Etudes des interactions hRPA / G-quadruplexe / Ligands G4 aux

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THESE DE DOCTORAT DE
L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité
Biologie moléculaire et cellulaire
(Ecole doctorale : Interdisciplinaire pour le vivant IViv)
Présentée par
Layale SAFA
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR de l’UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE
Etudes des interactions hRPA / G-quadruplexe / Ligands G4
aux télomères
soutenue le 25 Juin 2013, devant le jury composé de :
Mme. Joëlle SOBCZAK-THEPOT
Professeur de l’Université Paris VI
Présidente
Mme. Geneviève PRATVIEL
Directeur de Recherche, CNRS)
Rapporteur
M. Eric DEFRANCQ
Professeur de l’Université de Grenoble 1
Rapporteur
M. Vincent GELI
Directeur de Recherche, CNRS
Examinateur
Mme. Carole SAINTOME
Maître de Conférence de l’Université Paris VI
Directeur de thèse
M. Jean-François RIOU
Professeur du Muséum National d’Histoire Naturelle
Co-directeur de thèse
A la mémoire de mon oncle Souheil
A mon amour Wassim
A la source de mon bonheur Léa
A toute ma famille
Remerciements
Je remercie vivement le docteur Geneviève Pratviel et le professeur Eric Defrancq d’avoir accepté
d’être rapporteurs de cette thèse. Je remercie également le professeur Joëlle Sobczak-Thepot de
m’avoir fait l’honneur de présider mon jury de thèse, ainsi que le docteur Vincent Géli d’avoir accepté
d’être membres du jury et d’évaluer ce travail.
Je tiens à remercier Mme Carine Giovannangeli pour m’avoir accueillie au sein du laboratoire
« Régulation et Dynamique du génome ».
Je remercie chaleureusement Mme Carole Saintomé pour son encadrement et pour tout ce
qu’elle m’a apporté pendant ces années de thèse et surtout pour m’avoir donné la chance d’arriver
jusqu’au là. Je la remercie pour sa patience, sa confiance et son soutien qu’elle m’a toujours accordés.
Tu m’as beaucoup appris, merci !
J’exprime ma reconnaissance et ma gratitude à M. Jean-François Riou pour ses conseils précieux,
ses connaissances scientifiques et son soutien tout au long de ma thèse.
Un grand Merci à Xénia, pour les discussions que nous avons eues, pour le temps qu’elle m’a
consacré et pour tout ce qu’elle m’a appris…
Je remercie également Mme. Chantal Trenteseaux et Mme Nathalie Rousselet pour leurs
conseils, leur qualité humaine et leur gentillesse.
Mes remerciements vont également à Mme Emmanuelle Delagoutte pour ses conseils et son
aide dans la purification de RPA.
Merci à Mme Patrizia Alberti pour les expériences de dichroïsme circulaire et ses explications.
Je voudrais adresser un remerciement aux membres du laboratoire surtout à Hind, Céline,
Charlotte, François, Jean, Julien, Vivien et Coralie pour leur gentillesse et sympathie. Je remercie
également tous les membres de l’équipe JFR pour leurs conseils et le temps consacré pour écouter nos
répétitions et nos présentations.
A vous Asta, Najah, Ivana, Abdel et Adrian cette aventure n’aurait pas été la même si je ne vous
ai pas rencontrés. Merci pour votre amitié, votre soutien permanent et les bons moments partagés
ensemble.
Je remercie mes amies Layal et Samar pour m’avoir écoutée et soutenue pendant les périodes
dures de la thèse…J’ai eu de la chance de vous rencontrer les filles.
Des personnes plus intimes méritent des remerciements plus profonds, à eux je dédie ce
travail..... Je remercie ceux qui ont fait de moi ce que je suis, ceux grâce à qui tant d'années d'études
ont été possibles, ma mère et mon père. C’est à vous que je dois cette réussite, et j’ai le plaisir de vous
l’offrir. Je remercie du fond de mon cœur mes frères Ali et Hassan. Je remercie toute ma famille
particulièrement ma tante Lama qui m’a toujours soutenue et encouragée.
A toi tonton ! Je sais que tu attendais ce jour comme je l’attendais…
Je voudrais remercier celui qui a toujours été là pour m’écouter se plaindre et supporter ma
mauvaise humeur, surtout à la fin de ma thèse. Merci à toi, Wassim, pour m’avoir aidée pour arriver
jusqu’au là. Merci pour ton amour.
