Peste équine

SECTION 2.5.
EQUIDAE
CHAPITRE 2.5.1.
PESTE ÉQUINE
RÉSUMÉ
La peste équine (PE) est une maladie virale infectieuse mais non contagieuse, frappant toutes les
espèces d’équidés, due à un orbivirus de la famille des Reoviridae et caractérisée par une atteinte
des fonctions respiratoire et circulatoire. La PE est transmise par au moins deux espèces de
Culicoides. Neuf sérotypes différents ont été décrits.
Tous les sérotypes de virus de la PE se rencontrent en Afrique de l’Est et du Sud. Seuls les
sérotypes 9 et 4 ont été trouvés en Afrique de l’Ouest d’où ils gagnent parfois les pays
circumméditerranéens. Les exemples d’épizooties survenues hors d’Afrique sont : Le
Moyen-Orient (1959-1963), l’Espagne (sérotype 9, 1966, sérotype 4, 1987-1990), et le Portugal
(sérotype 4, 1989).
Le diagnostic de laboratoire de la PE est fondamental. Bien que les signes cliniques et les lésions
soient très évocateurs, ils peuvent être confondus avec ceux d’autres maladies équines.
En tant que maladie virale, le diagnostic de laboratoire peut reposer sur l’identification du virus
infectieux, de son acide nucléique, des antigènes viraux ou des anticorps spécifiques. Durant ces
dernières années, une grande variété d’épreuves de laboratoire a été adaptée à la détection à la
fois du virus (AHSV, African Horse Sickness Virus) et de ses anticorps spécifiques.
Identification de l’agent pathogène : il est important d’effectuer l’isolement et le sérotypage du
virus chaque fois que des foyers apparaissent hors des régions d’enzootie.
Le virus équipestique peut être isolé du sang prélevé durant la phase fébrile initiale. Pour isoler le
virus, les autres tissus de choix sont représentés par la rate, le poumon et les nœuds lymphatiques,
prélevés lors de l’autopsie. Les préparations peuvent être inoculées en cultures de cellules, telles
que celles de rein de jeune hamster (BHK-21), de singe (MS) ou de rein de singe vert africain
(Vero), et par voie intra-cérébrale au souriceau nouveau-né. Différentes méthodes
immuno-enzymatique (ELISA) ont été mises au point pour la détection rapide d’antigènes viraux
dans la rate et le surnageant de cultures de cellules infectées. L’identification de l’ARN viral a aussi
été réalisée à l’aide de la technique de transcription inverse couplée à une réaction d’amplification
en chaîne par polymérase (RT-PCR). Les virus isolés peuvent être sérotypés par une réaction
sérologique spécifique telle qu’une séroneutralisation virale (SN), par une transcription inverse
couplée à une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) et par séquençage.
Épreuves sérologiques : les chevaux qui survivent à une infection naturelle développent des
anticorps vis-à-vis du sérotype viral infectant, en 8 à 12 jours après l’infection. Ceci peut être
démontré par plusieurs méthodes sérologiques telles que la réaction de fixation du complément,
l’ELISA, l’immuno-empreinte et la SN. Cette dernière est utilisée pour le sérotypage. D’autres
épreuves ont été décrites et proposées comme l’immunodiffusion en gélose et l’inhibition de
l’hémagglutination.
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Chapitre 2.5.1. — Peste équine
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
des vaccins vivants atténués (monovalents et polyvalents) destinés au cheval, mulet et âne, sont à
l’heure actuelle disponibles dans le commerce. Un vaccin inactivé monovalent a été commercialisé
mais n’est plus disponible. De nouveaux vaccins, y compris un vaccin sous-unités, ont été évalués
expérimentalement.
A. INTRODUCTION
La peste équine (PE) (Peste equina africana, African horse sickness [AHS]) est une maladie des équidés non
contagieuse, transmise par des arthropodes, due à un orbivirus (ARN double brin) de la famille des Reoviridae.
Le genre Orbivirus comprend aussi le virus de la fièvre catarrhale ovine et celui de la maladie hémorragique
épizootique qui ont des aspects morphologiques et des propriétés biochimiques voisines alors qu’ils diffèrent par
leurs caractéristiques pathogènes et antigéniques ainsi que par les espèces affectées. La particule virale d’une
taille d’environ 70 nm n’est pas enveloppée. Le génome du virus de la peste équine (AHSV, African Horse
Sickness Virus) est formé de 10 segments double brin d’ARN, qui codent 7 protéines structurales (VP 1-7), la
plupart de celles-ci ayant été séquencées pour les sérotypes viraux 4, 6 et 9 (29, 36, 39), et 4 protéines non
structurales (NS1, NS2, NS3, NS3A) (11, 19). Les protéines VP2 et VP5 forme la partie externe de la capside du
virion, et les protéines VP3 et VP7 constituent les constituants majeurs de la couche interne de la capside. Les
protéines VP1, VP4 et VP6 sont les constituants mineurs de cette couche interne. Les protéines NS3 sont les
secondes protéines virales les plus variables (35) ; les plus variables étant la protéine majeure VP2 de la surface
de la capside. Cette protéine VP2 est aussi responsable des sérotypes viraux et, avec VP5, de l’activité de
neutralisation du virus (26). Neuf sérotypes distincts de virus de la PE ont été identifiés par neutralisation virale,
mais quelques réactions croisées ont été constatées entre les sérotypes 1 et 2, 3 et 7, 5 et 8, ainsi que 6 et 9,
mais aucune réaction croisée avec d’autres orbivirus connus n’a été observée.
La PE demeure enzootique en Afrique sub-saharienne, bien que des poussées occasionnelles aient été
enregistrées en Afrique du Nord (1965, 1989-1990), au Moyen Orient (1959-1961), et en Europe (Espagne, 1966,
1987-1990 et Portugal, 1989).
La maladie présente, à la fois une incidence saisonnière (fin de l’été, automne) et cyclique avec des pics
épizootiques en Afrique du Sud durant les accès de chaleur (1). La mortalité apparaît en rapport avec les
espèces d’équidés affectés et la souche ou le sérotype de virus en cause. Au moins deux vecteurs sont impliqués
sur le terrain : Culicoides imicola et C. bolitinos. Parmi les équidés, le cheval est le plus sensible au virus de la
PE, avec un taux de mortalité de 50 à 90 %, suivi par le mulet, avec un taux de mortalité voisin de 50 %. Dans les
régions d’enzootie africaines ; l’âne est très résistant et ne fait que des infections sub-cliniques. Cependant, en
Europe et dans les pays asiatiques, l’âne se révèle moyennement sensible et la mortalité peut atteindre 10 %.
Les zèbres sont aussi très résistants, n’extériorisent aucun signe clinique excepté de la fièvre, mais ils peuvent
présenter une virémie prolongée (jusqu’à 40 jours) (4).
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Bien que certains signes cliniques et certaines lésions soient très évocateurs, comme par exemple l’œdème de la
fosse temporale souvent présent chez les chevaux atteints de forme subaiguë, ces signes cliniques associés à
des commémoratifs historiques et des informations épidémiologiques peuvent être suffisant pour tenter le
diagnostic. Cependant, d’autres signes et lésions sont moins spécifiques de la PE, et d’autres maladies telles que
l’encéphalose équine, l’anémie infectieuse, la pneumonie à morbilivirus, l’artérite virale équine, la babésiose et le
purpura hémorragique, peuvent être confondues avec une forme ou l’autre de la PE et doivent être écartées.
C’est pourquoi le diagnostic de laboratoire est essentiel pour confirmer le diagnostic clinique.
1.
Les formes cliniques de la PE
Il existe 4 formes cliniques classiques de PE : pulmonaire, cardiaque, cardio-pulmonaire ou mixte, et fébrile pure
(7).
