Rapport de synthèse BIO 12-15-09-05 (fr) - NF VALIDATION

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ACCREDITATION
N°1-0144
PORTEE DISPONIBLE
SUR WWW.COFRAC.FR
bioMérieux
Chemin de l’Orme
69280 MARCY L’ETOILE
NF VALIDATION
Validation des méthodes alternatives d’analyse
Application à la microbiologie alimentaire
Rapport de synthèse
Validation EN ISO 16140 de la méthode
TEMPO® TVC pour le dénombrement de la
flore aérobie mésophile
Ce rapport comprend 35 pages.
La reproduction de ce rapport n’est autorisée que sous sa forme intégrale.
L’accréditation du COFRAC atteste de la compétence du laboratoire pour les seuls essais
couverts par l’accréditation qui sont identifiés par le symbole .
Version 0
16 juillet 2013
ADRIA DEVELOPPEMENT
Creac’h Gwen - F. 29196 QUIMPER Cedex - Tél. (33) 02.98.10.18.18 - Fax (33) 02.98.10.18.08
E-mail : [email protected] - Site web : http://www.adria.tm.fr
ASSOCIATION LOI DE 1901 - N° SIRET 306 964 271 00036 - N° EXISTENCE 532900006329 - N°TVA
FR4530696427100036
bioMérieux
Sommaire
1
RAPPEL SUR LA METHODE ALTERNATIVE _________________________ 4
1.1 Date de la première validation, dates de reconduction et d’extension4
1.2 Protocole et principe de la méthode alternative __________________4
1.3 Méthode de référence à laquelle la méthode alternative a été
comparée _________________________________________________5
1.4 Principaux résultats obtenus lors de la validation initiale (2005), des
études d’extension (2009 et 2011) et de reconduction (2013) _______6
1.4.1 Etude comparative des méthodes (Validation initiale – 2005) ____ 6
1.4.1.1
Etude de linéarité _____________________________________________ 6
1.4.1.2
Exactitude relative ____________________________________________ 12
1.4.1.2
Limite de détection (LOD) et limite de quantification (LOQ) _____________ 20
1.4.1.3
Sensibilité relative ____________________________________________ 21
1.4.1.4
Praticabilité _________________________________________________ 22
1.4.2 Etude d’extension (2009) _________________________________ 24
1.4.3 Etude d’extension dans des laits crus (2011) ________________ 26
1.4.3.1
Nombre et nature des échantillons _______________________________ 26
1.4.3.2
Résultats bruts ______________________________________________ 26
1.4.3.3
Interprétation ________________________________________________ 27
1.4.3.4
Conclusion _________________________________________________ 29
1.4.4 Etude interlaboratoire ___________________________________ 29
1.4.4.1
Préparation _________________________________________________ 29
1.4.4.2
Analyses ___________________________________________________ 29
1.4.4.3
Résultats obtenus par les laboratoires collaborateurs _________________ 29
1.4.4.4
Calculs et interprétation statistique (Etude de reconduction – 2013) ______ 31
1.4.4.5
Conclusion _________________________________________________ 34
2
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE _____________________________________35
3
AUTRES VALIDATIONS OBTENUES_______________________________ 35
ADRIA Développement
(Synthèse – Version 0)
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16 juillet 2013
bioMérieux
Avant-propos
L’ensemble des renseignements permettant de valider la garantie des analyses
est tenu à la disposition de la Société bioMérieux.
Les résultats sont synthétisés au sein de tableaux et interprétés selon la norme
NF EN ISO 16140.

Fabricant :
bioMérieux
Chemin de l’Orme
69280 MARCY L’ETOILE

Laboratoire expert :
ZA Creac’h Gwen
29196 QUIMPER Cedex

Méthode à valider :
Reconduction de la validation de la méthode
TEMPO® TVC pour le dénombrement de la
flore aérobie mésophile

Référentiel de validation :
Norme EN ISO 16140 (octobre 2003) :
microbiologie des aliments - Protocole pour la
validation des méthodes alternatives

Méthode de référence :
Norme EN ISO 4833 : Directives générales pour
le dénombrement des micro-organismes méthode par comptage des colonies obtenues à
30°C

Etendue de la validation :
Tous produits d’alimentation humaine et
aliments pour animaux de compagnie à
l’exclusion des boissons et de l’alimentation
du bétail


Organisme de validation :
AFNOR Certification
Essais effectués sous le couvert de l’accréditation
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bioMérieux
1
RAPPEL SUR LA METHODE ALTERNATIVE
1.1
Date de la première validation, dates de reconduction et
d’extension
La méthode TEMPO® TVC a été validée le 19 septembre 2005 (Attestation
n° BIO 12/15 – 09/05) selon le référentiel EN ISO 16140. Des extensions et
reconductions ont été obtenues :
- en juillet 2009 : reconduction sans essai complémentaire,
- en septembre 2009 : extension avec de nouveaux essais validant la
possibilité de différer la lecture des cartes TEMPO® TVC après
incubation, en les réfrigérant à 2 – 8°C jusqu'à 48 h.
- en février 2011 : extension de la méthode à l’analyse des laits crus,
- en juillet 2013 : reconduction, avec interprétation des données statistiques
de l’étude interlaboratoire selon l’amendement 1 de la norme EN ISO
16140.
1.2
Protocole et principe de la méthode alternative
TEMPO est un test automatisé sur le système TEMPO, permettant de
dénombrer la flore aérobie mésophile dans les produits d’alimentation
humaine et aliments pour animaux de compagnie à l’exclusion des boissons
et de l’alimentation du bétail.
La numération des micro-organismes est basée sur la méthode NPP
(Nombre le Plus Probable) associée à la technologie des cartes TEMPO.
Le système TEMPO réalise l’interprétation de la croissance microbienne de
chaque carte TEMPO et calcule le résultat des numérations (UFC/g).
TEMPO est composé de deux postes d'activité distincts :
- un poste de préparation TEMPO pour l’ensemencement, avec distribution
d'un échantillon alimentaire dilué dans un flacon de milieu de culture, puis
remplissage et scellage des cartes TEMPO au moyen du TEMPO Filler,
- un poste de lecture TEMPO pour effectuer la lecture et l’interprétation des
cartes TEMPO par l'intermédiaire du TEMPO Reader.
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Le protocole général est présenté ci-après :
Préparation échantillon 1/10 ème en sac TEMPO
Diluant : peptone-sel
ème
dilution 1/400
3,9 ml eau distillée stérile
en flacon TEMPO TVC
0,1 ml suspension dans flacon (une carte)

