Développement de TEQ HAP (Toxicité équivalente - GIP Seine-Aval

Transcription

Etat d’avancement des travaux du programme coordonnée
de recherche sur l’estuaire de Seine (Thème I)
Avril 2002
Développement de TEQ HAP (Toxicité équivalente des HAP)
chez la moule et étude de la toxicité de l'eau de Seine
J. Faucet, F.Quiniou, M. Maurice, , X. Caisey, T. Burgeot
Ifremer Laboratoire d’écotoxicologie,
BP 21105, 44311 Nantes et BP 70, 29280 Plouzané
Préambule :
Cette étude se déroule sur deux années, une note à ce sujet ayant été envoyée en début de
proposition de projet. Un rapport sera donc produit pour cette partie du projet début 2003. A la place,
une fiche est adjointe pour présenter l’état d’avancement.
Introduction générale
Ce projet réuni deux approches écotoxicologiques visant a évaluer la toxicité potentielle de
contaminants chimiques présents dans l’eau de l’estuaire et la Baie de Seine. L’objectif est de proposer
deux outils méthodologiques complémentaires pour une estimation du risque chimique.
La première approche propose d’évaluer la toxicité des HAP présents dans l’eau sur le modèle moule.
La recherche de facteurs de toxicité (TEF) des HAP réalisée en condition contrôlée, permet ensuite
l’estimation d’une toxicité équivalente (TEQ) à partir des concentrations d’HAP mesurées dans le
milieu naturel.
La seconde approche s’appuie sur la réalisation d’un bio-essai sur le développement embryonnaire de
bivalve . Deux espèces peuvent être employées : la moule ou l’huître creuse (Mytilus edulis ou
Crassostrea gigas). Ce bio-essai permet d’évaluer la sensibilité des embryons de bivalves à la toxicité
potentielle d’une contamination diffuse de l’eau.
1. Introduction
L’étude proposée s’intéresse à l’évaluation des effets des contaminants chimiques sur
l’environnement en estuaire en appliquant des TEQ moule. L’objectif est (1) de répondre à la question
posée sur la validité des biomarqueurs pour diagnostiquer les risques des contaminants chimiques en
système estuarien avec priorité accordée aux HAP et (2) tester la validité et la signification des
équivalents toxiques en milieu estuarien à partir du couple d’espèces cibles : moule et dreissène.
Le concept de toxicité équivalente ou TEQ a été développé chez les mammifères et les
poissons, pour estimer la potentialité toxique d’un mélange de composés chimiques appartenant à la
même classe de contaminants (les hydrocarbures aromatiques polycycliques). Le TEQ consiste à
exprimer la toxicité potentielle de chaque congénère par comparaison avec le congénère considéré
comme le plus toxique. Tout d’abord, un facteur de toxicité spécifique (TEF) à chaque congénère est
établi par rapport au congénère le plus toxique. Ce TEF est fixé sur la base de tests de toxicité aiguë du
type CL50 et une série de mesures biologiques (biomarqueurs) intégrant pour les plus courantes des
réponses d’immunotoxicités, des altérations tissulaires ou l’analyse d’activités enzymatiques
(ethoxyrésorufine-O-déethylase ; EROD) sur des cellules en culture. Le calcul de TEF chez les
poissons est réalisé majoritairement à partir de la mesure de l’activité EROD dépendante du
cytochrome P450 (Clemons et Van den Heuvel, 1994 ; McDonald et al., 1995). La concentration
chimique dans le milieu de chaque congénère analysé est ensuite multipliée par son TEF spécifique.
La somme des différents produits (TEF x concentration chimique) obtenus pour chaque congénère
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aboutie à un TEQ caractéristique du potentiel toxique d’une même classe de contaminants. Les TEQ
figurent ainsi aujourd’hui parmi les indicateurs les plus utilisés pour l’évaluation du risque chimique
en santé humaine. Les TEQ sont cependant inadaptés à des études environnementales chez des
mollusques. La démarche recommandée pour l’étude de la faisabilité et le développement de TEQ
mollusque repose sur une combinaison d’approches toxicologiques (toxicité mesurée sur des primocultures cellulaires, relation doses effets) et écotoxicologiques (exposition en laboratoire et validation
sur le terrain) (Ahlborg et al., 1994).