Enfin, à mon trésor le plus précieux, à mon amour éternel, à la source de ma force et de mes
joies, ma fille Léa. Merci pour m’avoir remonté le moral avec ton sourire et ton regard angélique…
TABLE DES MATIERES
Introduction .......................................................................................................................................1
Chapitre I: Les télomères.....................................................................................................................3
I. Historique ............................................................................................................................................5
II. Fonctions ............................................................................................................................................6
III. Composition des télomères humains ................................................................................................ 7
III.1. L’ADN télomérique ...................................................................................................................7
III.2. Les protéines télomériques ........................................................................................................9
III.3. Facteurs accessoires du complexe Shelterin ............................................................................12
IV. Structures des télomères humains ..................................................................................................13
IV.1. La t-loop...................................................................................................................................13
IV.2. Les G-quadruplexes (G4) ........................................................................................................15
IV.2.1. Généralités ........................................................................................................................15
IV.2.2. G-quadruplexe télomérique humain..................................................................................18
IV.3. G-quadruplexe in vivo..............................................................................................................22
IV.4. Fonctions biologiques des G-quadruplexes ............................................................................23
IV.5. Protéines reconnaissant les G-quadruplexes. ...........................................................................24
IV.6. G-quadruplexe et t-loop ...........................................................................................................26
Chapitre II: La réplication des télomères ........................................................................................27
I. Généralités .........................................................................................................................................29
II. Le problème de la réplication terminale. ........................................................................................29
III. Formation de l’extremité télomérique ............................................................................................31
IV. Les obstacles de la réplication des télomères. ................................................................................32
V. Le complexe CST humain ...............................................................................................................33
V.1. Généralités ................................................................................................................................ 33
V.2. Structure du CST humain ..........................................................................................................34
VI. Mécanismes impliqués dans le maintien des télomères .................................................................35
VI.1. La télomérase ...........................................................................................................................36
VI.1.1. Structure de la télomérase .................................................................................................36
VI.1.2. La sous-unité catalytique TERT .......................................................................................37
VI.1.3. L’ARN de la télomérase (TER) ........................................................................................38
VI.1.4. Les autres composants de la télomérase ...........................................................................39
VI.2. Mode d’action de la télomérase ............................................................................................... 40
VII. Maintien des télomères par le mécanisme ALT ...........................................................................42
VII.1. Phénotype des cellules ALT ...................................................................................................42
VII.1.1. T-circles et C-circles ........................................................................................................44
VII.1.2. APBs (Associated PML Bodies) .....................................................................................45
VII.2. Mécanisme ALT .....................................................................................................................46
VII.3. Facteurs protéiques du mécanisme ALT ................................................................................49
Chapitre III: RPA aux télomères ......................................................................................................51
I. Historique et généralités ....................................................................................................................53
II. Les fonctions de RPA aux télomères ............................................................................................... 54
II.1. La réplication des télomères ......................................................................................................54
II.2. Le maintien des télomères par la télomérase ............................................................................55
II.3. Le maintien des télomères par le mécanisme ALT ..................................................................57
III. Interactions RPA – ADNsb ............................................................................................................58
III.1. Le motif OB-fold .....................................................................................................................58
III.2. Caractéristiques des interactions .............................................................................................. 59
III.3. Site et mode de liaison sur l’ADN simple brin ........................................................................61
III.3.1. Mode de liaison 8-10-nt ....................................................................................................62
III.3.2. Mode de liaison 12-23-nt ..................................................................................................63
III.3.3 Mode de liaison 23-27-nt ...................................................................................................64
III.3.4. Mode de liaison 30-nt ........................................................................................................65
III.4. Mode de liaison séquentiel de la RPA humaine ......................................................................69
III.5. Les domaines de phosphorylation ............................................................................................71
III.5.1. Le domaine N-terminal de RPA2 ......................................................................................71
IV. Interactions RPA G-quadruplexe ...................................................................................................73
V. POT1 humaine .................................................................................................................................76