La forme suraiguë ou pulmonaire, qui a une incubation courte (3 à 5 jours), est caractérisée par une dyspnée
sévère et une atteinte respiratoire progressive. Une poussée aiguë fébrile, durant 1 à 2 jours et pouvant atteindre
40 à 41 °C, peut être le seul signe. Le plus souvent elle est suivie par divers degrés de détresse respiratoire – la
fréquence respiratoire peut augmenter à 60 ou même 75 respirations/min. Le sujet se tient immobile, les
antérieurs écartés, la tête tendue sur l’encolure, les naseaux dilatés. Un jetage abondant est fréquent et une toux
spasmodique peut être notée en phase terminale avec un jetage mousseux obstruant les naseaux. La mort
survient en général quelques heures après le début des manifestations cliniques, l’animal se noyant littéralement
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dans son propre fluide séreux. La forme pulmonaire est habituellement observée chez les animaux très sensibles,
infectés par une souche hautement virulente, ou sur des animaux qui ont été soumis à un effort physique durant
la phase fébrile. La guérison de cette forme est exceptionnelle, survenant dans moins de 5 % des cas. Cette
forme est aussi celle qui est observée en général chez les chiens.
L’incubation de la forme subaiguë, œdémateuse ou cardiaque, varie de 7 à 14 jours, et l’apparition des signes
cliniques est marquée par une réaction fébrile (39 à 41 °C) qui dure 3 à 6 jours. Peu après le déclin de la fièvre,
des tuméfactions œdémateuses peuvent apparaître. Elles débutent dans la fosse temporale ou supra-orbitaire et
sur les paupières, puis, plus tard atteignent les lèvres, les joues, la langue, l’espace inter-mandibulaire et la
région laryngée. Les œdèmes sous-cutanés peuvent s’étendre à distance du cou vers la poitrine et, dans les cas
sévères, peuvent envahir la cage thoracique et les épaules, mais en général pas les membres postérieurs. En
phase terminale, des pétéchies peuvent être constatées dans la conjonctive et sous la face ventrale de la langue.
Finalement, l’animal devient agité et peut montrer des signes de coliques avant de mourir d’un arrêt cardiaque.
Une difficulté de déglutition en rapport avec une paralysie de l’œsophage est aussi rencontrée. Le taux de
mortalité est d’environ 50 % et la mort survient généralement en 4 à 8 jours après l’apparition de la réaction
fébrile. Lors de guérison, les œdèmes se résorbent progressivement en 3 à 8 jours. Cette forme clinique est
habituellement associée à une infection par une souche virale de basse virulence ou se rencontre sur des sujets
immunisés par des souches virales hétérologues, ou apparaît en rapport avec des variations biologiques chez
l’animal infecté.
La forme aiguë ou mixte associe à la fois la forme pulmonaire et la forme cardiaque et elle est souvent la forme la
plus fréquente chez le cheval et le mulet. La mort survient en 3 à 6 jours après le début de l’hyperthermie, et le
taux de mortalité est d’environ 70 %. La maladie peut se manifester de la façon suivante :
!
Des signes pulmonaires initiaux relativement modérés sont suivis par l’apparition de tuméfactions
œdémateuses importantes de la tête et de l’encolure, la mort résultant d’un arrêt cardiaque.
!
Des tuméfactions œdémateuses, typiques de la forme subaiguë, sont suivies par l’apparition soudaine d’une
dyspnée et des autres signes cliniques caractéristiques de la forme suraiguë pulmonaire.
La forme fébrile pure est la forme la plus discrète et passe souvent inaperçue dans les foyers. L’incubation varie
de 5 à 14 jours débouchant sur une réaction fébrile (39 à 40 °C) de type rémittent, avec une rémission le matin et
une exacerbation le soir, durant 5 à 8 jours. Mis à part la réaction fébrile, les autres manifestations sont rares. Les
conjonctives peuvent être légèrement congestionnées, le pouls accéléré, et un certain degré d’anorexie et
d’abattement peut être noté ainsi qu’un œdème des fosses supra-orbitales. Il n’y a pas de mortalité. Cette forme
de maladie est habituellement observée chez les animaux bénéficiant déjà d’une immunité partielle et sur les
espèces résistantes, telles que les ânes et les zèbres.
Il n’existe aucune donnée plaidant pour la possibilité d’infection de l’homme par une souche de terrain de virus de
la PE, soit à la suite d’un contact avec des animaux infectés naturellement ou expérimentalement, soit au cours
de manipulation du virus au laboratoire. Cependant certaines souches vaccinales neurotropes peuvent entraîner
des encéphalites et des rétinites chez l’homme, suite à une contamination trans-nasale (28). La transmission
expérimentale et naturelle du virus au chien a été rapportée, suite à l’ingestion de viande de cheval infecté (3).
Néanmoins, on ne dispose que de peu d’éléments quant à la possibilité d’infection du chien par piqûre
d’insecte (34).
2.
Isolement et identification de l’agent pathogène
Plusieurs techniques sont déjà disponibles pour l’identification du virus de la PE, allant de l’épreuve
immuno-enzymatique de capture (ELISA sandwich indirect) qui est une technique rapide et utilisant des anticorps
soit polyclonaux (AcP) soit monoclonaux (AcM), à la réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) qui
inclue une nouvelle technique de transcription inverse couplée à une PCR (RT-PCR) pour discriminer les
9 sérotypes du virus (31) et en passant par la culture sur cellule et l’inoculation à un souriceau nouveau-né. Si
possible, plus d’une épreuve doit être réalisée pour diagnostiquer un foyer de PE, spécialement pour préciser le
taux d’atteinte. L’épreuve initiale peut être une épreuve rapide telle que l’ELISA ou la PCR, complétée par
l’isolement du virus en culture de cellules. La séroneutralisation virale (SN) permettant l’identification du sérotype,
doit être effectuée aussitôt que possible lors d’épizootie afin de pouvoir choisir le vaccin adapté. Par la suite,
l’ELISA sera très utile pour le diagnostic de laboratoire.
Aujourd’hui, il n’existe aucune souche virale de référence au niveau international, ni de réactifs de diagnostic de
référence, et ni aucune méthodologie normalisée pour l’identification du virus de la PE. Néanmoins un panel de
virus a été évalué et des études comparatives entre différentes tests ELISA pour l’identification antigénique ont
été conduites dans différents laboratoires. Les résultats ont démontré un haut niveau de corrélation, pour la
détection antigénique (30) lorsque l’on utilise la méthode ELISA sandwich indirecte (13, 18).
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Un élément très important du diagnostic est le choix des prélèvements et les conditions de leur transport au
laboratoire.
a)
Prélèvements pour isolement du virus
Du sang récolté sur anti-coagulant durant le début de la phase fébrile de la maladie, ainsi que des fragments
(2 à 4 g) de rate, poumon et nœuds lymphatiques prélevés sur un animal venant de mourir, constituent les
prélèvements de choix du diagnostic. Ils doivent être placés à 4 °C durant le transport et au laboratoire.
b)
Culture de cellules
L’isolement direct du virus a été réalisé avec succès sur lignées de cellules de mammifères : cellules de rein
de jeunes hamsters (BHK-21), de singe (MS), de rein de singe vert africain (Vero), ainsi que sur des lignées
de cellules de moustiques et de Culicoides. Les prélèvements de sang recueillis sur un anticoagulant
approprié peuvent être utilisés non dilués comme inoculum. Après 15 à 60 min d’adsorption à température
ambiante ou à 37 °C, les cellules en culture sont lavées et le milieu d’entretien est ajouté. Il est aussi
possible et plus courant de laver le sang, de le lyser et le diluer au 1/10. Cette modalité élimine les anticorps
indésirables qui peuvent neutraliser le virus et favorise la libération des virus associés aux membranes
cellulaires des globules rouges. Quand des prélèvements tissulaires (rate, poumon, etc.) sont utilisés, une
suspension tissulaire à 10 % est préparée dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)
ou dans du milieu de culture de cellules, contenant des antibiotiques.