Incubation 40 - 48 h à 30°C  1°C

Lecture
La dilution au 1/400 ème permet une numération dans la gamme 100 à 490 000
ufc/g.
En fonction de la contamination attendue, la dilution peut être modifiée.
1.3
Méthode de référence à laquelle la méthode alternative a été
comparée
La méthode de référence utilisée est la méthode NF ISO 4833 présentée ciaprès :
Suspension mère
et dilutions décimales en peptone-sel

1 ml par boîte (2 boîtes par dilution)

Ajout du milieu PCA
(+ 1 g de poudre de lait écrémé / litre si analyse de produits laitiers)

Incubation 72 h  3 h à 30°C  1°C

Dénombrement

Essai effectué sous le couvert de l’accréditation
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1.4
Principaux résultats obtenus lors de la validation initiale (2005),
des études d’extension (2009 et 2011) et de reconduction (2013)
1.4.1
Etude comparative des méthodes (Validation initiale – 2005)
1.4.1.1 Etude de linéarité

Matrices utilisées et protocoles de contamination
Cinq couples (matrice alimentaire / souche) ont été analysés à cinq niveaux
de contamination, de façon à couvrir la gamme de contamination
habituellement rencontrée. Deux répétitions ont été réalisées par
échantillon. Les produits ont été analysés à la fois par la méthode alternative
et la méthode de référence.
Les matrices suivantes ont été testées :
- pâté de porc, inoculé par Enterobacter agglomerans 72, isolée de bœuf
bourguignon,
- bouchées pour chat, inoculées par Bacillus cereus 29, isolée de VSM
ionisée,
- haricots verts, inoculés par Xanthomonas maltophilia 11.2, isolée de
plante,
- crème pâtissière, inoculée par Staphylococcus aureus 501, isolée de lait
cru,
- pavé de saumon, inoculé par Listeria seeligeri BR1, isolée de truite.
Les lectures ont été effectuées à 40 et 48 h pour la méthode TEMPO TVC.

Résultats
Les graphiques bidimensionnels pour chaque catégorie sont donnés figure 1
et les droites de régression figure 2.
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L’interprétation a été réalisée pour les résultats obtenus à 40 h et 48 h
d’incubation pour la méthode TEMPO TVC en considérant :
- analyses au 1/400 pour tous les échantillons,
- analyses avec combinaison de dilutions (1/40 pour le niveau 1, 1/400
pour les niveaux 2 et 3, 1/4000 pour les niveaux 4 et 5).
Aucune évolution des dénombrements n’est observée entre 40 h et 48 h
d’incubation des cartes TEMPO.