V.1. Les fonctions de hPOT1 aux télomères ....................................................................................76
V.2. Interactions hPOT1 – ADNsb ...................................................................................................77
V.3. Interactions hPOT1 – G quadruplexe........................................................................................79
VI. RPA versus POT1 aux télomères : adversaires ou amis ? .............................................................. 81
Chapitre IV: Les ligands G4 ..............................................................................................................85
I. Généralités .........................................................................................................................................87
II. Types de ligand G4 et interaction avec les G-quadruplexes ............................................................89
III. Ligands G4 : effet biologique .........................................................................................................91
III.1. Effet des ligands G4 sur la prolifération et le cycle cellulaire ...............................................91
III.2. Effet des ligands G4 sur la taille des télomères ......................................................................92
III.3. Dysfonction télomérique et altération de l’extension simple brin télomérique .......................93
III.4. Activation de voies de réponses aux dommages de l’ADN .....................................................94
III.5. Altération de la réplication.......................................................................................................94
III.6. Effet des ligands G4 sur la trancription et la traduction ..........................................................95
IV. Propriétés du 360A-Br et du 9944 ..................................................................................................96
Objectifs du projet de thèse .......................................................................................................99
Résultats et discussion................................................................................................................103
I. Etude du mécanisme de liaison et d’ouverture des G-quadruplexes télomériques humains par la RPA
humaine ..............................................................................................................................................105
I.1. Introduction .............................................................................................................................. 105
I.2. Résultats: Article ......................................................................................................................105
I.3. Conclusion et perspectives .......................................................................................................136
II. Effet biologique du 9944 dans les cellules ALT ............................................................................138
II.1. Introduction ............................................................................................................................. 138
II.2. Matériels et méthodes: ............................................................................................................139
II.3. Résultats ..................................................................................................................................145
II.3.1. Effets du 9944 sur la prolifération et le cycle cellulaire de la lignée ALT MRC5V1 ....145
II.3.2. Le 9944 induit des dommages de l’ADN .........................................................................148
II.3.2.1. Le 9944 n’induit pas de défaut de transcription de l’ADNr ......................................149
II.3.2.2. Le 9944 induit des dommages de l’ADN ..................................................................151
II.3.3. Effet du 9944 sur RPA et les télomères ............................................................................154
II.3.3.1. RPA est présente dans les APBs des MRC5V1 .........................................................154
II.3.3.2. Effet du 9944 sur la localisation, l’expression et la phosphorylation de RPA ..........156
II.3.3.3. Effets télomériques du 9944 ......................................................................................161
II.4. Discussion et perspectives .......................................................................................................163
Conclusions générales ................................................................................................................169
Bibliographie .................................................................................................................................173
Liste des figures
Figure 1. Image de microscopie de chromosomes de cellule humaine présentant les télomères aux
extrémités
Figure 2. Structure primaire de l’ADN d’un télomère humain
Figure 3. L’ADN télomérique humain associé aux protéines du complexe Shelterin
Figure 4. Les différents états du complexe Shelterin
Figure 5. t-loop
Figure 6. Modèle de la formation de la t-loop par TRF1 et TRF2
Figure 7. Modèle de résolution des structures t-loop
Figure 8. G-quartet et G-quadruplexe
Figure 10. Les diffèrentes conformations possibles des boucles latérales d’un G-quadruplexe
intramoléculaire
Figure 11. Structures de G4 anti-parallèle, parallèle et hybride
Figure 12. Représentation schématique des structures G-quadruplexe intramoléculaires formées par la
séquence télomérique humaine
Figure 13. Modèle représentant les trois états de l’ADN télomérique humain coexistant et en équilibre
Figure 14. Prédiction des conformations de Tel22 (A(GGGTTA)3GGG) en fonction de la température
et de la concentration en K+
Figure 15. Enchaînement hypothétique de G-quadruplexes intramoléculaires à l’extrémité 3’ sortante
du télomère humain. Succession de G4 homogènes “parallèles” (A) ou “hybrides” (B) ou “mixtes” (C)
(Xu, 2011). Succession de G4
Figure 16. Modèle de boucle formée au cours de la transcription de région riche en G
Figure 17. Schéma représentant la formation d’un ADN G-quadruplexe pendant des évènements
cellulaires
Figure 18. Formation d’un G-quadruplexe /t-loop
Figure 19. La dépendance entre le nombre de divisions cellulaires et la taille des télomères dans
différents types cellulaires
Figure 20. Le problème de la réplication des extrémités: Les étapes de la réplication sur les brins direct
(leading) et indirect (lagging)
Figure 21. Modèle de formation du G-overhang télomérique
Figure 22. Les activités du complexe Shelterin et des facteurs de réplication au cours de la réplication
des télomères.
Figure 24. Schéma des domaines protéiques de CST de différentes espèces (l’Homme, Arabidopsis
thaliana, S. pombe et S. cerevisiae) et de RPA humaine
Figure 25. Modèle des différents domaines de TERT
Figure 26. L’organisation des domaines de TERT
Figure 28. . Les étapes d’élongation de l’ADN télomérique humain par la télomérase humaine (Sabatier
et al., 2006)
Figure 29. Les échanges au niveau télomérique dans les cellules ALT et les différentes formes adoptées
par l’ADN extra-chromosomique
Figure 30. Modèle hypothétique de la formation des APBs dans les cellules ALT.
Figure 31. Les modèles d’élongation des télomères par le mécanisme ALT.
Figure 32. Les différents modèles de recombinaison homologue dans les cellules ALT.
Figure 33. La RPA et le métabolisme de l’ADN
Figure 34. Modèle d’action de Taz1 et RPA aux télomères
Figure 35. Activité de la télomérase pendant le cycle cellulaire.
Figure 36. Structure du motif OB-fold
Figure 37. Domaines structuraux et fonctionnels de RPA.
Figure 38. Séquences des DBD A et B de RPA1 alignées et la structure du complexe formé entre les
DBD A et B de la RPA70 et le polyC.
