèces ............................................................................................. 58
1.3.1 La fermentation des hydrates de carbones .............................................................. 58
1.3.2 Profil fermentaire sur galeries API 50CHL ............................................................ 63
2. L’activité antibactérienne des souches .......................................................................... 67
2.1
Mise en évidence des inhibitions ................................................................................. 67
2.1.1 Méthode de Fleming et al., (1975) .......................................................................... 67
2.1.2 Méthode de Barefoot et Kaenhammer (1983) ......................................................... 71
2.1.3 Inhibition due à l’acide lactique .............................................................................. 72
2.2 Etude de l’évolution de la croissance en culture mixte ................................................ 74
2.2.1 Dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et mixte ..................... 74
2.2.1 Dénombrement d’Escherichia coli en culture pure et mixte ................................... 76
IV. Discussion
1. Isolement et identification des souches ......................................................................... 77
2. L’activité antibactérienne des souches .......................................................................... 81
Conclusion et perspectives ...................................................................................................... 86
Références bibliographiques ................................................................................................... 88
Publications scientifiques
Annexe
I. REVUE DE LITTERATURE
Introduction
Introduction :
Le lait occupe une place stratégique dans l'alimentation quotidienne de l'homme, de par ses
composants nobles (protéines, glucides et lipides) et sa richesse en vitamines et en minéraux,
notamment en calcium alimentaire. De nos jours, les besoins en lait sont de plus en plus
importants vu que ce produit peut être consommé à l’état frais, mais aussi sous forme
pasteurisé, stérilisé ou transformé en produits dérivés.
Plusieurs produits laitiers sont obtenus par fermentation et cela par ensemencement du lait cru
ou stérilisé par des bactéries lactiques qui sont capables de bioconvertir ses différents
éléments en nouvelles molécules dotant le lait de nouvelles propriétés organoleptiques,
hygiéniques et même sanitaire.
Les bactéries lactiques sont des microorganismes très répandus dans la nature ; on les trouve
dans le sol, sur les végétaux, elles jouent un rôle important dans notre santé car elles
constituent une fraction majeure de notre flore intestinale et tapissent les muqueuses nasales,
buccales et vaginales, contribuant ainsi à nous protéger contre l’invasion des germes
pathogènes.
Les bactéries lactiques sont utilisées depuis des siècles pour fermenter les aliments. Elles sont
largement présentées un grand intérêt biotechnologique. Considérées comme inoffensives
pour l’homme, leur usage est fréquent dans le monde entier pour fabriquer des produits
laitiers fermentés (fromage, yaourts…). La production d’acide lactique est essentielle à la
fermentation de ces produits et leur confère une saveur typique.
Les bactéries lactiques colonisent naturellement plusieurs matrices alimentaires. Elles sont
depuis des siècles associées à l’alimentation humaine et animale. Ces micro-organismes sont
tolérés par l’homme et les animaux, ce qui a conduit à la reconnaissance de leur statut GRAS
(Generally Recognized As Safe) (Klaenhammer et al., 2005).
Certaines souches de BL s’avèrent bénéfiques pour la santé humaine et sont appelées
probiotiques. Ils sont capables de survivre dans le système digestif humain, voire de le
coloniser et sont utilisées pour le traitement des diarrhées et autres troubles digestifs. Des
études récentes mettent en évidence des propriétés de stimulation de la réponse immunitaire
spécifique et certaines souches auraient la capacité de réduire les réactions d’allergie
alimentaire, en particulier aux protéines du lait (Salminen et al., 1996). L’utilisation des
bactéries lactiques comme vecteurs vivants en vue d’une vaccination par voie orale est
aujourd’hui un axe de recherche très privilégié.
1
Introduction
En industrie agro-alimentaire, les bactéries lactiques sont employées pour aider à la fois à la
fabrication et à la conservation des produits à partir de certaines matières premières telles que
le lait, la viande, le poisson, les végétaux et les céréales. Elles sont utilisées en tant que telles
(biotechnologies empiriques) ou sous forme de ferment (souche sélectionnée et purifiée)
Elles réalisent dans les aliments une acidification, une production d’arômes, une production
d’enzymes permettant d’améliorer la digestibilité des aliments et une inhibition des
microorganismes qu’elle soit pathogène ou d’altération. Cette dernière activité est due à la
production de substances antagonistes tels que les acides organiques (acétique et lactique), le
peroxyde d’hydrogène, le diacétyle et les bactériocines (Klaenhammer et al., 1994 ; Lasagno
et al., 2002; De Vuyst et Leroy, 2007).
Actuellement, les scientifiques exploitent les interactions microbiennes pour assurer la
salubrité des aliments et pour réduire d’une façon considérable la présence des
microorganismes indésirables et nuisibles.
L’intérêt de ce travail est d’identifier et de caractériser des bactéries lactiques isolées de laits
cru (chèvre et vache), provenant de la région de l’Ouest Algérien. La partie suivante nous
avons étudié les interactions dans le but de sélectionner des souches inhibitrices qui possèdent
un pouvoir inhibiteur contre les germes pathogènes et de déterminer la nature des substances
inhibitrices.
2
1. Lait :
Le lait destiné à l’alimentation humaine a été défini en 1909 par le congrès international de la
répression des fraudes : « le lait est le produit intégral de la traite totale et ininterrompue d’une
femelle laitière bien portante, bien nourrie et non surmenée. Il doit être recueilli proprement et
ne pas contenir de colostrum » (Larpent J-P., 1996b)
1.1 Présentation générale :
Le lait est produit par les ruminants qui transforment les protéines végétales en protéines
animales. Le lait est sécrété par les glandes mammaires des femelles de plus de quelques 4000
espèces de mammifères. Sa composition varie légèrement d’une espèce de mammifère à
l’autre.
Le lait est un fluide aqueux opaque, blanc mat, légèrement bleuté, d’une saveur douceâtre et
d’un pH (6,6 à 6,8) légèrement acide, proche da la neutralité (Pougheon et Goursaud, 2001)
Couleur
Caractère normal
Caractère anormal
Blanc mat
Gris jaunâtre :
lait de mammite
Bleu, jaune…
Blanc jaunâtre :
Lait riche en crème
Lait coloré par des
substances chimiques ou
des pigments bactériens
Odeur faible
Odeur
Odeur de putréfaction, de
moisi, de rance…
Saveur agréable
Saveur
Saveur salée :
Lait de mammite
Gout amer :
Lait très pollué par des
bactéries
Consistance
Homogène
Grumeleuse : mammite
Visqueuse ou coagulée :
Pollution bactérienne
Tableau (I) 1 : Caractère physique du lait cru (Larpent J-P et al., 1997)
3
Le lait est un substrat très riche fournissant à l’homme et aux jeunes animaux naissants, un
aliment presque complet. Protides, glucides, lipides, sels minéraux et vitamines sont présents
à des concentrations tout à fait satisfaisantes pour la croissance et la multiplication cellulaire
(Larpent J-P et al., 1997).
Les principaux constituants du lait sont donc par ordre décroissant :

de l’eau, très majoritaire ;

des glucides, principalement représentés par le lactose ;

des lipides, essentiellement des triglycérides rassemblés en globules gras ;

des protéines : caséines rassemblées en micelles, albumines et globulines solubles ;

des sels et minéraux à l’état ionique et moléculaire ;

des éléments à l’état de traces mais au rôle biologique important : enzymes, vitamines,
oligoéléments…
Composition Unité Lait de chèvre Lait de vache Lait de femme
Eau
g
87,5
87,7
87,1
Energie
Kcal
71
65
69
Proteines
g
3,3
3,3
1,3
Lipides
g
4,5
3,8
4,1
Glucides
g
4,6
4,7
7,2
Na
mg
40
50
14
K
mg
180
150
58
Ca
mg
130
120
34
Mg
mg
20
12
3
P
mg
110
95
12
Fe
mg
0,04
0,05
0,07
Cu
mg
0,05
0,02
0,04
Zn
mg
0,3
0,35
0,28
Caséines
%
83
82
40
Protéines de
%
17
18
60
lactosérum
Tableau (I) 2 : Composition moyenne des laits de chèvre, vache et de femme par 100ml
(Pellerin, 2001)
4
1.2 Lait de chèvre :
Le lait de chèvre est caractérisé par sa couleur blanche due à l’absence de bêta carotène,
contrairement au lait de vache. Le lait de chèvre se digère plus facilement que le lait de vache
et il est donc recommandé pour les bébés et les personnes qui supportent mal ce dernier. De
plus il est naturellement homogénéisé car il est dépourvu d'une protéine, l'agglutinine.
Les concentrations en calcium, magnésium, potassium et en phosphore dans le lait de chèvre
et le lait de vache sont presque équivalentes (IDF, 1990).
Pour ce qui est des vitamines, le lait de chèvre est particulièrement plus pauvre en vitamines
C, D, pyridoxine, B12 et acide folique.
La quantité du lactose dans le lait de chèvre est équivalente à celle du lait de vache soit
10g/250ml.
La teneur en protéines du lait de chèvre est comparable à celle du lait de vache. Les caséines
représentent la partie la plus importante des protéines du lait, elles constituent environ 70% des
matières azotés (Corsy, 1991).
Les matières grasses du lait de chèvre sont caractérisées par la longueur des chaînes de
carbone (C18). Ces matières grasses sont constituées de triglycérides et d’acides gras.
1.3 Lait de vache :
Le lait de vache est un liquide opaque de couleur blanche, plus au moins jaunâtre selon la
teneur de la matière grasse en bêta carotène. Sa saveur est douce et son odeur faible.
Le ait de vache de part sa richesse en matière azotée, en calcium et en vitamines offre un
intérêt alimentaire exceptionnel.
Les proportions des différents composants du lait de vache varient quelque peu selon les
espèces de mammifères et parmi ces espèces selon leur race. Un litre de lait cru contient près
de 900 g d'eau et 132 g d'extrait sec.
Le pourcentage de matière grasse est sensiblement le même que dans le lait de chèvre.
Cependant, le diamètre moyen des globules gras dans le lait de vache est de 6um, le lait de
chèvre est d’environ 3um.
Les principales protéines du sérum sont identiques, soit l’α-lactalbumine, la β-lactoglobuline
et les immunoglobulines. Le lait de vache contient des quantités équivalentes entre les
caséines alpha et bêta alors que le lait de chèvre contient une quantité plus grande de caséines
de type bêta.
5
Le lait contient presque toutes les vitamines indispensables à la vie à l’exception de la
vitamine C (très petite quantité).
1.4 Microflore du lait :
Milieu neutre, le lait, par ce caractère, prédispose encore à la prolifération des éléments
microbiens qui l'habitent. Enfin, élément liquide, il permet en outre le déplacement dans toute
sa masse des corps étrangers vivants qui l'ont envahi.
Le lait constitue donc au sens écologique du terme un « écosystème ». Du fait de sa
composition physicochimique, le lait est un excellent substrat pour la croissance microbienne.
1.4.1 Flore contaminante :
La flore contaminante est l’ensemble des microorganismes ajoutées au lait, de récolte
jusqu’à la consommation. Elle peut se composer d’une flore d’altération, qui causera des
défauts sensoriels de gout, d’arômes ou qui réduira la durée de conservation des produits,
et d’une flore pathogène capable de provoquer des malaises chez des personnes
(Lamontagne et al, 2002).
Le lait au cours de la traite, du transport et du stockage à la ferme ou à l’usine, est
contaminé par une grande variété de microorganismes (Larpent J-P., 1997).
Les principales sources de contamination sont les suivantes ;

fèces et téguments de l’animal : coliformes, Bacillus, Clostridium, Salmonella ;

sol : Streptomyces, bactéries sporulées, spores de champignons ;

litières et aliments : flore banale, lactobacilles, Clostridia butyriques (ensilage) ;

air et eau : flores diverses ;

équipement de traite et de stockage du lait : flore lactique, microcoques,
lactobacilles, Chromobacterium, Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium,
Acinitobacter, levures ;

manipulateurs : staphylocoques des mains, germes d’expectoration et de
contamination fécale ;

vecteurs divers : insectes en particulier.
Les principaux genres identifiés comme flore d’altération sont : Pseudomonas, Proteus,
les coliformes, soit principalement les genres Escherichia et Enterobacter, les sporulées
telles que Bacillus, Clostridium et certaines levures et moisissures.
6
D’autres microorganismes peuvent se trouver dans le lait lorsqu’il est issu d’un animal
malade : ils sont généralement pathogènes et dangereux. Il peut s’agir par exemple
d’agents de mammites.
Les mammites sont dues à des infections par Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae, Escherichia coli, Corynebacterium bovis ou Corynebacterium pyogenes,
Mycoplasma, Nocardia asteroides.
1.4.2 Flore indigène ou originelle :
Le lait contient peu de microorganismes lorsqu’il est prélevé dans des conditions
aseptiques, à partir d’un animal sain, il devrait contenir moins de 5000 germes/ml et de
moins de 1 coliforme/ml.
La flore indigène du lait se définit comme l’ensemble de germes saprophytes du pis et des
canaux galactophores.
Microorganismes
Pourcentage(%)
Micrococcus
30-90
Lactobacillus
10-30
Streptococcus ou
< 10
Lactococcus
Gram négatif
< 10
Tableau (I) 3 : Flore indigène du lait cru (Lamontagne et al, 2002)
La flore microbienne du lait cru participe de façon importante à l’établissement des
caractéristiques organoleptiques des fromages et ce, indépendamment de la présence des
ferments (Michel V. et al., 2001)
Les fabrications de produits laitiers utilisent beaucoup de microorganismes et, en particulier,
des bactéries lactiques.
2. Les bactéries lactiques :
Les bactéries lactiques sont très anciennes et sont apparues avant les cyanobactéries, il y a
près de 3 milliards d’années (Tailliez, 2001).
7
Les bactéries lactiques sont utilisées depuis des millénaires dans l’alimentation humaine
(Penaud, 2006). La découverte de leur action sur le lait fut probablement accidentelle mais
leur utilisation fut perpétuée sous forme de levains, simple récupération d’une partie du milieu
de fermentation.
La fermentation confère aux aliments une saveur et une texture particulière, permet de mieux
les conserver et apporte aussi certains bénéfices nutritionnels et de santé.
Ces bactéries furent et sont encore utilisées sous la forme de levains artisanaux, mais le
développement de l’industrie de transformation, en particulier de l’industrie laitière, a conduit
à la production de ferments industriels capables d’assurer à la fois la qualité et la constance du
produit.
Malgré leur importance économique, les bactéries lactiques n’ont pas toujours reçu l’attention
nécessaire ni de la part des microbiologistes ni de celle des industriels. Depuis quelques
années, elles deviennent un sujet d’étude privilégie de par le monde (Novel G., 1993).
2.1 Définition :
La première culture pure était des Bacterium lactis probablement des Lactococcus lactis,
obtenue par Lister en 1873 (Ho, 2008). Les bactéries lactiques ont été isolées pour la première
fois à partir du lait (Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972; et Carr et al., 2002).
Les bactéries lactiques sont définies comme des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes
et chimio-organotrophes (De Roissart, 1986).
2.2 Caractéristiques principales des bactéries lactiques :
Le groupe des bactéries lactiques a été défini par Orla-Jensen (1919) et réunit plusieurs genres
caractérisés par leur capacité à fermenter les glucides en produisant de l’acide lactique (Novel
G., 1993).
Les bactéries lactiques sont un groupe de bacilles ou coccobacilles ont pour principales
caractéristiques d’être : à Gram positif, généralement immobiles, asporulés, anaérobies mais
aèrotolérantes, dépourvus de cytochromes-oxydase et de nitrate-réductase, ne possède pas le
catalase (certaines souches possèdent une pseudo-catalase) (Dellaglio et al., 1994 ; Carr et al.,
2002 ; Axelsson, 2004).
Pour se développer, elles ont besoin de sources de carbone organique (glucides
fermentescibles) et de nombreuses bactéries lactiques ont des exigences nutritionnelles
8
complexes en ce qui concerne les acides aminés ou les peptides, les vitamines et les acides
gras (Prescott et al., 1999).
Les bactéries lactiques sont un groupe hétérogène de microorganismes produisant de l’acide
lactique comme produit principal du métabolisme fermentaire. Selon le type de fermentation
préférentiellement utilisé, les bactéries lactiques sont dites :
-
homofermentaires : l’acide lactique est le seul produit de la fermentation du glucose
-
hétérofermentaires facultatif : la fermentation du glucose aboutit à la formation
d’acide lactique ou de l’acide lactique et de l’acide acétique
-
hétérofermentaires strict : elles produisent, en plus de l’acide lactique, de l’acide
acétique ou de l’éthanol et du CO2
Figure (I) 1 : Principales voies assurant le transport et le métabolisme du glucose par les
bactéries lactiques (Desmazeaud et De Roissart, 1994).
9
Beaucoup de ces caractères sont typiques et servent à définir le « cœur » du groupe lactique
que les recherches taxonomiques et phylogéniques (ou phylogénétiques) sont en train de
modifier de façon significative, soit au niveau des genres et des espèces, soit au niveau de la
ligne de démarcation avec d’autres groupes de bactéries (Dellaglio et al., 1994).
2.3 Classification des bactéries lactiques :
La systématique est en évolution permanente. Il n'y a jamais eu de règles unanimement
reconnues sur la façon dont deux bactéries différentes devraient être phénotypiquement
classées. Par exemple, quelles caractéristiques sont importantes dans la définition des sousespèces, des espèces et du genre ? La littérature scientifique suit généralement les
recommandations des comités de taxonomie qui opèrent sous les auspices de l'Union
internationale de Sociétés Microbiologiques (Sneath, 2001).
La première classification des bactéries lactiques basée sur les propriétés observables à savoir
les propriétés morphologiques, biochimiques et physiologiques a été établie en 1919 par OrlaJensen.
Figure (I) 2 : Schéma montrant l’arbre phylogénique des bactéries lactiques y compris des
genres apparenté (Axelsson, 2004)
10
D’après Ludwig et al. (2008), le phylum Firmicutes comprend trois classes :
Bacilli, Clostridia et Erysipelotrichi. Appartenant à la classe Bacilli, les bactéries lactiques
sont divisées en trois familles :

Famille des Lactobacillaceae comportant les Lactobacillus, Paralactobacillus
et Pediococcus.