Un effet cytopathogène (ECP) peut apparaître entre 2 et 10 jours en post-infection avec les cellules de
mammifère. Trois passages aveugles doivent être réalisés avant de considérer les prélèvements comme
négatifs. Sur cellules d’insecte, aucun ECP n’est observé, mais la présence du virus peut être détectée 7 à
10 jours après que les cellules d’insecte infectées soient passées sur cellules de mammifère.
c)
Souriceau nouveau-né
Cette méthode d’isolement de l’AHSV nécessite une inoculation intra-cérébrale de deux familles de
souriceaux âgés de 1 à 3 jours. Lors de résultats positifs, les animaux présentent des signes nerveux entre
3 et 15 jours après l’inoculation. Les cerveaux des animaux malades peuvent être récoltés, homogénéisés
et ré-inoculés par voie intra-cérébrale à au moins 6 souriceaux de 1 à 3 jours. Le second passage doit
induire une réduction de la période d’incubation (2 à 5 jours) et 100 % d’infectiosité. Le typage du virus peut
être réalisé directement à partir des cerveaux de souris soit par la technique conventionnelle de séroneutralisation, soit par extraction et séquençage de l’ARN.
d)
Méthode immuno-enzymatique sandwich
Au moins deux techniques ELISA sandwich spécifiques de groupe ont été mises au point et appliquées à la
détection de l’antigène de l’AHSV à la fois sur des prélèvements de terrain et sur des cultures de cellules
infectées au laboratoire (13, 18).
L’une (13), utilise des AcPs et l’autre (18), des AcMs vis-à-vis de l’une des protéines majeures la mieux
conservée parmi les sérotypes – la protéine VP7. Les deux méthodes se sont révélées convenables pour le
diagnostic de la PE, en raison de leur grande sensibilité et spécificité ainsi que de l’obtention des résultats
en seulement 2 à 4 h (30). L’utilisation de l’immunoglobuline IgY dans un ELISA en double sandwich
d’anticorps pour la détection de tous les sérotypes de l’AHSV, a aussi été décrite (6).
Les réactifs nécessaires à l’ELISA peuvent être obtenus auprès des Laboratoires de référence de l’OIE pour
la peste équine (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre).
904
!
Ce qui suit est un exemple d’ELISA utilisant des anticorps monoclonaux
i)
Phase solide : adsorber sur les plaques ELISA (par exemple Nunc Maxisorb à haute capacité
d’adsorption) un mélange de AcM 5G5 et 3D2 dilué en PBS, pH 7,2 (10 µg/ml). Incuber une nuit à
4 °C ;
ii)
Laver les plaques 5 fois avec de l’eau distillée contenant 0,05 % (v/v) de Tween 20 (solution de
lavage). Tapoter délicatement les plaques sur une substance absorbante pour éliminer le liquide
résiduel ;
iii)
Saturer les plaques avec du PBS + 1 % de sérum-albumine bovine (SAB), pH 7,2, 200 µl par puits,
pendant 1 h à 37 °C ;
iv)
Éliminer la solution de blocage et tapoter délicatement les plaques sur une substance absorbante ;
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v)
Prélèvements à tester : ajouter les prélèvements à tester (dilutions de 2 en 2 en commençant par les
homogénats ou les surnageant de cultures de cellules non dilués) dilués en PBS + 1 % SAB, pH 7,2,
100 µl par puits. Incuber pendant 1 h à 37 °C. (homogénat de rate : homogénéiser environ 2 cm3 [1 g]
de rate dans 3 ml de milieu de culture MEM [milieu essentiel minimum]. Centrifuger à 600 g pendant
10 min et récupérer le surnageant) ;
vi)
Laver les plaques comme décrit à l’étape ii) ;
vii)
Conjugué : répartir 100 µl par puits de 5G5 AcM marqué à la biotine, dilué au 1/500 en PBS + 1 % de
SAB, pH 7,2. Incuber 1 h à 37 °C. Laver les plaques comme décrit à l’étape ii). Ajouter 100 µl par puits
d’avidine/peroxidase à la dilution optimale en PBS + 1 % de SAB. Incuber 45 min à la température
ambiante ;
viii) Laver les plaques comme décrit à l’étape ii) ;
e)
ix)
Substrat : ajouter 200 µl par puits de solution de substrat (10 ml de DMAB 80,6 mM [diméthyl amino
benzaldéhyde] + 10 ml de MBTH 1,56 mM [3-méthyl-2-benzo-thiazolinone hydrazone hydrochlorure]
+ 5 µl de H2O2). Le développement de la couleur est stoppé par addition de 50 µl de H2SO4 3 N, après
environ 5 à 10 min (avant que les témoins négatifs commencent à se colorer) ;
x)
Lire les plaques à 600 nm (ou 620 nm) ;
xi)
Interprétation des résultats : calculer le seuil critique de la façon suivante : C + ou – 0,06 = Seuil (où C
est la valeur de densité optique [DO] obtenue avec le témoin négatif). Les prélèvements donnant des
DO inférieures au seuil sont considérés négatifs. Les prélèvements donnant des DO supérieures
de + 0,20 sont considérés positifs. Les échantillons donnant des DO intermédiaires sont douteux et
doivent faire l’objet d’une autre technique afin de confirmer les résultats.
Réaction d’amplification en chaîne par polymérase
Une technique RT-PCR a été mise au point pour la mise en évidence spécifique du génome viral. Cette
épreuve (méthode 1) peut être utilisée pour détecter l’ARN viral dans le sang collecté sur éthylène diamine
tétra-acétique (EDTA), ou dans des tissus équins ou de souris ou dans des cultures cellulaires. Les amorces
correspondent aux extrémités 5’ (nucléotides 1-21) et 3’ (nucléotides 1160-1179) du segment 7 de l’ARN
(4, 22, 33, 40) et amplifient le segment 7 en entier. Plus récemment, une nouvelle technique conventionnelle
(méthode 2) et une RT-PCR en temps réel (méthode 3) utilisant des amorces d’une région très conservée
du même segment 7 de l’ARN viral ont été mises au point afin d’améliorer la sensibilité et la rapidité du
diagnostic de la PE (10). Les 3 techniques de RT-PCR peuvent détecter les 9 sérotypes ; elles sont décrites
ci-dessous.
!
Protocole de la méthode 1 (4)
L’extraction des acides nucléiques à partir de prélèvements de rate, est effectuée de la façon suivante :
1 g du prélèvement tissulaire est homogénéisé dans 1 ml de solution dénaturante (thiocyanate de guanidium
4 M, citrate de sodium 25 mM, 2-mercaptoéthanol 0,1 M, sarcosyl 0,5 %). Après centrifugation, 1 µg d’ARN
de levure, 0,1 ml d’acétate de sodium 2 M pH 4, 1 ml de phénol et 0,2 ml d’un mélange (49/1) de
chloroforme/alcool isoamylique, sont ajoutés au surnageant. La suspension est agitée vigoureusement et
placée sur glace pendant 15 min. Après centrifugation, l’ARN présent dans la phase aqueuse est extrait au
phénol, précipité à l’éthanol et repris en eau stérile. Les méthodes de synthèse de l’ADNc et d’amplification
en PCR sont appliquées, dans tous les cas, à une température de régénération de 37 °C. Les séquences
d’amorces PCR utilisées sont : 5’-GTT-AAA-ATT-CGG-TTA-GGA-TG-3’, qui correspond à la polarité de
l’ARN messager et 5’-GTA-AGT-GTA-TTC-GGT-ATT-G-3’, qui est complémentaire de la polarité de l’ARN
messager. Le protocole PCR proprement dit comprend 40 cycles (94 °C pendant 1 min, 55 °C durant
1,5 min, 72 °C pendant 2,5 min et 70 °C durant 7 min) puis les tubes PCR sont conservés à 4 °C. L’analyse
des produits PCR est conduite par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1,2 % (poids/volume) contenant
du bromure d’éthidium. Les prélèvements positifs donneront des bandes de 1179 paires de base.