Interprétations statistiques selon la norme EN ISO 16140
Tableau 1 - Récapitulatif des données statistiques
de l’étude de linéarité - Incubation TEMPO TVC 40 et 48 heures
Dilution 1/400
Matrice
R
Régression
utilisée
Rob. F
Valeur P %
critique
Coefficient
de
corrélation
Equation de la droite de
régression
Pâté de porc
1,50
GMFR
1,061
5,41
Bouchées pour chat
2,80
OLS1
9,536
5,41
44
0,997
log Alt = - 0,223 + 0,976 log Réf
2
0,984
log Alt = - 0,441 + 1,134 log Réf
Haricots verts
4,00
OLS1
3,957
5,41
9
0,992
log Alt = 0,151 + 0,996 log Réf
Crème pâtissière
1,33
GMFR
9,560
5,41
2
0,996
log Alt = - 0,50 + 1,165 log Réf
Pavé de saumon
1,67
GMFR
1,668
5,41
29
0,999
log Alt = - 0,340 + 1,115 log Réf
de l’étude de linéarité - Incubation TEMPO TVC 40 et 48 heures
Dilutions combinées
Matrice
R
Régression
utilisée
Rob. F
Valeur P %
critique
Coefficient
de
Equation de la droite de
régression
corrélation
Pâté de porc
0,87
GMFR
0,000
5,41
100
0,999
log Alt = 0,141 + 1,018 log Réf
Bouchées pour chat
8,20
OLS1
0,000
5,41
100
0,983
log Alt = - 0,398 + 1,137 log Réf
Haricots verts
5,00
OLS1
3,240
5,41
12
0,991
log Alt = - 0,282 + 1,101 log Réf
Crème pâtissière
1,40
GMFR
20,489
5,41
0
0,993
log Alt = 0,023 + 1,012 log Réf
Pavé de saumon
4,33
OLS1
3,252
5,41
12
0,992
log Alt = - 0,136 + 1,046 log Réf
Interprétation statistique :
P>5%
:
pas significatif
0,1 % < P < 1 % :
très significatif
1%<P<5%:
P < 0,1 %
:
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significatif
hyper significatif
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bioMérieux
Figure 1 - Linéarité : graphiques bidimensionnels
Dilutions 1/400
Boulettes pour chat-D 1/400
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
log(Méthode alternative)
Pâté de porc-D 1/400
6,00
5,00
4,00
3,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
log(Méthode de référence)
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
Crème pâtissière-D 1/400
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
4,00
Haricots verts-D 1/400
6,00
5,00
4,00
3,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
3,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0,00
9,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Pavé de saumon-D 1/400
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
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Bouchées pour chat-D combinées
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
Pâté de porc-D combinées
6,00
5,00
4,00
3,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
Crème patissière-D combinées
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
4,00
Haricots verts-D combinées
6,00
5,00
4,00
3,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
3,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Pavé de saumon-D combinées
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
9/35
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Figure 2 - Linéarité : droites de régression
Dilutions 1/400
10/35
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
Conclusion
Dans la majorité des cas, les valeurs de P sont supérieures à 5 %, quelles
que soient les dilutions et les analyses considérées. Le test de non-linéarité
est non significatif, ce qui permet de conclure à la linéarité de la méthode.
Les coefficients de corrélation associés aux valeurs de P inférieures à 5 %
montrent des valeurs élevées (supérieures à 0,98) et satisfaisantes pouvant
mettre en défaut la robustesse du test de non-linéarité. L’observation des
graphes confirme la linéarité de la méthode TEMPO TVC.
La linéarité de la méthode TEMPO TVC apparaît satisfaisante.
1.4.1.2 Exactitude relative

Nombre et nature des échantillons
Cinq catégories de produits, réparties sur trois types de matrices, ont été
testées. Un minimum de dix résultats exploitables a été obtenu par
catégorie.
Les matrices étudiées sont les suivantes :
- produits carnés, dont volaille,
-
aliments pour animaux de compagnie,
produits laitiers,
fruits et végétaux,
produits de la mer.
Tableau 3 - Nombre d’échantillons analysés et exploités par catégorie
Catégorie
Nombre d’échantillons
analysés
17
exploités
10
Aliments pour animaux de compagnie
22
10
Produits laitiers
17
12
Fruits et végétaux
22
11
Produits de la mer
12
10
Tous produits
90
53
Produits carnés
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
Résultats
Tableau 4 - Calcul du biais et de la limite de répétabilité
Biais D
Catégorie
Répétabilité
méthode alternative
Répétabilité
méthode de référence
40 h
48 h
40 h
48 h
Produits carnés
0,103
0,208
0,866
0,675
0,352
Aliments pour animaux de
compagnie
-0,130
-0,065
0,822
0,440
0,088
Produits laitiers
-0,240
-0,255
0,484
0,183
0,293
-0,045
0,015
0,470
0,543
0,088
Produits de la mer
0,023
0,120
0,382
0,382
0,191
Tous produits
-0,080
0,040
0,528
0,528
0,235
Catégorie d’aliments
Domaine de contamination
Produits carnés
2,23 à 6,57 log UFC/g
Aliments pour animaux de compagnie
1,00 à 5,36 log UFC/g
Produits végétaux
1,95 à 4,64 log UFC/g
Produits laitiers
1,00 à 4,70 log UFC/g
Produits de la mer
1,32 à 6,32 log UFC/g
Les graphiques bidimensionnels pour chaque catégorie sont donnés figure 3
et les droites de régression figure 4.
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Figure 3 - Exactitude relative : graphiques bidimensionnels
40 h
Aliments pour animaux de compagnie-40H
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
Produits carnés-40H
5,00
4,00
3,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
9,00
5,00
4,00
3,00
6,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Produits de la mer-40H
Tous produits-40H
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
5,00
Fruits et végétaux-40H
9,00
5,00
4,00
3,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
4,00
Produits laitiers-40H
0,00
3,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
14/35
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bioMérieux
48 h
Aliments pour aniamux de compagnie-48H
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
Produits carnés-48H
5,00
4,00
3,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
9,00
5,00
4,00
3,00
6,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Produits de la mer-48H
Tous produits-48H
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
5,00
Fruits et végétaux-48H
9,00
5,00
4,00
3,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
4,00
Produits laitiers-48H
0,00
3,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
15/35
16 juillet 2013
bioMérieux
Figure 4 - Exactitude relative : droites de régression
40 h
Produits carnés - Régression OLS 1
Alim ents pour anim aux de com pagnieRégression OLS 1
7,00
7,00
y = 1,0649x - 0,6185
6,00
5,00
5,00
Alternative
Alternative
y = 1,1162x - 0,4171
6,00
4,00
3,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0,00
0,00
7,00
1,00
2,00
Référence
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Référence
Fruits et végétaux - Régression OLS 1
7,00
y = 1,1162x - 0,3878
6,00
Alternative
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Référence
Produits de la m er - Régression OLS 1
7,00
y = 0,735x + 0,9927
6,00
Alternative
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Référence
16/35
16 juillet 2013
bioMérieux
48 h
Alim ents pour anim aux de com pagnieRégression OLS 1
7,00
y = 1,0471x - 0,4497
6,00
Alternative
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Référence
Fruits et végétaux - Régression OLS 1
7,00
y = 1,0614x - 0,1619
6,00
Alternative
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Référence
Produits de la m er - Régression OLS 1
7,00
6,00
y = 0,8068x + 0,8315
Alternative
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Référence
17/35
16 juillet 2013
bioMérieux

