Evaluation de la sécurité des médicaments

Cycle reproductif chez le rat
spermatogenèse
J0
mâle
J0
+ 6 pc
J0+
J0+ 21 pc
15/17 pc
J0+
21 pp
femelle
ovogenèse
implantation
accouplement
embryogenèse
Mise bas
Fin organogenèse
F0
pc = post coitum
pc = post partum
F1
femelle
sevrage
néonatalité
foetogenèse
mâle
maturation
sexuelle
F2
Segment 1:
Fertilité et capacité globale de reproduction
rat
spermatogenèse
♂
Mâle J0–15/30 pc
Femelle J0–15 pc
ovogenèse
♀
J0
J0
+ 6 pc
implantation
accouplement
J0+ J0+
13pc 15pc
sacrifice
mâles
- spermatozoïdes
= traitement - testicules
pc = post coitum
pc = post partum
femelles
- ovaires: corps jaunes
- utérus: points implantations
- petits morts et vivants
Segment 2:
tératogenèse – embryo et foetotoxicité
chez le rat
spermatogenèse
mâle
J0
J0
+ 6 pc
J0+
J0+ 21 pc
15/17 pc
femelle
implantation
ovogenèse
accouplement
= traitement
pc = post coitum
pc = post partum
Fin
organogenèse
Sacrifice
JO + 20 pc
Femelles
•évolution pondérales
•ovaires: corps jaunes
•utérus: points implantations
Fœtus
•petits morts et vivants
•Malformations des tissus mous (coupes de Wilson)
•Malformations squelettiques (KOH+ rouge alizarine S)
Segment 2:
tératogenèse – embryo et foetotoxicité
chez le lapin
spermatogenèse
mâle
J0
J0
+ 6 pc
J0+
J0+
30 pc
18 pc
femelle
implantation
ovogenèse
accouplement
= traitement
pc = post coitum
pc = post partum
Fin
organogenèse
Sacrifice
JO + 29 pc
Femelles
•évolution pondérales
•ovaires: corps jaunes
•utérus: points implantations
Fœtus
•petits morts et vivants
•Malformations des tissus mous (coupes de Wilson)
•Malformations squelettiques (KOH+ rouge alizarine S)
Segment 3:
Toxicité péri et post-natale
chez le rat
spermatogenèse
mâle
J0
J0
+ 6 pc
J0+
J0+ 21 pc
15/17 pc
J0+
21 pp
femelle
implantation
ovogenèse
accouplement
Mise bas
- Conditions
- Durée gestation
- Nombre de petits
vivants et morts
= traitement
pc = post coitum
pc = post partum
Mise bas
Fin organogenèse
mâle
femelle
sevrage
1 mâles + 1 femelle
par portée
Accouplement à
>J0+80pp
- survie des petits
- évolution
- comportement
-Autopsie J21pp sauf
1 M+ 1F / portée
4.3 Toxicité vis à vis des fonctions
de reproduction
• Méthodes de substitution
– Culture de cellules embryonnaires
– Culture de membres
– Culture d’embryons
4.4.TESTS DE MUTAGENESE
4.4.1 Mécanismes
Mutations géniques
o Substitution de paires de bases
o
Mutations frameshift (décalage du
cadre de lecture du code génétique)
Mutations chromosomiques
o
De structure
o
De nombres : génomique
Altérations primaires de l’ADN
Métabolite
inactif
métabolisme
Promutagène
Mutagène direte
métabolisme
Mutagène ultime
Dérivé electrophile
Mort
cellulaire
Inhibiteur
réparation
ADN
Adduits ADN
Division
cellulaire
Réparation ADN
ADN
normal
Inhibition du fuseau mitotique
Anomalies centromères,
Centrioles, kinétochore
MUTATIONS
GENOMIQUES
MUTATIONS
MUTATIONS GENIQUES
Substitution de
Paires de bases
A-G-C
T-C-G
A-T-C
T-A-G
Frameshift
A-G-C-A-C-G
T-C-G-T-G-C
A-G-C-T-A-C-G
T-C-G-A-T-G-C
MUTATIONS
CHROMOSOMIQUES
anomalies de structure
CLASTOGENES
anomalies de nombre
ANEUGENES
4.4.2 Méthodes d’étude
4.4.2.1. Tests de mutations géniques
a. Tests sur bactéries : test d’Ames
Souches de Salmonella typhimurium mutantes
souches histidine dépendantes
Souche mutante → Souche sauvage
→
his -
his
+
exemple
G
C
→
A
T
5 souches
- mutations frameshift (2)
- substitution de paires de bases (3)
Test d’Ames
souche
Produit
à étudier
solution
Culture 10-12 h 37°C
Sous agitation
S9 mix
Gélose molle de surface
Pauvre en histidine
Comptage des
Colonies his+
Étalement sur gélose
nutritive de fond
Étuve à 37°C
48 à 72 h
Milieu de culture sans histidine
Mutagène = pousse de colonies
Non mutagène = pas de pousse de colonies
Test d’Ames
• Produit mutagène
– Augmentation par rapport au témoin
– Relation dose – effet
– reproductibilité
4.4.2 Méthodes d’étude
4.4.2.1. Tests de mutations géniques
b. Tests de mutations géniques sur
cultures de cellules
Cellules de lymphome de souris L5178Y
Thymidine Kinase +/-
TriFluoroThymidine
sensible
mutagène
mutagène
ThymidineKinase -/-
TriFluoroThymidine
résistante
Cellules de lymphome
+
de souris L5178Y
Produit
mutagène
incubation
+TriFluoro
Thymidine
survivants
mutants = fréquence de
survivants
mutations
mutants
fréquence
de mutations
dose
4.4.2 Méthodes d’étude
4.4.2.2. Tests de mutations chromosomiques