!
Protocole de la méthode 2 (10)
L’extraction de l’ARN double brin peut être réalisée en utilisant le kit commercialisé High Pure Viral Nucleic
Acid (Roche Diagnostics), décrit ci-dessous. D’autres kits d’extraction de l’ARN sont disponibles dans le
commerce pour la préparation de matrices convenant à la RT-PCR selon l’échantillon à analyser et peuvent
être utilisées. Différents échantillons peuvent être soumis à analyse selon cette procédure comme des
surnageants de cultures cellulaires, du sang récolté sur EDTA, du sérum ou des tissus homogénéisés.
Le kit High Pure Viral Nucleic Acid (Roche Diagnostics) comprend les réactifs suivants : un tampon de
liaison, de l’ARN porteur de Poly (A), la protéinase K, un tampon qui élmine les inhibiteurs, un tampon de
lavage et des tubes filtres (high pure filter tubes) et des tubes de collecte.
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Chapitre 2.5.1. — Peste équine
Pour les échantillons d’organe ou de tissu, il convient de préparer d’abord une suspension homogénéisée
au 1/10 dans du PBS, puis de la clarifier par centrifugation à 12 000 g pendant 5 min. Extraire l’ARN du
surnageant. Parfois, il est recommandé d’analyser en parallèle une dilution au 1/10 du surnageant.
Extraction à partir des échantillons témoins : homogénéiser en diluant au 1/10 le même tissu que celui des
échantillons à traiter ; (a) pour le témoin négatif utiliser 200 µl du tissu indemne de virus et (b) pour le témoin
positifs, 200 µl d’homogénat de tissu contenant du virus. Traiter les deux témoins en même temps que les
échantillons à analyser.
i)
À l’aide d’une pipette, déposer 200 µl d’échantillon dans un microtube à centrifuger de 1,5 ml ;
ii)
Ajouter 200 µl de tampon de liaison supplémenté en poly(A) et 50 µl de protéinase K ; mélanger
immédiatement et incuber à 72 °C pendant 10 min ;
iii)
Centrifuger brièvement le microtube pour éliminer les gouttes à l’intérieur du bouchon ;
iv)
Mélanger l’échantillon avec 100 µl de tampon de liaison ; centrifuger brièvement le microtube pour
éliminer les gouttes à l’intérieur du bouchon ;
v)
Insérer un tube filtre (high pure filter tube) dans un tube de collecte et pipetter l’échantillon dans le
réservoir supérieur ; centrifuger pendant 1 min à 8 000 tr/min (pour les échantillons de sang
recommencer la centrifugation si l’échantillon est resté dans le tube filtre) ;
vi)
Éliminer le filtrat et le tube de collecte et placer le tube filtre dans un nouveau tube de collecte ;
vii)
Ajouter 500 µl de tampon d’élimination des inhibiteurs dans le réservoir supérieur et centrifuger
pendant 1 min à 8 000 tr/min ;
viii) Éliminer le filtrat et le tube de collecte et placer le tube filtre dans un nouveau tube de collecte ;
ix)
Ajouter 450 µl de tampon de rinçage dans le réservoir supérieur et centrifuger pendant 1 min à
8 000 tr/min ;
x)
Éliminer le filtrat et le tube de collecte et répéter l’étape de lavage ;
xi)
Éliminer le tube de collecte et placer le tube filtre dans un tube de collecte propre ; centrifuger pendant
10 s à 13 000 tr/min pour éliminer le tampon de rinçage résiduel ;
xii)
Éliminer le tube de collecte et placer le tube filtre dans un microtube à centrifuger de 1,5 ml ;
xiii) Pour éluer l’ARN, ajouter 50 µl d’eau stérile sans RNAse et préchauffée à 70 °C dans le réservoir
supérieur et centrifuger pendant 1 min à 8 000 tr/min ;
xiv) Traiter immédiatement ou conserver à –20 °C pour traitement ultérieur.
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!
Solutions mères pour RT-PCR
-
Eau stérile dépourvue de nucléase ;
-
Kit One-step RT-PCR disponible dans le commerce auprès de Qiagen, et qui contient pour la RT et la
PCR : les enzymes, le mélange de nucléotide, le tampon avec du chlorure de magnésium et une
solution Q ;
-
Une enzyme inhibitrice de la RNAse disponible dans le commerce auprès de plusieurs fournisseurs ;
-
Les amorces à une concentration de 20 pmol/µl. Séquence de l’amorce 1 : 5’-GGC-TCC-AAC-ACTCAC-AAG-ATG-T-3’ (amorce de tête); séquence de l’amorce 2 : 5’-GGC-GGA-TTA-ATA-GGC-TGCATA-3’ (amorce inverse) ;
-
Tampon de charge concentré 10× : 0,2 % de xylène cyanol ; 0,2 % de bleu de bromophénol ; 30 % de
glycérol ;
-
Tampon TAE (50×) pour gel d’agarose : Tris base (242 g) ; acide acétique glacial (57,1 ml) ; 0, 5 M
EDTA, pH 8 (100 ml) ; eau distillée (qsp 1 litre) ;
-
Marqueurs ADN : une échelle de 100 paires de bases est disponible dans le commerce.
!
Épreuve d’amplification par RT-PCR
i)
Il est recommandé de dénaturer l’ARN viral double brin avant de réaliser la RT-PCR. Préparer le
mélange suivant pour chaque échantillon : amorce 1 : 20 pmol/µl (0,5 µl) ; amorce 2 : 20 pmol/µl
(0,5 µl) ; 7 µl d’eau stérile sans nucléase ; et 2 µl de la matrice de l’échantillon extrait ;
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Chapitre 2.5.1. — Peste équine
ii)
Placer les tubes dans le thermocycleur ou la base chauffante et incuber à 95 °C pendant 5 min.
Centrifuger brièvement les tubes pour éliminer les gouttelettes accrochées au couvercle et placer
immédiatement les tubes sur de la glace ;
iii)
Pour chaque échantillon préparer le mélange réactionnel pour la RT-PCR (décrit ci-dessous) dans un
microtube à centrifugation de 1,5 ml. Préparer le mélange réactionnel en quantité suffisante pour
l’ensemble des échantillons en prévoyant un supplément équivalent à un échantillon ;
iv)
Eau stérile sans nucléase (3,25 µl), tampon de PCR 5× avec du chlorure de magnésium (5 µl),
mélange de dNTP 10 mM (0,5 µl), solution Q 5× (5 µl), inhibiteur de la RNAse 20 U/µl (0,25 µl),
mélange d’enzymes (1 µl) ;
v)
Ajouter 15 µl du mélange réactionnel pour RT-PCR dans chaque tube de PCR contenant la matrice
ARN dénaturée ;
vi)
Inclure un témoin positif (2 µl d’ARN du virus de la PE) et un témoin négatif (2 µl d’eau distillée) dans
chaque test de RT-PCR ;
vii)
Placer les tubes dans un thermocycleur automatisé et suivre le programme suivant :
-
Un cycle à 55 °C pendant 30 min ;
-
Un cycle à 95 °C pendant 15 min ;
-
40 cycles à 94 °C pendant 30 s, 58 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ;
-
Un cycle à 72 °C pendant 7 min ;
-
Maintenir à 4 °C.
viii) Retirer les tubes de PCR à la fin du programme et ajouter dans chaque tube 2,5 µl de tampon de
charge (10×) ;
ix)
Placer tous les échantillons sur un gel d’agarose à 3 % dans du tampon TAE contenant du bromure
d’éthidium à la concentration finale de 0,5 µg/ml. Ajouter l’échelle ADN dans des pistes de chaque côté
du gel ;
x)
Réaliser l’électrophorèse à un voltage constant entre 150 et 200 volts pendant environ 30 min ;
xi)
Lecture des résultats : examiner le gel sous lumière ultra-violette. Une bande discrète apparaît dans un
échantillon positif qui doit migrer de façon identique à ce qui se passe dans le témoin positif. Calculer
la taille des produits d’amplification dans les échantillons à tester et dans le témoin positif en
comparant avec les échelles ADN. Les produits d’amplification du témoin positif ont une taille de
102 paires de bases. Aucune bande ne doit être observée avec le témoin négatif.