Interprétation statistiques selon la norme ISO16140
de l’étude d’exactitude relative Incubation TEMPO TVC 40 heures
Catégorie
n
R
Régression
utilisée
a
t (a)
b
t (b)
T
critique
P%
Ordonnée Pente
à0
à1
33
25
Biais
D
Produits carnés
Aliments pour animaux
de compagnie
Produits laitiers
Produits de la mer
Tous produits
10
2,46
OLS1
- 0,417
1,026
1,116
1,236
2,306
10
9,33
OLS1
- 0,619
0,786
1,065
0,330
2,306
75
45
-0,130
12
11
10
53
1,65
5,33
2,00
2,25
GMFR
OLS1
OLS1
OLS1
- 0,682
- 0,388
0,993
- 0,230
2,923
0,497
2,532
0,993
1,146
1,116
0,735
1,030
2,164
0,500
2,741
0,492
2,228
2,262
2,306
2,008
2
63
4
33
6
63
3
63
-0,240
-0,045
0,023
-0,080
0,103
Avec - a : ordonnée à l’origine de la droite de régression
- b : pente de la droite de régression
P>5%
:
pas significatif
0,1 % < P < 1 % :
très significatif
1%<P<5%:
P < 0,1 %
:
significatif
hyper significatif
Pour toutes catégories de produits confondues, l’équation de la droite de
régression est :
log TEMPO TVC = - 0,23 + 1,03 log Référence
de l’étude d’exactitude relative Incubation TEMPO TVC 48 heures
Catégorie
n
R
Régression
utilisée
a
t (a)
b
t (b)
T critique
P%
Ordonnée Pente
à0
à1
24
14
Produits carnés
Aliments pour animaux
de compagnie
Produits laitiers
Produits de la mer
Tous produits
10
1,92
GMFR
-0,541
1,279
1,159
1,625
2,306
10
5,00
OLS1
-0,450
0,672
1,047
0,282
2,306
52
79
-0,065
12
11
10
53
1,75
6,17
2,00
2,25
GMFR
OLS1
OLS1
OLS1
-0,504
-0,162
0,832
-0,178
2,475
0,197
2,228
0,830
1,111
1,061
0,807
1,036
1,880
0,250
2,099
0,642
2,228
2,262
2,306
2,008
3
85
6
41
9
81
7
52
-0,255
0,015
0,120
0,040
Avec - a : ordonnée à l’origine de la droite de régression
- b : pente de la droite de régression
P>5%
:
pas significatif
0,1 % < P < 1 % :
très significatif
1%<P<5%:
P < 0,1 %
:
18/35
significatif
hyper significatif
16 juillet 2013
Biais
D
0,208
bioMérieux
Pour toutes catégories de produits confondues, l’équation de la droite de
régression est :
log TEMPO TVC = - 0,178 + 1,036 log Référence
Pour toutes catégories confondues et quel que soit le temps d’incubation
des cartes TEMPO TVC, les résultats des tests statistiques valident des
ordonnées à l’origine proches de 0 et des pentes proches de 1.
De même, toutes catégories confondues, le biais entre les deux méthodes
varient entre - 0,080 et 0,040 log UFC/g, respectivement pour des durées
d’incubation des cartes TEMPO TVC de 40 h et 48 h.
Pour une incubation de 40 et 48 heures des cartes TEMPO TVC, la limite de
répétabilité (tous produits) est de 0,235 pour la méthode de référence et de
0,528 pour la méthode alternative

Conclusion
Selon les échantillons, une faible variation des dénombrements est
observée entre les deux durées d’incubation des cartes TEMPO TVC, 40h et
48h.
Pour toutes catégories confondues et quel que soit le temps d’incubation
des cartes TEMPO TVC, les résultats des tests statistiques valident des
ordonnées à l’origine proches de 0 et des pentes proches de 1.
La limite de répétabilité de la méthode alternative est supérieure à celle de
la méthode de référence, tel qu’observé de manière générale entre une
méthode basée sur le principe NPP et une méthode de dénombrement sur
gélose (Gangar1 et Gambrel-Lenarz, 1999). La plupart des études
comparatives de méthodes AFNOR ou AOAC rapporte des limites de
répétabilité comprises entre 0,7 et 1,8 log UFC/g pour les méthodes de
référence basées sur le principe NPP.
La méthode TEMPO TVC avec une valeur de 0,528 présente une limite
de répétabilité satisfaisante.
1
Gangar V., Curiale M.S., Lindberg K., Gambrel-Lenarz S. (1999) Dry rehydratable film method for
enumerating confirmed Escherichia coli in poultry, meats and seafood: collaborative study. J.
AOAC Int., 82 (1) :73-8
19/35
16 juillet 2013
bioMérieux
1.4.1.2 Limite de détection (LOD) et limite de quantification (LOQ)

Protocole
La limite de détection a été réalisée à l’aide d’une culture de
Escherichia coli 94.
Quatre niveaux d’inoculation ont été testés, ainsi que le niveau 0. Les
dénombrements des suspensions ont été réalisés en milieu PCA.
Des suspensions ont été préparées puis diluées au 1/10 (tryptone-sel) en
sac TEMPO. Une dilution au 1/40 de chaque suspension a donc été
analysée par la méthode TEMPO TVC.