Figure 39. Comparaison des structures des domaines DBD C et DBD B.
Figure 40. Comparaison des structures cristallines des DBD E (A), DBD D (B) et DBD B (C).
Figure 41. Modèle de liaison proposé pour un 26mer
Figure 42. Structure cristalline d’un dimère du trimère DBD C, D et E.
Figure 43. Modèle schématique des modes de liaison 30, 13-22nt et 8-10nt
Figure 44. Structure cristalline de la RPA tronquée du domaine N-terminal (OBN) avec un polyT
Figure 45. Représentation schématique des contacts RPA-ADNsb.
Figure 46. Modèle suggéré pour la formation de l’hétérotrimère.
Figure 47. Modèle de fixation séquentielle polarisée de RPA sur l’ADNsb.
Figure 48. Modèle de régulation de la RPA par la phosphorylation.
Figure 49. Modèle sequentiel de la liaison de hRPA au G-quadruplexe représenté par F-hTelo-T
Figure 50. Les différentes constructions des domaines de RPA utilisées dans l’étude de Prakash
Figure 51. Modèle de découplage de fourche de réplication en absence de WRN
Figure 52. Structure des protéines POT1 et TPP1 humaines (Wang et al. 2007)
Figure 53. Structure de hPOT1-ADN simple brin
Figure 54. Structure du domaine N-terminal de TPP1 contenant le motif OB-fold
Figure 55. Modèle d’activation de la télomérase par déroulement des structures G-quadruplexes par
hPOT1
Figure 56. Modèles statique passif et stérique dynamique de modulation des structures G-quadruplexes
télomériques par POT1
Figure 57. Modèles de liaison et d’ouverture du G-quadruplexe par POT1 ou POT1-TPP1
Figure 58. Modèle d’interaction du Sheterin avec l’ADN télomérique permettant le positionnement de
POT1-TPP1 via TIN2 et empêchant la liaison de RPA aux télomères
Figure 59. Modèle schématique de la coordination des fonctions de RPA et POT1 aux télomères
Figure 61. Modèle représentant la stratégie d’inhibition de la télomérase par les ligands de G4
Figure 62. Structures de quelques ligands G4
Figure 63. Représentation schématique des différents sites d’interaction entre ligand G4 et G4
Figure 64. Structure chimique des ligands G4
Figure 65. Illustration schématique des rôles possibles des G-quadruplexes des régions 5’-UTR de
l’ARN
Figure 66. Structure chimique du 360A-Br et du 9944
Figure 67. Effet du 9944 (3 et 6 µM) sur la prolifération de la lignée MRC5V1 au cours du temps
Figure 68. Le cycle cellulaire analysé par cytométrie de flux des cellules non traitées et traitées au 9944
pendant 4,8 et 12 jours
Figure 69. Analyse du point de contrôle G2/M par cytométrie de flux
Figure 70. Analyse de la localisation de RPA par immunofluorescence
Figure 71. Analyse de l’expression de ɣH2AX par western blot
Figure 72. Le cycle cellulaire analysé par cytométrie de flux des cellules non traitées et traitées au
9944 pendant 1,2, 3 et 4 jours
Figure 73. Analyse de la cinétique d’expression de ɣH2AX par western blot dans les cellules MRC5V1
non traitées et traitées par le 9944 entre 2h et 24h et entre J1 et J4.