1.1 Objectif général de l’étude
L’objectif de l’étude est de sélectionner les biomarqueurs utiles à la détermination de TEF puis
au calcul de TEQ HAP moule. Pour cela différents biomarqueurs seront testés sur deux modèles
biologiques (modèles cellulaires et organes) exposés à des concentrations d’HAP comparables à celles
observées dans l’estuaire de la Seine. Deux types de biomarqueurs seront étudiés pour la recherche de
TEF HAP. Des biomarqueurs spécifiques d’altérations fonctionnelles (variations d’activités
enzymatiques) et des biomarqueurs d’altérations de structures (dommages à l’ADN) seront testés. A
partir des biomarqueurs les plus pertinents, des TEF HAP seront déterminés en milieu contrôlé à partir
d’effets mesurés pour certaines molécules d’HAP sélectionnées suivant leur toxicité potentielle et leur
poids moléculaire. Les biomarqueurs seront mesurés sur les tissus de moules exposées en aquarium et
des primo cultures cellulaires. La culture cellulaire offre plus de souplesse pour le screening de
diverses molécules toxiques et les individus exposés reflètent de manière plus réaliste la réponse d’un
organismes dans son milieu naturel. L’originalité de cette approche consistera à (1) comparer les
résultats obtenus in vivo sur des moules exposées en aquarium et in vitro sur les primo cultures et (2) à
valider les TEF HAP moule développés en milieu contrôlé par des mesures de biomarqueurs in situ sur
des stations RNO de la Baie et l’estuaire de Seine.
1.2 Rappel des objectifs fixés pour l’année 2001
– Travaux en laboratoire
- Développement d’un modèle de culture cellulaire de moules pour l’élaboration de
TEF HAP : sélection des types cellulaires utilisables, et mise au point des primo
cultures.
- Sélection de tests de toxicité (Rouge neutre, viabilité, MTT) et de biomarqueurs
d’altérations
fonctionnelles :
benzopyrène
hydroxylase
(BPH),
acéthylcholinestérase (ACHE), résistance aux xénobiotiques (MXR), stabilité
lysosomale, adduits à l’ADN, immunocompétences, protéines de stress (Heat
Shock Proteines) mécanismes de défenses. Mesure sur des primo cultures
- Collecte de moules en estuaire de Seine sur des stations RNO pour valider les TEF
HAP à partir d’un suivi mensuel des variations saisonnières des biomarqueurs.
2. Mise au point des modèles cellulaires : modèle in vitro
Les cultures cellulaires présentent l’intérêt de pouvoir travailler sur des microvolumes,
réduisant le coût d’utilisation de standards chimiques et leur toxicité pour les utilisateurs. L’utilisation
de microplaques offre l’avantage d’effectuer aisément des études quantitatives et reproductibles.La
culture cellulaire de mollusque reste cependant délicate. A ce jour, aucune culture cellulaire
reproductible n’est disponible (Mulcahy, 2000). Les cultures de mollusques offrent un potentiel
important pour la compréhension des effets toxicologiques des xénobiotiques sur l’environnement.
Selon Sheehan (2000), un certain nombre de biomarqueurs de cytotoxicité et de génotoxicité seront
applicables sur des cultures in vitro d’invertébrés. Déjà dans le passé, la mise en place de cultures
cellulaires de mammifères avait accéléré le développement de l’écotoxicologie et de la mesure de
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risques pour la santé humaine en multipliant les possibilités d’études. Le développement de cultures
cellulaires de mollusques a également pour objectif de tester la toxicité d’un grands nombre de
molécules isolées ou en mélanges à partir de volume restreints.
2.1 Sélection des types cellulaires
La priorité a été donnée à la sélection des types cellulaires utilisables comme modèle. Cette
première étape a nécessité l’optimisation des protocoles de lavage des tissus, de dissociation et de mise
en culture des cellules (Annexes, Tab 1, 2, 3). Ce travail s’inspire directement de l’étude de D. Sud et
al.1998 sur les branchies de coques (Rapport Seine Aval, 1998) et de l’étude de Birmelin et al. 1999
sur les glandes digestives de moules. Notre étude a permis de sélectionner les cellules de branchies et
de glandes digestives comme modèle cellulaire les plus adaptés au développement de TEF.