Résultats
Les données sont intrinsèques à la méthode. Les interprétations sont
données dans les tableaux suivants :
Tableau 7 - Récapitulatif
Niveau visé
(UFC/g)
0
10
50
100
« positifs »
0/6
4/6
6/6
6/6
Ecart-type
So
/
7,842
28,081
37,639
Biais
Xo
/
10
87,5
140
Tableau 8
Formules
Valeurs obtenues
LC
1,65 So + Xo
22,9
LOD
3,3 So + Xo
35,9
LOQ
10 So + Xo
88,4
20/35
16 juillet 2013
bioMérieux
1.4.1.3 Sensibilité relative
Les données sont intrinsèques à la méthode. Elles sont obtenues à partir
des résultats obtenus dans l’étude de linéarité. Les profils de précision
obtenus pour les différentes matrices sont présentés figures 5 et 6.
Figure 5 - Profils de précision obtenus pour les différentes matrices
Dilution 1/400
Profils de précision obtenus pour les différentes matrices
60,0%
50,0%
cv(<x(y)>)
40,0%
Pâté de porc
Boulettes pour chat
30,0%
Crème patissière
Pavé de asumon
Haricots verts
20,0%
10,0%
0,0%
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
Méthode de référence ufc/g (x)
Figure 6 - Profils de précision obtenus pour les différentes matrices
Profils de précision obtenus pour les différentes matrices
60,0%
50,0%
cv(<x(y)>)
40,0%
Pâté de porc
Boulettes pour chat
30,0%
Crème patissière
Pavé de asumon
Haricots verts
20,0%
10,0%
0,0%
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
Méthode de référence ufc/g (x)
21/35
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1.4.1.4 Praticabilité
 Temps réel de manipulation et flexibilité de la technique par rapport au
nombre d’échantillons à analyser (temps en minutes)
Etape
Prélèvement
Ajout diluant
Broyage
Préparation des boîtes (2)
Dilutions
Ensemencements
Lecture
Temps total
Temps pour 1 échantillon
Méthode ISO 4833
1 échantillon
20 échantillons
4
45
Méthode TEMPO TVC
1 échantillon
20 échantillons
4
45
2
15
2
15
0,5
21
/
/
107
2
20
90
278
13,9
0,45
8,45
8,45
2
82
4,1
6
2,5
15
15
Les temps indiqués ne tiennent pas compte de la préparation des milieux qui
vient s’ajouter essentiellement pour la méthode de référence, la méthode
TEMPO TVC nécessitant uniquement du TS pour la préparation de la
suspension-mère, et un ou deux tubes de TS de 9 ml pour les dilutions
décimales.
L’utilisation de la méthode TEMPO TVC réduit considérablement les temps
de manipulation, en particulier au niveau du poste de lecture.
Il faut souligner également le gain de temps au niveau de la gestion des
déchets.
Le volume des consommables par la méthode TEMPO TVC est négligeable
par rapport au volume des consommables nécessaires pour la méthode ISO
4833.
L’espace d’incubation nécessaire pour la méthode TEMPO TVC est
particulièrement restreint par rapport à celui de la méthode ISO 4833.
(2)
5 dilutions x 2 boîtes
22/35
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bioMérieux
 Délai d’obtention des résultats
Etape
Méthode ISO 4833
Méthode TEMPO TVC
J0
J0
J3 (72h)
J2 (40 à 48 h)
Prélèvement
Broyage
Analyse
Lecture
La méthode TEMPO TVC permet de gagner plus d’un jour (32h) sur
l’obtention du résultat par rapport à la méthode ISO 4833.
 Traçabilité des résultats
Une traçabilité complète est assurée au niveau du TEMPO Filler et du
TEMPO Reader, à savoir :
- identification de l’échantillon,
- heure de réalisation du kit,
-
manipulateur ayant réalisé le test,
lots de réactifs et consommables utilisés,
heure de lecture des cartes,
manipulateur ayant réalisé la lecture,
édition des résultats, associant le résultat (UFC/g) à l’échantillon, au
paramètre testé et à la date d’analyse,
- transfert possible vers un LIMS (Laboratory Information Management
System).
 Maintenance par le laboratoire
Les performances du TEMPO Reader sont contrôlées une fois par mois à
l’aide du kit TEMPO QC qui est composé de :
- 3 flacons TEMPO QC 8 µM
-
2 flacons TEMPO QC 20 µM
3 cartes TEMPO QC 8 µM
2 cartes TEMPO QC 20 µM
1 notice.
23/35
16 juillet 2013
bioMérieux
Ce kit permet de vérifier que le niveau de fluorescence donné par le TEMPO
Reader se situe bien dans la plage de valeurs attendues, signifiant que
l’appareil est conforme.
L’intérêt majeur de la méthode TEMPO TVC réside :
- dans le gain
et de la lecture,
de
temps
important
au
niveau
de
l’analyse
- dans le délai d’obtention du résultat qui se trouve réduit de
32 heures,
- dans le gain de place à l’incubation des cartes TEMPO TVC
et la gestion facilitée des déchets.
1.4.2
Etude d’extension (2009)
Cette étude d’extension avait été menée pour valider la possibilité de stocker
les cartes TEMPO 48 h à 2 – 8°C avant lecture.
71 échantillons ont été analysés au total. La répartition par catégorie est
présentée dans le tableau ci-après :
Catégorie
analysés
exploitables
Produits carnés
12
6
Produits laitiers