!
Protocole de la méthode 3 : RT-PCR en temps réel (10)
Pour la préparation des échantillons et l’extraction de l’ARN, suivre le même protocole que celui décrit pour
la méthode 2 de RT-PCR conventionnelle.
!
Solutions mères pour la RT-PCR
i)
Eau stérile dépourvue de nucléase ;
ii)
Kit One-step RT-PCR disponible dans le commerce auprès de Qiagen, et qui contient les enzymes
pour la RT (mélange RT) et la PCR, le mélange de nucléotide et le tampon avec du chlorure de
magnésium (mélange primaire) ;
iii)
Une enzyme inhibitrice de la RNAse disponible dans le commerce auprès de plusieurs fournisseurs ;
iv)
Utiliser les mêmes amorces que pour la méthode 2 de la RT-PCR conventionnelle décrite plus haut.
Les amorces sont à une concentration de 20 pmol/µl. Séquence de l’amorce 1 (sens positif) : 5’-GGCTCC-AAC-ACT-CAC-AAG-ATG-T-3’ ; séquence de l’amorce 2 (sens négatif) : 5’-GGC-GGA-TTA-ATAGGC-TGC-ATA-3’ ;
v)
®
Sonde fluorogénique TaqMan-MGB à la concentration de 10 pmol/µl : (5’-[6-carboxy-fluoréscéine
(FAM)-TGG-CAC-GCC-TTA-CGC-GC-[MGB - Minor Groove Binder Molecule]-3’).
!
Épreuve d’amplification par RT-PCR
i)
il est recommandé de dénaturer l’ARN viral double brin avant de réaliser la RT-PCR. Préparer le
mélange suivant pour chaque échantillon : amorce 1 : 20 pmol/µl (0,75 µl) ; amorce 2 : 20 pmol/µl
(0,75 µl) ; 6,5 µl d’eau stérile dépourvue de nucléase ; et 2 µl de la matrice de l’échantillon extrait ;
Manuel terrestre de l’OIE 2008
907
Chapitre 2.5.1. — Peste équine
ii)
Placer les tubes dans le thermocycleur ou la base chauffante et incuber à 95 °C pendant 5 min.
Centrifuger brièvement les tubes pour éliminer les gouttelettes accrochées au couvercle et placer
immédiatement les tubes sur de la glace ;
iii)
Pour chaque échantillon préparer le mélange réactionnel pour la RT-PCR (décrit ci-dessous) dans un
microtube à centrifugation de 1,5 ml. Préparer le mélange réactionnel en quantité suffisante pour
l’ensemble des échantillons en prévoyant un supplément équivalent à un échantillon ;
iv)
Eau stérile dépourvue de nucléase (1,375 µl), sonde TaqMan - MGB® 10 pmol/µl (0,625 µl), mélange
primaire 2× (12,5 µl), inhibiteur de la RNAse 20 U/µl (0,25 µl), mélange pour RT (0,25 µl) ;
v)
Ajouter 15 µl du mélange réactionnel pour RT-PCR dans chaque tube optique pour PCR ou dans
chaque puits d’une plaque optique contenant la matrice ARN dénaturée ;
vi)
Inclure un témoin positif (2 µl d’ARN du virus de la PE) et un témoin négatif (2 µl d’eau distillée) dans
chaque test de RT-PCR ;
vii)
Placer les tubes dans un thermocycleur automatisé et suivre le programme suivant :
-
Un cycle à 55 °C pendant 30 min.
-
Un cycle à 95 °C pendant 15 min.
-
45 cycles à 94 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min. Faire les mesures de la fluorescence à la
fin de chaque cycle à une longueur d’onde appropriée.
viii) Lecture des résultats : déterminer une valeur seuil du cycle (Ct) pour chaque réaction de PCR à partir
d’une grille des points d’amplification (un point dû au signal de fluorescence en rapport avec le nombre
du cycle). Les échantillons négatifs, les témoins négatifs non infectés ou les témoins « blancs » doivent
avoir une valeur Ct > 45,0. Les échantillons à tester positifs et les témoins positifs doivent avoir une
valeur Ct < 45,0 (les échantillons fortement positifs ont une valeur Ct < 30).
!
Sérotypage du virus de la peste équine (AHSV)
Il y a encore peu de temps, la séroneutralisation (SN) était, grâce à des antisérums spécifiques, la méthode
de choix pour le sérotypage ainsi que l’épreuve étalon (gold standard) pour l’identification des souches de
virus isolées sur le terrain (37). Cette technique nécessite au moins 5 jours avant que les résultats ne soient
disponibles. La mise au point récente d’une épreuve RT-PCR spécifique de type pouvant servir à
l’identification et à la différentiation des 9 sérotypes du virus a fourni une méthode qui confirme en quelques
heures l’identité du virus dans les échantillons de tissu (27, 31). Neufs paires d’amorces ont été préparées à
partir du segment 2 du génome viral de chaque sérotype. Les résultats obtenus par la RT-PCR sont en
concordance parfaite avec ceux de la séroneutralisation.
Le typage des 9 sérotypes du virus équipestique a aussi été réalisé avec des sondes obtenues d’une série
de gènes entiers clonés de VP2 et cette technique peut être une alternative à l’amplification du segment
génomique 2 (17).
3.
Épreuves sérologiques
Des sérums de référence internationale OIE sont disponibles (consulter le site web de l’OIE [www.oie.int] pour
l’adresse). Ces sérums ont été produits afin de normaliser l’ELISA, qui est une épreuve prescrite par l’OIE. De
plus, un ensemble de sérums de référence a été évalué et des études comparatives entre différentes techniques
ELISA utilisant des AcMs et des AcPs, impliquant plusieurs laboratoires, ont été réalisées. Les résultats ont
révélé un degré élevé de corrélation en utilisant l’ELISA de compétition ou indirect pour la mise en évidence des
anticorps (12, 20, 30). Plus récemment, un ensemble de sérums a été produit et est utilisé aujourd’hui pour les
contrôles annuels de qualité de trois épreuves de détection des anticorps par ELISA adoptés par les laboratoires
nationaux en Europe (9, 12, 20).
Les épreuves ELISA indirecte ou de compétition utilisant soit l’antigène soluble de l’AHSV soit une protéine VP7
recombinante (12, 20) se sont révélés de bonnes méthodes de détection des anticorps spécifiques de groupe,
notamment pour des recherches à grande échelle (30). L’ensemble de ces épreuves a été reconnu par la
Commission Européenne (9). L’ELISA de compétition peut aussi être utilisé chez les animaux sauvages puisque
les anti-globulines spécifiques d’espèce ne sont pas nécessaires avec cette méthode. Une épreuve d’immunoempreinte a été appliquée à la recherche des anticorps anti-AHSV (20). Elle est particulièrement adaptée à
l’étude d’un petit nombre de sérums. Un ELISA indirect utilisant la protéine non structurale NS3 du sérotype 4
comme antigène, est aussi disponible ; il peut être utilisé pour différencier les animaux infectés ou vaccinés avec
le vaccin à virus vivant de ceux vaccinés avec le vaccin inactivé préparé à partir de virions purifiés (21). Il
convient néanmoins de remarquer qu’aucun vaccin inactivé n’est commercialisé à l’heure actuelle. La réaction de
fixation du complément (FC) a été largement utilisée, mais certains sérums se révèlent anti-complémentaires,
notamment ceux des ânes et des zèbres.