2.2 Mise en culture et suivi de la viabilité par le test MTT
Après le lavage des tissus et la dissociation cellulaire, la viabilité des cellules mesurée par le
test Eosine Y est estimée à 95% permettant d’envisager la mise en culture. Les cellules sont mises en
culture dans des plaques de 96 puits, dans du milieu L15 modifié (Leibovitcz), à 18°C sous air. Les
densités d’ensemencement varient de 0,1 à 2 105 cellules par puit pour les cellules de glandes
digestives et de 0,1 à 5 105 cellules par puit pour les cellules de branchies.
Le test de réduction du MTT a été mis au point afin de suivre l’évolution à court terme de la
viabilité des cellules en culture. Ce test basé sur la mesure d’une réaction colorimétrique permet de
déterminer l’activité des cellules vivantes via la mesure de l’activité des déshydrogénases
mitochondriales. La figure 1 illustre la validité du test MTT pour les primo-cultures de cellules de
glande digestive et de branchie. La DO mesurée (correspondant à la réponse MTT) est directement
proportionnel au nombre de cellules viables par puit et montre une bonne corrélation (y = 0.054 x, R2
= 0,9422 ; y = 0.016 x, R2 = 0.9776). Cette corrélation se retrouve pour tous les réplicats et quelque
soit le temps d’incubation des cellules.
Les primo-cultures de branchies sont maintenues 10 jours et celles de glandes digestives 5
jours. Toutefois la contamination bactérienne apparaît au bout de quelques jours dans les deux types
de cultures et ceci malgré l’utilisation d’antibiotiques (Annexes, Tab 4 ,5).
y = 0.0542x
R 2 = 0.9422
y = 0.0161x
R 2 = 0.9776
0.14
0.12
DO 570-630 nm
DO 570-630 nm
0.16
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0
1
2
3
0
10 5 cellules viables /puit
a)
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
2
4
6
105 cellules viables /puit
b)
Figure 1. Validité du test MTT. 14 heures après la mise en culture des cellules de glandes digestives
(a) et des cellules de branchies (b), l’absorbance (DO 570-630 nm) est mesurée en fonction de la
densité cellulaire d’ensemencement. Les densités d’ensemencement varient de 0,1 à 2 105 cellules par
puit pour les cellules de glandes digestives (a) et de 0,1 à 5 105 cellules par puit pour les cellules de
branchies (b).
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3. Modèle in vivo
Des expositions en aquarium ont été réalisées dans le but de tester des biomarqueurs
d’altérations fonctionnelles à partir de moules exposées à un HAP modèle le Benzo(a)pyrène et sur la
base des travaux menés par une équipe anglaise (Birmelin et al., 1999).
3.1 Exposition en aquarium au Benzo(a)pyrène
Dans des aquariums de 30 litres à 16°C, 40 moules de 35 à 45 mm sont exposées durant 15
jours à différentes concentrations en Benzo(a)pyrène. Le Benzo(a)pyrène est dissous préalablement
dans du DMSO (concentration finale en DMSO égale à 0.05%). Les expositions sont réalisées à 6
concentrations différentes (10-2 nM, 10-1 nM, 1 nM, 10 nM, 102 nM, 103 nM) et 2 aquariums servent
de témoins (T0 = sans ajout de B(a)P et T1= en présence de 0.05% de DMSO). L’eau des aquariums
est changée chaque jour et les moules sont nourries de façon continue pendant 8 heures grâce à une
pompe péristaltique. L’exposition au Benzo(a)pyrène intervient après la remise en eau des aquariums.
A chaque prélèvement, 7 individus par concentration sont disséquées. Les glandes digestives, les
branchies et l’hémolymphe sont stockés en vue de la mesure des différents biomarqueurs. Les
prélèvements interviennent au bout de 3, 8 et 15 jours d’exposition. Les conditions de maintien en
aquarium ont conduit à une faible mortalité (<2%) et une faible perte de poids quelque soit les
concentrations en B(a)P.
3.2 Résultats
Nous avons mesurer sur les glandes digestives la modulation de l’activité de la benzo(a)pyrène
hydroxylase. Cette activité associée au cytochrome P450 a été mesurée en tant qu’indicateur des
activités de biotransformation des HAP. Le dosage de l’activité benzo(a)pyrène hydroxylase est réalisé
en microplaque (adapté par Burgeot d’après Michel et al., 1993) de façon individuelle et pour 7
individus par concentration. Les premiers résultats (Fig 2) montrent des écarts types élevés illustrant
une importante variabilité inter-individus. Quelque soit le temps d’exposition (0 jour (a), 3 jours (b), 8
jours (c), 15 jours (d)), il semble impossible de mettre en évidence un quelconque effet du BaP sur
l’activité de la benzo(a)pyrène hydroxylase à cause de la grande variabilité des réponses mesurées.