Figure 74. Analyse de la colocalisation de RPA / TOPOIIIα par immunofluorescence
Figure 75. Analyse de la colocalisation RPA/PML par immunofluorescence
Figure 76. Analyse de l’effet du traitement au 9944 sur la localisation de RPA et PML par
immunofluorescence
Figure 77. Quatification du nombre de foyers RPA, PML et RPA/PML
Figure 78. Analyse de l’expression de RPA2 par western blot
Figure 79. Analyse de l’expression de RPA2(S33) par western blot
Figure 80. Analyse de l’effet du traitement au 9944 sur la localisation de RPA et TRF2 par
immunofluorescence
Figure 81. Analyse de l’effet du traitement au 9944 sur la taille des télomères par TRF
Liste des abréviations
ADN: Acide DésoxyRibonucléique
ALT: Alternative lengthening of telomeres
APBs: ALT associated PML bodies
ARN: Acide Ribonuléique
ATM: Ataxia telangiectasia mutated
ATP: Adénosine Triphosphate
ATR: ATM and Rad3 related
Bcl-2: B-cell lymphoma 2
BLM: Bloom syndrome protein
BSA: Bovine serum Albumin
C: Cytosine
CDK: Cyclin dependant Kinase
ChIP: Chromatin Immunoprecipitation
chk1: checkpoint kinase 1
chk2: checkpoint kinase 2
CI50: Concentration Inhibitrice de 50% de l'activité
c-myc: Myelocytomastosis
CO-FISH: Chromosome orientation-Fish
CTC1: conserved telomere maintenance component 1
DC: Dyskératose congenitale
D-loop: Displacement loop
DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO: Dimethyl sulfoxyde
ECTR: extra-chromosomal Telomeric DNA
EDTA: Ethylène Diamine Tetra-Acetate de sodium
ERCC1: Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1
FANCD2: Fanconi anemia D2 (FANDC2) Phosphospecific
FEN1: Flap structure-specific endonuclease 1
FISH: Fluorecence In Situ Hybridization
G: Guanine
GAR1: H/ACA ribonucleoprotein complex subunit 1
GQN1: G quartet nuclease 1
HIV: Human immunodeficiency virus
kb: kilobase
kDa: kilo-Dalton
MRE11: MRE11 meiotic recombination 11
NOP1: nucleolar RNP protein
p16: protein 16
p21: protein 21
p53: protein 53
pb : paire de bases
PBS : Phosphate Buffered Saline
PIKK: Phosphoinositide 3-Kinase related Kinase
PML: promyelocytic leukemia
Polα: Polymérase alpha
PPM1D: Protein phosphatase 1D
Rap1: Repressor activator protein 1
RFA1: Replication Factor A
Rif 1: Rap1 interacting factor 1
Rif 2: Rap1 interacting factor 2
RMN: Résonance Magnétique Nucléaire
RPA: Replication protein A
RTEL1: Regulator of telomere elongation helicase 1
ScRNA: small cytoplasmic RNA
shARN: small hairpin RNA
siRNA: small interfering RNA
SMC: Structure maintenance of telomere complex
snoRNA: small nucleolar RNA
STELA: Single telomere length analysis
STN1: Suppressor of cdc 13
SUMO: Small Ubiquitin-like MOdifier
SV40 : Simian Virus 40
SVF : Sérum de Veau Fœtal
TBE: Tris/Borate/EDTA
TEN1: Telomere length regulation protein
TER: Telomerase RNA
TERRA: Telomeric Repeat containing RNAPNUTS
TERT: Telomerase Reverse transcriptase
TIF: dysfunctional Telomeric -Induced Foci
TIN2: TRF1 and TRF2 Interacting Nuclear protein 2
t-loop: Telomeric loop
Top2α: Topoisomérase 2 alpha
TOPOIIIα: Topoisomérase IIIα
TRAP: Telomeric Repeat Amplification Protocol
TRF1: Telomeric repeat binding factor 1
TRF2: Telomeric repeat binding factor 2
Tris-HCl : Hydrochlorure de Tris(hydroxyméthyl)aminométhane
T-SCEs: Telomeric- sister chromatids exchanges
TSS: Transcription start site
UTR: Untranslated region
WH: wild type Homo sapiens
WRN: Werner syndrome protein
XPF: Xeroderma pigmentosum Factor
Introduction
1
2
Chapitre I: Les télomères
3
4
I. Historique
Le nom «télomère» signifie en grec telos (fin) et mere (segment), c’est à dire la fin des
chromosomes ou plus communément les extrémités des chromosomes. La découverte des
télomères remonte aux années 1930, lorsque H.J. Muller observa que des délétio ns ou des
inversions induites par irradiation aux rayons X de l’ensemble du génome étaient quasiment
indétectables dans les régions terminales des chromosomes de drosophile (Muller, 1938). Il en
conclut que les extrémités des chromosomes, qu’il nomma télomères, devaient posséder une
structure particulière capable de stabiliser les chromosomes (Figure 1). À la même époque, B.
McClintock démontrait que des chromosomes du maïs ayant subi des cassures double brin étaient
capables de fusionner entre eux, contrairement à leurs extrémités naturelles qui demeuraient
stables (McClintock, 1939). Suite à ces résultats, les auteurs définirent le télomère comme une
structure particulière susceptible de protéger les chromosomes d’éventuelles fusions de leurs
extrémités.
Figure 1. Image de microscopie de chromosomes de cellule humaine (marqués en bleu) présentant les télomères aux
extrémités (marqués en rouge).
Une vingtaine d’années plus tard, L. Hayflick montra que des cellules humaines de type
embryonnaire, en culture, avaient un potentiel de réplication limité, d’environ 50 divisions (limite de
Hayflick) (Hayflick, 1961). Hayflick montra également que ces cellules embryonnaires, entraient
ensuite dans un état appelé «sénescence réplicative» caractérisé par des changements morphologiques
et biochimiques qui déclenchaient l’arrêt de la prolifération.