Famille des Leuconostocaceae contenant les Leuconostoc, Oenococcus et
Weissella.

Famille des Streptococcaceae comprenant les Streptococcus, Lactococcus et
Lactovum.
Historiquement, le genre Bifidobacterium était aussi considéré comme faisant partie du
groupe des bactéries lactiques grâce à la similarité de ses propriétés physiologiques et
biochimiques et à sa présence dans le même habitat écologique, tel que le tube gastrointestinal (Klein et al., 1998).
2.4 Les différents genres :
La classification actuelle des bactéries lactiques fait apparaître douze genres qui incluent
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus, Oenococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Stiles
et Holzapfel, 1997).
2.4.1 Lactobacillus :
Le genre Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae. Les
lactobacilles représentent un genre important des bactéries lactiques tant au niveau industriel
qu’au niveau de la flore commensale infantile.
L’hétérogénéité des espèces est illustrée par le contenu en G + C qui peur varier de 32 à 53 %
(Schleifer et Stackebrandt, 1983 ; Pilet M-F. et al., 2005)
La classification remaniée par Kandler et Weiss (1986) les subdivise en 3 groupes selon leur
type fermentaire :

groupe I : anciennement appelé Thermobacterium. Il regroupe les lactobacilles
homofermentaires stricts et thermophiles, ils sont incapables de fermenter les pentoses
et le gluconate. Ces bactéries fermentent les hexoses par la voie d’Embden-Meyerhof,
en produisant exclusivement de l’acide lactique, elles se développent à 45°C mais pas
à 15°C. Leurs cellules sont longues, droites souvent en palissades (Bottazzi, 1988).
11

groupe II : anciennement appelé Streptobacterium. rassemble les lactobacilles
hétérofermentaires facultatifs et mésophiles qui se développent à 15°C. Les hexoses
sont fermentés par la voie d’Embden-Meyerhof, en produisant exclusivement de
l’acide lactique (mais pour certaines souches : du lactate, de l’acétate, de l’éthanol et
du formiate), celle des pentoses et du gluconate peuvent être dégradés par la voie
hétérofermentaire avec une production d’acide lactique et d’acide acétique par une
phosphokétolase inductible. Leurs cellules sont courtes, souvent arrangées en
filaments (Bottazzi, 1988).