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80
70
70
60
50
40
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20
activité nmol/mn/mg
80
60
50
40
30
20
10
10
0
a)
0
10 2 1 0 3
T0 T1 10 - 2 10 - 1 1 10
concentration en B(a)P (nM)
b)
10 2 1 0 3
60
40
20
80
80
60
40
20
0
T0 T1 10 - 2 1 0 - 1 1 10
c)
0
0 2 10 3
T0 T1 10 - 2 10 - 1 1 10
T0 T1 10 - 2 10 - 1 1 1 0
d)
10 2 1 03
Figure 2. Dosage de l’activité de la benzo(a)pyrène hydroxylase en fonction de la concentration en
benzo(a)pyrène (10-2 nM, 10-1 nM, 1 nM, 10 nM, 102 nM, 103 Nm). 2 aquariums servent de témoins
(T0 = sans ajout de B(a)P et T1= en présence de 0.05% de DMSO). Les dosages de l’activités sont
réalisés avant exposition (a), au bout de 3 jours (b), 8 jours (c) et 15 jours (d) d’exposition
L’activité de l’acétylcholinestérase (AChE) a été dosée sur les branchies comme biomarqueurs
de neurotoxicité (Fig 3). Tout comme pour l’activité de la benzo(a)pyrène hydroxylase, les premiers
résultats montrent une importante variabilité inter-individus qui ne permet pas de mettre en évidence
une inhibition significative de l’AChE dans les conditions de l’expérimentation.
L’hémolymphe prélevé a permis de mesurer la variation des réponses d’immunotoxicité en
fonction de la concentration en BaP. Les premiers résultats concernant l’activité phagocytaire sont en
cours. Ces travaux sont réalisés en collaboration avec M. Auffret et N. Mujdzic du LEMAR de
l’Université de Brest.
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60
40
20
a)
80
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40
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0
0
T 0 T 1 1 0-2 1 0 -1 1 1 0 1 0 2 1 0 3
b)
100
80
60
40
20
120
120
100
80
60
40
20
0
T0 T1 10 -2 1 0 -1
c)
0
T 0 T 1 1 0-2 1 0 -1 1 1 0 1 0 2 1 0 3
1 1 0 1 02 1 03
T 0 T 1 1 0-2 1 0 -1 1 1 0 1 0 2 1 0 3
100
80
120
100
d)
Figure 3. Dosage de l’activité de l’acétylcholinestérase (AChE) (d’après Galgani et Bocquéné, 1998)
en fonction de la concentration en benzo(a)pyrène (10-2 nM, 10-1 nM, 1 nM, 10 nM, 102 nM, 103 Nm).
2 aquariums servent de témoins (T0 = sans ajout de B(a)P et T1= en présence de 0.05% de DMSO).
Les dosages de l’activités sont réalisés avant exposition (a), au bout de 3 jours (b), 8 jours (c) et 15
jours (d) d’exposition
Nous nous sommes également intéressés à l’induction du phénotype MXR par le B(a)P. Les
MXR (Multi Xenobiotics Resistance) sont des protéines transmembranaires participant à l’excrétion
des xénobiotiques. L’induction du système MXR a déjà été mis en évidence dans les branchies de
moules (M. galloprovincialis) transférées à partir de milieux non contaminés dans des milieux pollués
(Kurelec, 1995a). Cette étude est menée en collaboration avec le Laboratoire d’EcotoxicologieMilieux Aquatiques (Université du Havre) et les analyses sont en cours.
4. Validation in situ : prélèvements en estuaire de Seine
La démarche écotoxicologique menée sur le terrain a pour objectif de valider des facteurs de
toxicité (TEF) des HAP développés en milieu contrôlé chez la moule. Cinq sites en baie de Seine ont
été sélectionnés et des nasses ont été mises en place dans le port d’Antifer. Ces sites sont également
suivis dans le cadre du Réseau National d’Observation et des profils de contamination par les HAP
sont réalisés tout le long de l’année. Le site de Pirou a été retenu pour son faible niveau de
contamination, Villerville est la station représentative de la contamination diffuse de l’estuaire de
Seine, Vaucotte et Port en Bessin sont des stations plus éloignées de l’estuaire avec des profils de
contaminations différents de l’estuaire et Antifer est une station au profil caractéristique d’une
contamination par les HAP.