a) Test d’analyse de métaphases ou
cytogénétiques
In vitro : sur cultures cellulaires
In vivo : moelle osseuse (rat ou souris)
4.4.2 Méthodes d’étude
4.4.2.2. Tests de mutations
chromosomiques
b) Test du micronucleus
Corps de Howell-Joly dans la moelle
osseuse (rat ou souris)
Corps de Howell-joly
4.4.2 Méthodes d’étude
4.4.2.3 Test d’altération primaire de l’ADN
a)Test de synthèse non programmée de l’ADN
Cellules en phase G0 de la division cellulaire
Addition de 3H thymidine (3HTh)
Pas de lésion de l’ADN → pas incorporation
3HThymidine dans ADN
Lésions de l’ADN → incorporation 3HThymidine
dans ADN
4.4.2 Méthodes d’étude
4.4.2.3 Test d’altération primaire de l’ADN
b)Test des comètes
Technique d’électrophorèse très sensible
qui permet la détection de cassures de l’ADN
ADN non fragmenté
lyse
déroulement
de l'ADN
pas de migration
de l'ADN non
fragmenté
Cellule individualisée
ADN fragmenté
lyse
Electrophorèse
déroulement
de l'ADN
Electrophorèse
Cellule individualisée
migration des fragments d'ADN
Noyau non
endommagé
Noyau endommagé
Noyau légèrement
endommagé
Noyau fortement
endommagé
4.4.3 réglementation
Au moins 3 tests:
cas général:
- test de mutations géniques sur bactéries
test d’Ames
- test d’altération chromosomiques in vitro
test du lymphome de souris MLA/TK
ou
test d’aberrations chromosomiques in vitro
- test d’altération chromosomiques in vivo
test du micronucleus moelle osseuse rongeur
ou
test d’aberrations chromosomiques in vivo
Tests complémentaires
-test positif ou douteux dans la batterie de base
-Produit cancérogène
-Structure à risque
4.5 Détermination du potentiel cancérogène
4.5.1 Définition
Produit qui augmente la fréquence
et/ou diminue la période de latence
d’apparition des tumeurs cancéreuses
4.5.2 Mécanisme / classification
Expériences de cancérogenèse cutanée chez le lapin par
Berenblum
Goudrons de houille
Huile de croton
Fréquence
des tumeurs
++
v v
0
v v
+++
v v v v v v v v v v v v v v v v v v
+
+/-
v v
Conclusions:
La cancérogenèse se réalise en au moins 2 étapes
Initiation puis promotion
L’étape d’initiation est irréversible
+++
4.5.3 Origine de la cancérogenèse
Mutagènes ⇒ cancérogènes
génotoxiques = initiateurs
Non Mutagènes ⇒ cancérogènes
épigénétiques = promoteurs
4.5.4 Méthodes d’études
4.5.4.1 Études long terme chez le rongeur
principes:
- cancer = événement rare et alléatoire
nombre élevé d’animaux
- délai entre exposition et apparition des tumeurs
traitement pendant toute la vie
- peut atteindre n’importe quel organe
examen de tous les organes
4.5.4 Méthodes d’études
4.5.4.1 Études long terme chez le rongeur
2 ans chez le rongeur
rat + souris
- évolution pondérale/ consommation nourriture
- mortalité/ apparition de tumeurs palpables
- examens anatomo-pathologiques
4.5.4 Méthodes d’études
4.5.4.1 Études à court et moyen terme
Souris transgéniques
p 53 +/-, (KO)
Hras 2,
XPA -/-, (KO)
Transformation cellulaire
SHE: syrian hamster embryo
Études de mutagenèse
4.6 Tolérance locale
4.6.1 Définition
4.6.2 Méthodes d’études animales
4.6.2.1 Peau
Réaction immédiate
Irritation primaire
Application réitérée
Lapin
albinos
Allergie de contact
test cobaye : Magnusson Kligman
test souris : test de prolifération des lymphocyte
ganglion proximal
Phototoxicité
Photoallergie
4.6.2.2
Œil
Irritation primaire
Application réitérée
cobaye
albinos
Lapin
albinos
4.6 Tolérance locale
4.6.2.3 Veines
Tolérance veineuse
Tolérance péri veineuse, intraartérielle, sous cutanée,
intramusculaire
4.6.2.4 Poumons
Etudes par inhalation
4.6 Tolérance locale
• Méthodes de substitution
– Peau
• Culture de kératinocytes
• Peaux reconstituées
– Œil
• Cornée isolée de bœuf
• Œuf embryonné
5. Autres études
5.1 Etudes mécanistiques
5.2 Etudes des impuretés et
des produits de dégradation
6.Coût des études précliniques médicaments
Sécurité
Toxicité aigue
10 000 €
Toxicité subaigue (+toxicocinétique)
2 espèces < 3 mois
250 000 €
2 espèces > 3 mois
450 000 €
Toxicité fonctions de reproduction (+toxicocinétique)
segment 1
150 000 €
segment 2 (2 espèces)
250 000 €
segment 2 (2 espèces)
200 000 €
Mutagenèse
3 tests (2 in vitro + 1 in vivo)
30 000 €
Cancérogenèse(+toxicocinétique)
2 espèces
2 000 000 €
+ études complémentaires, pharmacologie de
sécurité,tolérance locale, études mécanistiques,
écotoxicologie,…
Total : 3 à 4 millions €