5
Dans les années 70, le problème de la réplication terminale a été posé par J.D. Watson: le
complexe enzymatique de l'ADN polymérase s'avère incapable de synthétiser l’extrémité de molécules
d’ADN linéaire; l'ADN télomérique est alors sujet à un raccourcissement qui serait dû à une réplication
incomplète des extrémités (Watson, 1972). La relation qui existe entre la longueur du télomère et le
vieillissement a été mise en évidence par A. Olovnikov, il proposa une hypothèse reliant la sénescence
cellulaire et le problème de réplication. Il expliqua la prolifération limitée des cellules par l’érosion des
télomères à chaque division cellulaire (Olovnikov, 1973). Ainsi, le raccourcissement télomérique
correspond à une horloge interne du vieillissement.
En 1985, l’équipe d’E. Blackburn a pu identifier chez le cilié Tetrahymena une enzyme appelée
«la télomérase» qui assure la stabilité des télomères au cours des divisions cellulaires successives
(Greider and Blackburn, 1985). Cette découverte, récompensée par le prix Nobel de Physiologie ou
Médecine en 2009, fut la réponse au problème de la réplication terminale des chromosomes. La
télomérase est une réverse transcriptase ribonucléoprotéique, responsable de l’élongation d’un brin du
télomère, évitant ainsi la perte progressive de séquences télomériques. L’enzyme est exprimée
préférentiellement dans les cellules tumorales, qui ont des télomères courts (Morin, 1989) et est
quasiment absente dans la plupart des cellules somatiques normales qui possèdent habituellement de
longs télomères. Le télomère et la télomérase assurent alors une fonction qui se situe à la croisée de
deux thèmes de recherche : le vieillissement et le cancer.
Toutefois, T.M. Bryan et E.M. Rogan observèrent que des cellules de mammifères ne montrant
aucune activité télomérase étaient capables de maintenir la taille de leurs télomères (Bryan et al., 1995;
Rogan et al., 1995). Cette découverte mit en évidence l’existence d’un nouveau mécanisme nommé
ALT (Alternative Lengthening of Telomeres) capable de maintenir la longueur des télomères, en
l’absence de la télomérase et basé sur des recombinaisons homologues entre les télomères (Bryan et
al. 1997; Dunham et al. 2000).
II. Fonctions
Les télomères jouent un rôle essentiel dans la protection du matériel génétique (Blackburn
2001) vis-à-vis :
6
- des cassures double brin et de l’érosion due aux divisions cellulaires (Bertuch and Lundblad,
1998).
- d’éventuelles lésions de l’ADN afin de maintenir l’intégrité du génome.
- de la dégradation par les nucléases et des phénomènes de recombinaison et de fusion
chromosomique (Zakian, 1995). Ainsi, le complexe nucléoprotéique constitué par l’ADN télomérique
et des nombreuses protéines associées est souvent décrit comme étant une structure “coiffante”
(“capping structure”).
Ils permettent aussi de contrôler le nombre de divisions des cellules somatiques et d’induire à
terme la sénescence cellulaire et/ou l’apoptose. Ces caractéristiques ont permis de leur attribuer le rôle
d’horloge mitotique (Harley, 1991). En effet, leur raccourcissement au fur et à mesure des divisions
cellulaires, produit un signal d’arrêt de la prolifération par entrée en sénescence réplicative. De plus, le
télomère empêche l’activation des protéines de contrôle du cycle cellulaire qui reconnaissent les
dommages à l’ADN et qui déclenchent l’apoptose ou la sénescence.
Outre les fonctions citées ci-dessus, les télomères pourraient d’une part avoir un rôle dans
l’organisation et la répartition des chromosomes dans le noyau, et dans la ségrégation des chromosomes
au moment de la mitose et de la méiose (Pandita et al., 2007) ; et d’autre part, un rôle dans la répression
de l’expression de gènes dans les régions sub-télomériques (Tham and Zakian, 2002).
III. Composition des télomères humains
Les télomères sont des structures nucléoprotéiques particulières présentes aux extrémités des
chromosomes eucaryotes dont l’intégrité est vitale pour la croissance de la cellule. Les structures
télomériques, appelées aussi capuchons télomériques «telomeric cap», sont constituées par
l’association de l’ADN télomérique et de protéines spécifiques.
III.1. L’ADN télomérique
L’ADN télomérique est constitué d’une région double brin et d’une extension simple brin du
côté 3’, nommée G-overhang. Dans la majorité des cellules eucaryotes, l’ADN télomérique consiste
en une séquence répétée, arrangée en tandem, non codante qui varie d’une espèce à une autre. Cette
7
séquence est le plus souvent riche en guanine sur le brin orienté de 5' en 3' vers l'extrémité du
chromosome (Figure 2).