908
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.5.1. — Peste équine
a)
Méthode immuno-enzymatique indirecte (épreuve prescrite pour les échanges internationaux)
La protéine VP7 recombinante a été utilisée comme antigène pour la recherche des anticorps anti-AHSV et
a révélé une grande sensibilité et spécificité (20, 38). Les autres avantages de cet antigène résident dans sa
stabilité et son innocuité (23).
!
Protocole
i)
Phase solide : fixer sur les plaques ELISA (par exemple des plaques Nunc Maxisorb à haute capacité
d’adsorption) le recombinant AHSV-4 VP7 dilué en tampon carbonate/bicarbonate, pH 9,6. Incuber une
nuit à 4 °C ;
ii)
Laver les plaques 5 fois à l’eau distillée contenant 0,01 % (v/v) de Tween 20 (solution de lavage).
Retourner et tapoter délicatement les plaques sur une substance absorbante pour éliminer le liquide
résiduel ;
iii)
Saturer les plaques avec du PBS, pH 7,2 + 5 % (poids/volume) de lait écrémé, 200 µl par puits,
pendant 1 h à 37 °C ;
iv)
Éliminer la solution de blocage et tapoter délicatement les plaques sur la substance absorbante ;
v)
Prélèvements à tester : les prélèvements de sérum à tester et les sérums témoins positif et négatif sont
dilués au 1/25 en PBS + 5 % (poids/volume) de lait écrémé + 0,05 % (v/v) de Tween 20, 100 µl par
puits. Incuber durant 1 h à 37 °C. Lors de titrage, ajouter des dilutions en série de raison 2, à partir de
la dilution au 1/25 (100 µl/puits), un sérum par colonne, et faire la même chose avec les témoins positif
et négatif. Incuber 1 h à 37 °C ;
vi)
Laver les plaques comme décrit à l’étape ii) ;
vii)
Conjugué : Répartir 100 µl/puits d’anti-gamma globuline de cheval conjuguée à la peroxydase de
raifort, diluée en PBS + 5 % de lait + 0,05 % de Tween 20, pH 7,2. Incuber 1 h à 37 °C ;
viii) Laver les plaques comme indiqué en ii) ;
b)
ix)
Substrat : ajouter 200 µl/puits de solution de substrat (10 ml de DMAB + 10 ml de MBTH + 5 µl de
H2O2). Le développement de la couleur est stoppé en ajoutant 50 µl de H2SO4 3 N, après environ 5 à
10 min (avant que le témoin négatif ne commence à se colorer). D’autres substrats tels que l’ABTS
(acide 2,2’-azino-di-[3-éthyl-benzothiazoline]-6-sulphonique), le TMB (tétraméthyl benzidine) ou l’OPD
(orthophényldiamine) peuvent aussi être utilisés ;
x)
Lire les plaques à 600 nm (ou 620 nm) ;
xi)
Interprétation des résultats : calculer le seuil critique en ajoutant 0,6 à la valeur obtenue pour le témoin
négatif (0,6 est la déviation standard calculée sur un ensemble de 30 sérums négatifs). Les sérums
donnant une densité optique (DO) inférieure au seuil sont considérés négatifs ; ceux donnant une DO
supérieure de +0,15 sont considérés positifs. Les sérums donnant des DO intermédiaires sont
suspects et doivent faire l’objet d’une seconde technique pour confirmer le résultat.
Immuno-empreinte (immunoblotting)
La fixation d’anticorps sur des protéines virales séparées par électrophorèse et transférées sur film de
nitrocellulose, a été appliquée à la recherche des anticorps anti-AHSV (20).
!
Protocole
Des protéines de virus équipestique semi-purifiées sont séparées par SDS/PAGE (électrophorèse sodium
dodecyl sulfate/gel de polyacrylamide) dans des gels à 15 % (poids/volume) de DATD (acrylamide-N,N’diallyltartar-diamide). Les protéines séparées sont transférées sur une membrane de nitrocellulose sous un
courant constant de 280 mA pendant 6 h à 4 °C. L’immuno-empreinte d’une membrane de nitrocellulose
découpée en bande est réalisée avec des sérums dilués à 1/20, une immunoglobuline de lapin
anti-globuline de cheval conjuguée à la peroxydase à la dilution de 1/500 et un temps d’incubation de 1 h à
37 °C. Les bandes reconnues par les sérums sont développées par la méthode du 4-chloro-naphtanol.
Interprétation des résultats : la comparaison avec les bandes obtenues des sérums témoins positif et négatif
permet l’identification des bandes spécifiques du virus. L’apparition d’au moins deux de ces bandes
spécifiques avec un sérum posant problème permet de considérer celui-ci comme un sérum positif.
c)
NS3 ELISA
Un ELISA indirect permettant de différencier les chevaux infectés des chevaux vaccinés avec un vaccin
inactivé purifié de sérotype 4, utilisant un recombinant de la protéine NS3 comme antigène, a été décrit (21).
Les résultats obtenus indiquent que le recombinant NS3 permet de bien différencier les animaux infectés de
Manuel terrestre de l’OIE 2008
909
Chapitre 2.5.1. — Peste équine
ceux vaccinés par un vaccin inactivé. De ce fait, ce recombinant peut être un réactif de diagnostic essentiel
pouvant autoriser le transport des chevaux vaccinés. Pour assurer la fiabilité des résultats, il est
fondamental que le vaccin anti-peste équine inactivé soit un vaccin purifié. Il faut s’assurer de l’absence de
traces de NS3 car celles-ci stimuleraient la production d’anticorps anti-NS3 chez les chevaux vaccinés, qui
risqueraient d’être considérés comme présentant une réponse à une infection naturelle. Ce type d’ELISA
pourrait aussi être utile pour distinguer les chevaux infectés de ceux vaccinés avec un vaccin sous-unités
dépourvu de protéine NS3. Il convient néanmoins de remarquer qu’aucun vaccin inactivé n’est
commercialisé à l’heure actuelle.
d)
Fixation du Complément (épreuve prescrite pour les échanges internationaux)
La fixation du complément (FC) a été largement utilisée, mais en raison du pouvoir anti-complémentaire de
certains sérums et des bons résultats donnés par l’ELISA, elle est quelque peu délaissée. La FC est surtout
utilisée pour la recherche des anticorps anti-AHSV spécifiques de groupe. Un extrait sucrose/acétone de
cerveau de souris est communément utilisé comme antigène.
!
Réactifs
i)
Tampon salin véronal contenant 1 % de gélatine (VBSG) ;
ii)
Les sérums, exempts d’érythrocytes, doivent être inactivés par la chaleur : à 56 °C pour le cheval,
60 °C pour le zèbre, 62 °C pour l’âne, pendant 30 min ;
iii)
L’antigène est un extrait sucrose/acétone de cerveau de souris infectée par le virus. Le témoin
antigène est du cerveau de souris non infecté extrait de la même façon. En l’absence d’un sérum
étalon international, l’antigène doit être titré avec un sérum témoin positif préparé localement. Dans le
test, 4 à 8 unités antigéniques sont utilisées ;
iv)
Le complément est un sérum normal de cobaye ;
v)
L’hémolysine est un sérum de lapin anti-globules rouges de mouton (GRMs) ;
vi)
Les GRMs sont obtenus par ponction stérile de la veine jugulaire et conservés en solution d’Alsever
ou en citrate de sodium ;
vii)
Le système hémolytique (SH) est préparé en diluant l’hémolysine pour obtenir 2 doses hémolytiques et
en utilisant cette dilution pour sensibiliser les GRMs lavées. Les GRMs sont normalisées à une
concentration de 3 % ;
1
viii) Sérums témoin : un sérum témoin positif est obtenu localement et validé. Un sérum provenant d’un
cheval en bonne santé et dépourvu d’anticorps est retenu comme témoin négatif.
e)
!