Des prélèvements mensuels réalisés depuis le mois de décembre 2001 permettront la mesure
in situ des mêmes biomarqueurs que ceux mesurés in vivo en aquarium et in vitro sur des primo
cultures cellulaires. La finalité de cette étude sera de valider in situ les facteurs de toxicité (TEF)
spécifiques à la moule développés en milieu contrôlé et utiles à l’évaluation du risque chimique en
milieu côtier.
Ce travail est conduit en étroite relation avec l’équipe DEL/EC Ifremer sur les mêmes stations.
L’objectif est de combiner le modèle de bioaccumulation moule avec l’étude des TEQ HAP moule. La
combinaison de ces deux approches devrait permettre d’intégrer des données d’effets biologiques dans
le modèle de bioaccumulation d’une part et d’autre part favoriser une interprétation des TEQ à partir
des HAP dans les tissus et l’eau grâce au modèle de bioaccumulation.
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5. Conclusion et perspectives
Les travaux réalisés à ce jour sur les modèles in vitro permettent de réaliser des expositions
aux HAP de cultures cellulaires de glande digestives et de branchies. Toutefois, les difficultés
rencontrées pour maintenir des cultures viables et non contaminées nous contraignent à réaliser des
expositions de courte durée (2 à 3 jours).
Les premiers résultats obtenus lors de l’exposition en aquarium montrent que des analyses
individuelles des biomarqueurs d’altérations fonctionnelles comme l’activité de l’acétylcholinestérase
(AChE) et de l’activité de la benzo(a)pyrène hydroxylase ne permettent pas de mettre en évidence un
effet du B(a)P à cause de fortes variabilités inter-individuelles. Ces résultats se heurtent à un problème
de méthodologie. Le calcul de TEF HAP nous contraint à travailler avec plusieurs concentrations en
B(a)P (6 concentrations et 2 témoins) afin d’obtenir des courbes doses réponses. Un tel protocole
multiplie le nombre de moules à exposer et le nombre d’analyses. Pour diminuer le nombre de moules
exposées nous travaillons sur un nombre plus réduit d’individus par concentrations (7 moules) et nous
effectuons des analyses individuelles. La variabilité des réponses entre individus masquent alors toutes
variations d’activités en fonction de la dose en polluant. Les deux biomarqueurs d’altérations
fonctionnelles (BPH et AChE) sont donc pour l’instant écartés pour le développement de TEF HAP
chez la moule. Deux autres biomarqueurs d’activité fonctionnelle, les MXR et la phagocytose, sont
actuellement en cours d’exploitation. Dans le cas d’un résultat similaire aux biomarqueurs BPH et
AChE, nous changerons de méthodologie et remplacerons les biomarqueurs fonctionnelles par des
biomarqueurs d’altération de structure. Nous réaliserons les expositions en aquarium sur des pools
d’individus afin de lisser les variations inter-individuelles afin de minimiser les écarts entre individus
et tenter de mettre en évidence un effet des HAP sur les biomarqueurs mesurés. Parmi les 16 HAP
couramment mesurés dans le milieu, nous ciblerons notre effort sur quelques molécules caractérisées
par différents poids moléculaires.
Les études à venir seront surtout axées sur la mesure des biomarqueurs d’altérations de
structure (ADN) comme le test comet et les adduits à l’ADN, à partir sur les modèles in vitro et in
vivo. Ce type de biomarqueurs a déjà était mesuré sur des moules exposées au B(a)P (Akcha et al.,
2000) et sur des cellules isolées de glandes digestives (Birmelin et al.,1998) ou de branchies (Wilson
et al., 1998). La mesure de ces biomarqueurs sur des primo cultures ne nécessite qu’un nombre limité
de cellules (106 cellules par analyse pour le comet assay), alors que la mesure de biomarqueurs
d’altérations fonctionnelles (AChE, benzo(a)pyrène hydroxylase) nécessite des concentrations en
protéines importantes, parfois difficiles à obtenir avec des cellules en cultures. D’autre part, la
variabilité des réponses semble plus réduite pour les altérations de structures en comparaison des
altérations fonctionnelles soumises à un renouvellement plus rapide des protéines.