groupe III : anciennement appelé Betabacterium. Ces espèces ont un métabolisme
strictement hétérofermentaire. la fermentation des hexoses produit de l’acide lactique,
de l’acide acétique (ou de l’éthanol) et du CO2, celle des pentoses, de l’acide lactique
et de l’acide acétique. ces bactéries possèdent une phosphokétolase (tableau (I) 4). c’est
un groupe qui rassemble des espèces relativement hétérogènes, surtout mésophiles. les
cellules sont courtes, droites et séparées (Bottazzi, 1988).
Group I,
homofermentaires
Obligatoires
Group II,
hétérofermentaires
Facultatifs
Group III,
hétérofermentaires
Obligatoires
Fermentation des
pentoses
CO2 à partir du glucose
-
+
-
-
-
+
CO2 à partir du gluconate
-
+
+
FDP aldolase
+
+
-
Phosphokétolase
-
+
+
Caractéristiques
Lb. acidophilus
Lb. delbrueckii
Lb. helveticus
Lb. salivarius
Lb. casei
Lb. curvatus
Lb. plantarum
Lb. sakei
Lb. brevis
Lb. buchneri
Lb. fermentum
Lb. reuteri
Tableau (I) 4 : Critères différentiels des trois groupes de Lactobacilles (Sharpe, 1981; Kandler
et Weiss, 1986)
FDP : Fructose 1-6 diphosphate aldolase
12
Les Lactobacilles, de par leur variété, sont présents dans des milieux très différents (Novel G.,
1993) : cavité buccale, tractus digestif, organes génitaux chez l’homme, produits végétaux,
lait et produits laitiers (différents type de fromages), produits carnés, poissons marinés ou
fumés.
A
B
Figure (I) 3 : Morphologie de A: Lactobacillus casei and B: Lactobacillus acidophilus
(Examen en microscopie électronique, ×7000)
Photo Bottazzi Vittorio
2.4.2 Carnobacterium :
Ce genre a été créé par Collins et al. (1987). sont des bacilles hétérofermentaires souvent
trouvés dans les viandes de bœuf, de poisson et de volaille emballées sous vide et stockées à
basse température (Novel G., 1993 ; Joffraud et al., 2006). Ils ont originellement décrit
comme Lactobacillus mobile, Lb. gallinarum, Lb. divergens, Lb. piscicola (Novel G.,
1993). Une étude taxonomique de ces différentes souches a permis de les regrouper après
hybridations ADN-ADN, dans un nouveau genre, Carnobacterium.
Morphologiquement proche des Lactobacillus (petits batonnets isolés, par paires ou en
courtes chaines), ils s’en différencient par leur production de l’acide lactique L(+) et leur
incapacité à se développer dans les substrats à base d’acétate. En général, les Carnobacterium
peuvent croître à un pH relativement élevé (par exemple, pH=9) tandis que les lactobacilles ne
peuvent pas s’y développer (Schillinger et Lücke, 1987). La croissance est possible à 0°C et
10°C mais pas à 45°C, ni en présence de NaCl 8% (Larpent J-P., 1996a). Leur contenu G+C
est compris entre 33 et 37% (Dellaglio et al., 1994).
13
Ce genre comprend 4 espèces fréquemment associées aux aliments C. divergens, C. piscicola,
C. mobile et C. gallinarum. Ils sont isolés de produits carnés, ou de produits de la mer,
saumon fumé mais certains ont également été isolés de fromages.
2.4.3 Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus et Vagococcus :
Les genres Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus et Vagococcus étaient précédemment
inclus dans un seul genre : Streptococcus (Axelsson, 2004). Ce sont des coques en paire ou en
chaîne, leur fermentation est homolactique, produisant en majorité de l’acide L-lactique.
Ces espèces diffèrent principalement entre elles par la présence d’un antigène de groupe dit
antigène de Lancefield.
-
Le genre Streptococcus comprend la majorité des espèces de streptocoques. ces
organismes ont un contenu en G+C de 35 à 46% (Pilet M-F. et al., 2005). Ce genre est
généralement divisé en trois groupes : pyogène, oral et les autres streptocoques.
Le groupe pyogène contient essentiellement des espèces pathogènes, hémolytiques
(hémolyse β) comme Streptococcus pyogenes ; d’autres streptocoques oraux (α- ou
non-hémolytiques) sont associés principalement à la cavité orale de l’homme et de
l’animal (Streptococcus mutans).
L’espèce thermophile qui soit utilisée en technologie alimentaire est Streptococcus
thermophilus. Les Sp. thermophilus ont été inclus dans le groupe des « autre
streptocoques » par Scheilfer et Kilpper-Bälz (1987). Du fait par son habitat (lait et
produits laitiers), et son caractère non pathogène seul cette espèce est considérée comme
appartenant aux bactéries lactiques.
Figure (I) 4 : Morphologie en microscopie électronique de Streptococcus thermophilus
(Liebefeld, 2002)
14
-
Le genre Lactococcus appartient au groupe N de Lancefield, représente les
streptocoques dits « lactiques ». Récemment Schleifer et al. (1985), se fondant sur des
critères moléculaires, ont proposé de séparer les streptocoques lactiques mésophiles du
genre Streptococcus et de créer le genre Lactococcus (Novel G., 1993).
Les lactocoques sont associés à de nombreuses fermentations alimentaires et ne
possèdent aucun caractère pathogène, mais seuls les Lactococcus lactis sont
actuellement utilisés dans la technologie laitière.Trois sous-espèces de La. lactis peuvent
être distinguées : L. lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris et L. lactis ssp. hordniae.
Seules les deux premières interviennent dans la plupart des produits laitiers.
Figure (I) 5 : Morphologie en microscopie électronique de Lactococcus lactis
subsp. “diacetylactis” (Teuber et Geis, 2006)
-
Le genre Enterococcus rassemble la plupart des espèces du groupe D de Lancefield
(streptocoques fécaux), présentent une hémolyse de type λ, β, et qui se caractérisent
par leur développement à 10 et 45°C, leur aptitude à croitre en présence de 6,5 %
NaCl, et leur grande résistance aux facteurs de l’environnement. Les espèces
rencontrées dans l’alimentation sont essentiellement En. faecalis (auparavant
Streptococcus faecalis), et ses variétés (En. durans et En. bovis).
Leur habitat est très varié : intestin de l’homme et des animaux, produit végétaux, sol,
produits laitiers (Giraffa et al., 1997). Les entérocoques jouaient un rôle important
dans la maturation des fromages.
-
Les espèces du nouveau genre Vagococcus sont facilement confondues avec les
lactocoques au niveau morphologique, mais ces deux genres sont clairement distincts
par leur composition en acides gras (Ho, 2008).
15
2.4.4 Leuconostoc, Oenococcus et Weissella :
Ils rassemblent les coques lenticulaires en paires ou en chaines, mésophiles, qui possèdent un
caractère hétérofermentaire marqué, avec production de l’acide D(-) lactique.
-
Le genre Leuconostoc a été défini par Van Thieghem en 1878. Ce genre a auparavant
inclus des coccobacilles hétérofermentaires, produisant uniquement de l’acide
lactique, et ne produisant pas d’ammoniaque à partir de l’arginine. Leur température
optimale de croissance se situe entre 25°C et 30°C, et leurs contenG+C sont assez
voisins (37 à 45%) (Garvie, 1986). Leur croissance est toujours lente. Ils ne sont pas
hémolytiques ni pathogènes. ces espèces sont caractérisées par la production à partir
du citrate du lait de diacétyle et pafois par la synthèse de dextranes et de lévanes
extracellulaires en présence de saccharose (Novel G., 1993).
Les études phylogénétiques des Leuconostoc montrent une diversité dans ce genre (Eom
et al., 2007).
En général les Leuconostocs sont utiles dans différents types de fromages (Devoyod
et Poullain, 1988 ; Ogier et al., 2008) où ils facilitent l’ «ouverture » par la production
de CO2. Ils interviennent aussi dans l’industrie laitière (beurre et crème) principalement
les Ln. mesenteroides ssp. cremoris, ensilage et les végétaux fermentés (olives,
choucroute, ets) (Hemme et Foucaud-Scheunemann, 2004).
Figure (I) 6 : Fixation des Leuconostocs sur les moules en grès-vernissé.
(Examen en microscopie électronique de balayage, 11 500×).
Photo Micheline Rousseau - Christiane Le Gallo
INRA - C.R. Jouy-en-Josas
16
-
L’espèce Leoconostoc oenos isolée de vins a été renommée Oenococcus oeni et
certains lactobacilles hétérofermentaires ont été groupés avec Leoconostoc
paramesenteroides dans le nouveau genre Weissella (Stiles et Holzapfel, 1997).
2.4.5 Aerococcus, Pediococcus et Tetragenococcus :
Ce sont des coques formées de cellules groupées en paires ou en tétrades. Ils sont mésophiles,
homofermentaires, et le plus souvent incapable d’utiliser le lactose.
-
Sept espèces de Pediococcus sont connues : P. acidilactici, P. damnosus, P.
-
dextrinicum, P. inopinatus, P. parvutus, P. pentosaceus et P. urinaeequi. Ils fermentent
les sucres en produisant de l’acide lactique DL ou L(+) et sont aussi caractérisés par le
GC% de leur ADN (34-42%). Ces dernières sont importantes dans l’agroalimentaire
tant sous l’aspect négatif que positif. Ce sont des agents de dégradation en brasserie
(P. damnosus). Les P. acidilactici et P. pentosaceus ont démontré leur utilité dans
l’élaboration de plusieurs produits carnés fermentés naturels. ils sont parfois utilisés
comme levains lactiques pour les charcutries. Les pédiocoques sont également des
bactéries lactiques autochtones qui permettent la maturation des fromages (Gonzalez
et al., 2007 ; Gurira et al., 2005).
Figure (I) 7 : Morphologie en microscopie électronique de Pediococcus sp
-
L’espèce Pediococcus halophilus a été renommée Tetragenococcus halophilus.
Seulement deux espèces de Tetragenococcus sont connues : T. halophilus et
T. muriaticus. Ces bactéries résistent à des concentrations élevées en sel (supérieures à
17
18 % NaCl). Ils ont un rôle crucial dans la fabrication des produits alimentaires
comme les saumures (anchois salés), les sauces de soja, ets.
-
Le genre Aerococccus qui contient cinq espèces est généralement moins intéressant
dans l’agroalimentaire (Axelsson, 2004).
2.4.6 Bifidobacterium :
Les Bifidobacterium (l’ancien nom étant Lactobacillus bifidus), la forme des cellules de
Bifidobacterium est très irrégulière, pouvant être : cellules courtes, conoïdales, cellules
ramifiées, spatulées, isolées ou en chaine, disposées en V ou en palissade (Larpent J-P.,
1996a ; Pilet M-F. et al., 2005).
Elles se différencient des autres bactéries lactiques par leur caractère anaérobie, leur contenu
G+C (55-67%) et la présence d’une enzyme, la fructose-6-phosphocétolase). En fait
Bifidobacterium permet de fermenter les hexoses en produisant plus d’acide acétique que
d’acide lactique (rapport 3:2), de faible quantités d’éthanol et d’autres acides organiques.
Cette fermentation « lactique » a conduit à les rapprocher du groupe des bactéries lactiques
(Pilet M-F. et al., 2005). Leur température de croissance est comprise entre 37°C et 41°C.
Ils sont isolés à partir de la flore intestinale du nouveau-né, on les retrouve aussi dans
l’intestin de l’homme et de nombreuses espèces animales. Ils sont utilisés dans la fabrication
du yaourt et produits laitiers fermentés (probiotiques).
Leur présence entraînerait une protection contre les agents infectieux au niveau intestinal
grâce à la présence d’un facteur bifidogène (Sondergaard, 2005).
Figure (I) 8 : Morphologie en microscopie électronique de Bifidobacterium animalis
18
2.5 Méthodes d’identification des bactéries lactiques :
Les bactéries lactiques ont de nombreuses propriétés métaboliques dont les industriels. Ces
propriétés (technologiques, sensorielles antimicrobiennes ou probiotiques) sont spécifiques de
l’espèce, ce qui implique qu’on puisse les mettre en évidence par des techniques
d’identification et de différenciation.
2.5.1 Méthodes classiques :
Les caractéristiques phénotypiques ont généralement servi de point de départ pour plusieurs
tests sophistiqués et constituent la base de différenciation et d’identification des bactéries
lactiques. Différents tests clefs sont largement adoptés. La morphologie ainsi que les
méthodes physiologiques, métaboliques/biochimiques et chimiotaxonomiques sont les plus
utilisées.
Les méthodes physiologiques incluent principalement, la croissance à certaines températures,
à certaines concentrations de NaCl, à différents pH. Les méthodes métaboliques/biochimiques
incluent principalement, la production de CO2 en milieu glucosé le profil de fermentation de
nombreux sucres, l’hydrolyse de l’arginine, de l’esculine et la détermination de l’isomère
optique de l’acide lactique. Les méthodes chimiotaxonomiques incluent principalement, la
détection de l’acide meso-diaminopimelique (mDAP) dans le peptidoglycane. Le Tableau (I) 5
présente les différentes caractéristiques de bactéries lactiques.
Schillinger et Lücke (1987) ont été les premiers à proposer une clef d’identification des
bactéries lactiques de la viande basée sur la comparaison des caractéristiques physiologiques
et biochimiques typiques des différentes espèces (Ammor, 2004).
Plus les méthodes mentionnés en dessus, il ya aussi la technique sérologique. pour les
bactéries lactiques, l’analyse sérologique de fait principalement suivant la méthode de
Lancefield (1933), basée sur l’utilisation de polysaccharides de l’enveloppe cellulaire en tant
qu’antigènes (Curk et al., 1994).
19
Pediococcus
Streptococcus
Tetragenococcus
Weissella
+
-
-
-
-
-
+
-
Production de gaz
-
±
-
-
-
+
-
-
-
+
Croissance à 10°C
+
±
+
+
+
+
±
-
+
+
Croissance à 45°C
-
±
-
+
-
-
±
±
-
-
Croissance à 6.5% NaCl
ND
±
+
+
-
±
±
-
+
±
Croissance à 18% NaCl
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
Croissance à pH 4,4
ND
±
-
+
±
±
+
-
-
±
Croissance à pH 9,6
-
-
+
+
-
-
-
-
+
-
Acide lactique
L
D,L,DL
L
L
L
D
L,DL
L
L
D,DL
Oenococcus
Vagococcus
Leuconostoc
-
Lactococcus
-
Lactobacillus
Formation des tétrades
caractéristiques
Carnobacterium
Enterococcus
Coques
Aerococcus
Bacilles
Tableau (I) 5 : Les différentes caractéristiques de bactéries lactiques (Axelsson, 2004)
+ : positif ; - : négatif ; ± : réponse variable selon les espèces ; ND : non déterminé.
2.5.2 Méthodes moléculaires :
Les méthodes modernes d’identification des bactéries lactique font appel à l’étude des
constituants des cellules.
le séquençage de l’ARN 16S reste une des méthodes les plus appliquées pour obtenir une
identification précise en complément des méthodes classiques. Cependant plusieurs méthodes
d’identification par PCR, plus abordables en routine se sont développées pour l’identification
des bactéries lactiques.
Pour la différenciation intraspécifique, les différentes méthodes moléculaires, comme
composition en base de l’ADN : G+C%, l’hybridation ADN/ADN et ADN/ARN, l’analyse
des fragments de restriction de l’ADN par l’électrophorèse en champ pulsé (R-ECP), les
profils protéiques par SDS-PAGE, sont généralement couplées et permettent l’analyse de la
biodiversité des isolats dans un écosystème donné.
20
2.6 Bactéries lactiques et fermentation alimentaire :
L’utilisation de la fermentation par l’Homme remonte à des temps très anciens. Les ferments
lactiques, contenant une ou plusieurs cultures pures en proportions définies de différentes
bactéries lactiques, sont largement utilisés en agroalimentaire (Holzapfel, 2002).
Les bactéries lactiques interviennent dans de nombreuses transformations du lait (crème
maturée, laits fermentés comme le yaourt, fromages frais et affinés), mais également dans la
vinification (fermentation malolactique), la fabrication des salaisons, la fermentation des
végétaux (choucroute et ensilages) et en boulangerie traditionnelle (Desmazeaud, 1998).
Les bactéries lactiques ont plusieurs rôles dans la production de produits fermentés. Tout
d’abord, les bactéries lactiques (BL) vont permettre de changer la saveur de l’aliment et sa
texture. Ces changements sont dus notamment à l’acide lactique produit au cours de la
croissance. D’autre part, les BL produisent des peptides et des molécules comme l’acétoine,
l’acétaldéhyde, le diacétyle ou l’éthanol qui sont importants pour la flaveur des aliments
(Tableau(I) 6).
Genre
Substrat
Exemples de produits
Bifidobacterium
Lactobacillus
lait
lait
viande
végétaux
céréales
lait
Végétaux
lait
végétaux
viande
végétaux
lait
laits fermentés
yaourts, laits fermentés, kéfirs, fromages
saucissons secs, jambons secs
choucroute, olives, "yaourts" au lait de soja
pain au levain, bières
fromages, kéfirs
choucroute, olives, vin
fromages, kéfirs
choucroute
saucisses semi-séchées
vin
yaourts, laits fermentés, fromages
Lactococcus
Leuconostoc
Pediococcus
Oenococcus
Streptococcus
Tableau (I) 6 : Principaux produits issus de la fermentation des bactéries lactiques
(Penaud, 2006)
Dans les produits laitiers, il s’agit du domaine d’application le plus courant des fermentations
lactiques. Les ferments lactiques naturels ou commerciaux interviennent dans l’élaboration de
tous les produits laitiers fermentés (Pilet et al., 2005), ces micro-organismes assurent
plusieurs fonctions telles que la protéolyse pour donner aux fromages leurs caractères
21
rhéologiques et la production d’agents épaississants pour améliorer la texture du fromage. Les
bactéries lactiques sont souvent utilisées en association par exemple le yaourt est obtenu par
deux espèces lactiques : Lb delbrueckii ssp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus.
Dans les produits carnés, les bactéries lactiques améliorent la qualité hygiénique et marchande
en réduisant d’avantage les risques de croissance de microorganismes indésirables. Les
bactéries lactiques interviennent aussi dans la préparation de nombreux produits végétaux
fermentés. L’exemple le plus connu est la choucroute, elle fait intervenir quatre espèces
lactiques : Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis et
Pediococcus damnosus.
2.7 Bactéries lactiques et santé humaine :
Dans le domaine de la santé, certaines bactéries lactiques spécifiques sont utilisées comme
probiotiques c'est-à-dire des micro-organismes vivants dont l’application à l’homme ou à
l’animal exercent un effet bénéfique sur ce dernier par amélioration des propriétés de la flore
intestinale. Les espèces couramment utilisées sont Lb. Acidophilus, Lb. casei, Lb. johnsonii,
Lb. reuteri, Lb. delbruecki, subsp bulgaricus (Salminen et al., 2004). Les souches lactiques
sont également utilisées dans le traitement de certaines affections telles que les diarrhées, les
allergies alimentaires. D’autres effets, comme la prévention des gastro-entérites nosocomiales
chez le nourisson, des propriétés anticancérigènes, antihypercholestérolémiques, lutte contre
Clostridium difficile et Helicobacter pylori, prévention des maladies inflammatoires
chroniques de l’intestin.
2.8 Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques :
On reconnait depuis longtemps, aux bactéries lactiques, la propriété de produire des
substances antibactériennes leur permettant de se développer préférentiellement dans divers
écosystèmes. L’activité antagoniste des bactéries lactiques est due aux métabolites excrétés :
l’acide lactique et autre acides organiques, peroxyde d’hydrogène, diacétyl, reutérine et les
bactériocines (Leveau et al., 1991 ; Klaenhammer et al., 1994 ; De Vuyst et Leroy, 2007).
2.8.1
Les acides organiques :
Le métabolisme principal des bactéries lactiques a pour effet une production importante des
acides organiques. Les acides organiques sont produits soit par les bactéries homofermentaire,
soit par les bactéries hétérofermentaire. Le métabolisme du pyruvate conduit à la formation
22
uniquement d’acide lactique chez les homofermentaires tandis qu’il conduit à la formation
d’acide lactique, acétique et formique, d’éthanol et de dioxyde de carbone chez les
hétérofermentaires (Liu, 2003).
En général, la production d'acides organiques permet une acidification du milieu qui peut
limiter la croissance de certaines bactéries entre autres les bactéries indésirables et pathogène.
Ainsi, les acides organiques ont différentes actions telles qu'un excellent pouvoir bactéricide
ou un effet bactériostatique contre les micro-organismes pathogènes se trouvant dans le tube
digestif.
Les acides organiques sont un des agents classiques de préservation des aliments (Brul et
Coote, 1999) et sont reconnus comme des additifs alimentaires.
2.8.2
Le peroxyde d’hydrogène :
L’intervention du peroxyde d’hydrogène dans les phénomènes d’inhibition par les bactéries
lactiques a été établie. en 1951 Wheater et al., mettent en évidence l’inhibition de
Staphylococcus aureus par Lactobacillus lactis et l’attribuent à une « lactobacilline ». Dés
1952 ils montent que l’agent inhibiteur est en fait le peroxyde d’hydrogène produit par le
lactobacille (Mathot et al., 1996).
Les bactéries lactiques sont catalase négatives et certaines souches peuvent accumuler du
peroxyde d’hydrogène (H2O2) essentiellement par le métabolisme aérobie ou en
microaérobiose des glucides. Le peroxyde d’hydrogène est, depuis lontemps, reconnu comme
un agent majeur de l’activité antimicrobienne des bactéries lactiques en particulier celle des
lactobacilles. Il peut s’accumuler et être inhibiteur de différents micro-organismes par
l’oxydation des lipides membranaires et la destruction des structures des protéines cellulaires
(Zalan et al., 2005).
En plus de son effet bactéricide direct, le peroxyde d’hydrogène active le système
lactoperoxydase-thyocynate présent dans le lait des mammifères, et génère par oxydation
deux puissants inhibiteurs microbiens, à savoir l’hypothyocyanate(OSCN) et l’acide
hypothyocyaneux (HOSCN). D’un point de vue pratique, ce système agit contre les germes
psychotrophes, en permettant un report appréciable de la date limite de vente du lait cru ; il
permet aussi d’inhiber les germes pathogènes potentiellement présents dans des aliments
23
2.8.3
Le dioxyde de carbone :
Celui-ci est formé pendant la fermentation hétérolactique et crée un environnement anaérobie
qui inhibe les microorganismes aérobies. L’accumulation de dioxyde de carbone dans la
bicouche lipidique peut causer un dysfonctionnement de la perméabilité (Ammor et al., 2006).
Ainsi le CO2 peut effectivement inhiber la croissance de nombreux germes d’altération et
essentiellement les germes psychrotrophes à Gram négatif.
2.8.4
Le diacétyl :
Le diacétyl produit par nombre de bactéries lactiques est un inhibiteur actif contre de
nombreux microorganismes, bactéries ou moisissures. Le diacétyl (C4H6O2) est un des
composants aromatiques essentiels du beurre. L’action inhibitrice est accue en milieu acide,
les bactéries Gram-négatives sont plus sensibles que les bactéries Gram-positives ((Mathot et
al., 1996).
Les concentrations nécessaires à l’obtention d’une inhibition sont de l’ordre de 100 ppm, et
sont supérieures à celles présentes dans le beurre et susceptibles de provoquer son arôme (2 à
7 ppm) (Caplice et Fitzgerald, 1999).
2.8.5
La reutérine :
Axelsson et al., (1989) ont mis en évidence l’action inhibitrice d’une substance produite par
Lactobacillus reuteri. Cette substance (reutérine) a été purifiée et identifiée.
La reutérine (ou 3-hydroxypropionaldehyde) est une substance antimicrobienne qui est
produite comme métabolite intermédiaire pendant la fermentation anaérobique du glycérol. La
reutérine a un large spectre d’activité. Elle a une action contre les procaryotes (Gram-positif
ou Gram-négatif), les eucaryotes, les virus, les champignons et les protozoaires. Elle interfère
avec la réplication de l’ADN. Elle a des applications aussi bien dans le domaine médical que
dans le domaine alimentaire (Vollenweider, 2004).
Figure (I) 9 : Structure de la reutérine, 3-hydroxypropanal (Axelsson, 2004).
24
2.8.6
Les bactériocines :
La détection de la première bactériocine remonte à 1925 par André Gratia qui a observé que
la croissance de certaines souches d'Escherichia coli a été inhibée en présence d'un composé
antibactérien, dont il a donné le nom de colicin V. La découverte d'une bactériocine chez les
lactocoques remonte à 1933. À cette époque, Whitehead (1933) avait observé dans un lot de
lait spécifique que la présence de deux souches de lactocoques inhibait la croissance d'un
ferment de culture fromagère. En 1953, Jacob et al. proposèrent le terme général
« bactériocine ». Les bactériocines diffèrent de la plupart des antibiotiques thérapeutiques par
leur composition protéique et possèdent généralement une spécificité d'action étroite contre
les mêmes espèces (Tagg et al., 1976).
Différentes définitions des bactériocines ont été données au cours du temps. Cependant, la
définition qui reste la plus largement acceptée est celle de Klaenhammer (1988) qui définit les
bactériocines comme des protéines, ou complexes de protéines, avec une activité bactéricide
contre des espèces proches de la souche productrice. Les bactériocines représentent une large
classe de substances antagonistes qui varient considérablement du point de vue de leur poids
moléculaire, de leurs propriétés biochimiques, de leur spectre d’action et de leur mode
d’action (Klaenhammer, 1988). Toutes les bactériocines produites par des bactéries lactiques
décrites jusqu’à présent ont une activité dirigée contre les bactéries Gram-positive. Aucune
bactériocine produite par des bactéries lactiques avec une activité contre des bactéries
Gram-négatif n’a été décrite. En effet, la membrane externe des bactéries Gram-négatif ne
permet pas aux bactériocines d’atteindre la membrane interne, siège de leur activité.
2.8.6.1
Classification des bactériocines :
On trouve des souches productrices de bactériocines chez tous les genres de bactéries
lactiques. Le nombre de bactériocines des bactéries lactiques caractérisées a augmenté de
façon exponentielle depuis une dizaine d'années en raison de l'intérêt tant fondamental
qu'appliqué qu'elles suscitent.
D'après (Klaenhammer, 1993), leur structure primaire a permis de définir une classification en
quatre classes :
Classe I - Les lantibiotiques :
Il s’agit de peptides de taille réduite (< à 5 kD), contenant des acides aminés inhabituels
obtenus par modification post-traductionnellement dont le plus caractéristique est la
25
lanthionine (Morisser et al., 2005). Les lantibiotiques sont stables à la chaleur. Ils peuvent être
divisés en deux types : la classe Ia qui contient des peptides cationiques hydrophobes allongés
contenant jusqu’à 34 acides aminés et la classe Ib qui contient les peptides globulaires
chargés négativement ou sans charge nette et contenant jusqu’à 19 acides aminés. (Mc Auliffe
et Hill, 2001; Twomey et al., 2002). La nisine, la subtiline, la duramycine ainsi que la
cytolysine L1 sont des exemples de lantibiotiques
.
Figure (I) 10 : Séquence et structure de lantibiotiques de type A (nisin) et B (mersacidin)
(Dortu et Thonart, 2009)
Classe II :
La classe II est caractérisée par des petits peptides (< 10 kDa). Ces peptides demeurent
également stables après un traitement à la chaleur et sans modification post-traductionnelle.
Ces peptides sont le plus souvent produits sous forme de prépeptides dont leader N-terminal
sera clivé au niveau d’un doublet glycine. Cette classe est divisée en trois sous classes.
Sous classe IIa Bactériocine active contre les espèces de Listeria monocytogenes
(Cenatiempo et al., 1996 ; Axelsson, 2004). Ils contiennent entre 27 et 48 acides aminés et ont
toutes une partie N-terminale hydrophobe contenant la séquence consensus YGNGV ainsi
qu’un pont disulfure et une partie C-terminale moins conservée, hydrophobe ou amphiphile
qui détermine la spécificité d’action (Fimland et al., 2000 ; Richard et al., 2006).
Ces bactériocines semblent par ailleurs avoir une meilleure activité antimicrobienne, un
spectre d’action plus large et une meilleure résistance à l’exposition à des hautes températures
(Fimland et al., 2000 ; Drider et al., 2006 ; Richard et al., 2006).
26
Tableau (I) 7 : Liste non exhaustive et séquences de bactériocines appartenant à la classe II
(Dortu et Thonart, 2009)
Sous classe IIb correspond à des bactériocines à deux composants. Ont pour trait commun la
nécessité de la mise en commun de plusieurs petits peptides aboutissant à un ensemble
biologiquement actif. Entrent dans cette catégorie diverses lactococcines, plantaricines ou
encore la lactacine F (Allison et al, 1994).
Sous classe IIc Peptides thiol-actives requérant la réduction du résidu cystéine pour être actif.
Les bactériocines de classe II n’appartenant pas aux sous-classes IIa et IIb seront considérées
comme étant de sou-classe IIc.
Classe III :
Les bactériocines de classe III sont caractérisées par leu grande taille. Il s’agit de protéines
dont la masse est supérieur à 30 kDa et thermosensible. Ils sont en effet détruits par un
chauffage de 10 à 15 min à 60°C.
27
La plupart d’entre elles sont produites principalement par des souches de lactobacilles.
l’helveticin J produite par Lactobacillus helveticus A, l’enterolysin A produite par
Enterococcus faecium, la zoocin A produite par Spreptococcus zooepidemicus et la millericin
B produite par Streptococcus milleri (Nilsen et al., 2003 ; Papagianni, 2003 ; Nigutova et al.,
2007).
Tableau (I) 8 : Liste des bactériocines appartenant à la classe III
(Klaenhammer, 1993; Riley et Wertz, 2002)
Classe IV :
Englobe les bactériocines qui nécessitent une partie non protéique pour être active. Cette
quatrième classe, comportant des bactériocines complexes qui exigent des carbohydrates ou
des fractions lipidiques pour leur activité biologique (Morisset et al., 2005 ; Savadogo et al.,
2006). Les bactériocines de classe IV présentée par Klaenhammer (1993) a été contestée par
la suite par de nombreux auteurs, puisque aucun de ces peptides n’a été copurifié avec sa
partie glucidique ou lipidique (Nes et al., 1996)
2.8.6.2
La production des bactériocines et sa régulation :
Différentes protéines sont impliquées dans la production des bactériocines et sa régulation.
Les bactériocines sont produites sous forme d’un prépeptide non-biologiquement actif qui
subira des modifications post-traductionnelles pour aboutir au peptide actif. Cette production
est souvent régulée par un système de Quorum Sensing, un mécanisme permettant à certains
gènes d’être exprimés en fonction de la densité de la population bactérienne (Dortu, 2008).
L'ensemble des déterminants génétiques responsables de la production d'une bactériocine sont
en général trouvés au voisinage les uns des autres groupés en une ou plusieurs unités
28
transcriptionnelles. Elles sont portées par des éléments génétiques mobiles (transposons,
plasmides) et exceptionnellement localisées sur le chromosome bactérien (Cenatiempo et al.,
1996).
2.8.6.3
Les mécanismes d’action des bactériocines :
Toutes les bactériocines de bactéries lactiques, dont le mode d'action a été étudié, paraissent
agir de façon similaire en formant des pores dans la membrane plasmique des cellules cibles.
La formation des pores dans la membrane cytoplasmique va causer l’efflux rapide de petits
composés cytoplasmiques tels que les ions, les acides aminés, l’ATP… (Montville et al.,
1995 ; Dortu et Thonart, 2009) qui aura pour conséquence de perturber le potentiel
transmembranaire et le gradient de pH, à la cessation rapide des activités cellulaires et à la
mort de la cellule. Certaines bactériocines, comme la nisine (lantibiotiques), n'ont pas de
récepteur spécifique. En effet, la nisine semble se lier aux lipides et phospholipides
cationiques présents à la surface de la cellule (Rink et al., 2005; Moll et al. 1999). Par contre,
il semblerait que pour les lactococcines A, B et M. l'initiation de la formation de pores
nécessite la présence d'un récepteur spécifique qui permet la fixation de la bactériocine à la
membrane cellulaire (van Belkum et al., 1991). De plus, certaines bactériocines, telles que, la
bactériocine J46 dont l’activité dépend de la présence d'une force proton motrice sur la
membrane pour pouvoir s'y lier. Certaines bactériocines ne sont pas actives à pH 7 et donc
une activité due à la production d’une bactériocine pourrait être considérée comme étant due à
la production d’acide (Klaenhammer, 1993).
Gravesen et al., (2002) ont examiné la résistance de Listeria monocytogenes à la classe II des
bactériocines et ont trouvés un rapport avec le site spécifique de reconnaissance. Huit mutants
de L. monocytogenes résistants aux bactériocines de la classe IIa, tel que la pediocine PA-1 et
la leucocine A, ont été isolés et étudiés. La lacticine 3147 est un lantibiotique constitué de 2
composants, 2 peptides appelés lac 1 et lac 2 (McAuliffe et al., 1998); les deux composants
sont nécessaire pour exercer une activité antagoniste complète résultant de la formation de
pores ioniques spécifiques dans la membrane de la cellules gram positive cible. McAuliffe et
al., (2000) ont démontrés que la lacticine 3147 exige une enzyme de modification séparée
pour chacun des prepeptides lac1 et lac2.
29
Figure (I) 11 : Mode d’action des bactériocines de bactéries lactiques (Paul et al., 2005)
2.8.6.4
Spectre d’activité des bactériocines :
Les bactériocines peuvent être produites par la plupart des espèces de bactéries lactiques et
leur spectre d'activité est restreint en général aux bactéries taxonomiquement proches du
microorganisme producteur (Piard et Desmazeaud, 1992).
La plupart des bactériocines de la classe I, ont un spectre d'activité relativement large,
touchant à la fois à des bactéries lactiques elles-mêmes mais aussi des espèces pathogènes, tel
que Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium
botulinum. Plusieurs bactériocines dans cette classe, tel que la nisine et la thermophiline 13,
empêchent la germination des spores de Bacillus cereus et Clostridium botulinum. La
plantaricine LP84 (produite par Lactobacillus plantarum NCIM 2084) a montré un
antagonisme contre Escherichia coli (Suma et al., 1998).
La plupart des bactériocines de la clase IIa, ont des spectres d'activité étroits et inhibent
seulement des bactéries gram positif apparentées. En général, les membres du genre
Enterococcus, Lactobacillus, Pediococcus sont sensibles à cette classe IIa, et les membres du
genre Lactococcus sont résistants.
30
Quelques unes des bactériocines IIa, tel que la pediocine PA-1, ayant des spectres inhibiteurs
assez large et pouvant inhiber des bactéries, tel que S. aureus et des cellules végétatives de
Clostridium sp. et de Bacillus sp. Quelques bactériocines de la classe IIa, tel que la
mundticine produite par Enterococcus mundtii, empêche la germination des spores de
Clostridium botulinum. Les bactériocines de la classe IIa, sont généralement actives contre
Listeria. Dans une comparaison directe, Il a été montré que la nisine a un spectre d’inhibition
plus large contre Listeria monocytogenes que la pediocin PA-1 (Ennahar et al., 2000).
Tableau (I) 9a : Indique les différentes classes de bactériocines I et IIa produiten par les
bactéries lactiques et leur spectre d’activité (Chen et Hoover, 2003).
31
Tableau (I) 9b : Indique les différentes classes de bactériocines I et IIa produiten par les
bactéries lactiques et leur spectre d’activité (Chen et Hoover, 2003).
2.8.6.5
Les applications des bactériocines dans l’industrie alimentaire :
Les bactériocines sont employées dans plusieurs domaines, leur utilisation dans le domaine
alimentaire est devenue très intéressante grâce à leur potentiel d'assurer une sécurité
microbienne et une bonne qualité du produit alimentaire. Leur spectre antimicrobien peut être
large ou étroit, elles peuvent donc cibler sélectivement des bactéries pathogènes ou
détériorantes sans inhiber les bactéries indispensables et ont un mode d’action bactéricide
(Galvez et al., 2007). Les bactériocines produites par les bactéries lactiques, peuvent être
32
considéré comme des conservateurs naturels ou biopreservateurs qui accomplissent ces
exigences.
Les bactériocines peuvent être appliquées sous un forme purifiée, semi-purifiée ou sous la
forme d’une concentré obtenu après fermentation d’un substrat alimentaire. Les bactériocines
purifiées ou semi-purifiées sont appliquées après production en fermenteur. Jusqu’à présent,
seule la nisine, un lantibiotique, est acceptée comme additif alimentaire (E234) (Guinane et
al., 2005). Les bactériocines peuvent également être appliquées sous la forme d’un concentré
obtenu après fermentation par la souche productrice et atomisation d’un substrat alimentaire
tel que le lait par exemple. Elle contiendra la bactériocine mais d’autres métabolites
antimicrobiens tels que l’acide lactique. La pediocin est commercialisée sous cette forme sous
le nom ALTA 2341. Un autre mode d’application des bactériocines, des emballages en
polyéthylène ou d’autres films plastiques contenant des bactériocines ont été développés. Ces
emballages permettent de réduire la croissance des microorganismes pathogènes ou
indésirables pouvant se développer en surface durant la conservation du produit (Luchansky
et Call, 2004 ; Ghalfi et al., 2006 ; Galvez et al., 2007).
Les bactéries productrices peuvent également être appliquées dans les produits alimentaires,
peuvent être ajoutées comme starter dans des produits fermentés ou comme culture
protectrice. Elles doivent être capables de croître et de produire des bactériocines dans
l’aliment à conserver.
La combinaison de différentes bactériocines permet d’augmenter l’activité et le spectre
d’action, tout particulièrement en combinant des bactériocines appartenant à des classes
différentes (Vignolo et al., 2000). La combinaison des bactériocines avec d’autres traitements
de conservation chimique ou physique donne des résultats prometteurs pour la conservation
des aliments.
33
II. MATERIEL & METHODES
Objectif du travail
Notre étude répond à trois objectifs :

