Diapositiva 1

PHYSIOPATHOLOGIE DE L’INFECTION BACTERIENNE
N°386
Echec du traitement des infections à Pseudomonas aeruginosa en biofilm par persistance bactérienne :
un mécanisme conservé, reproductible sous ciprofloxacine et indépendant des variants à petites colonies.
J. Renard1, E. Fiaux1-2, M. Pestel-Caron1-3, F. Caron1-2, M. Etienne1-2
1GRAM
EA2656, Faculté de Médecine et de Pharmacie, 2Maladies infectieuses, CHU Charles Nicolle, 3Microbiologie, Rouen, France
INTRODUCTION
Le mécanisme de persistance bactérienne pourrait être en partie responsable de l’échec de l’antibiothérapie des infections en biofilm (BF). La persistance est un mécanisme phénotypique adaptatif et transitoire
permettant à une population bactérienne en BF de devenir hautement tolérante aux antibiotiques (ATB), sans développer de mécanismes de résistance (CMI inchangée après exposition à un antibiotique). Ce
mécanisme est principalement décrit in vitro et pour les fluoroquinolones.
OBJECTIF : Analyser la persistance de Pseudomonas aeruginosa (PA) dans un modèle in vitro d’infection urinaire (IU) sur cathéter (CU) en comparant phénotypiquement une souche de collection et deux isolats
cliniques impliqués dans une IU sur CU.
MÉTHODES
● Sélection des souches : * Souche de collection PA14.
* Collecte de 2 souches de PA issues de CU de patients traités pour une IU à PA. Isolats issus des CU, CMI comparée à l’isolat issu des urines avant traitement.
● Modèle in vitro d’IU en biofilm (BF) sur cathéter urinaire (CU) :
4 jours
37°C, MH, statique
Ajout CIP (128*CMI)
24h 37°C, MH, statique
Souche à tester
+ 2 cathéters urinaires
- Exposition à la CIP pendant 24h (128*CMI ; CMI = 0,125 mg/L)
J+5
J+4
J0
- Formation de BF pendant 4 jours sur CU
Dénombrement sur gélose MH enrichie en CIP (1*CMI) :
absence de mutant résistant
Dénombrement sur gélose MH
Caractérisation phénotypique
Dénombrement sur gélose MH
Caractérisation phénotypique
- Absence de mutant résistant par absence de croissance sur gélose enrichie en CIP (1*CMI)
● Caractérisation phénotypique des bactéries persistantes : * Formation de BF : croissance en microplaque pendant 24h, à 37°C, statique. Coloration au cristal violet 0,1%. Lecture de DO595nm.
* Mobilité : mesure (mm) du « swimming », « swarming », « twitching » sur géloses MH après 24h de croissance.
* Production de sucres par fixation au Rouge Congo.
RÉSULTATS
IN VIVO
● Souche patient n°1 « persistante » :
Patient
- pas de diminution de concentrations bactériennes sous traitement
- pas de stérilisation des urines
Concentrations bactériennes urinaires (UFC/mL)
N°
ATB
urines avant ATB
urines après ATB
CU après ATB
1
tazocilline (150mg/kg IV)
106
106
2.106
2
tazocilline (150mg/kg IV) + amikacine (15mg/kg IV)
104
0
15
- CMI inchangée : pas de sélection de résistance
● Souche patient n°2 « non persistante » :
- diminution des concentrations bactériennes de 4 log10 sur le CU
ATB : antibiotique
- stérilisation des urines après traitement
 In vivo : Persistance inconstamment retrouvée
- CMI inchangée : pas de sélection de résistance
IN VITRO
● Sélection de bactéries persistantes sous CIP :
- diminution des concentrations bactériennes de 3 log10
- pas de stérilisation des CU
- pas de mutant résistant sélectionné
concentrations bactériennes
(log10 CFU/ml)
10
9
8
7
6
sélection de persisters sous CIP (128*CMI)
BF
BF+CIP
5
4
100% des bactéries survivantes sont sensibles
3
2
1
0
PA14
souche 1
souche 2
Dénombrement bactérien en biofilm avant et après exposition à la CIP
● Caractérisation des bactéries persistantes :
- Dissociation en 2 morphotypes des bactéries isolées du biofilm :
 In vitro : Persistance constante sous ciprofloxacine
* avant exposition à la CIP : variants à petites colonies (SCV) et variants à grandes colonies (LCV)
* après exposition à la CIP : SCV persistants (SCVper) et LCV persistants (LCVper)
- Les persisters (SCVper et LCVper) n’ont pas de caractéristique phénotypique commune en terme de biofilm, de mobilité et de production de sucres.
WT
4
3,5
« swimming »
3
Moyenne DO 595nm
SCV
LCV
SCVper
LCVper
7
4
15
10
17
25
5,5
10,5
5
14
10,5
6
11
6,5
10,5
(souche initiale
PA14)
mesure
(mm)
2,5
image
2
« swarming »
1,5
1
mesure
(mm)
image
0,5
« twitching »
0
WT
SCV
LCV
SCVper LCVper
souche PA14
U
SCV
LCV
SCVper LCVper
U
SCV
souche 1
LCV
mesure
(mm)
SCVper LCVper
souche 2
image
WT : Wild type ; U : Urines
Formation de biofilm en fonction des différents morphotypes
Mobilité des différents morphotypes de PA14
Les variants à petites colonies, forment plus de biofilm, …
et sont moins mobiles, ...
qu’ils soient persisters ou non!
CONCLUSION
La persistance :
• est un phénomène reproductible et conservé pour Pseudomonas aeruginosa dans un modèle in vitro d’infection urinaire sur cathéter urinaire traitée par ciprofloxacine,
• semble s’exprimer inconstamment in vivo chez des patients traités par tazocilline,
• ne s’associe à aucune autre caractéristique phénotypique commune autre que la tolérance aux antibiotiques.