La validation des TEF labo sur le terrain sera menée de concert avec l’équipe Ifremer DEL/EC
de Brest dans l’objectif de 1) de valider le modèle bioaccumulation PCB et HAP à partir de données
chimiques de terrain et 2) de combiner les deux modèles TEQ et bioaccumulation chez la moule. Si le
modèle TEQ donne satisfaction sur le terrain, les données de toxicités produites pourraient être
intégrées dans le modèle de bioaccumulation moule. D’autre part le modèle de bioaccumulation PCB
élargi aux HAP, permettrait d’optimiser le modèle TEQ HAP moule grâce à l’estimation des
concentrations dans les tissus et l’eau qu’il peut fournir.
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Toxicité de l'eau de la Seine
J. Faucet, F.Quiniou, M. Maurice, , X. Caisey, T. Burgeot
Ifremer Laboratoire d’écotoxicologie
BP 21105, 44311 Nantes et BP 70, 29280 Plouzané
1. Introduction
Cette étude a pour but d’évaluer la toxicité de l’eau de la Seine prélevée depuis l’amont vers
l’aval à l’aide du bio-essai « développement embryonnaire de bivalve ». Deux espèces peuvent être
employées : la moule ou l’huître creuse (Mytilus edulis ou Crassostrea gigas). Ces bivalves euryhalins
et ayant une répartition géographique très large, sont recommandés de longue date pour la surveillance
du milieu marin (WOELKE, 1972), utilisé pour l’évaluation de la qualité du milieu (QUINIOU et al,
1997, NAUDIN et al, 1995 ; QUINIOU et al., 1999) et ce test est aussi préconisé pour l’évaluation de
la toxicité des rejets de dragages (QUINIOU et ALZIEU, 1999 ; ALZIEU et QUINIOU, 2001).
A cet effet, une série de prélèvements d’eau a été réalisée en juillet 2001, grâce à la cellule
antipollution de la Seine : les 22 stations habituellement suivies ont été testées à l’aide du bio essai
développement embryonnaire de l’huître creuse. En juin 2001 l’eau et les sédiments des trois stations
amont (Poses amont, La Bouille et Caudebec en Caux) ont aussi été échantillonnés et testés.
La finalité de cette première année étant de rechercher l’existence d’un gradient de toxicité
potentielle de l’eau de la Seine qui pourrait être mis en corrélation avec les niveaux de contamination
mesurés lors de la phase 1 du projet.
2. Matériel et méthode
La méthodologie adoptée est inspirée du protocole ASTM (1994) et décrite par QUINIOU et
ALZIEU (1999) et QUINIOU et al (1999)
2.1 Les milieux testés
Le milieu de référence est constitué par une eau de mer synthétique (ZAROOGIAN et al., 1969) dont
le pH et la salinité répondent aux exigences du bio essai (CALABRESSE et DAVIS 1966, DAVIS,
1958).
Les échantillons d’eau ont été testés bruts, à six dilutions (de 1 à 18%) en eau de synthèse de manière
à avoir une salinité de 31 ? 2. Les sédiments ont été homogénéisés manuellement et tamisés sur tamis
nylon de 2 mm de vide de maille puis testés à raison de 0 à 10 g de sédiment humide par litre d’eau de
synthèse de salinité 31 ? 2.L’intervalle entre deux dilutions est de 0,25 unités logarithmiques.
2.2 Le déroulement du bio essai
La ponte des mollusques matures est déclenchée par des chocs thermiques modérés (15 à 28 °C). Dès
leur obtention les gamètes des géniteurs sélectionnés sont mis en contact sous agitation douce afin de
réaliser la fécondation en eau de référence. Les œufs fécondés sont alors rapidement répartis dans les
milieux à tester (20 000 par litre).
Le stade larve "D", atteint en 24 h à 24 °C pour l'huître creuse, détermine la durée du test.
L’arrêt de l’incubation est réalisée par injection de formol neutre à 8% (1,5 ml/100ml).Un test est
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conservé si la taux de développement de larve « D » normales est au moins égal à 80% dans les
témoins.
