Étude comparée du développement de deux souches

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1983, 2 (2), 499-507.
Étude comparée du développement
de deux souches vaccinales
du virus claveleux
sur cellules testiculaires et rénales
d'agneau. Résultats préliminaires
M. F A S S I - F E H R I , M . EL HARRAK** et F. BERTIN**
Résumé : Les auteurs ont comparé la multiplication en culture cellulaire de deux souches vaccinales du virus claveleux : la souche Perego,
d'origine nord-africaine, sur cellules de testicules d'agneau, et la souche
RM65, d'origine yougoslave, sur cellules rénales d'agneau.
L'effet cytopathogène et les titres obtenus sont comparables pour
les deux virus. Les avantages et inconvénients respectifs des deux types
de cultures cellulaires utilisées sont présentés.
La clavelée est une maladie contagieuse spécifique des ovins se traduisant par des éruptions vésiculo-pustuleuses sur la peau et certaines m u q u e u ses, n o t a m m e n t les muqueuses respiratoires, digestives et génitales. P a r sa
fréquence, sa diffusion et sa gravité, elle constitue au M a r o c comme dans
plusieurs pays d'Afrique et du p o u r t o u r méditerranéen une des principales
maladies légalement contagieuses du cheptel ovin.
La prophylaxie, à base essentiellement médicale, nécessite des vaccins
d'innocuité, d'efficacité, de conservation et de commodité d'application
satisfaisantes. En outre, tout p r o g r a m m e de prophylaxie visant l'éradication
par ailleurs possible de la maladie, implique que soient disponibles des quantités suffisantes (stocks de sécurité) de vaccin (3).
Ces considérations nous ont incités à entreprendre l'étude de certains
facteurs de production de vaccins anticlaveleux.
Dans la présente note nous r a p p o r t o n s les résultats préliminaires relatifs :
* Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II, Département de Microbiologie, Maladies
contagieuses, Rabat (Maroc).
** Institut de Biologie animale, B.P. 4505, Rabat (Maroc).
— 500 —
— à l'adaptation d'une souche virale atténuée (souche Perego) à la culture de cellules de testicules d'agneau. Cette adaptation est évaluée par la
rapidité d'apparition de l'effet cytopathogène (ECP) et par titrage du virus;
— à l'étude comparée de cette souche avec la souche RM65 sur cellules
rénales d'agneau.
Ce travail sera poursuivi ultérieurement par l'étude de la multiplication
et du pouvoir immunogène, d ' u n e part, de la souche Perego sur cellules rénales d'agneau et, d ' a u t r e part, de la souche RM65 sur cellules testiculaires
d'agneau.
L'étude de la multiplication du virus claveleux sur culture de tissus a été
entreprise depuis de nombreuses années (6). Le virus claveleux s'est révélé
apte à se multiplier aussi bien sur cellules homologues (rénales, testiculaires,
spléniques, cutanées) que sur cellules hétérologues (rein et testicules de porc
et de veau, fibroblastes de poussin, etc.). L ' a d a p t a t i o n à des lignées continues
a été également réalisée. Toutefois, c'est sur cellules homologues d'agneau
que l'adaptation se fait avec le plus de facilité ( 1 , 2, 6, 8).
Les souches vaccinales dont l'adaptation et l'atténuation sur cultures cellulaires ont été réalisées sont nombreuses. P a r m i ces souches signalons :
— La souche R M 6 5 , d'origine yougoslave, qui a été adaptée et atténuée
à l'Institut Razi de Téhéran par 30 passages sur cellules rénales d'agneau (7).
— La souche Perego, d'origine nord-africaine, adaptée sur cellules testiculaires d'agneau après une vingtaine de passages (4).
— La souche roumaine Fanar ( S P V / R F ) atténuée après 25 passages sur
cellules testiculaires d'agneau (5).
Dans notre expérimentation nous avons utilisé les souches RM65 et
Perego provenant des collections de différents laboratoires du Service de
l'Élevage.
MATÉRIELS ET M É T H O D E S
Milieux de croissance et d'entretien.
Les milieux utilisés sont :
— Solution de PBS pour la récolte d'organe et son lavage.
— Milieu de croissance : milieu de Eagle 199 additionné de 10% de
sérum de fœtus de veau (Flow laboratories).
— Milieu d'entretien : milieu 199 à 5 % de sérum.
— Solution de trypsine Difco à 0,25% dans le P B S .
Cultures de tissus.
Culture en couche monocellulaire de cellules de testicules d'agneaux de
3 à 4 mois non vaccinés.