Protocole
i)
Les sérums, le complément et l’antigène sont répartis dans des plaques de micro-titrage à fond rond,
ou dans des tubes si la macro-technique est choisie, puis incubés à 4 °C pendant 18 h ;
ii)
Les GRMs (3 %) sensibilisés sont ajoutés dans tous les puits de la plaque ;
iii)
La plaque est incubée à 37 °C pendant 30 min ;
iv)
Les plaques sont alors centrifugées à 200 g, et les puits sont examinés pour juger de l’hémolyse ;
v)
Les témoins suivants sont utilisés : (a) sérum et complément ; (b) sérum et GRMs ; (c) antigène FC et
témoin antigène chacun avec 4 CH50 (50 % unité hémolytique de complément), 2 CH50 et 1 CH50 de
complément ; (d) antigène FC et GRMs ; (e) témoin antigène et GRMs ; (f) dilutions de complément de
4 CH50, 2 CH50, et 1 CH50 ; (g) GRMs ;
vi)
Les résultats sont lus en retenant l’hémolyse à 50 % comme seuil. L’inverse de la plus haute dilution
de sérum fixant spécifiquement le complément avec l’antigène FC, constitue le titre ;
vii)
Un titre de 1/10 ou plus est considéré positif, négatif si inférieur à 1/10.
Séroneutralisation virale
La séroneutralisation du virus permet de détecter les anticorps spécifiques de type (14, 15). Elle présente
aussi un intérêt pour la surveillance épidémiologique et les études de transmission, notamment dans les
régions d’enzootie où plusieurs sérotypes sont susceptibles de circuler (27).
1
910
Dextrose : 20,5 g (114 mM) ; citrate de sodium 2H2O : 7,9 g (27 mM), NaCl : 4,2 g (71 mM) ; H2O qsp 1 litre. Ajuster le pH
avec de l’acide citrique 1 M.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.5.1. — Peste équine
!
Protocole
i)
Le virus stock est dilué de façon à obtenir 100 DICT50 (Dose de virus infectant 50 % de la culture
tissulaire) avec un éventail allant de 30 à 300 DICT50 dans 25 µl, et 25 µl sont ajoutés à chacun de
4 puits de plaque de micro-titrage contenant 25 µl de dilutions de sérum. Pour réaliser une épreuve de
dépistage, une dilution finale de 1/10 est utilisée. Des dilutions de 2 en 2 sont utilisées pour les
titrages.
ii)
Les mélanges sérums/virus sont incubés à 37 °C pendant 60 min avant l’addition de 0,1 ml de
suspension de cellules Vero (200 000 cellules/ml) dans chaque puits.
iii)
Un titrage de confirmation du virus stock est préparé pour chaque épreuve en utilisant 4 puits par
dilution de 10 en 10, 25 µl par puits. Les plaques sont incubées à 37 °C, 5 % de CO2, 95 %
d’humidité pendant 4 à 5 jours, jusqu’à ce que le titrage de vérification indique que le virus stock
contient de 30 à 100 DICT50.
iv)
Les plaques sont alors fixées et colorées par une solution à 0,15 % (poids/volume) de cristal violet
dans 2 % (v/v) de glutaraldéhyde, puis sont rincées. En alternative, elles peuvent être fixées à l’éthanol
à 70 % et colorées avec de la fuschsine basique à 1 %.
v)
Le titre au point 50 % du sérum est calculé par la méthode de Spearman-Kärber et exprimé en log10
négatif.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS
ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Des vaccins polyvalents ou monovalents vivants atténués de la PE, issus de la sélection en culture de cellules
Vero de macro-plaques génétiquement stables, sont disponibles dans le commerce auprès de Onderstepoort
Biological Products, Onderstepoort, Afrique du Sud (8). Un vaccin monovalent inactivé (anti-sérotype 4) préparé
par purification du virus et inactivation au formol a été produit, mais n’est pas disponible à l’heure actuelle (5, 16).
Les exigences à la fois pour les vaccins atténués et inactivés sont résumées ci-dessous.
Les prescriptions pour la production des vaccins à usage vétérinaire sont données au Chapitre 1.1.8., « Principes
de fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Les instructions données ici et dans le Chapitre 1.1.8. ont une
portée générale et peuvent être complétées par des exigences nationales et régionales.
C1. Vaccin équipestique atténué
1.
Gestion des semences virales
a)
Caractéristiques de la semence virale
Elle est issue de la sélection, en cellules Vero, de grandes plaques génétiquement stables apparues après
un petit nombre de passages de l’AHSV. Les mutants « plaque » sont multipliés par
3 passages supplémentaires sur cellules Vero. Une grande quantité de cet antigène est alors lyophilisée et
stockée à –20 °C en tant que stock de semence antigène.
b)
Méthode de culture
Le virus semence est produit en culture de cellules Vero en flacons roulants.
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
Le virus semence doit se révéler exempt de virus contaminants, de bactéries et de mycoplasmes, suite à la
mise en œuvre des techniques appropriées. L’identité du sérotype doit être confirmée.
2.
Méthode de fabrication
En début de fabrication, les antigènes choisis sont produits à partir du stock de semence antigène, en
culture soit de cellules BHK-21 soit de cellules Vero. Les antigènes dits « de travail » sont testés pour leur
6
stérilité, pureté et identité ; ils doivent renfermer au moins 1 × 10 unités formant plaque (UFP)/ml de virus
infectieux.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
911
Chapitre 2.5.1. — Peste équine
Des cultures de cellules Vero ou BHK-21 en flacons roulants sont réalisées en utilisant du sérum bovin traité
par des radiations gamma, dans le milieu de culture. Une fois les cultures confluentes, le milieu est éliminé
et les cellules sont ensemencées avec les antigènes de travail. Après 1 h, le milieu d’entretien est ajouté
aux cultures. L’incubation est poursuivie à 37 °C pendant 2 à 3 jours. Lorsque l’ECP est bien développé, les
cellules ainsi que le surnageant sont récoltés. Les produits issus d’un même sérotype sont mélangés et
stockés à 4 °C.
3.
Contrôles en cours de fabrication
Les récoltes de chaque sérotypes subissent individuellement un contrôle de stérilité et un titrage sur cellules
Vero en plaques de titrage. Le titre minimum acceptable est de 1 × 106 UFP/ml.
Finalement, deux vaccins quadrivalents sont préparés en mélangeant respectivement des volumes égaux
de sérotypes 1, 3, 4, 5 et 2, 6, 7, 8. Par la suite, le sérotype 5 fut retiré de ce vaccin. Un vaccin monovalent
peut aussi être préparé. Après addition d’un stabilisant convenable, le vaccin est distribué sous un volume
de 1,0 ml en flacon de verre et lyophilisé.
4.
Contrôles des lots
a)
Stérilité
Suite à la lyophilisation, 5 flacons de vaccin, prélevés au hasard, sont contrôlés pour la stérilité par les
méthodes reconnues internationalement. Les tests de stérilité et d’absence de contaminations des produits
biologiques sont décrits au Chapitre 1.1.9., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des
matériels biologiques ».
b)
Innocuité
L’innocuité d’un vaccin est déterminée par inoculation du vaccin reconstitué à la souris (0,25 ml par voie
intra-péritonéale), au cobaye (1,0 ml par voie intra-péritonéale) et au cheval (5,0 ml par voie sous-cutanée).