Isolement et identification de souches lactiques à partir de laits crus de chèvre et de
vache collectés dans la région de l’Ouest Algérien.

Sélection des souches lactiques productrices des substances antibactériennes.

Rechercher la nature des substances inhibitrices.
34
1. Provenance des échantillons :
Les échantillons de laits crus de vache et de chèvre proviennent de la région Ouest Algérien
(Oran), ils sont prélevés auprès des éleveurs, et cela dans deux fermes différentes :
-
Lait de chèvre : ferme situé aux amandiers
-
Lait de vache : ferme situé à Messereguine
Les mamelles sont lavées avec l’eau savonneuse puis rinçage à l’eau javellisée. Les
échantillons du lait (100 ml) sont recueillis dans des flacons de 250 ml stériles. Les
échantillons de lait sont conservés à 4°C et transportés au laboratoire où ils sont analysés.
2. Souches utilisées
2.1
Souches pathogènes :
Pour les tests d’activité antibactérienne, nous avons choisi trois micro-organismes
pathogènes : Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27883, ces bactéries sont des souches de références de la
collection du laboratoire d’analyses médicales de l’Hôpital Universitaire d’Oran.
ATCC: American Type Culture Collection
2.2
Souches de référence :
Deux souches de bactéries lactiques : Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus CNRZ 449 et
Streptococcus thermophilus CNRZ 447. Ces souches provenaient de CIRM-BIA de Rennes
INRA (France).
3. Isolement et culture de la flore lactique :
Après coagulation de l’échantillon de lait qui est réparti en deux tubes, le premier tube est
incubé à 30°C et le deuxième à 45°C, Des dilutions décimales (10-1 à 10-9) de la suspension
mère sont réalisées à l'aide de milieu de dilution (peptone-sel) (voir annexe) et 1ml de chaque
dilution est ensemencé dans la masse des milieux gélosés suivant :
35
Milieux
d’isolement
bactéries
T°C/durée
Incubation
MRS (Man et al.,
1960)
M17 (Terzaghi et
Sandine, 1975)
Elliker
(Elliker, 1956)
MSE (Mayeux et
al., 1962)
M17 (Terzaghi et
Sandine, 1975)
Lactobacilles
37/24h-72h
Anaerobiose
Streptocoques
lactiques
Lactocoques
45/24h-72h
Aerobiose
30/48h-72h
Aerobiose
Leuconostocs
30/48h-72h
Aerobiose
Pediocoques
30/48h-72h
Aerobiose
Tableau(II) 1 : Milieux l’isolement des bactéries lactiques (Badis et al, 2004)
T°C : température optimale de croissance
4. Purification et conservation des souches :
Seules les bactéries à Gram positif et catalase négative ont été retenues. Pour chaque
échantillon, 5 à 10 colonies sont prélevées sur les milieux MRS ou M17 et repiquées sur
milieu MRS ou M17. Après purification, les souches sont conservées par deux méthodes :
-
Conservation de courte durée : les souches pures étaient ensemencées dans des tubes
de gélose inclinée, après l’incubation à 30°C, les tubes sont placés à +4°C et le
renouvellement des souches se fait toutes les 4 semaines.
-
Conservation de longue durée : les cellules des isolats purifiés sont congelée à -20°C
dans un milieu contenant 70% de lait écrémé (enrichi par 0.05 % d’extrait de levure) et
30% de glycérol (Samelis et al., 1994) après la centrifugation à 3000 tr/min pendant
10min . La culture peut être conservée plusieurs mois.
5. Identification des isolats :
5.1
Critères morphologiques :
5.1.1
Caractérisation macroscopique :
L’examen macroscopique est portée sur l’observation macroscopique qui permet de décrire
l’aspect des colonies (la forme, taille, pigmentation contour, viscosité…)
5.1.2 Caractérisation microscopique :
La coloration de Gram a été utilisée pour classer les bactéries selon leur Gram, leur
morphologie et leur mode d’association
Les bactéries Gram positives et catalase négatives sont présumées des bactéries lactiques.
36
à 45°C
Incubation
(l’enrichissement)
à 30°C
Echantillon de
lait cru
Dilution décimale
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Milieu de dilution
(peptone-sel)
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
Recherche: Lactobacilles
MRS
Incubation à 37°C
Recherche: Streptocoques
M17
Lecture des
résultats
Incubation à 45°C
Recherche: Lactocoques
Elliker
Incubation à 30°C
Recherche: Leuconostocs
MSE
Incubation à 30°C
Purification et
conservation
Identification
Figure(II) 1 : Protocole d’isolement des souches lactiques
37
5.2
Critères physiologiques et biochimiques :
5.2.1
Test de la catalase :
le test catalase sert à démontrer si la bactérie possède l’enzyme catalase servant à
décomposer le peroxyde d’hydrogène.
L’activité catalytique consiste à prélever une colonie sur gélose MRS ou M17 et dissociée
dans une goutte d'eau oxygénée (H2O2) à 10 volumes; l’apparition de bulles révélant le
dégagement d'oxygène (Ahmed et Irene, 2007).
5.2.2 Croissance à différentes températures :
Ce test est important car il permet de distinguer les bactéries lactiques mésophiles des
bactéries lactiques thermophiles (Leveau et al., 1991). L’aptitude à la culture est testée à :
 37°C et 45°C (lactobacilles) sur milieu MRS (Man et al., 1960)
 37°C (leuconostocs) sur milieu MRS
 45°C (streptocoques, lactocoques et enterocoques) sur milieu M17 (Terzaghi et
Sandine, 1975)
La croissance est appréciée par l’apparition de trouble.
5.2.3
Type fermentaire :
Ce test permet de classer les bactéries en hétérofermentaire ou homofermentaire. Il est
effectué dans un milieu dépourvu de citrate pour éviter la formation de CO 2 liée à ce
métabolisme particulier (Dicks et Van Vuuren, 1987). On Ensemence abondamment un
tube de 10 ml de bouillon MRS (sans citrate) ou M17 dans le milieu on introduit une
cloche de Durham, le CO2 dégagé par les bactéries hétérofermentaires s’accumule dans la
cloche après l’incubation à 30°C pendant 24 à 48 h.
5.2.4
Croissance dans des conditions hostiles :
Ce test est réalisé pour la caractérisation les lactocoques des enterocoques (Schleifer et al.,
1985 ; Hardie et Whiley, 1995; Stiles et Holzapfel, 1997)
5.2.4.1 La culture à pH 9,6 et celle en présence de NaCl : 4% , 6,5%:
Un milieu hypersalé à différentes concentration de NaCl (4% et 6,5%) et le milieu
MRS alcalinisé à pH 9,6 sont ensemencées et incubées à 30°C pendant 2à 3 jours. On
apprécie la croissance par apparition d’un trouble.
38
5.2.4.2 Croissance sur le lait bleu de Sherman (1937) :
Tester le développement en présence 1% et 3% de bleu de méthylène. Du lait écrémé
additionné de 0,1% et/ou 0,3% de bleu de méthylène (1ml de solution à 1% et/ou 3%
par tube de 9ml de lait) est ensemencé et incubé durant une période de 24 à 48h à 30°C.
Lactococcus lactis est capable de pousser en présence de 0,3% de bleu de méthylène
(Leveau et al., 1991).
5.2.5
La thermorésistance :
La thermorésistance est réalisée pour les cocci, un chauffage du milieu à une température
de 60°C pendant 30 min (Stiles et Holzapfel, 1997; Teuber et Geis, 2006) est testé en
utilisant le milieu M17 liquide et mettre à l’étude 24h à 30°C. Le chauffage est réalisé
dans un bain-marie.
5.2.6
Hydrolyse de l’arginine (ADH) :
Elle est mise en évidence sur un milieu de Moëller (Moëller, 1955; Harrigan et McCance,
1976), pour chaque souche isolée ensemencé ; un tube de bouillon Moëller arginine et un
tube témoin (Moëller sans arginine) recouvrir le milieu avec 4 à 5 mm d’huile de paraffine
(V/V) stérilisé. Après 2 à 6 jours d’incubation à 30°C la culture dans le tube témoin se
manifeste par un virage au jaune dû à l'acidification du milieu (métabolisme du glucose)
(Larpent-Gourgaud et al., 1997; Carr et al., 2002). La dégradation de l’arginine aboutissant
à la formation d’ammoniaque est révélée par alcalinisation du milieu qui devient violet.
5.2.7
Hydrolyse de l’esculine :
L’hydrolyse de cet hétéroside est mise en évidence sur le milieu gélosé à l’esculine
(Devoyod et Poullain, 1988; Larpent-Gourgaud et al., 1997), inoculer le milieu à partir
d’une culture de 24h. Après une incubation à 30°C pendant 24h à 48h,
Une réaction positive se traduit par un noircissement du milieu dû aux sels ferriques
soluble et l’esculétine. Pour les bactéries négatives, le milieu reste inchangé mais il ya
croissance.
5.2.8
Production d’acétoїne :
La recherche de l’acétoïne est testée par la réaction de Voges Proskauer (VP) (Harrigan et
McCance, 1976; Zourari et al., 1991; Facklam et Elliot, 1995) après une culture de 24h à
30°C sur milieu Clark et Lubs (annexe).
39
Ajouter 5 gouttes du réactif VP1 (solution de soude NaOH à 16% dans l’eau distillée) et le
même volume du réactif VP2 (alpha-naphtol à 6% dans l’alcool à 95°). Agiter
soigneusement les tubes et attendre un temps maximum de 10 min.
La présence d'acétoïne se traduit par une coloration rose en surface mais pouvant diffuser
dans tout le milieu.
5.2.9
Utilisation du citrate :
Utilisation du citrate est détectée sur le milieu Kempler et Mc Kay (1980). Après
l’incubation à 30°C pendant 24h à 48h, les colonies qui fermentent le citrate sont des
colonies bleues ou ayant un centre bleu (Citr+). Les colonies incapables de fermenter le
citrate restent blanches (Citr-).
5.2.10 Production de CO2 à partir du citrate :
Cette recherche est faite en inoculant la souche dans un tube (10,5ml) de lait écrémé stérile
10%, ajouter 0,5ml d’une solution de citrate de sodium stérile (10%) et verser environ 4ml
de gélose blanche (1,5%) elle-même stérilisée. La décomposition du citrate se manifeste
par la production de gaz dans la masse du milieu en trois à cinq jours d’incubation à 30°C
(Harrigan et McCance, 1976; Leveau et al., 1991). La production de gaz chez les
leuconostocs et Lactococcus lactis ssp biovar diacétylactis se traduit par la fragmentation
de la gélose dans le tube (Larpent-Gourgaud et al., 1997).
5.2.11 Fermentation des hydrates de carbones :
Il s’agit d’apprécier l’aptitude des souches à métaboliser divers substrats carbonés en
particulier les sucres. Ce test est réalisé en galeries classiques de tubes sur bouillon MRS
sans extrait de viande et sans citrate (MRSc-ev) selon Leveau et al., (1991) additionné d’un
indicateur de pH (pourpre de bromocrésol à 0.05 g/l), le glucose du milieu MRS est
remplacé par l’hydrate de carbone à tester, les solutions de sucres (mannitol, dextrine,
raffinose, xylose, maltose, galactose, fructose, inositol, rhamnose, glucose, lactose,
saccharose, arabinose) sont stérilisées par tyndallisation après ils ont introduit dans le
milieu avec une concentration finale de 1%.
Une culture bactérienne de 24h est centrifugée à 3000 tr/min pendant 10min, le culot est
rincé 2 fois à l’eau physiologique stérile, une suspension est réalisé avec l’eau
physiologique. 0,1 ml de cette suspension est ensemencé dans 2ml du MRSc-ev-BCP-sucre
recouvrir avec une couche mince d’huile de paraffine (V/V) stérilisé (Samelis et al., 1994).
40
Après incubation pendant 48h à 72h le développement de la culture et le virage au jaune de
l’indicateur coloré dû à l’acidification du milieu traduit la fermentation du sucre.
Culture bactérienne de 24h
Milieu MRS
Sans extrait de viande
Sans citrate
Centrifugation
3000 tr/min pendant
10min
MRSc-ev
+ Pourpre de bromocrésol
2 fois rinçage du culot
MRSc-ev-BCP
Suspension
culot + eau physiologique
+ Solution de sucre
0,1 ml
Milieu MRSc-ev-BCP-sucre
Recouvrir avec 4 à 5
mm d’huile de paraffine
Incubation 48h à 72h
virage au jaune de l’indicateur
fermentation du sucre
Figure(II) 2 : protocole de la fermentation des hydrates de carbones.
41
5.2.12 Identification par la galerie API 50CHL :
Les galeries API 50 CHL (Biomérieux, REF 50 300, France) permettent une identification
des bactéries lactiques au niveau de l’espèce et même parfois de la sous-espèce sur la base
de la fermentation de 49 sucres différents.
La galerie API 50 CHL est constituée de 50 microtubes permettant l’étude de la
fermentation de substrat, appartenant à la famille des hydrates de carbone et dérivés
(hétérosides, polyalcools, acides uroniques).
Préparation des galeries :
Chaque galerie est constituée de 5 bandes comprenant chacune 10 tubes numérotés.
 Préparer une boite d’incubation (fond et couvercle)
 Inscrire la référence de la souche sur la languette latérale de la boite.
 Répartir environ 10 ml d’eau distillée ou déminéralisée dans les alvéoles du fond
pour créer une atmosphère humide.
 Sortir les bandes de leur embalage, séparer en deux les bandes 0-19 et 20-39 et les
déposer dans le fond de la boite d’incubation.
 Compléter la galerie avec la bande 40- 49
Préparation de l’inoculum :
 Cultiver les bactéries sur un milieu adapté à sa croissance
 Après 24 h d’incubation, la culture est récupérée par centrifugation à 3100 tr/mn
pendant 10 mn, le culot est rincé 2 fois à l’eau physiologique stérile.
 Préparer l’inoculum dans le milieu de l’API 50 CHL.
Inoculation des galeries :
Répartir la suspension bactérienne à l’aide d’une pipette stérile dans les 50 tubes de la
galerie en se conformant aux précautions suivantes :
 Incliner légèrement vers l’avant la boite d’incubation.
 Eviter la formation de bulles en posant la pointe de la pipette sur le coté de la
cupule.
 Lorsque les tubes doit être inoculés, les cupules sont remplie avec de l’huile de
paraffine stérile.
 Incuber les galeries à la température optimum de croissance de bactéries étudiées.
42
Durant la période d’incubation, la fermentation des sucres est indiquée par une couleur
jaune exceptée pour l’esculine (brun foncé). Les résultats sont lus à 24 h et vérifiés après
48 h d’incubation.
L’interprétation des résultats peut se faire par le logiciel Api Web (BioMérieux) pour
identifier les bactéries lactiques.
5.2.13 Production de dextrane :
Appliqué pour les isolats de Leuconostoc (Carr et al., 2002; König et Fröhlich, 2009), les
souches à tester sont ensemencées sur la gélose MSE (Mayeux et al., 1962), après
incubation à 30°C pendant 48h les colonies sont muqueuses brillantes d’une pellicule
opaque à la surface de la gélose.
5.2.14 Vancomycine-résistance :
Seuls les isolats de genre Leuconostoc ont été testés pour la résistance à la vancomycine.
Elle est mise en évidence par culture sur milieu MSE (Mayeux et al., 1962) gélosé à une
concentration de vancomycine égale 200 µg/ml (Orberg et Sandine, 1984; Swenson et al.,
1990) l’ensemencement est réalisé à la surface et les boites sont incubées à 30°C pendant
48h.
6. Etude de l’activité antibactérienne des souches :
Cette étude est réalisée par deux méthodes :
6.1
Méthode de double couche (méthode de Fleming et al., 1975) :
Pour mettre en évidence les zones d'inhibition, les souches lactiques ont été ensemencées en
touche (à l’aide d’un inoculateur multipoint stérile) à la surface d’un milieu MRS ou M17
solide à partir d’une culture de 24h, les boites sont séchées sous la température ambiante
pendant 2h. Après 24 h d’incubation chaque spot est recouvert avec une goutte de gélose
nutritive maintenue en surfusion (50°C). Cela permet de fixer les colonies et d’éviter leur
dispensions (Larpent-Gourgaud et al., 1997). Une couche de gélose moelle (0,7%) contenant
0,1 ml d’une culture en milieu liquide de 18h d’une souche indicatrice (pathogène), est
coulée au-dessus de la première couche de gélose.
La lecture des boites s’effectue après 24h d’incubation à 37°C en aérobiose, les souches
présentant une zone transparente sont considérées comme productrices de substances
antimicrobiennes. La taille des zones d’inhibition produites a été mesurée en mm.
43
6.2
Méthode des puits (méthode de Barefoot et Kaenhammer, 1983) :
Cette méthode est réalisée sur les bactéries lactiques inhibitrices possédant les plus grande
zones d’inhibition montrant la présence de substances inhibitrices, ces substances peuvent
diffuser dans un milieu de culture solide.
Les bactéries lactiques sont repiquées dans du milieu MRS ou M17 liquide et incubées
pendant une période de 18h à 30°C. Après incubation une centrifugation réfrigérée (4°C) est
réalisée à 4000 tr/min pendant 15 min.
Des puits de 5 mm de diamètre sont creusés stérilement à l’aide d’un emporte-pièce (cloche
de Durham) sur la gélose nutritive inoculé par la souche indicatrice (pathogène) et seront
remplies avec 100 μL du surnageant de culture ou d’extrait cellulaire. Les boîtes de Petri sont
mises à une température de +4°C/4h pour permettre la bonne diffusion de la substance
antibactérienne (Doumandji et al., 2010). Les boites sont incubées à 37°C et la présence de
zones d’inhibition formées autour des puits est examinée après 24h d’incubation (Hwanhlem
et al., 2011).
6.3
Inhibition due à l’acide lactique :
L’acide lactique est un facteur majeur dans les inhibitions. Ce test a pour but d’étudier l’effet
de l’abaissement du pH sur le développement des souches indicatrices. Nous avons procédé
selon la méthode de Fleming et al. (1975) sauf que nous avons utilisé le milieu MRS
tamponnée à pH 6,1 (Larpent-Gourgaud et al., 1997)
La lecture des boites s’effectue après 24h d’incubation à 37°C en aérobiose, la lecture des
résultats se fait par comparaison au milieu témoin non tamponnée .La taille des zones
d’inhibition produites a été mesurée en mm.
44
Méthode de Fleming et al., 1975
Inoculateur multipoint
Culture bactérienne
Incubation 18h
à 30°C
Culture de 18h
(bactérie lactique)
Inoculation de 4
souches lactiques
0,1 ml
Incubation 24h
à 37°C
Culture de 18h
(bactérie pathogène)
7 ml de
gélose moelle
7 ml de gélose moelle
+ souche indicatrice
Zone d’inhibition
Méthode de Barefoot et Kaenhammer, 1983
100 μl
Centrifugation
4°C à 4000 tr
100 μl surnageant de
la culture bactérienne
Surnageant
pd 15 min
Culot
Culture de 18h
(bactérie lactique)
Incubation 24h
Zone d’inhibition
Gélose nutritive contenant
la souche indicatrice
à 37°C
Figure(II) 3 : Les différentes méthodes utilisées pour la recherche de substances
antimicrobienne.
45
6.4
Etude de l’évolution de la croissance en culture mixte :
Cette étude est réalisée sur milieu lait écrémé (10%). L’évolution de la croissance des
bactéries pathogènes (Staphylococcus aureus et Escherichia coli) a été faite en culture pure et
culture mixte (présence de bactéries lactiques inhibitrices)
Une culture de 18h de la souche Ln7, Staphylococcus aureus et Escherichia coli sont d’abord
pré-incubés sur milieu lait à 30°C pendant 18h. Des tubes contenant 10 ml de lait écrémé sont
ensemencés à raison de 3% à partir de la culture de pré-incubation. Ils sont ensuite incubés à
une température de 30°C. La première série reçoit la souche lactique Ln7, la deuxième une
culture pure de Staphylococcus aureus, la troisième Escherichia coli et la quatrième représente
la culture mixte la souche lactique Ln7 et les bactéries pathogènes (Staphylococcus aureus et
Escherichia coli). La croissance est effectuée juste après l’ensemencement, puis chaque
intervalle de temps suivant : 0h, 4h, 8h, 18h, 24h.
Chaque heure d’incubation des comptages sur milieu solide sont effectués selon la méthode
officielle (IFD) (Guessas, 2006). Des séries de dilutions des méthodes suivantes ont été
utilisées pour :
- Staphylococcus aureus : dénombrement sur milieu Chapman, incubation 24 h à 37°C
- Escherichia coli : dénombrement sur milieu gélose nutritif, incubation 24 h à 37°C
- La souche Ln7 : dénombrement sur milieu MRS, incubation 24 h à 30°C
- Culture mixte : seules Staphylococcus aureus et Escherichia coli sont comptés.
Tous les milieux ont été ensemencés à la surface de la gélose.
46
III. RESULTATS
Résultats
1.
Identification des isolats :
Lors de cette étude nous avons identifié les souches isolées à partir du lait de vache et du lait de
chèvre par les procédures phénotypiques conventionnelles basées sur les tests morphologiques,
physiologiques et biochimiques.
Les isolats Gram positif, catalases négatifs sont étudiées.
1.1
Critères morphologiques :
L’examen macroscopique sur milieu solide MRS ou M17 montre des colonies circulaires,
bombées et de couleur blanche, leur taille est d’environ 1mm à 2 mm de diamètre (Figure(III) 2),
une deuxième forme de colonie irrégulière, érodée, de couleur crème et de 1 à 3 mm de diamètre
(Figure(III) 2).
L'aspect microscopique des souches après coloration de Gram a révélée deux formes de
cellules : Coques et Bâtonnets. Les coques sont disposées en paires (diplocoques) ou en courtes
chaînettes (Figure(III) 3), mais les bâtonnets présents des cellules associées en paires ou en
courtes chaînettes (figure(III) 3). Tandis que la forme ovoïde est associée en paire ou en
chainette.
A
B
C
D
Figure(III) 1 : Aspect macroscopique sur milieu MRS des souches; Leuconostoc (A), Lactococcus
(B), Lactobacillus (C) et Enterococcus (D) sur milieu M17 après 24h d’incubation.
47
Résultats
A
B
C
D
Figure(III) 2 : Aspect des Colonies des souches sur milieu MRS Leuconostoc (A) et Lactobacillus (B),
lactocoques(C) sur Elliker, Enterococcus (D) sur milieu M17 après 24h d’incubation (vue sous une loupe)
A
B
C
D
Figure(III) 3 : Observation microscopique de la souche Lactobacillus (A), Leuconostoc (B),
lactocoques (C) et Enterococcus (D) après coloration de Gram (G x100).
48
Résultats
1.2
Critères physiologiques et biochimiques :
Un total de 53 isolats lactiques ont été rattachés à 4 groupes de bactéries avec leur pourcentage
(Figure(III) 4) .Ces isolats ont été identifiés au stade du genre en se basant sur leurs
caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques.
Lctobacillus
Lactococcus
Lactococcus
3,44%
13,79%
Leuconostoc
Enterococcus
8,33%
Leuconostoc
Enterococcus
45,83%
45,83%
20,68%
Lait de chèvre
62,06%
Lait de vache
Figure(III) 4 : Distribution du pourcentage des isolats lactiques
Les résultats des méthodes phénotypiques appliquées pour l’identification des souches sont
regroupés dans le tableau(III) 1, tableau(III) 2 et tableau(III) 3
L’identification du genre est d’abord orientée par la morphologie, puis par le type fermentaire
(production de CO à partir du glucose) et les conditions physiologiques de croissance (Pilet MF. et al., 2005)