17
8
14
6
Produits de la pêche
16
6
Produits d’alimentation des animaux
12
6
71
32
de compagnie
Total
Les échantillons exploitables présentent des niveaux de population allant de
1,32 log à 6,57 log.
Les résultats obtenus après stockage à 4°C pendant 24 h et 48 h ont été
comparés à ceux obtenus immédiatement après incubation.
Les droites de régression sont présentées ci-après :
24/35
16 juillet 2013
bioMérieux
Figure 7
Lecture après incubation / Lecture après stockage 24H à 4°c
Lecture après stockage 24H à 4°c (logufc:g)
7,00
y = 0,9858x + 0,0977
R² = 0,9944
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
6,00
7,00
Lecture après incubation (log ufc/g)
Lecture après incubation / Lecture après stockage 48H à 4°C
7,00
Lecture après stockae 48H à 4°c (log ufc/g)
y = 0,987x + 0,1026
R² = 0,9922
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
Lecture après incubation (log ufc/g)
Les équations des droites obtenues sont les suivantes :
- lecture réalisée après stockage 24 h à 4°C : y = 0,986x + 0,098
- lecture réalisée après stockage 48 h à 4°C : y = 0,987x + 0,103
La conservation des cartes TEMPO pendant 24 h à 48 h à 4°C ne
modifie pas le résultat observé immédiatement après incubation.
25/35
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bioMérieux
1.4.3
Etude d’extension dans des laits crus (2011)
1.4.3.1 Nombre et nature des échantillons
18 échantillons ont été analysés ; 14 ont donné des résultats exploitables
par les 2 méthodes.
1.4.3.2 Résultats bruts
Le domaine de contamination se situe entre 1,98 et 6,41 log. Les graphiques
bidimensionnels pour la catégorie « Laits crus » sont donnés figure 8 et pour
tous produits figure 9.
Figure 8 – Graphique bidimensionnel
Catégorie « Laits crus »
Tempo TVC
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
26/35
5,00
6,00
7,00
16 juillet 2013
bioMérieux
Figure 9 – Graphique bidimensionnel
Catégorie « Tous produits »
Tous produits
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
1.4.3.3 Interprétation
Tableau 9
P%
Catégorie
n
R
Régression
utilisée
a
t(a)
b
t(b)
T
critique
Ordonnée à 0
Pente à 1
Laits crus
14
2,50
OLS1
0,501
1,764
0,919
1,337
2,179
10
21
Tous produits
67
2,38
OLS1
- 0,092
0,452
1,019
0,380
1,997
65
71
Les limites de répétabilité obtenues pour la méthode alternative et la
méthode de référence, ainsi que les biais D obtenus sont donnés ci-après :
Tableau 10
Laits crus
Biais D
(médiane)
0,133
Répétabilité
méthode alternative
0,587
Répétabilité
méthode de référence
0,235
Tous produits
0,065
0,558
0,235
Catégorie
Les droites de régression sont données figure 10 pour la catégorie « Laits
crus » et figure 11 pour « Tous produits ».
27/35
16 juillet 2013
bioMérieux
Figure 10 – Droite de régression
Catégorie « Laits crus »
Tempo TVC-Régression OLS 1
7,00
y = 0,9192x + 0,5013
6,00
Alternative
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Référence
Figure 11 – Droite de régression
Catégorie « Tous produits »
Régression OLS 1
8,00
y = 1,0191x - 0,092
7,00
Alternative
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
Référence
5,00
6,00
7,00
Pour les laits crus, le biais entre les 2 méthodes est faible. La limite de
répétabilité de la méthode alternative est plus élevée que celle de la
méthode de référence. L’équation de la droite de régression pour les laits
crus est la suivante :
log Alt = 0,9192 log Réf. + 0,5013
L’équation de la droite de régression pour tous produits est la suivante :
log Alt = 1,019 log Réf. – 0,092
La
méthode
TEMPO
®
TVC
montre
des
résultats
d’exactitude
satisfaisants pour l’analyse des laits crus.
28/35
16 juillet 2013
bioMérieux
1.4.3.4 Conclusion
La méthode TEMPO® TVC appliquée aux laits crus donne des résultats
similaires à ceux observés pour la méthode de référence.
Il est à noter que la limite de répétabilité observée pour la méthode
TEMPO® TVC est supérieure à celle observée pour la méthode de référence.
1.4.4
Etude interlaboratoire
1.4.4.1 Préparation
Treize laboratoires ont participé à l’étude. Du lait UHT a été inoculé par la
souche d’Enterobacter cloacae 10, isolée de produit laitier.
1.4.4.2 Analyses
Les laboratoires collaborateurs et le laboratoire expert ont effectués les
analyses à la fois par la méthode alternative et la méthode de référence.
1.4.4.3 Résultats obtenus par les laboratoires collaborateurs
29/35
16 juillet 2013
bioMérieux
Tableau 11 - Synthèse des résultats obtenus par la méthode alternative et la méthode de référence (en UFC/g)
Dilution 1/400
Niveau 0
Laboratoires
A
B
D
E
F
G
H
I
J
Méthode
de référence
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
Niveau 1
Méthode
alternative
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