Les résultats sont exprimés en taux de réussite de développement, déterminé à l’aide d’un microscope
inversé sur des volumes contenant 100 larves, prélevés après homogénéisation douce pour chaque
milieu testé. Le pourcentage de larves « D » normales et anormales est ainsi déterminé pour chaque
concentration testée. Une larve est normale lorsqu’elle a une forme de D régulier contenant la totalité
de l’animal alors qu’elle est anormale si le manteau est hypertrophié et sort des valves, si la coquille
est malformée ou quand le stade larve D n’est pas atteint (développement bloqué au stade embryons).
Chaque milieu a été testé en double (un couple de géniteur pour chaque expérience) et trois
répliquat par expérience : ainsi c’est la moyenne de six comptages qui est retenue. Les résultats sont
exprimés en pourcentage brut (PBA = Pourcentage Brut de larves Anormales)ou net (PNA =
Pourcentage Net de larves Anormales), ce dernier est calculé selon la formule de Abbott
(ANONYME, 1980)
PBA = 100 – larves normales du test
PNA = (PBA essai – PBA Témoin)/(100- PBA témoin))*100
La dose déterminant 50% de larves anormales (CE50) est déterminée graphiquement ou par calcul en
utilisant la méthode des probits.
Le contrôle qualité de chaque série d’essais, est assuré par la réalisation d'un test avec le sulfate cuivre
(CuSO4) : toxique de référence (QUINIOU et al, 1999)
3. Résultats
3.1 Toxicité des eaux de la Seine
Les résultats obtenus (Fig. 1) permettent de détecter une toxicité potentielle à Poses aval dès la
dilution 1,8 % ; puis aux stations Vatteville, Camailleraye, Duclair, pont de l’Arche rive gauche et
Poses aval à la dilution 5,6 %. Les eaux testées à 10 % provoquent plus de 20 % de développement
anormal à Poses amont et aval ainsi qu’au pont de l’Arche (rive gauche) et à Vatteville. Testées à 18
%, les mêmes eaux entraînent plus de 30 % d’anomalies du développement, aux mêmes points plus
Courval en aval de Vatteville. Une corrélation avec les niveaux de contamination et/ou la présence de
rejets, au niveau de ces stations, est à rechercher.
Ces résultats préliminaires montrent que l’eau de la Seine présente une toxicité potentielle non
négligeable, détectable dès la dilution 5,6 %, par le test « développement embryonnaire de bivalve »
permettant de déterminer la présence d’une contamination du milieu. qui peut permettre de suivre une
amélioration et/ou dégradation de la qualité des eaux et des rejets divers dans la Seine.
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Toxicité des eaux de la Seine
sur le développement embryonnaire de Crassostrea gigas
40%
30%
20%
10%
0%
-10%
r
le
el
t
e
al ille ec ye
et
le
x
uf
air
al
en
lle
vil vill
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b
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R
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n
H
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'A
'
Va
Ca
P
l
l
n
es
i
n
s
e
e
a
M
r
s
d
d
G Ba
Pt
Pt
Dilutions testées (% vol/vol)
18
10
5.6
3.2
1.8
1
Fig 1 : Toxicité des eaux de la Seine
3.2 Comparaison eau-sédiment
Le 21 juin, trois prélèvements ont été réalisés : Poses amont, La Bouille et Caudebec.
L’eau et les sédiments ont été prélevés aux trois points permettant ainsi une comparaison eausédiment.
Les résultats ont mis en évidence une toxicité des sédiments alors qu’aucune toxicité n’a été
observée sur les échantillons d’eau testés jusqu’à 18%. (Tab.1)
Tableau1 : Toxicité des eaux et sédiments prélevés en juin 2001
Station
Poses
amont
La Bouille
Caudebec
CE50 eau PNA
eau CE50
%
dilution18% sédiment
G/L
> 18
<1
> 10
20
> 18
> 18
47
38
<1
<1
5,3
8,4
PNA
à 5g hum./L
Conclusion
Ces résultats montrent que le test développement embryonnaire de bivalves est adapté pour
détecter la toxicité de l’eau et des sédiments et que les mesures permettent de hiérarchiser la toxicité
des prélèvements.
Les toxicités observées en juillet, sur les prélèvements d’eau, montrent que l’eau de la Seine
présente une toxicité potentielle non négligeable, détectable dès la dilution 5,6%, permettant de
déterminer la présence d’une contamination du milieu . Cependant, une corrélation avec les niveaux de
contamination et/ou la présence de rejets, est à rechercher.