Genre Enterococcus : les résultats (Tableau(III) 3) des tests préliminaires montrent que
les isolats appartenant au groupe d’Enterococcus 45,83% (lait de chèvre), 62,06% (lait
de vache) sont homofermentaires, poussent dans le milieu 4% et 6.5% de NaCl
(Figure(III) 5), peuvent aussi croitre à 1% de lait de Sherman et à pH 9,6.
Toutes les souches du genre Enterococcus donnent des résultats positifs pour différents
tests : croissance à 45°C, hydrolyse de l’arginine, thermorésistance, hydrolyse de
l’esculine (voir Figure(III) 6),
49
Résultats
S1
S3
S2
S4
Figure(III) 5 : Croissance en présence de 6.5% NaCl pour les souches S1, S2, S3 et
S4 (Enterococcus).
T
L3
S5
L5
S8
S11
S2
S1
S3
S4
S3
S5
S
S2
S3
A
B
S1
Figure(III) 6 : Croissance en milieu gélosé à l’esculine (A : en tubes,
S4 B : en boite de pétri) après
24h d’incubation.
S5
T : témoin, L3; L5; S5; S8 ; S11 : Enterococcus

Genre Lactococcus : parmi les cocci on a des souches du genre Lactococcus qui sont
homofermentaires, citrate positif, ADH positif, aucune croissance en présence de 4% et
6,5% de NaCl. Les souches L3, L5, L8, représentent une croissance variable en
présence 6,5% de NaCl ; nous l’avons situé parmi le genre Lactococcus
Parmi ce genre certaines souches sont acétoїne positif, d’autres sont incapable de
produire l’acétoїne (montrer dans la Figure(III) 7), la majorité des souches n’ont produit
50
Résultats
pas de CO2 à partir du citrate sauf les souches : L3, L8 (réaction faible) et la souche
L11 : nous l’avons situé parmi l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis biovar
diacetylactis.
Toutes les souches possèdent résultat négative pour la croissance dans 3% pour lait de
Sherman (sauf la souche L5), mais les deux souches : L1 et L2 ne représentent aucune
croissance dans 1% et 3% de lait de Sherman (Figure(III) 8)
T
L1
L2
L9
L11
Figure(III) 7 : Résultat de la recherche de l’acétoїne.
T : témoin, L1; L2; L9; L11 : Lactococcus
T
L4
L5
L9
L2
Figure(III) 8 : Croissance en milieu lait de Sherman à 1%.
T : témoin, L4; L5; L9; L2 : Lactococcus
51
Résultats

Genre Leuconostoc : Les leuconostocs ont été déterminés comme Leuconostoc
mesenteroides grâce ces souches produisent le dextrane (Figure(III) 9)
Toutes les souches donnent des résultats positifs aux tests suivants : croissance à 37°C,
résistent à 200 µg/ml de Vancomycine, ADH négatif, citrate positif (Figure(III) 11).
Les souches de Leuconostocs sont hétérofermentaires (Figure(III) 10), acétoїne négatif,
produisent le CO2 à partir du citrate (sauf Ln5, Ln6, Ln7, Ln8) (voir Figure(III) 11),
esculine positif (sauf Ln12, Ln13, Ln14, Ln15, Ln16 et Ln17)
Figure(III) 9 : Résultat de production de dextrane par la souche Ln16 (Leuconostoc) sur milieu MSE.
L5
L6
Ln6
L7
Ln8
Ln10
Figure(III) 10 : Test de type fermentaire des souches : L5, L6, L7 (Lactococcus),
Ln6, Ln8, Ln10 (Leuconostoc)
52
Résultats
T
Ln3
Ln12
Ln13
Ln15 Ln16
Figure(III) 11 : Résultat de la production du CO2 à partir du citrate.
T : témoin, Ln3; Ln12; Ln13; Ln15; Ln16 : Leuconostoc
Ln1
Ln2
Ln3
Ln8
Ln10
Ln7
Ln4
Ln5
Ln6
Lb1
Ln7
Ln8
Ln9
A
B
Figure(III) 12 : Résultat de test du citratase sur milieu KMK.
A: méthode de mutipoint et B: la méthode des stries.
Ln1; Ln2; Ln3; Ln4; Ln5; Ln6; Ln7; Ln8; Ln9; Ln10: Leuconostoc (cit+)
Lb1: Lactobacillus (cit-)
53
Résultats