Méthode
de référence
670
950
760
910
1000
1000
1600
2300
720
1200
610
880
1600
1800
1000
1700
1000
1300
Niveau 2
Méthode
alternative
1100
1900
1200
730
1400
860
830
1100
1400
1000
1600
1000
1000
1600
1400
2800
590
5000
Méthode
de référence
13000
14000
11000
11000
15000
13000
26000
31000
13000
10000
6700
18000
18000
19000
12000
15000
15000
13000
Méthode
alternative
6400
11000
12000
8100
19000
17000
20000
22000
13000
21000
21000
18000
12000
11000
37000
53000
13000
23000
Niveau 3
Méthode
de référence
190000 180000
160000 170000
160000 130000
510000 430000
160000 150000
170000 120000
220000 230000
210000 210000
170000 180000
Méthode
alternative
170000 250000
300000 250000
490000 300000
490000 150000
490000 490000
300000 150000
210000 300000
300000 >490000
370000 300000
Tableau 12 - Synthèse des résultats obtenus par la méthode alternative et la méthode de référence (en log UFC/g)
Dilution 1/400
Niveau 0
Laboratoires
A
B
D
E
F
G
H
I
J
Méthode
de référence
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
Méthode
alternative
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
Niveau 1
Méthode
de référence
2,826
2,978
2,881
2,959
3,000
3,000
3,204
3,362
2,857
3,079
2,785
2,944
3,204
3,255
3,000
3,230
3,000
3,114
Niveau 2
Méthode
alternative
3,041
3,279
3,079
2,863
3,146
2,934
2,919
3,041
3,146
3,000
3,204
3,000
3,000
3,204
3,146
3,447
2,771
3,699
30/35
Méthode
de référence
4,114
4,146
4,041
4,041
4,176
4,114
4,415
4,491
4,114
4,000
3,826
4,255
4,255
4,279
4,079
4,176
4,176
4,114
Méthode
alternative
3,806
4,041
4,079
3,908
4,279
4,230
4,301
4,342
4,114
4,322
4,322
4,255
4,079
4,041
4,568
4,724
4,114
4,362
Niveau 3
Méthode
de référence
5,279
5,255
5,204
5,230
5,204
5,114
5,708
5,633
5,204
5,176
5,230
5,079
5,342
5,362
5,322
5,322
5,230
5,255
Méthode
alternative
5,230
5,398
5,477
5,398
5,690
5,477
5,690
5,176
5,690
5,690
5,477
5,176
5,322
5,477
5,477
>5,477
5,568
5,477
16 juillet 2013
bioMérieux
1.4.4.4 Calculs et interprétation statistique (Etude de reconduction – 2013)
Les calculs ont été réalisés selon l’amendement 1 de la norme
EN ISO 16140 (15 août 2011).
 DEFINITIONS
 Exactitude : « Etroitesse de l’accord entre un résultat d’essai et la valeur de
référence acceptée ».
 Fidélité : « Etroitesse de l’accord entre les résultats d’essais indépendants
obtenus dans des conditions de répétabilité et de reproductibilité
stipulées ».
 Répétabilité : « Etroitesse d’accord entre des résultats successifs et
indépendants obtenus avec la même méthode en utilisant un matériau
d’essai identique, dans des conditions identiques (appareillage, opérateur,
laboratoires et intervalles de temps courts, c’est-à-dire des conditions de
répétabilité) ».
 Limitée de répétabilité (r) : « Valeur inférieure ou égale à laquelle la
différence absolue entre deux résultats d’essai obtenus dans des
conditions de répétabilité est attendue avec une probabilité de 95 % ».
 Reproductibilité : « Etroitesse d’accord entre des résultats d’essai
individuels effectués sur un matériau d’essai identique en utilisant la même
méthode et obtenus par des opérateurs de différents laboratoires utilisant
un équipement différent (c’est-à-dire dans des conditions de
reproductibilité) ».
 Limite de reproductibilité (R) : « Valeur inférieure ou égale à laquelle la
différence absolue entre deux résultats d’essai obtenus dans des
conditions de reproductibilité est attendue avec une probabilité de 95 % ».
Les interprétations ont été réalisées en tenant compte des résultats obtenus
avec la dilution 1/400 pour la méthode TEMPO ® TVC aux niveaux 1 et 2, et
avec la dilution 1/4000 pour le niveau 3.
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16 juillet 2013
bioMérieux
 CONTROLE DE LA COHERENCE DES RESULTATS DE MESURAGE
Des graphiques de cohérence ont été appliqués pour identifier les résultats
incohérents par rapport à l’ensemble des résultats : il s’agit des statistiques
robustes h (cohérence interlaboratoire) et k (cohérence intralaboratoire) de
Mandel.
Le nombre de valeurs situées au-dessus des seuils pour h et K est donné dans le
tableau ci-après :
Valeurs de Mandel
Nombre de valeurs observées au-dessus du seuil
Méthode de référence
h>1%
h>5%
Labo E
Méthode alternative
Niveau 3
Labo E
Niveau 2
Labo A
Niveau 2
Labo I
Niveau 2
/
Niveau 3
k> 1 %
k>5%
Labo G
Labo G
Niveau 2
Labo I
Niveau 3
Niveau 3
Labo J
Niveau 1
Niveau 2
Labo I
Niveau 3
Niveau 3
Labo J
Niveau 1
L’ensemble des résultats a été conservé pour l’interprétation statistique.
 BIAIS
Afin d’estimer le biais de la méthode alternative par rapport à la méthode de référence
pour chaque niveau, Dij et t sont calculés selon les équations suivantes :