— 501 —
Le testicule récolté aux abattoirs est débarrassé de ses enveloppes, divisé
en deux parties égales qui sont ensuite découpées séparément en petits fragments. On lave plusieurs fois à l'aide d ' u n solution de PBS et on soumet à
une digestion trypsique, la suspension cellulaire récoltée est centrifugée et
lavée 2 ou 3 fois. Le culot cellulaire est ensuite repris dans une quantité adéquate de milieu de croissance, réparti en boîtes de Roux ou en flacons de
plastique type Falcon et en tubes de Leighton qui sont incubés à 37°C.
L'incubation se fait soit en position stationnaire pour les boîtes de Roux,
tubes de Leighton, flacons et tubes en plastique, soit, p o u r les titrages en
tubes de verre, en tambour-rouleur t o u r n a n t à la vitesse de 1 tour en 2 minutes.
Parallèlement, nous avons procédé à la mise en culture, selon la m ê m e
technique, de cellules de rein d ' a g n e a u . Le milieu M E M a été utilisé additionné de 10% de sérum de veau.
P a r ce procédé, u n tapis cellulaire complet est obtenu au b o u t de 2 ou
3 j o u r s d'incubation p o u r les cellules testiculaires, 4 ou 5 jours pour les cellules rénales. Selon le cas, ces cellules sont soit ensemencées directement avec
le virus, soit soumises à une trypsination afin de préparer des subcultures.
Nous avons aussi utilisé des cellules des 2 , 3 et 4 subcultures dans le but
d'évaluer une éventuelle modification de l'effet cytopathogène ou du titre
viral.
e
e
e
Inoculation virale.
Deux souches atténuées du virus claveleux ont été utilisées :
— souche Perego sur cellules testiculaires;
— souche RM65 sur cellules rénales.
P o u r le premier cas, 5 passages préliminaires ont été réalisés avec le virus
dilué au 1/10 et a u 1/100, et ce pour observer la régularité d'apparition des
signes d'infection virale. A u cours de ces passages, le virus est inoculé sur le
tapis cellulaire vidé de son milieu et mis à adsorber pendant une heure à
37°C. A la destruction de 6 0 % environ du tapis, les flacons sont congelés et
décongelés deux fois, centrifugés et le surnageant est conservé pour les passages ultérieurs.
Observation de l ' E C P .
L ' E C P est observé au fur et à mesure de son évolution soit à l'état frais à
l'aide du microscope inversé, soit après coloration par la méthode de M . G . G .
des lamelles contenues dans les tubes de Leighton.
Titrage du virus.
Le titrage du virus Perego est effectué après 5 passages sur cellules testiculaires d'agneau. Différents systèmes de titrage ont été utilisés :
— Titrage en boîtes de matière plastique (30 ml) avec 0,2 ml d'inoculum
et 4 boîtes par dilution.
— 502 —
— Titrage sur tubes en matière plastique (culture en position stationnaire).
— Titrage sur tubes de Leighton (culture en position stationnaire).
— Titrage sur tubes en verre en rotation.
Dans tous les cas on inocule 4 tubes par dilution avec u n inoculum de
0,1 m l . Les titrages ont lieu sur des cellules de première explantation et des
cellules des subcultures.
La dilution limite qui provoque un E C P dans 5 0 % des tubes ou flacons
est déterminée par la méthode de Reed et Muench et les résultats sont exprimés en Dose à effet cytopathogène à 5 0 % par millilitre ( D E C P ) .
5 0
RÉSULTATS ET DISCUSSION
1. Caractères de l'infection virale du virus Perego sur cellules de testicules
d'agneau.
e
— Au 3 jour, les boîtes inoculées montrent dans un tapis cellulaire confluent, des cellules isolées réfringentes et arrondies.
A la coloration de Giemsa, on note deux types de cellules : des cellules
épithéliales polygonales et des cellules fibroblastiques fusiformes. Les deux
types de cellules m o n t r e n t des inclusions cytoplasmiques, acidophiles, de
forme et de taille variable, caractéristiques des pox virus. Il y en a généralement une o u deux par cellule. Ces inclusions sont entourées d ' u n e auréole
claire. Le noyau apparaît n o r m a l . A ce stade le titre du virus est de l'ordre de
102 à 103 D E C P / m l .
5 0
e
e
— Aux 4 et 5 jours, on note à l'état frais de multiples plages de lyse
plus ou moins étendues.
A la coloration, les inclusions cytoplasmiques apparaissent comme au
stade précédent. Le noyau de la plupart des cellules présente des zones claires
de contour mal défini, occupant parfois presque la totalité du noyau. Cette
vacuolisation du noyau est accompagnée d ' u n e margination de la c h r o m a tine. A ce stade le titre viral se situe entre 1 0 et 1 0 D E C P par millilitre.
5 , 5
6
5 0
e
— Au 6 jour, ce qui reste du tapis cellulaire se décroche rapidement, le
cytoplasme disparaît, la cellule est réduite à un noyau ratatiné et picnotique.