3’
5’
3’
5’
Figure 2. Structure primaire de l’ADN d’un télomère humain
La séquence 5’GGGTTA3’ représente l’extrémité des chromosomes des vertébrés ; d’autres
séquences télomériques ont été identifiées chez les protozoaires, les levures et les végétaux supérieurs
(Tableau 1). Le premier motif télomérique TTGGGG a été caractérisé chez le cilié Tetrahymena
thermophila par E. Blackburn (Blackburn and Gall, 1978). Le séquençage de l’ADN télomérique chez
les différentes espèces montre que la séquence d’ADN aux extrémités des chromosomes est
relativement bien conservée, ce qui démontre son importance fonctionnelle. La taille moyenne des
télomères varie selon l’espèce, le type de cellule et les différents chromosomes. Chez l’homme, la taille
des télomères varie entre 2 et 15 kb pour la région double brin, et entre 150 et 300 bases pour la région
simple brin (Morin, 1989; Lebel et al., 2004).
Organsime
Protozoaires
Tetrahymena
Levure
Saccharomyces
cerevisiae
Longueur
télomérique
Répétition télomérique
250-350 pb
T2G4
TG2-3(TG)1-6
300 pb
Plantes
Chlamydomonas
2-9 kb
T3AG3
Invertébrés
Ascaris
10000 pb
T2AG2C
Vertébrés
Homme
5-15 kb
T2AG3
Tableau 1. Séquences télomériques de quelques organismes (Wellinger and Sen., 1997)
8
III.2. Les protéines télomériques
Les protéines spécifiques des télomères humains forment un complexe nommé Shelterin ou
«télosome» (De Lange, 2005). Le Shelterin fait environ 1 MDa ; il est composé de 6 protéines (Tableau
2). Il reconnaît spécifiquement les répétitions télomériques TTAGGG grâce à trois protéines: TRF1 et
TRF2 (Telomeric Repeat binding Factor 1 et 2) qui se lient à la partie double brin télomérique, et POT1
(Protection Of Telomeres 1) qui s’associe aux répétitions TTAGGG simple brin de l’extrémité 3’
(Figure 3). Les autres protéines du complexe Shelterin, TIN2 (TRF2- and TRF1-Interacting Nuclear
protein 2), Rap1 (Repressor Activator Protein 1), et TPP1 servent d’adaptateurs entre TRF1, TRF2 et
POT1. En absence de l’ADN télomérique, le Shelterin forme un complexe stable dans des extraits
nucléaires de cellules et peut être isolé par tamisage moléculaire (Liu et al., 2004).
Protéine
TRF1
Fonctions
Protection des télomères et recombinaison (1)
Régulation de la taille des télomères(1)
Inhibition de la réponse aux dommages de l’ADN (1)
Réplication des télomères (2)
TRF2
Régulation de la taille des télomères (1)
Inhibition de la réponse aux dommages de l’ADN(1)
Protection du brin G (3)
Inhibition de la réponse aux dommages de l’ADN (1)
POT1
TIN2
Rap1
Inhibition de la réponse aux dommages de l’ADN(1)
Répression des gènes subtélomériques (4)
Régulation transcriptionnelle (4); (5)
Activateur de la signalisation NF- κB (5)
TPP1
Recrutement de la télomérase (6)
Tableau 2. Tableau récapitulatif des rôles télomériques et extra-télomériques des protéines du complexe Shelterin ;
(1) (De Lange, 2005); (2) (Sfeir et al., 2009); (3) (Wu et al., 2006; Hockemeyer et al., 2006); (4) (Martinez et al., 2010);
(5) (Teo et al., 2010); (6)(Abreu et al., 2010)
9
Figure 3. L’ADN télomérique humain associé aux protéines du complexe Shelterin (Xu, 2011)
Les interactions entre ces protéines et l’ADN télomérique permettent la protection des
télomères. En effet, le Shelterin permet aux cellules de faire la distinction entre les extrémités
naturelles des chromosomes et les cassures d’ADN. Il protège les télomères contre la réparation par
recombinaison homologue ou non homologue, induisant la fusion, et contre la dégradation. Le
Shelterin est impliqué également dans la régulation de la longueur des télomères en contrôlant l’accès
de la télomérase à l’ADN télomérique ou en remodelant la chromatine. L’inhibition fonctionnelle de
chacune des protéines du Shelterin, par ARN interférence ou par la surexpression d’un dominant
négatif, affecte la protection ou la taille des télomères et déclenche un dysfonctionnement télomérique
(De Lange, 2005; Takai et al., 2011; Diotti and Loayza, 2011). Un modèle de régulation de la longueur
et de la protection du télomère, en fonction de l’état du complexe Shelterin a été proposé. Ce modèle
envisage l’existence de ce complexe dans deux ou trois états possibles:
- un état “ouvert” dans lequel les protéines du télosome sont présentes et protègent l’ADN
télomérique mais laissent l’extrémité 3’ accessible à la télomérase, durant les étapes d’élongation et de
réplication du télomère notamment (Figure 4A).