Les résultats obtenus sur les échantillons de juin, montrent que la qualité des masses d’eau est
fluctuante : le test peut donc permettre de suivre l’évolution de leur qualité ou toxicité. Les résultats
- Page 10 -
Avril 2002
obtenus sur les sédiments permettent d’évaluer leur toxicité potentielle et de la classer selon un
gradient.
En 2002, les sédiments des stations suivies lors de la première phase, pourront être étudiés
(Poses, Oissel, Rouen, La Bouille, Duclair, Le Landin, Caudebec en Caux, Vieux Port, Tancarville et
Honfleur), plus quelques points de l’estuaire ainsi que quelques substances préoccupantes pour
l’environnement.
La réalisation d’essais sur espèces d’eau douce et marines permettra de déterminer des PNEC
et de comparer leurs sensibilités.
Références bibliographiques
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Avril 2002
Annexe I : Développement de TEQ HAP chez la moule
Composition
Concentration finale
Leibovitcz L15
15,08 g/l
NaCl
20 g/l
KCl
3,67 g/l
Hepes
4,765 g/l
Pénicilline
400 UI/ml
Streptomycine
400 µg/ml
Nystatine
50 µg/ml
Gentamycine
50 µg/ml
Tableau 1. Milieu de lavage des branchies. Milieu L15 modifié. pH =7,4,
osmolarité =1100 mOsm.
Composition
NaCl
500 mM
KCl
12,5 mM
Hepes
20 mM
EDTA
5 mM
Gentamycine
0,1 g/l
Tableau 2. Milieu de lavage et de dissociation des glandes digestives
(CMFS). pH =7,3, osmolarité =1100 mOsm.
Composition
NaCl
22,3 g/l
D-glucose
20,8 g/l
Citrate de sodium
8 g/l
EDTA
3,36 g/l
Tableau 3. Milieu de dissociation des branchies. Solution d’Alsever
modifiée. pH =7,2, osmolarité =1100 mOsm.
- Page 13 -
Avril 2002
Composition
Leibovitcz L15
15,08 g/l
NaCl
20 g/l
KCl
3,67 g/l
Hepes
4,765 g/l
Pénicilline
100 UI/ml
Streptomycine
100 µg/ml
Sérum de poulet
1%
Tableau 4. Milieu de culture des cellules de branchies. Milieu L15 modifié.
pH =7,4, osmolarité =1100 mOsm.
Composition
Leibovitcz L15
15,08 g/l
NaCl
20,2 g/l
KCl
0,54 g/l
CaCL2
0,6 g/l
MgSO4
1 g/l
MgCl2
3,9 g/l
Sérum de veau foetal
10%
Gentamycine
0,1 g/l
AntiPPLO
1%
Tableau 5. Milieu de culture des cellules de glande digestives. Milieu L15
modifié. pH =7,4, osmolarité =1100 mOsm.
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Avril 2002
Annexes II : Toxicité de l’eau de Seine
Eaux prélevées en juillet
Série 1
Série 2
% net moyen de larves anormales
% de larves anormales
80%
30%
1
10
100
Concentration testée (% V/V)
-20%
Honfleur
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
Berville
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Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Tancarville
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
Courval
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Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Vatteville
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
Caudebec
- Page 17 -
Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Camaillerage
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
Heurteville
- Page 18 -
Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Mesnil Jumière
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
Duclair
- Page 19 -
Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Val des Leux
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
La Bouille
- Page 20 -
Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Grand Couronne
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
Bassin des Docks
- Page 21 -
Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Croisset
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
Rouen
- Page 22 -
Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Oissel
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
Elboeuf
- Page 23 -
Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Pt de l'Arche riv. G
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
Pt de l'Arche riv. D
- Page 24 -
Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Poses aval
Série 1
Série 2
80%
30%
1
10
100
-20%
Poses amont
Tests sur les prélèvements de juin
- Page 25 -
Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Poses amont (eau)
Série 1
Série 2
100%
50%
0%
1
Concentration testée (g/l sédt brut) 10
Poses amont (sédiment)
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Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
La Bouille (eau)
Série 1
Série 2
100%
50%
0%
1
La Bouille (sédiment)
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Série 1
Série 2
Avril 2002
80%
30%
1
10
100
-20%
Caudebec (eau)
Série 1
Série 2
100%
50%
0%
1
Caudebec (sédiment)
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Développement de TEQ HAP (Toxicité équivalente - GIP Seine-Aval

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