C'est la phase de dégénérescence et de nécrose cellulaire. A ce stade le titre du
virus diminue rapidement.
Ces résultats (titre et caractère de l ' E C P ) sont retrouvés aussi bien sur
cellules testiculaires de première explantation que sur les cellules de subculture.
— 503 —
2 . Comparaison avec la souche R M 6 5 sur culture de cellules rénales.
Sur culture de cellules rénales, nous avons pu observer un E C P de la
souche RM65 assez comparable à celui décrit ci-dessus. Toutefois, l'évolution
de l ' E C P est plus lente, la vacuolisation nucléaire plus marquée et les p h é n o mènes de dégénérescence sont beaucoup plus discrets, si bien que le tapis ne
se décroche q u ' e n partie.
Ces considérations suggèrent que :
A u début de la culture, le titre est faible parce que le virus est en phase
de multiplication, par conséquent le n o m b r e de particules infectantes est peu
élevé.
e
Au 5 j o u r , le titre viral du surnageant est faible. P a r contre, le titre est à
son o p t i m u m si on procède au titrage lorsque 6 0 % des cellules lésées mais
non encore dégénérées sont soumises à un éclatement par congélationsdécongélations successives.
Cela pourrait s'expliquer par le fait que les particules virales ne sont libérées q u ' a u m o m e n t de la dégénérescence cellulaire et que, dans le surnageant,
ces particules perdaient rapidement leur pouvoir infectieux.
En conclusion, cette étude préliminaire m o n t r e :
a) que le virus Perego se multiplie sur cellules testiculaires d'agneau et
titre entre 1 0 et 1 0 D E C P / m l au 5 j o u r lorsque 4 0 % environ du tapis
cellulaire est détruit. La multiplication se traduit par u n E C P où dominent
des inclusions cytoplasmiques à partir du 3 j o u r , une vacuolisation nucléaire
à partir du 4 jour;
5 , 5
6
e
5 0
e
e
b) que le virus RM65 se développe sur cellules rénales en p r o v o q u a n t u n
E C P et des titres comparables au virus Perego sur testicules d ' a g n e a u .
Par ailleurs, les cellules testiculaires d'agneau présentent certains avantages dus :
— à leur rapidité de multiplication,
— à la possibilité de nombreuses subcultures avec une sensibilité constante au virus,
— au risque moindre de transmission de virus, n o t a m m e n t les virus
lents.
Cependant, on se heurte à la difficulté d'approvisionnement en testicules
d'agneau. L'étude des conditions de conservation des cellules testiculaires
pourrait pallier cet inconvénient.
*
* *
— 504 —
FIG.
1.
Subculture de cellules testiculaires d'agneau après 72 heures d'incubation.
F I G . 2.
Cellules testiculaires d'agneau trois jours après infection.
Présence d'inclusions intracytoplasmiques.
— 505
Fig. 3.
L'infection cellulaire au 5 jour.
Inclusions cytoplasmiques, vacuolisation du noyau et margination de la chromatine.
e
FiG. 4.
L'infection au 6 jour.
Dégénérescence et nécrose des cellules.
e
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COMPARATIVE STUDY OF THE GROWTH OF TWO VACCINAL STRAINS
OF THE SHEEP POX VIRUS ON LAMB TESTICLE AND KIDNEY CELL CULTURES. PRELIMINARY RESULTS. — M. Fassi-Fehri, M. El Harrak and
F. Bertin.
Summary ; The authors have compared the growth in cell culture of
two vaccinal strains of the sheep pox virus : the Perego strain, of North
African origin, in lamb testicle cells, and the RM65 strain, of Yugoslavian origin, in lamb kidney cells.
The cytopathogenic effect and titres obtained are comparable for
both viruses. The respective advantages and disadvantages of the two
types of cell cultures used are discussed.
*
* *
ESTUDIO COMPARATIVO DEL DESARROLLO DE DOS CEPAS VACUNALES
DEL VIRUS DE LA VIRUELA OVINA EN CÉLULAS TESTICULARES Y RENALES DE CORDERO. RESULTADOS PRELIMINARES. — M. Fassi-Fehri,
M. El Harrak y F. Bertin.
Resumen : Compararon los autores la multiplicación en cultivo celular
de dos cepas vacunales de virus de la viruela ovina : la cepa Perego, de
origen norteafricano, en células de testículo de cordero, y la cepa
RM65, de origen yugoslavo, en células renales de cordero.
Son comparables para ambos virus el efecto citopatogénico y los
títulos obtenidos. Se exponen las ventajas e inconvenientes de ambos
tipos de cultivos celulares.
*
* *
BIBLIOGRAPHIE
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