Genre Lactobacillus : La forme bâtonnets est représentée par le genre Lactobacillus,
on a trouvé une seule souche Lb1 qui possède les caractéristiques suivantes :
homofermentaire, pousse à 45°C, ADH négatif (Figure(III) 13), esculine positif.
T
Lb1
S21
S22
S23
Figure(III) 13 : Résultat de dégradation de l’arginine.
T : témoin, Lb1 (Lactobacillus), S21; S22; S23 (Enterococcus)
54
Résultats
+
+
+
Ln2
Ovoïde
+
+
Hétéro
-
+
-
+
+
+
+
Ln3
Ovoïde
+
+
Hétéro
-
+
-
+
+
+
+
Ln4
Ovoïde
+
+
Hétéro
-
(+)
-
+
+
+
+
Ln5
Ovoïde
+
-
Hétéro
-
-
-
+
+
+
+
Ln6
Ovoïde
+
-
Hétéro
-
-
-
+
+
+
+
Ln7
Ovoïde
+
-
Hétéro
-
-
-
+
+
+
+
Ln8
Ovoïde
+
-
Hétéro
-
-
-
+
+
+
+
Ln9
Ovoïde
+
+
Hétéro
-
+
-
+
+
+
+
Ln10
Ovoïde
+
+
Hétéro
-
+
-
+
+
+
+
Ln11
Ovoïde
+
+
Hétéro
-
+
-
+
+
+
+
Ln12
Ovoïde
+
ND
Hétéro
-
+
-
-
+
+
+
Ln13
Ovoïde
+
ND
Hétéro
-
+
-
-
+
+
+
Ln14
Ovoïde
+
ND
Hétéro
-
(+)
-
-
+
+
+
Ln15
Ovoïde
+
ND
Hétéro
-
+
-
-
+
+
+
Ln16
Ovoïde
+
ND
Hétéro
-
+
-
-
+
+
+
Ln17
Ovoïde
+
ND
Hétéro
-
+
-
-
+
+
+
Groupe
+
Leuconostocs
Vancomycinerésistance
-
Leuconostocs
Production de
dextrane
+
Citratase
-
Hydrolyse de
l’esculine
Hétéro
Acétoїne
CO2 à partir
du citrate
+
NaCl 6,5%
+
37°C
Ovoïde
Morphologie
Ln1
Code
Arginine
di hydrolase
Production de :
Type
fermentaire
Lait de vache
Lait de chèvre
L’origine
Croissance
Tableau(III) 1 : Critères d'identification des isolats lactiques du groupe de Leuconostocs.
+ : croissance positive, - : négative, (+) : croissance faiblement positive, ND : non déterminé,
Hétéro : hétérofermentaire
55
Résultats
Type
fermentaire
Arginine
di hydrolase
CO2 à partir
du citrate
Acétoїne
+
-
-
-
ND
Homo
+
-
+
+
+
+
L2
Cocci
+
+
+
-
-
-
ND
Homo
+
-
+
+
+
+
L3
Cocci
+
+
+
V
-
-
ND
Homo
+
(+)
-
+
(+)
+
L4
Cocci
+
+
+
+
+
-
ND
Homo
+
-
-
+
+
+
L5
Cocci
+
+
+
V
+
+
ND
Homo
+
-
+
+
+
+
L6
Cocci
+
+
+
+
+
-
ND
Homo
+
-
-
+
+
+
L7
Cocci
+
+
+
+
+
-
ND
Homo
+
-
-
+
+
+
L8
Cocci
+
+
+
V
+
-
ND
Homo
+
(+)
+
+
+
+
L9
Cocci
+
+
+
+
+
-
ND
Homo
+
-
-
+
+
+
L10
Cocci
+
+
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
-
ND
+
ND
L11
Cocci
+
+
-
-
ND
ND
ND
Homo
-
+
-
ND
+
ND
Lb1
Bacille
+
+
ND
-
ND
ND
ND
Homo
+
-
V
ND
+
-
S1
Cocci
+
+
ND
+
+
+
+
Homo
+
-
+
+
+
+
S2
Cocci
+
+
ND
+
+
+
+
Homo
+
-
+
+
+
+
S3
Cocci
+
+
ND
+
+
-
+
Homo
+
-
+
+
+
+
S4
Cocci
+
+
ND
+
+
+
+
Homo
+
-
+
+
+
+
S5
Cocci
+
+
ND
+
+
+
+
Homo
+
-
+
+
+
+
S6
Cocci
+
+
ND
+
+
-
+
Homo
+
-
+
+
+
+
Tableau(III) 2 : Critères d'identification des isolats lactiques du groupe : Lactocoques,
Lactobacilles et Enterocoques.
+ : croissance positive, - : négative, (+) : croissance faiblement positive ND : non déterminé,
V : croissance variable, Homo : homofermentaire, Lacb : Lactobacille
56
Groupe
pH 9,6
+
Lactocoques
NaCl 6,5%
+
3%
Lacb
NaCl 4%
Cocci
1%
Entérocoques
45°C
Thermorésista
nce60°C pd 30
min
Hydrolyse de
l’esculine
Citratase
37°C
Lait de
Sherman
Morphologie
Lait de
chèvre
Lait de vache
Lait de chèvre
Production de :
L1
Code
L’origine
Croissance
Résultats
Type
fermentaire
Arginine
di hydrolase
CO2 à partir
du citrate
Acétoїne
+
ND
+
+
-
+
Homo
+
-
+
+
+
+
S8
Cocci
+
+
ND
+
+
-
+
Homo
+
-
+
+
+
+
S9
Cocci
+
+
ND
+
+
+
+
Homo
+
-
+
+
+
+
S10
Cocci
+
+
ND
+
+
+
+
Homo
+
-
+
+
+
+
S11
Cocci
+ ND ND
+
+
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S12
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S13
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S14
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S15
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S16
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S17
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S18
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S19
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S20
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S21
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S22
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S23
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
S24
Cocci
+ ND
+
+
ND
ND
ND
Homo
+
-
+
ND
+
+
Tableau(III) 3 : Critères d'identification des isolats lactiques du groupe d’Enterocoques.
+ : croissance positive, - : négative, (+) : croissance faiblement positive, ND : non déterminé,
V : croissance variable, Homo : homofermentaire
57
Groupe
pH 9,6
+
3%
Entérocoques
NaCl 6,5%
Cocci
1%
Entérocoques
NaCl 4%
Thermorésista
nce60°C pd 30
min
Hydrolyse de
l’esculine
Citratase
45°C
S7
Code
37°C
Lait de
Sherman
Production de :
Morphologie
Lait de vache
Lait de chèvre
L’origine
Croissance
Résultats
1.3
Identification des espèces :
1.3.1
La fermentation des hydrates de carbones :
L’identification est complétée avec l’étude de la fermentation des hydrates de carbones par
les souches isolées.
La fermentation des sucres par les souches isolées et leur identification ont été présentées
dans le tableau(III) 2.
L’identification des souches isolées est basée sur les profils des souches de référence selon
les travaux de : Leveau et al., 1991 ; Larpent J-P, 1996 ; Bjökroth J. et Holzapfel W., 2006 ;
Devoyod J.J. et Poullain F., 1988 ; Teuber M. et Geis A., 2006 ; Hammes W.P. et Hertel
C., 2006

Les souches de Leuconostoc généralement sont capable de fermenter la plupart des
sucres, mais ne fermentent pas l’inositol.
Les souches Ln1, Ln2, Ln3, Ln5, Ln8, Ln12, Ln13, Ln14, Ln15, Ln16, Ln17 ont le
même profil fermentaire sauf : Ln1 fermente le mannitol, Ln17 ne fermente pas le
cellobiose, Ln5 et Ln8 sont arabinose négatif
Les souches Ln4, Ln6, Ln7, Ln9, Ln10, Ln11 ont le même profil fermentaire excepté
que Ln6 ne fermente pas le raffinose, Ln9 ne fermente ni le raffinose ni le rhamnose
aussi Ln11 ne fermente pas le xylose.
Elles sont classées parmi l’espèce Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides

La souche de Lactobacillus (Lb1) fermente la majorité des sucres, elle ne fermente ni le
xylose, ni l’inositol, ni le rhamnose.
Elle est classée parmi l’espèce Lactobacillus plantarum

Les souches de Lactococcus ont le même profil fermentaire, tandis que les souches L1,
L2, L11 fermentent le raffinose, mais le rhamnose est utilisé par les souches L1 et L2.
Toutes ces souches sont classées parmi l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis biovar
diacetylactis

Toutes les souches d’entérocoques sont capables d’utilisées la majorité des sucres, elles
sont alors au genre Enterococcus ssp

