tp 4.3 : utilisation du complexe immun dans la detection d

T.P. 4.3 :
UTILISATION DU COMPLEXE IMMUN DANS LA DETECTION D’ANTIGENE
Un lapin présente une forte réaction immunitaire sans qu’il soit en contact avec un microbe susceptible de lui déclencher
cette réaction. On s’oriente alors vers une réaction de type allergique.
On cherche à identifier l’antigène présent chez un lapin ayant déclenché cette réaction allergique.
Déroulement du TP
Les complexes immuns peuvent être mis en évidence par la méthode d’Ouchterlony
Principe , Matériel
Le sérum du lapin (= S) contient des anticorps dirigés contre un antigène inconnu recherché.
4 antigènes sont testés : pancréatine, caséine, hémoglobine, albumine de bœuf ;
1 témoin négatif : l’eau distillée.
Protocole du test
Résultat du test
L’IDENTIFICATION DE L’ANTIGENE DU LAPIN S’EXPRIME PAR :
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un schéma du résultat visible dans la boîte de pétri.
un schéma d’interprétation moléculaire de l’arc de précipitation entre les puits S et B
en comparaison avec un schéma d’interprétation des molécules en absence d’arc entre les puits S et C
un texte court identifiant l’antigène présent dans le lapin et la justification de ce choix.
Modèles de schéma
PRINCIPE DE L'IMMUNODIFFUSION
suivi du TP
Les anticorps et les antigènes possèdent la propriété de diffuser dans la gélose : Il suffit de percer des puits dans une
gélose, d'y déposer les substances à tester pour que les substances se rencontrent.
S'il s'avère qu'un sérum contient des anticorps spécifiques d'un des antigènes, il y aura formation, entre les deux puits,
d'un précipité en forme d'arc correspondant au complexe immun.
Ce test permet de vérifier la spécificité d'un anticorps.
MATERIEL nécessaire (précipitation de l'antigène BSA = Sérum Albumine Bovine)
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sérum de lapin normal (N)
sérum de lapin (P) ayant reçu des injections d'albumine de bœuf
Albumine de sérum de bœuf en solution
Albumine de blanc d'œuf en solution (O)
Caséine (C)
Autre protéine (P)
Emporte-pièce de 4 mm de diamètre ; 2 Boites de Pétri, gélose, Pipettes Pasteur ; Etuve.
suivi TP
PROTOCOLE TECHNIQUE OUCHTERLONY
1.
2.
suivi du TP
Couler la gélose dans les boîtes de pétri :
 Peser dans la coupelle 0,2g d’Agar prélevés à l’aide de la spatule.
 Verser 14 ml de tampon puis l’Agar dans le bécher et dissoudre soigneusement l’Agar avec la spatule.
 Chauffer le mélange en remuant jusqu’à ce que le mélange soit limpide et arrêter au tout début de l’ébullition.
 Retirer le bécher à l’aide de la pince en bois et attendre 1 minute pour manipuler le bécher sans se brûler.
 Verser 5 ml de gel d’Agar chaud et fluide dans une boîte de Pétri.
 Egaliser le niveau ; supprimer rapidement les bulles, sans remuer les boîtes avant prise du gel d’Agar, ≈ 5 min.
Creuser les puits dans la gélose :
Après refroidissement ; percer des trous régulièrement espacés.
Gabarit de perçage
Boîte prête à l'emploi
Utiliser le gabarit pour répartir les puits ; les 5 trous se répartissent à 1 cm du trou central centre à centre.
S’exercer à creuser un ou deux puits sur la périphérie de la boite. Attention à ne pas fendre la gélose.
Utiliser la pince pour éliminer les disques de gélose si nécessaire
3.
Repérer la position des puits.
DISPOSITION DES PRODUITS DANS LES PUITS
Il faut marquer le nom des dépôts dans les puits :
PANCREATINE ; CASEINE ; HEMOGLOBINE ; ALBUMINE DE BŒUF ; EAU DISTILLEE
 Soit écrire sur le couvercle et faire un repère sur les deux boites au cas où le couvercle tournerait.
 Soit écrire sous le fond de la boite avant de remplir les puits
4.
Déposer les produits :
Déposer 1 goutte par produit en utilisant un compte goutte spécifique.
Dans le puits central déposer le sérum S à tester.
Dans les puits périphériques, déposer le témoin et les protéines antigéniques :
PANCREATINE ; CASEINE ; HEMOGLOBINE ; ALBUMINE DE BŒUF ; EAU DISTILLEE
Dépôt à la pipette
Déposer la goutte sans bulles, sans endommager la gélose, sans déborder ni éclabousser et remplir suffisamment.
Il est conseillé de s'exercer avant dans le puits d’essai en utilisant de l’eau distillée.
5.
Laisser migrer : La boite est placée à l'étuve pendant 24 heures.
La vitesse de migration dans la gélose dépend de la température, de la concentration des substances.
6.
Observer les résultats fournis.
RESULTATS OUCHTERLONY
suivi du TP
RESULTATS SUR FOND NOIR ET ÉCLAIRAGE RASANT
MODELES AC / AG
suivi du TP
MODELES D’ANTIGENES :
MODELES D’ANTICORPS :