Tous les animaux sont observés quotidiennement pendant 14 jours. La température rectale du cheval est
prise 2 fois par jour pendant 14 jours et ne doit jamais dépasser 39 °C.
c)
Activité
L’activité repose grandement sur la concentration virale du vaccin.
La dose immunisante minimum pour chaque sérotype est d’environ 1 × 103 UFP/dose. Le titre infectieux du
produit fini est déterminé par titrage sur plaque en culture de cellules Vero et doit être d’au moins
1 × 105 UFP/dose. Le cheval utilisé pour le test d’innocuité est aussi utilisé pour déterminer l’immunogénicité
du vaccin.
Des prélèvement de sang sont effectués le jour de la vaccination et 21 jours plus tard ; ils sont soumis à une
recherche des anticorps neutralisant pour chacun des sérotypes par l’épreuve de réduction des plages
utilisant des dilutions de 2 en 2 du sérum et environ 100 UFP de virus. Le cheval doit donner un titre
d’anticorps neutralisants d’au moins 20, vis-à-vis d’au moins trois des quatre sérotypes du vaccin
quadrivalent.
d)
Durée de l’immunité
La durée de l’immunité n’est pas évaluée pour chaque lot de vaccin, mais l’immunité est connue pour
persister au moins 4 ans. Cependant, en raison d’une possible interférence entre les sérotypes dans chacun
des vaccins quadrivalents, un rappel annuel est conseillé dans les régions d’enzootie. La vaccination à l’aide
du vaccin monovalent induit une immunité valable pour la vie.
e)
Stabilité
A l’état lyophilisé, le vaccin garde son activité pendant de nombreuses années quand il est conservé entre 4
et 8 °C. Néanmoins une durée de conservation de 2 ans est normalement donnée.
912
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.5.1. — Peste équine
C2. Vaccin équipestique inactivé
1.
Gestion des semences virales
a)
Caractéristiques de la semence virale
La semence primaire est la souche vaccinale atténuée (AHSV sérotype 4) largement utilisée en Afrique et
en Europe du Sud (des stocks de semence sont disponibles auprès du Laboratoire de référence OIE
[Onderstepoort]). Le virus a subi 10 passages sur cerveau de souriceaux nouveau-nés pour son atténuation,
puis 10 nouveaux passages en cultures de cellules BHK-21 en tubes roulants. Il a été purifié par plaques, 3
fois, en culture de cellules Vero, par sélection de grandes plaques (4 à 6 mm) aux dilutions limites. Le
produit de la plaque finale a été passé une fois sur cerveau de souriceau nouveau-né et 4 fois en cultures
de cellules Vero. Le produit a été lyophilisé et représente le lot de semence primaire du virus.
b)
Méthode de culture
Le virus atténué est produit par passage sur culture de cellules BHK-21 en flacons roulants.
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
La semence virale doit être reconnue exempte de contaminants viraux, de bactéries et de mycoplasmes par
les techniques appropriées. L’identité du sérotype est confirmée par ELISA double sandwich utilisant un
AcM.
2.
Méthode de fabrication
Le virus est récolté après développement complet de l’ECP. La culture est poursuivie en suspension de cellules
dans le milieu de Stocker sans sérum (MEM) à 37 °C. La croissance virale est contrôlée par évaluation de la
viabilité cellulaire (ECP), et, quand les conditions optimales sont atteintes, la température de culture du
fermenteur est abaissée à 4 °C. La suspension virale est récoltée stérilement.
La suspension filtrée du virus atténué est inactivée au formol à une concentration finale de 1/1 000. La
suspension est transférée dans un autre récipient et agitée à 4 °C pendant au moins 10 jours pour s’assurer que
la totalité du virus soit inactivée. Des contrôles d’inactivation sont effectués.
Après inactivation, la suspension antigénique est concentrée par ultrafiltration, puis purifiée par précipitation
sélective utilisant le complexe d’oxyde d’éthylène et de cations bivalents, selon la technique brevetée.
3.
Contrôles en cours de fabrication
Un contrôle d’identité virale par ELISA double sandwich, un titrage du virus sur cellules Vero avant inactivation,
une analyse en gradient de sucrose permettant d’estimer la concentration en particules, et des épreuves de
stérilité, sont effectués.
4.
Contrôle des lots
a)
Stérilité
Les tests de stérilité et d’absence de contamination par des produits biologiques sont décrits au Chapitre
1.1.9.
b)
Innocuité
Des chevaux sensibles à la PE reçoivent par voie intra-musculaire ou sous-cutanée une simple ou une
double dose de vaccin. Les températures rectales sont relevées quotidiennement pendant 14 jours et les
chevaux sont surveillés cliniquement. Cinq cobayes reçoivent une dose cheval de vaccin par voie
intra-musculaire. Les sérums récoltés à J 21 font l’objet d’une recherche d’anticorps par SN.
c)
Activité
Le contrôle d’activité est réalisé par épreuve virulente de chevaux vaccinés. Certains sont vaccinés avec
une dose, d’autres avec 2 doses. L’épreuve est effectuée par voie intra-veineuse 77 jours après la première
injection. Lorsque 2 injections sont pratiquées, la seconde dose est injectée 21 jours après la première.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
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Chapitre 2.5.1. — Peste équine
Des prélèvements de sérums sont effectués le jour de la vaccination, puis 21 jours plus tard, et sont soumis
à une recherche d’anticorps neutralisants et de virus.
d)
Durée de l’immunité
Aucune épreuve virulente n’a été pratiquée sur le cheval, seules des études sérologiques ont été conduites.
Si le taux d’anticorps induit par 2 injections (protocole recommandé sur le terrain) est, 12 mois après la
vaccination, équivalent à celui conféré 28 jours après une simple vaccination, les chevaux sont considérés
comme protégés. Avec ce principe, la durée de l’immunité est de 1 an, débutant 7 à 10 jours après la
première injection. Un rappel annuel est suffisant pour assurer un bon niveau de protection pour les années
suivantes. Le protocole de vaccination recommandé par le fabricant est de 2 injections (à 21 jours
d’intervalle) et de un rappel 365 jours après la première injection.
e)
Stabilité
Dans la mesure où le vaccin inactivé est relativement un nouveau produit, peu de données sont disponibles
sur la durée de sa stabilité. Les résultats disponibles montrent que la stabilité dépasse 3 ans.
C3. Vaccin sous-unités équipestique
Les protéines de surface de la capside VP2 et VP5 et la protéine interne de capside VP7, issues de simples et de
doubles vecteurs d’expression de recombinants baculovirus, ont été utilisées sous différentes combinaisons pour
immuniser des chevaux (24). Toutefois, ce vaccin n’est pas commercialisé.
Un vaccin expérimental préparé avec des extraits cellulaires bruts contenant les 3 protéines structurales a permis
d’obtenir une réponse immunitaire protectrice complète chez des chevaux éprouvés avec un virus PE virulent
(106 DICT50). La virémie n’a pas été mise en évidence chez les vaccinés (24). Des analyses supplémentaires de
lysats bruts partiellement protecteurs ont révélé que la protéine soluble VP2 seule était capable d’induire des
anticorps neutralisants. Il a été possible de définir les sites neutralisants de la protéine virale VP2 pour les
sérotypes AHSV 3, 4 et 9 (2, 25, 36) et très récemment, la protection de chevaux immunisés par la protéine
recombinante VP2 (AHSV de sérotype 5) adjuvée à la saponine, vis-à-vis d’une épreuve létale a été rapportée
(32). Bien que d’autres recherches soient nécessaires pour estimer la durée de l’immunité induite par ces
protéines, les données disponibles soulignent l’efficacité de ce candidat vaccin.
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*
* *
NB : Il existe plusieurs Laboratoires de référence de l’OIE pour la Peste équine (se reporter à la liste de la partie
3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site internet de l’OIE pour une liste actualisée : www.oie.int).
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