aucun Streptococcus thermophilus n'a été trouvé.
58
Résultats
T
Rf
Mn Xy
Gl
Ml
In
Fr
Lc
Sc
Ar
Cl Me
G Lc
Sc
Ar
Cl
Rh G
A
T
Dx
Rf Mn Xy
Ml
Gl Fr
In
Rh
Me
B
Figure(III) 14 : Résultat de la fermentation des hydrates de carbones de la souche Ln1:
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides (A) et la souche L2: Lactococcus lactis
subsp lactis var diacetylactis (B)
T : Témoin, Dx : Dextrine, Rf : Raffinose, Mn : Mannitol, Xy : Xylose, Ml : Maltose,
Gl : Galactose, Fr : Fructose, In : Inositol, Rh : Rhamnose, G : Glucose, Lc : Lactose,
Sc : Saccharose, Ar : Arabinose, Cl : Cellobiose, Me : Mélibiose.
59
Résultats
Dextrine
Raffinose
Mannitol
D-Xylose
Maltose
D-Galactose
D-Fructose
Inositol
L-Rhamnose
Glucose
Lactose
Saccharose
Arabinose
Cellobiose
Melibiose
Production d’acide à partir de :
Souches
Ln1
-
-
+
T
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Ln2
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Ln3
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Ln4
+
+
+
T
+
+
+
-
T
+
+
+
+
+
+
Ln5
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
+
+
Ln6
+
-
+
T
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
Ln7
+
+
+
T
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
Ln8
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
T
+
Ln9
+
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Ln10
+
T
+
T
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
Ln11
+
+
+
-
+
+
+
-
T
+
+
+
+
+
+
Ln12
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Ln13
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Ln14
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Ln15
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Ln16
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Ln17
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
+
Identification
Leuconostoc mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
subsp mesenteroides
Tableau(III) 4a : Profils fermentaires des isolats
+ : dégrade le sucre, - : ne dégrade pas le sucre, T : dégrade le sucre mais tardivement
ND : non déterminé
60
Résultats
D-Xylose
Maltose
D-Galactose
D-Fructose
Inositol
L-Rhamnose
Glucose
Lactose
Saccharose
Arabinose
Cellobiose
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
ND
ND
ND
L2
+
T
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
ND
ND
L3
+
-
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
L4
+
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
L5
+
-
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
ND
+
ND
+
-
L6
+
-
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
Enterococcus ssp
L7
+
-
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
Enterococcus ssp
L8
+
-
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
ND
+
ND
+
-
L9
+
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
L11
+
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
ND
+
ND
+
-
Lactococcus lactis subsp
lactis var diacetylactis
Lb1
+
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
ND
ND
-
S1
-
+
+
-
+
+
+
-
T
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
Lactobacillus
plantarum
Enterococcus ssp
S2
T
+
+
-
+
+
+
-
T
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
Enterococcus ssp
S3
+
+
+
-
+
+
+
-
T
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
Enterococcus ssp
S4
+
-
-
-
+
+
+
-
-
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
Enterococcus ssp
S5
-
-
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
Enterococcus ssp
S6
+
-
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
ND
+
ND
ND
ND
Enterococcus ssp
Dulcitol
Mannitol
+
Salicine
Raffinose
Souches
L1
Melibiose
Dextrine
Production d’acide à partir de :
Identification
Enterococcus ssp
Enterococcus ssp
Tableau(III) 4b : Profils fermentaires des isolats
61
Résultats
Mannitol
D-Xylose
Maltose
D-Galactose
D-Fructose
Inositol
L-Rhamnose
Glucose
Lactose
Saccharose
Cellobiose
+
-
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S8
-
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S9
-
-
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S10
-
-
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S11
-
-
-
T
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Enterococcus ssp
S12
+
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S13
-
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S14
T
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S15
T
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S16
+
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S17
+
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S18
-
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S19
T
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S20
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S21
-
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S22
+
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S23
T
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
S24
T
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
ND
ND
Enterococcus ssp
Melibiose
Raffinose
S7
Arabinose
Dextrine
Production d’acide à partir :
Souches
Identification
Tableau(III) 4c : Profils fermentaires des isolats
62
Résultats
1.3.2 Profil fermentaire sur galeries API 50 CHL :
Dans le tableau(III) 3, on rapporte les profils de fermentation sur galeries API 50 CHL
(Biomérieux, France) des 6 souches isolées.
Le système API 50 CHL (Biomérieux, France) a été utilisé pour déterminer la production
d’acides à partir des hydrates de carbone.
L’identification par la galerie API 50 CHL est faite en confirmant les profils obtenus avec
les résultats des profils fermentaire de la galerie classique, et en comparant avec les
données de la littérature.
Figure(III) 15 : Résultat du profil fermentaire de la souche: Lactobacillus plantarum Lb1 sur la
galerie API 50 CHL après 48 h d’incubation
63
Résultats
Figure(III) 16 : Résultat du profil fermentaire de la souche: Leuconostoc mesenteroides
subs mesenteroides Ln5 sur la galerie API 50 CHL après 48 h d’incubation
64
Résultats
Souches
Ln5
Ln10
Ln13
Lb1
L2
L3
sucres
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
0
GLY
ERY
DARA
LARA
RIB
DXYL
LXYL
ADO
MDX
GAL
GLU
FRU
MNE
SBE
RHA
DUL
INO
MAN
SOR
MDM
MDG
NAG
AMY
ARB
ESC
SAL
CEL
MAL
LAC
MEL
SAC
TRE
+
+
+/+
+
+
+
+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+
+
+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+/+
+/+
+/+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+/+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+
+
+
+
+
+
+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/-
+/+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+
+/+
+
+
+/+/+
+/+/+
+/+/+
+
+
+
+
+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Tableau(III) 5a : Profils fermentaires des isolats par les galeries API 50 CHL
65
Résultats
Souches
Ln5
Ln10
Ln13
Lb1
L2
L3
sucres
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
INU
MLZ
RAF
AMD
GLYG
XLT
GEN
TUR
LYX
TAG
DFUC
LFUC
DARL
LARL
GNT
2KG
5KG
+
+/+
+
+
-
+
+/+
+/+
+
-
+
+
-
+
+/+
-
+/+
+
+
+/+/-
+/+/+
+
+
+
+
+
+/-
+
+
+
+
-
+
+
+
+/+/+
-
+
+/-
+/+/+
+
+/-
+/-
+/-
Leuconostoc
mesenteroides
subsp
mesenteroides
Leuconostoc
mesenteroides
subsp
mesenteroides
Leuconostoc
mesenteroides
subsp
mesenteroides
Lactobacillus
plantarum
Lc. lactis
subsp lactis
var
diacetylactis
Lc. lactis
subsp lactis
var
diacetylactis
Tableau(III) 5b : Profils fermentaires des isolats par les galeries API 50 CHL
0: Témoin, GLY: Glycérol, ERY: Erythritol, DARA: D-Arabinose, LARA: L-Arabinose, RIB: DRibose, DXYL: D-Xylose, LXYL: L-Xylose, ADO: D-Adonitol, MDX: Méthyl-βD-Xylopyranoside,
GAL: D-Galactose, GLU: D-Glucose, FRU: D-Fructose, MNE: D-Mannose, SBE: L-Sorbose, RHA:
L-Rhamnose, DUL: Dulcitol, INO: Inositol, MAN: D-Mannitol, SOR: D-Sorbitol, MDM: Méthyl-αDMannopyranoside, MDG: Méthyl-αD-Glucopyranoside, NAG: N-AcétylGlucosamine, AMY:
Amygdaline, ARB: Arbutine, ESC: Esculine, SAL: Salicine, CEL: D-Cellobiose, MAL: D-Maltose,
LAC: D-Lactose, MEL: D-Mélibiose, SAC: D-Saccharose, TRE: D-Trehalose, INU: Inuline, MLZ:
D-Mélizitose, RAF: D-Raffinose, AMD: Amidon, GLYG: Glycogène, XLT: Xylitol, GEN:
Gentiobiose, TUR: D-Turanose, LYX: D-Lyxose, TAG: D-Tagatose, DFUC: D-Fucose, LFUC: LFucose, DARL: D-Arabitol, LARL: L-Arabitol, GNT: Gluconate, 2KG: 2-CétoGluconate, 5KG: 5CétoGluconate.
66
Résultats
2.
L’activité antibactérienne des souches :
Les souches isolées du lait cru de vache et du lait de chèvre ont été testées pour leur capacité à
inhiber les bactéries pathogènes Gram négatif tel que Escherichia coli ATCC 25922 et les
Gram positifs Staphylococcus aureus ATCC 25923
A
B
Figure(III) 17 : Aspect macroscopique des bactéries pathogènes après 24h d’incubation
A: Staphylococcus aureus ATCC 25923 sur milieu Chapman
B: Escherichia coli ATCC 25922 sur milieu Héktoine
2.1 Mise en évidence des inhibitions :
2.1.1 Méthode de Fleming et al., (1975) :
Notre choix s’est donc porté sur une technique largement décrite dans la littérature notamment
celle de Fleming et al (1975) qui nous a permis de faire une première sélection des souches
lactiques antibactériennes.
Les résultats de l’interaction obtenue, révèlent la présence d’une zone claire au tour des
souches de bactéries lactiques de nos collection ensemencées en touches.
Les résultats de l’interaction entre les souches lactiques et les bactéries pathogènes :
Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 sont mentionnés dans les
figures suivantes.
67
Résultats
Ln2
Ln3
Ln13
Ln12
Ln13
Ln12
Ln3
Ln2
A
B
Figure(III) 18 : Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par les souches de Ln2,
Ln3, Ln12, Ln13 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) contre E. coli (A) et
Staphylococcus aureus (B)
Ln14
Ln15
Ln16
Ln15
Ln14
Ln17
Ln17
Ln16
A
B
Figure(III) 19 : Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par des souches
de Ln14, Ln15, Ln16, Ln17 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) contre E. coli
(A) et Staphylococcus aureus (B)
68
Résultats
Ln6
Ln1
L2
Ln6
Ln1
Ln10
L2
A
Ln10
B
Figure(III) 20 : Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par des souches de
Ln1, Ln6, Ln10 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) et L2 (Lactococcus lactis
subsp lactis biovar diacetylactis) contre E. coli (A) et Staphylococcus aureus (B)
Spectre d’inhibition :
Le tableau (III) 6 représente les résultats des interactions sur milieu solide (Fleming et al (1975)),
ce tableaux montrent clairement que tous les 53 souches utilisés avait d’activité inhibitrice
contre les bactéries pathogènes (E. coli et Staphylococcus aureus). L’inhibition est notée
positive lorsqu’elle est supérieure à 1 mm (Schillinger et Lucke, 1989).
Les différentes souches de Leuconostoc sélectionnées, présentent un spectre d’activité très
proche vis-à-vis des germes cibles testés. Les longueurs des zones d'inhibition variaient de 8 à
24 mm.
La seule souche de Lactobacillus, présente le même spectre d’inhibition contre E. coli et S.
aureus (10 mm de diamètre).
Les souches de lactocoques, possèdent aussi un spectre d’activité vis-à-vis des germes cibles
testés. Il a été noté que la souche L2 a spectre d’activité plus important parmi les autres
lactocoques. On note aussi que les souches L3 et L8 ne présentent aucune inhibition contre S.
aureus.
69
Résultats
Pour les souches d’entérocoques leur spectre d’inhibition est moins important car le diamètre
des zones d'inhibition variable entre de 2 à 10 mm. Il a été noté que les souches S1 et S3 ne
présentent aucune inhibition contre E. coli
La souche de référence Streptococcus thermophilus CNRZ 447 présente un spectre d’activité
très proche vis-à-vis E. coli (4 mm) et S. aureus (2 mm).
Souches
Indicatrices
Inhibitrices
Ln1
Ln2
Ln3
Ln4
Ln5
Ln6
Ln7
Ln8
Ln9
Ln10
Ln11
Ln12
Ln13
Ln14
Ln15
Ln16
Ln17
Lb1
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
L8
L9
L11
S1
S2
Diamètre de la zone d’inhibition
en mm
Escherichia
Staphylococcus
coli
aureus
14
10
16
10
18
8
14
10
20
12
14
14
16
12
10
12
18
8
18
14
18
10
22
14
20
16
24
12
24
10
16
16
20
16
10
10
8
6
18
10
2
0
2
2
3
2
3
2
2
2
2
0
2
2
2
3
0
2
4
2
Tableau(III) 6a : Spectre d’activité antimicrobienne des souches lactiques par la méthode de
Fleming (1975)
70
Résultats
Souches
Indicatrices
Inhibitrices
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
S13
S14
S15
S16
S17
S18
S19
S20
S21
S22
S23
S24
Streptococcus
thermophilus CNRZ
447
en mm
Escherichia
Staphylococcus
coli
aureus
0
2
4
2
2
10
2
10
2
8
2
10
3
2
2
2
4
2
2
2
3
2
2
2
3
2
3
2
3
2
3
2
2
2
2
3
3
2
3
3
2
3
4
2
4
2
Tableau(III) 6b : Spectre d’activité antimicrobienne des souches lactiques par la méthode de
Fleming (1975)
2.1.2 Méthode de Barefoot et Kaenhammer (1983) :
Dans ce test, aucune zone d’inhibition n’a été observée autour des puits, que ce soit dans le cas
de l’utilisation des cultures de bactéries ou des filtrats de cultures de bactéries (Figure(III) 21), et
ceci malgré de nombreuses répétitions.
71
Résultats
Ln2
Ln1
Ln11
Ln3
Figure(III) 21 : Inhibitions obtenues par la méthode Barefoot et Kaenhammer (1983) par des
souches de Ln1, Ln2, Ln3, Ln11 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis
de Staphylococcus aureus
2.1.3 Inhibition due à l’acide lactique :
Dans ce test, on a sélectionné les souches lactiques qui ont un large spectre d’activité
antibactérienne par rapport des autres souches par la méthode de Fleming (1975).
Sur milieu solide MRS tamponné le nombre et la dimension des diamètres on diminué
(Tableau(III) 7). On remarque que les bactéries pathogènes cibles testés Escherichia coli et
Staphylococcus aureus ont été inhibés par toutes les souches lactiques utilisées.
Les différentes souches de Leuconostoc (Ln) sélectionnées, présentent un spectre d’activité très
proche vis-à-vis des germes cibles testés. Les longueurs des zones d'inhibition variable entre de
4 à 16 mm, ces zones d'inhibition sont petits comparativement aux zones d’inhibition qui ont
trouvées précédemment.
Il a été noté que seule la souche Lactococcus (L2), leur spectre d’inhibition est augmenté
contre E. coli (18 mm observé par la méthode de Fleming sur milieu non tamponnée et 20 mm
observé par la méthode de Fleming sur milieu tamponnée). Mais le spectre d’activité vis-à-vis
de Staphylococcus aureus reste stable (10 mm).
72
Résultats
Souches
Indicatrices
Inhibitrices
Ln1
Ln2
Ln3
Ln5
Ln6
Ln9
Ln10
Ln11
Ln12
Ln13
Ln14
Ln15
Ln16
Ln17
L2
en mm
Escherichia coli Staphylococcus aureus
14
16
14
6
14
4
12
12
14
8
10
16
12
10
20
6
12
6
4
6
8
6
12
12
12
14
16
16
10
10
Tableau(III) 7 : Spectre d’activité antimicrobienne des souches lactiques par la méthode de
Fleming (1975) sur milieu MRS tamponnée à pH 6,1
Ln14
Ln13
Ln13
Ln16
Ln15
Ln14
Ln15
A
Ln16
B
Figure(III) 22 : Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS
tamponnée à pH 6,1 par des souches de Ln13, Ln14, Ln15, Ln16 (Leuconostoc mesenteroides
subs mesenteroides) vis-à-vis de Staphylococcus aureus (A) et E. coli (B)
73
Résultats
Ln10
L2
Ln11
Figure(III) 23 : Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS
tamponnée à pH 6,1 par des souches L2 (Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis)
et Ln10, Ln11 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis de Staphylococcus
aureus.
2.2
Etude de l’évolution de la croissance en culture mixte :
2.2.1 Dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et mixte :
Le suivit de la croissance Staphylococcus aureus exprimé en UFC/ml en culture pure et mixte a
été étudié sur le milieu lait.
Les résultats obtenus de dénombrement Staphylococcus aureus en culture pure et mixte avec
les souches lactiques Ln10 et Ln14 (Leuconostoc) sont montés dans les figures(III) 24 et 25
respectivement.
Dans les huit premières heures d’incubation à 37°C en aérobiose on observe une croissance
des deux souches de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln10 et Ln14 et S.
aureus en culture pure et mixte.
On a remarqué une diminution du nombre de S. aureus en culture mixte atteint 0 UFC/ml
après 24h d'incubation, par contre la culture pure de S. aureus, on a noté une croissance
progressive.
74
Log UFC/ml
Résultats
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
4
8
18
24
Temps (h)
Figure(III) 24: La croissance de Staphylococcus aureus dans le lait à 37°C en présence de la
Log UFC/ml
La souche Ln10 ;
Staphylococcus aureus ;
Staphylococcus aureus avec Ln10.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
4
8
18
24
Temps (h)
Figure(III) 25 : La croissance de Staphylococcus aureus dans le lait à 37°C en présence de la
La souche Ln14 ;
Staphylococcus aureus ;
75
Staphylococcus aureus avec Ln14.
Résultats
2.2.2 Dénombrement d’Escherichia coli en culture pure et mixte :
Le suivit de la croissance d’Escherichia coli exprimé en UFC/ml en culture pure et mixte a été
étudié sur le milieu lait.
La figure(III) 26 montre une courbe de la croissance d’Escherichia coli en culture pure et mixte
avec la souche lactique Ln14 (Leuconostoc).
On note une croissance après huit heures d’incubation à 37°C pour la souche de Leuconostoc
mesenteroides subsp mesenteroides Ln14, E. coli en culture pure et culture mixte.
Après 24h d'incubation, on observe une décroissance d’E. coli en culture mixte atteint 0
Log UFC/ml
UFC/ml, en revanche la culture pure d’E. coli, suivre une croissance progressive.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
4
8
18
24
Temps (h)
Figure(III) 26 : La croissance d’Escherichia coli dans le lait à 37°C en présence de la souche
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14
La souche Ln14 ;
Escherichia coli ;
76
Escherichia coli avec Ln14.
IV. DISCUSSION
Discussion
1.
Isolement et identification des souches :
Cinquante trois souches de bactéries lactiques ont été isolées du lait cru de vache et du lait de
chèvre. Elles ont été cultivées et isolées sur milieu MRS, M17, Elliker et MSE. Du fait des
exigences nutritionnelles des bactéries lactiques, les milieux de culture doivent être très riches
en sucres, en matières azotées et surtout en facteurs de croissances (Pilet M-F. et al., 2005).
La présence de divers genres de bactéries lactiques dans le lait de la chèvre et de la vache était
prévisible car des bactéries lactiques ont été trouvées dans la microflore de tous les laits
étudiés.
L’étude des principaux caractères morphologiques, biochimiques et physiologiques ont
montré une diversité de genres et d’espèces isolées à partir du lait cru de chèvre et de vache.
Les espèces de bactéries lactiques détectées dépendent essentiellement de la nature du lait cru et
des conditions d’analyse (Saidi et al., 2002)
Les résultats d’identification de cette étude montrent une présence majoritaire de coques avec
97% par rapport les bâtonnets est ont été retrouvées à des faibles pourcentages 3%. Le même
type de résultat est apporté par Franciosi et al., (2009); Cheriguene A. (2008) ; Bekhouche F.
Boulahrouf A. (2005) et Kacem M. et al., (2002)
Les espèces lactiques des laits crus de vache et de chèvre sont très variées. Les entérocoques
occupent un pourcentage important (53%), cette résultat est aussi obtenus par Boubekri K. et
al., (1995). Abdi R. et al., (2006) ont démontré que 42% des souches isolées à partir de
"Lighvan" un fromage Iranien fabriqué à partir du lait de brebis sont des entérocoques. Les
Enterococus sont utilisées pour améliorer la qualité gustative du cheddar et d’autres fromages.
Puis, viennent les Leuconostoc mesenteroides (32%), et Lactococcus lactis (12%). La même
constatation a été mentionnée par Ayad et al. (2006) ayant isolé un nombre réduit de
Lactococcus (8%) à partir du fromage artisanal Egyptien. Dans d’autres travaux, il a été isolé
Leuconostoc mesenteroides à partir d’échantillons de lait cru de vache (Bekhouche et
Boulahrouf, 2005), du lait camelin (Khedid et al., 2009) et différent partie du chèvre
Africaine (Olaoye et Onilude, 2009).
Dans le genre Lactobacillus, n’est représentée que par une seule souche identifiée : l’espèce
Lactobacillus plantarum, La faible proportion de ces espèces parmi nos isolats ceci est
probablement dû au fait que les milieux utilisés insuffisamment sélectifs. Des études menées
sur 17 souches représentatives de bactéries lactiques de Jeotgal aliment fermenté Coréen ont
77
Discussion
montré que Lactobacillus ssp n’est qu’un groupe mineur représenté par seulement 3 souches
de la population totale (Gyu et Hyung, 2006).
Aucun Streptococcus thermophilus n'a été isolé des laits examinés, ceci est probablement dû
au fait que la méthode d’identification basée sur les caractéristiques morphologiques et
physiologiques sur un grand nombre d’échantillons (Cheriguene A., 2008).
L’identification phénotypique des souches conventionnelles basées sur les tests
morphologiques, physiologiques et biochimiques.
La flore dominante est représentée par les entérocoques (53%), macroscopiquement ces
bactéries forment sur milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) solide des colonies bombées,
circulaire, surface lisse et de couleur blanche environ 0,5 à 1 mm de diamètre. L'aspect
microscopique des souches après coloration de Gram a révélée des coques associées en deux
ou courte chaine (Franz C.M.A.P. et Holzapfel W. H., 2004).
Les entérocoques poussent dans les conditions hostiles, en présence de 6.5% NaCl, à pH 9,6,
croissance à 45°C et survivent généralement 30 min à 60°C (Stiles M.E. et Holzapfel W.H.,
1996 ; Larpent G.M. et al., 1997)
L’identification des espèces d’Enterococcus repose sur le profil fermentaire, mais dans notre
étude les sucres utilisés ne nous permettent pas une identification précise de l’espèce. D’après
Franz C.M.A.P. et al., 2004 l’utilisation de l’identification phénotypique traditionnelle pour
caractériser les espèces devient extrêmement difficile, si pas impossible.
Les souches de Leuconostoc développées sur milieu MSE (Mayeux et al., 1962) forment des
colonies brillantes transparentes, gluantes (1 à 5 mm) ne devenant muqueuses qu’après séjour
à la température du laboratoire à cause de la production de dextrane (Larpent G.M. et al.,
1997), sur milieu MRS solide révélées des petites colonies ponctiforme de couleur blanchâtre
à pourtour régulier de 1 mm de diamètre. L’observation après coloration de Gram, indique
qu’il s’agit des coques ovoïdes Gram positif en paires ou en chainettes (Novel G., 1993),
selon Garvie (1986) les corps cellulaires des Leuconostocs peuvent être sphériques, mais
souvent lenticulaires, surtout lorsqu'ils sont cultivés sur milieu gélosé.
Les Leuconostocs fermentent le glucose avec production de gaz (CO2), donc sont
hétérofermentaires, ces souches produisent aussi du CO2 à partir du citrate, ne produisent pas
l’acétoїne, n'hydrolysant pas l'arginine, développant à 37°C, présence une croissance à 6,5%
NaCl, la plupart des souches hydrolyse l’esculine (Larpent G.M. et al., 1997 ; Novel G.,
1993 ; Larpent J-P., 1996 ; Ogier J.-C. et al., 2008 ; Bjökroth J. et Holzapfel W., 2006 ; Badis
78
Discussion
A. et al., 2004). Ces espèces sont mésophiles et caractérisées par la production, à partir du
citrate du lait, de diacétyle (Novel G., 1993). La production du CO2 par Leuconostoc
provient de l’hétérofermentation du lactose et de l’utilisation du citrate (Bourel G. et al.,
2001) .
À partir de ces tests on trouve que toutes les souches de ce genre appartiennent à l’espèce :
Leuconostoc mesenteroides.
Toutes les souches sont résistantes à la vancomycine (200 µg/ml) cette résultat est obtenu par
plusieurs auteurs (Swenson J. M. et al., 1990 ; Orberg et Sandine, 1984 ; Benkerroum N. al.,
1993).
Certaines souches ne produisent pas du CO2 à partir du citrate (souches atypiques)
Le test de la dégradation des carbohydrates soit par les galeries classiques soit par les galeries
API 50 CHL est indispensable pour identifier l’espèce et même la sous-espèce. Les souches,
au vu de leurs profils de fermentation sont différentes.
Pour le genre Leuconostoc sont identifiées Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides
par la dégradation de l’arabinose, arbutine, cellobiose, mannitol, salicine (Larpent J-P., 1996 ;
Devoyod J.J. et al., 1988 ; Bjökroth J. et Holzapfel W., 2006 ; Milliere J.B., et al., 1989)
Leuconostoc mesenteroides subsp dixtranicum se distingue aisément de Leuconostoc
mesenteroides subsp mesenteroides parce qu'il ne fermente ni l’arabinose, arbutine,
cellobiose, mannitol, salicine et mesenteroides subsp cremoris parce qu'il ne produise pas le
dextrane. (Holzapfel W., 2006 ; Milliere J.B., et al., 1989).
Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris n’a pas été rencontré dans cette étude.
Il est difficile d’identifier une espèce ou sous-espèce par les méthodes classiques.
Parmi le genre Lactococcus, nous avons montré par les méthodes physiologiques et
biochimiques que les six souches étaient identifiées Lactococcus lactis subsp lactis var
diacetylactis
Aspects macroscopiques a montré que les Lactocoques développent sur le milieu M17 de
petites colonies à contour régulier de couleur blanchâtres, lisses et légèrement bombées.
Microscopiquement sont des Gram positif, de forme cocci sphérique, associé en paire,
groupées en chaînettes plus aux moins longues (Teuber M. et Geis A., 2006).
Par ailleurs, nous distinguons par nos isolats, des souches typiques et d’autres sont atypiques
car certains de leurs caractères ne correspondent pas au données rapportées par Teuber M. et
Geis A., 2006 ; Stiles M.E. et Holzapfel W.H., 1997. Selon ces auteurs, les Lactocoques sont
des bactéries homofermentaires, ne poussent pas à 45°C, et ne poussent en présence de 6,5%
79
Discussion
NaCl. Cependant au cours de cette étude, nous avons isolé des souches atypiques qui poussent
à 45°C même résultat a été obtenu par Franciosi et al., (2009) et en présence de 6,5% NaCl.
Des résultats similaires sont été rapportés par Kacem M. et al., 2002 ; Zadi Karam H. et al.,
2006.
Ces souches atypiques résistent aussi à 63°C pendant 30 min (Bensalah, 2006). lactocoques
atypiques présentent un double intérêt, vu leur croissance en milieu à haut salinité et leur taux
de survie dans des conditions hostiles à haute température (Bensalah, 2006).
Les souches L3, L5 et L8 présentent un développement positif à 4%, croissance variable à
6,5%, mais L3 produise de CO2 à partir du citrate et acétoїne négatif, par contre la souche L5
ne produise pas du CO2 à partir du citrate et elle est acétoїne positif, et la souche L8 ces deux
tests sont positifs. Toutes les souches d’une même espèce ne réagissent pas de manière
identique pour un même test.
Les souches L11, L1 et L2 ne poussent pas à 4% et à 6,5%, mais L11 produise de CO2 à partir
du citrate et acétoїne négatif, par contre les deux souches L1 et L2 sont acétoїne positif et ne
produisent pas le de CO2 à partir du citrate. La comparaison des profils fermentaires des
sucres montre que des souches appartenant à la même espèce peuvent présenter des profils
fermentaires différents (Kacem M. et al., 2002)
Toutes ces souches étaient identifiées Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis
Il est à signaler que la plupart des espèces lactiques identifiées dans cette étude sont atypiques
par rapport aux souches de références utilisées. Cette atypicité des souches est confirmée par
les propriétés métaboliques mises en évidence.
Aucune souche de lactococcus ne présentait de profils de fermentation des sucres similaires à
celui de l’espèce de référence.
Dans cette étude nous avons isolé une souche de Lactobacillus. Dans les produits carnés,
Hugas et al., (1993) ont trouvé que Lactobacillus plantarum représente 8 % des lactobacilles
isolées.
D’après l’observation macroscopique faite sur la souche de Lactobacillus (Lb1) développée
sur milieu MRS (Man et al., 1960), on remarqué que les colonies sont colonie irrégulière,
érodée, de couleur crème et de 1 à 3 mm de diamètre, et l’observation sous microscope après
coloration de Gram, indique qu’il s’agit de bacilles apparents Gram positif (Klein et al., 1998;
Axelsson, 2004; Hammes et Hertel, 2006; Tabasco et al., 2007).
La souche de Lactobacillus fermente le glucose sans production de gaz (CO2), donc cette
souche est homofermentaire (Hammes et Hertel, 2006).
80
Discussion
Le test de la dégradation des carbohydrates soit par les galeries classiques soit par les galeries
API 50 CHL a été étudié, cette souche fermente la majorité des sucres, elle ne fermente pas le
xylose, l’inositol et dégrade légèrement le rhamnose. Elle est identifiée Lactobacillus
plantarum (Larpent, 1996a).
2. L’activité antibactérienne des souches :
La deuxième étape a permis de recenser des souches possédant l’activité antibactérienne
intéressantes.
Les bactéries lactiques métabolisent le lactose en acide lactique, abaissant ainsi le pH et créant
un environnement défavorable au développement des bactéries pathogènes et des
microorganismes d’altération.
L'inhibition des micro-organismes pathogènes et la flore de contamination des aliments sont
un souci important en ce qui concerne la transformation des produits alimentaires. Les microorganismes pathogènes d'importance particulière en produits laitiers, incluent Listeria
monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus aureus.
Un total de 53 souches bactériennes avec des effets antagoniques sur Escherichia coli et
Staphylococcus aureus a été détecté. Cette interaction positive indique l’inhibition de la
croissance des deux bactéries pathogènes testés (E. coli et S. aureus) et montre une activité
antagonisme, qui est traduite par l’apparition des zones d’inhibition (Fleming et al., 1975;
Barefoot et Kaenhammer, 1983; Tabak et al., 2007).
Les souches ayant le une activité inhibitrice le plus important que nous avons rencontré sont
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides, Lactococcus lactis subsp lactis var
diacetylactis et Lactobacillus plantarum et ne présentent pas le même spectre d’action vis-àvis des bactéries pathogènes. Vaughan et al., (1994) démontrent les capacité des bactéries
lactiques isolées du lait cru de chèvre à inhiber aussi la croissance de Staphylococcus aureus.
Des bactéries lactiques démontrant une activité antibactérienne ont pourtant été isolées de
plusieurs produits tels que les viandes, poulet, produits laitiers, et divers aliments (Erdoúrul et
Erbülür, 2006; Lima et al., 2007; Castro et al., 2010 ).
La majorité des souches de Leuconostocs (Ln) présentent un potentiel à inhiber la croissance
des bactéries ciblées. Au sein de ces bactéries, plusieurs possèdent un potentiel élevé et
surtout les deux souches Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14 et Ln15 qui
présentent un spectre d’activité le plus large (24 mm) vis-à-vis Escherichia coli. S. aureus est
81
Discussion
inhibée par Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln13, Ln16 et Ln17 avec un
diamètre de 16 mm. Des résultats ont été démontrés par Gyu et Hyung (2006) ayant trouvé
que parmi les souches isolées à partir Jeotgal aliment fermenté Coréen les souches
Leuconostoc mesenteroides présentent des inhibitions contre S. aureus avec un diamètre de
22 mm.
Gonzalez et al. (2007) ont démontré que les souches de Leuconostoc qui ont été isolées à
partir de « Genestoso » un fromage fabriqué à partir du mélange des laits chèvre, vache et de
brebis en Espagne avaient une activité inhibitrice contre: S. aureus, L. monocytogenes, Cl.
tyrobutyricum et E. faecalis. Une étude a été réalisée par Fujitoshi et al. (2006) montre que
des souches de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides qui ont été isolées a partir du
sol, possèdent des inhibition contre Lactobacillus sakei JCM 1157T.
Nos travaux ont démontré que les souches Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis
présente un potentiel à inhiber la croissance des bactéries ciblées. Les deux souches
Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis L1 et L2 possèdent un spectre d’activité large
parmi les autres lactocoques avec un diamètre d’inhibition de 8 mm et 18 mm contre E. coli,
et 6 mm 10 mm contre S. aureus respectivement. González et al., (2007) ont isolé et identifié
125 souches de Lactococcus dont 13 souches étaient capable d’inhiber la croissance de
Staphylococcus aureus. Millette et al., (2007) ont pu isolé de l’intestin de l’Homme un
Lactococcus lactis subsp. lactis MM19 capable d’inhiber la croissance de Staphylococcus
aureus.
L’activité antibactérienne de Lactococcus lactis subsp lactis, isolé de les produits végétaux a
été récemment rapporté par Ponce et al. (2008). Pour les souches de références pathogènes
testés E. coli et S. aureus ses croissances sont inhibées par les souches de lactocoques, mais
essentiellement par. Pulusani et al. (1979) ont montré que S. thermophilus produit une
substance inhibitrice qui agit contre les bactéries pathogènes.
Des résultats similaires ont été observés par Diop et al. (2007); Metlef et Dilmi-Bouras (2009)
La croissance de Staphylococcus aureus et la croissance d’Escherichia coli est inhibé par
Lactobacillus plantarum (Lb1) avec un spectre d’activité important avec un diamètre de 10
mm et plusieurs auteurs ont déjà montré que L. acidophilus produisait une substance
inhibitrice agissant aussi contre les bactéries pathogènes (Shahani et al., 1977).
Lima et al. (2007) ont constaté que Les souches identifiées comme étant Lactobacillus
reuteri, L. salivarius, ou Lactobacillus spp. ont inhibé Enterococcus faecalis, E. faecium,
Listeria monocytogenes, et Salmonella spp. Allouche et al. (2010) que toutes les souches de
82
Discussion
Lactobacillus isolées du lait cru et d'un ferment lactique commercial produisent et excrètent
dans le milieu de culture des substances inhibitrices capables d'inhiber la croissance de
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa.
Des résultats similaires ont été observés par Frey et Hubert (1993); Erlend et al. (1998); De
Martinis et al. (2001); Labioui et al. (2005); Ayad et al. (2006); Erdoúrul et Erbülür (2006);
Bey (2009); Medouakh et al. (2010).
Les entérocoques qui ont été isolés à partir du lait de chèvre et du lait de vache possèdent une
activité antimicrobienne mais avec des valeurs étaient moins importantes, ses pouvoirs
inhibiteur est beaucoup moins grand que celui des autres bactéries. Karam et al., 2008 montre
des inhibition par la souche Enterococcus faecalis.
D’autre part Hwanhlem et al. (2011) ont également observé une activité inhibitrice des
souches Enterococcus faecalis vis-à-vis Escherichia coli, S. aureus et Salmonella sp.
Izquierdo et al., 2009; Molinos et al., 2009 ont proposés, que l’entérocine produite par
Enterococcus faecalis présente un intérêt potentiel car elle inhibe : Salmonella enterica, L.
monocytogenes, S. aureus, et B. cereus.
Des résultats semblables ont été obtenus par Hittu et Ravinder, (2007), qui ont examiné des
souches d’entérocoques isolés de 68 produits laitiers et 28 échantillons fécaux humains et ont
constaté que la production de bactériocine était maximale dans les échantillons laitiers, et
que les isolats avaient un effet anti-listeria.
Les résultats de l’interaction concernant l’inhibition dans le milieu tamponné ont montré que
la dimension des diamètres on diminué pour certains souches et d’autres souches comme
Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis L2 leur spectre d’inhibition est augmenté 20
mm vis-à-vis E. coli. En fait bien que la culture initiale ait produit une zone d'inhibition de 18
mm de diamètre. Donc l’acide lactique a un effet antagonique sur les bactéries pathogènes.
Ces résultats concordent avec ceux rapportés par Desmazeaud (1983) durant l'étude de l’effet
des acides organiques produits par les lactocoques dans l'inhibition des autres microorganismes. Spilman et al (1978) ont remarqué que certaines zones d'inhibition sont dues à
l'acidité.
Ces résultats nous ont permis de constater la présence des bactériocines, des acides
organiques ou de peroxyde d’hydrogène par les souches. Comme la présence d’anneau
d’inhibition ne signifie pas forcement production de bactériocine, (Klaenhammer, 1993)
83
Discussion
Les bactéries lactiques sont généralement connu par la production des acides organique dans
le milieu ce qui se manifeste par l'apparition de zone claire, on peut aussi reconnaître que ces
bactéries produisent des substances antimicrobiennes par le peroxyde d'hydrogène (Barefoot
et Klaenhammer, 1984).
Beaucoup d'études faites dans des conditions de cultures plus ou moins contrôlées mettent en
évidence des inhibitions de croissance sans toutefois pouvoir donner de façon définitive les
raisons de l'interaction. Suivant les recherches, sont incriminées: des bactériocines, des
produits du métabolisme tels que des acides organiques, le pH ou le peroxyde d'hydrogène.
Aucune des souches sélectionnées (cultures de bactéries ou filtrat) n’avait d’activité
antibactérienne contre la flore pathogène (S. aureus, E. coli) lorsqu’on utilise la méthode des
puits. Dans le cas de cultures de bactéries, l’absence de halo d’inhibition nous incite à penser
que la croissance bactérienne est trop faible pour permettre de visualiser une inhibition
(Dalache, 2006).
Dans le cas d’utilisation les filtrats de culture, l’absence d’activité antibactérienne observée
peut s’expliquer par une trop faible concentration en agent inhibiteur dans les filtrats. Des
résultats similaires ont été trouvés par Ammor et al. (2006).
L’activité inhibitrice a été détectée dans le milieu solide par la méthode de Fleming (double
couches) a partir de cette observation, on peut dire que la production de l’agent inhibiteur est
activée lorsque les souches productrices est cibles entrent en contact. L’utilisation de filtrats
concentrés est donc nécessaire pour la suite de l’étude.
Nous avons réalisé sur milieu lait des cultures mixtes bactéries lactiques-Staphylococcus
aureus et bactéries lactiques-Escherichia coli.
Les souches Ln10 et Ln14 du genre Leuconostoc, ont été retenue pour sa forte activité
inhibitrice, notamment vis-à-vis de S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922.
La souche test de Staphylococcus aureus est cultivée seule ou en présence de Leuconostoc
mesenteroides subsp mesenteroides Ln10 ou de Leuconostoc mesenteroides subsp
mesenteroides Ln14. Le nombre de cellules viables par millilitre diminuées après 18 heures
d'incubation. En revanche, aucune croissance n’a été décelée après 48 h d’incubation.
La deuxième souche test d’Escherichia coli est cultivée seule ou en présence de Leuconostoc
mesenteroides subsp mesenteroides Ln14. Une diminution du nombre de cellules et après 48 h
84
Discussion
d’incubation aucune croissance n’a été décelée. Ces résultats indiquent un mode bactéricide
de l'action du composé antibactérien. Des résultats similaires ont été observés par Ammor
(2006) ; Gessas (2006)
L'inhibition de Staphylococcus aureus par la souche Ln10 et Ln14 est dû à la production de
substances antibactérienne cependant l’acidité produite joue un rôle combiné dans cette
inhibition. Des résultats semblables ont été rapportés par Noonpakdee et al., (2003).
D’une manière générale, l’activité antimicrobienne des deux souches sélectionnées est
détectée au début de la phase exponentielle et n’atteint son niveau maximal de sécrétion
qu’après acidification quasiment complète du milieu de culture (Allouche et al., 2010).
85
Conclusion et perspectives
Les bactéries lactiques ont un intérêt primordial en alimentation il y a au moins quatre
milles ans que l'homme sert de ces bactéries pour la fermentation des aliments, et sont
connues pour leur aptitude à produire des composés antibactériens leur permettant de
se développer préférentiellement dans divers écosystèmes mais aussi d’être utilisées
en tant que bio-conservateurs.
A travers cette étude a été d’isoler et identifier des bactéries lactiques à partir des laits
crus de vache et de chèvre. Leur culture sur milieu spécifique permet à l’étude
bactériologique proprement dite de s’orienter vers ces bactéries, leurs caractères
physiologique et biochimique permettent de les différencier des autres groupes
bactériens.
La détermination de leur capacité à produire des substances inhibitrices contre leurs
souches cibles (Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Escherichia coli ATCC
25922) a été démontrée par contact direct cellule-cellule entre la souche productrice et
la souche indicatrice. Le test de l’antagonisme a montré l’effet inhibiteur de nos
souches vis-à-vis des souches cibles. Nous avons montré que la plus part des souches
lactiques étaient productrices d’agent inhibiteur soit H2O2 soit bactériocines à
l’encontre de Staphylococcus aureus et Escherichia coli.
Les résultats obtenus ont montré que les souches de Leuconostoc mesenteroides subsp
mesenteroides présentaient des effets antibactériens plus prononcés que les autres
souches.
La cinétique de croissance de Staphylococcus aureus et Escherichia coli a été évaluée
en culture pure et en culture mixte dans le milieu naturel le lait en présence des
souches productrices de substances antimicrobiennes.
Ce travail nous a permet de détecter plusieurs souches de bactéries lactiques capable
d’inhiber Staphylococcus aureus et Escherichia coli en milieu lait.
Ces observations ouvrent des perspectives futures :