Dij  Y ij , Alt  Y ij , Ref
t
median i ( Dij)
 / (2 p)  Diff
Si la valeur de t est supérieure à 2, la méthode alternative est significativement biaisée
par rapport à la méthode de référence.
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16 juillet 2013
bioMérieux
Tableau 13 - Valeurs de t(d) obtenues par niveau
Niveau
Biais D
t(d)
Conclusion
1
0,105
1,70
Biais non significatif
2
0,093
0,82
Biais non significatif
3
0,202
3,79
Biais significatif
La valeur t(d) est supérieure à 2 pour le niveau 3, la méthode alternative est
significativement biaisée par rapport à la méthode de référence. Le biais est de
0,202 log entre les deux méthodes, ce qui reste satisfaisant.
 COMPARAISON DES CARACTERISTIQUES DE JUSTESSE ET DE FIDELITE DE LA METHODE
DE REFERENCE ET DE LA METHODE ALTERNATIVE
Un bilan des valeurs observées est donné dans le tableau ci-après.
Tableau 14
Nivea
u
Médiane
Ecart-type de
répétabilité
Ecart-type de
reproductibilité
Médiane
Ecart-type de
répétabilité
Ecart-type de
reproductibilité
1
3,000
0,114
0,174
3,102
0,130
0,150
2
4,130
0,076
0,146
4,238
0,131
0,164
3
5,243
0,041
0,113
5,473
0,140
0,184
 COMPARAISON DES ECARTS-TYPES DE REPETABILITE
Si le rapport des écarts-types de répétabilité de la méthode alternative et de la méthode
de référence est supérieur à 2, la fidélité dans les conditions de répétabilité de la
méthode alternative est considérée inférieure à celle de la méthode de référence. Si ce
rapport est inférieur à 0,5, la fidélité de la méthode alternative est considérée comme
supérieure à celle de la méthode de référence.
Les valeurs de ces rapports sont données dans le tableau ci-après.
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bioMérieux
Tableau 15 – Rapport des écarts-types de répétabilité
Niveau de
Ratio
contamination
Sr Réf.
r Réf.
Sr Alt.
r Alt.
Sr Alt. / Sr Réf.
1
0,114
0,319
0,130
0,364
1,142
2
0,076
0,213
0,131
0,367
1,732
3
0,041
0,115
0,140
0,392
3,324
La fidélité dans les conditions de répétabilité de la méthode alternative est
équivalente à celle de la méthode de référence pour les niveaux 1 et 2 ; elle est
inférieure à celle de la méthode de référence pour le niveau 3.
 Comparaison des écarts-types de reproductibilité
Si le rapport des écarts-types de reproductibilité de la méthode alternative et de la
méthode de référence est supérieur à 2, la fidélité dans les conditions de reproductibilité
de la méthode alternative est considérée inférieure à celle de la méthode de référence.
Si ce rapport est inférieur à 0,5, la fidélité de la méthode alternative est considérée
comme supérieure à celle de la méthode de référence.
Les valeurs de ces rapports sont données dans le tableau ci-après.
Tableau 16 – Rapport des écarts-types de reproductibilité
Niveau de
Ratio
contamination
SR Réf.
R Réf.
SR Alt.
R Alt.
SR Alt/SR Réf.
1
0,174
0,487
0,150
0,420
0,864
2
0,146
0,409
0,164
0,459
1,126
3
0,110
0,308
0,184
0,308
1,676
La fidélité dans les conditions de reproductibilité de la méthode alternative est
équivalente à celle de la méthode de référence pour les trois niveaux
d’inoculation testés.
1.4.4.5 Conclusion
Les biais sont non significatifs pour les niveaux 1 et 3 ; il est significatif pour le
niveau 2 avec un biais de 0,2 log UFC.
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bioMérieux
La fidélité dans les conditions de répétabilité de la méthode alternative est
équivalente à celle de la méthode de référence pour les niveaux 1 et 2 ; elle est
inférieure pour le niveau 3.
La fidélité dans les conditions de reproductibilité de la méthode alternative est
équivalente à celle de la méthode de référence quel que soit le niveau
d’inoculation testé.
2
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Une recherche bibliographique a été réalisée dans les banques de données
internationales : FSTA3, Biosis4, Medline5 et Foodline6. Un article a été recensé :
Auteurs
Line JE, Stern NJ, Oakley BB,
Seal BS, 2011.
J Food Prot. 74(9):1558-63.
3
Titre
Comparison of an automated
most-probable-number
technique
with
traditional
plating methods for estimating
populations of total aerobes,
coliforms, and Escherichia coli
associated
with
freshly
processed broiler chickens.
Résumé
Comparaison des méthodes
sur boites, test Petrifilm AC, et
TEMPO TVC pour le contrôle
des échantillons de poulets en
abattoir: les différences de
résultats
sont
rarement
supérieurs à 1 log UCF/g.
AUTRES VALIDATIONS OBTENUES
La méthode TEMPO TVC a obtenu l’AOAC RI en 2006 (avec reconductions
annuelles) et l’AOAC OMA en 2008.
IFIS, http://library.dialog.com/bluesheets/html/bl0051.html
Biosis, une filiale de Thomson Scientific, http://library.dialog.com/bluesheets/html/bl0005.html
5 U.S. National Library of Medecine, http://library.dialog.com/bluesheets/html/bl0154.html
6 Leatherhead Food Research Center, http://library.dialog.com/bluesheets/html/bl0053.html
3
4
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16 juillet 2013

Rapport de synthèse BIO 12-15-09-05 (fr) - NF VALIDATION

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