Application du génie génétique pour l’identification des souches isolées.
86

Il serait intéressant de faire une caractérisation plus poussée et une purification
des substances inhibitrices produites par les souches de Leuconostoc
mesenteroides Ln.

Des études plus approfondies doivent être menées pour purifier, caractériser
l’agent inhibiteur.

L’enjeu à long terme, surtout pour l’agro-industrie et de trouver un moyen
naturel de diminuer l’utilisation des conservateurs.

Cependant toute méthode in vitro doit être complètement validée in vivo avec
des expériences sur des animaux afin de s'assurer de son applicabilité et de
déterminer ses limites.
87
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102
ANNEXE
Milieux de cultures :
Milieu MRS (Man, Rogosa et Sharpe, 1960)
Peptone
10 g
Extrait de viande
8g
Extrait de levure
5g
Acétate de sodium
5g
Phosphate bipotassique
2g
Citrate d'ammonium
2g
Sulfate de magnésium
0.1 g
Sulfate de manganèse
0,05g
Glucose
20 g
Tween 80
1ml
Agar
15g
Eau distillée
1000ml
Pour les lactobacilles ajuster le pH à 5,4 avec l’acide acétique. Autoclaver 20min
à 120°C
Milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975)
Peptone papainique de soja
5g
Peptone trypsique de caséine
2,5 g
Peptone pepsique de viande
2,5 g
Extrait de levure
2.5 g
Extrait de viande
5g
Glycérophosphate de sodium
19 g
Sulfate de magnésium
0.25 g
Acide ascorbique
0.5 g
Agar
15g
Eau distillée
950ml
pH 7,1 ± 0.2
50 ml de lactose à 10 % sont ajouté après autoclavage 20min à 120°C
Milieu d’Elliker (Elliker, 1956)
Bactotryptone
20g
Extrait de levure
5g
Gélatine
2.5g
Lactose
5g
Saccharose
5g
Glucose
5g
Acétate de sodium
1.5g
Chlorure de sodium
4g
Acide ascorbique
0.5g
Gélose
20g
Eau distillée
1000 ml
pH 6,5
Autoclavage 20min à 120°C
Milieu Mayeux, Sandine et Elliker – MSE
Tryptone
10 g
Gélatine
2.5 g
Extrait de levure
5g
Saccharose
100 g
Glucose
5g
Citrate de sodium
1g
Azide de sodium
0.075 g
Agar bactériologique
15 g
Eau distillée
1000 ml
pH du milieu prêt à l'emploi : 6.9 ± 0.2
Bouillon hypersalé : (Leveau et al., 1991).
Glucose
5g
Extrait de viande
5g
Peptone
15g
NaCl
65g
Eau distillée
1000ml
pH 7,5
Stérilisation 20 min à 120°C , on peut évidemment faire varie la concentration en
NaCl de 4%
Milieu de Moëller (Moëller, 1955) :
Peptone
5g
Extrait de viande
5g
Glucose
0,5g
Pridaxal
5mg
Pourpe de bromocrésol
0,1g
Rouge de crésol
5mg
Eau distillée
1000ml
Ajuster le pH à 6,4
Le milieu à l’arginine est obtenu en ajoutant 10g d’arginine. Stériliser 15 min à
120°C.
Milieu gélose esculine :
peptone
10g
Esculine
1g
Citrate de fer ammoniacal 1g
gélose
20g
Eau distillée
1000ml
pH 7, Stérilisation 20 min à 120°C
Milieu Clark et Lubs
Peptone
7g
Phosphate dipotassique
5g
Glucose
5g
Eau distillée
1000ml
pH 7, autoclaver 20 min à 120°C
Milieu Kempler et Mc Kay (1980)
Peptone
10g
Extrait de levure
3g
Glucose
5g
Agar
15 g
Eau distillée
1000 ml
pH du milieu prêt à l'emploi : 6,6
Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 15min à 121°C
Au moment de l’emploi on ajoute :
1 ml d’une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v)
1 ml d’une solution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p)
Ces solutions sont stérilisées par filtration sur filtre millipore et sont conservées à
l’obscurité à 4°C
Milieu de dilution (peptone-sel) :
NaCl
8,5g
Peptone
1g
Eau distillée
1000 ml
Autoclavage durant 15 min à 121°C.
Gélose nutritif (GN) :
Peptone
5g
Extrait de viande
1g
Extrait de levure
2g
NaCl
5g
Agar
15g
Eau distillée
1000 ml
pH 7
Autoclavage durant 15 min à 121°C.
Milieu lait écrémé :
Lait écrémé
10g
Eau distillée
100 ml
La stérilisation à 110°C pd 10 min
MRS tamponnée à pH 6,1 :
Milieu MRS (Man, Rogosa et Sharpe, 1960)
+
Tampon phosphate :
Phosphate monopotassique
54 g/l
Phosphate disodique
17,8 g/l
Autoclaver 20min à 120°C
Temps (h)
Souches (Log UFC/ml)
subsp mesenteroides Ln10
Staphylococcus aureus
avec Ln10
0
4
8
18
24
6,69
8,05
8,25
8,3
8,6
4,27
5
5,5
8
9
4,44
6
6,5
2
0
Tableau(III) 8 : Résultats de dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et
Temps (h)
avec Ln14
0
4
8
18
24
7,47
7,83
7,95
8
8,5
4,27
5
5,5
8
9
6,6
7,17
7,32
2
0
Tableau(III) 9 : Résultats de dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et
Temps (h)
0
4
8
18
24
Escherichia coli
7
7,17
7,69
8
8,59
7
7,23
8,64
8,95
9
Escherichia coli avec Ln14
7,16
7,92
8,57
1,14
0
Tableau(III) 10 : Résultats de dénombrement d’Escherichia coli en culture pure et mixte avec
Leuconostoc mesenteroides Ln14.
La galerie API 50CHL :

Isolement et sélection des souches de bactéries lactiques

Transcription

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