- un état fermé ou “capuchonné” dans lequel l’extrémité 3’ sortante n’est pas accessible aux
réactions enzymatiques de dégradation, de réparation ou d’élongation par la télomérase (Figure 4B).
- un état “décapuchonné”, dans lequel certaines protéines du complexe sont altérées, conduisant
à la perte du shelterin et donc entraînant une réponse aux dommages de l’ADN liée à la reconnaissance
de cassures double brin et l’apparition de “dysfunctional Telomere-Induced Foci” (TIFs) (Figure 4C).
10
Figure 4. Les différents états du complexe Shelterin: (A) le télomère «ouvert» ; (B) le télomère “fermé” replié en tloop. POT1 se lie au brin G déplacé par l’invasion de l’extrémité 3’; (C) Le télomère « décapuchoné » : en absence
des protéines Shelterin (TRF2, TIN2, ou POT1), les télomères sont reconnus par les facteurs de réponse au dommage
d’ADN formant ainsi les TIFs. Les dommages aux télomères activent la kinase ATM, qui aboutit à un arrêt du cycle
cellulaire en G1/S dépendant de p53 et qui induirait l’apoptose ou la sénescence (De lange, 2005).
11
III.3. Facteurs accessoires du complexe Shelterin
Le complexe Shelterin est essentiel pour la protection des télomères. Toutefois des protéines
ne faisant pas partie de ce complexe, interviennent également dans l’homéostasie et la protection des
télomères (Tableau 3). Elles sont peu abondantes et interagissent soit directement avec l’ADN comme
le complexe MRE11 (Deng et al. 2009), soit avec le complexe Shelterin comme la nucléase Apollo
(Wu et al. 2010).
Rȏle
Protéines accessoires
Protéines associées à TRF1
Tankyrase 1,2
PINX1
ATM
PARsylation de TRF1; protection
Inhibiteur de la télomérase
Phosphorylation de TRF1; regulation de la longueur
des télomères
Inhibition de HDR (Homologous Direct Repair)
Ubiquitination et degradation de TRF1
Repliement et dimérisation de TRF1
Ku 70/80
FBX4/Nucleostermin
PIN1/GNL3L
Protéines associées à TRF2
Apollo
Complexe ORC
ATM
Complexe MRE11
Interaction avec l’extension simple brin télomérique
Protection des télomères
Inhibée par l’association à TRF2
Interaction avec l’extension simple brin des
télomères en dysfontion et régulation de la taille des
télomères
Interaction avec l’extension simple brintélomérique
Réplication des chromosomes à partir des télomères
et suppression des T-SCE
Inhibition de HDR et suppression des cercles-T
chromosomiques
Régulation de la taille des télomères
Protection des télomères
XPF-ERCC1
WRN/FEN1
Ku70/80
PNUTS
MCPH1
Autres facteurs
ATR
Facteurs de recombinaison
XRCC3/RAD51/RTEL1
Facteurs de méthylation
TEIP6/LPP
PRMT1
Activée par la déplétion de POT1 et TPP1
Maintien des télomères et dégradation des télomères
Recrutement de la méthylase
Méthylation et Modification de TRF2
Tableau 3. Les protéines accessoires du complexe Shelterin et leurs fonctions (Diotti and Loayza, 2011)
12
IV. Structures des télomères humains
IV.1. La t-loop
Des études de microscopie électronique sur des extraits télomériques purifiés de cellules
humaines et de souris, ont permis de visualiser une structure t-loop (pour boucle télomérique,
«Telomeric-loop») stabilisée par un pontage au psoralène ou aux UV (Griffith et al., 1999; Stansel et
al., 2001) (Figure 5A). Une telle conformation a également été mise en évidence dans Trypanosoma
brucei (Muñoz-Jordán et al., 2001), le petit pois (Cesare et al., 2003), les ciliés (Murti and Prescott,
1999) et dans des cellules de poulet et de souris (Nikitina and Woodcock, 2004). De manière
comparable aux premières étapes de la recombinaison homologue, cette large boucle résulterait de
l’invasion de l’extrémité 3’ sortante riche en guanine dans la région double brin télomérique (Figure
5B). Le brin G de l’ADN double brin, déplacé par l’extrémité 3’, forme la D-loop (Displacement tloop). La formation de cette structure serait permise pour une taille relativement longue du simple brin
télomérique, et grâce à l’association de protéines telles que TRF1 et TRF2. Il a été suggéré qu’au moins
100 nucléotides de l’extrémité simple brin participent à la formation de cette t-loop. La taille de la
boucle est variable puisque des t-loops de 1 kb ainsi que de 25 kb ont été observées dans les cellules
humaines (Griffith et al., 1999; Stansel et al., 2001). Cette structure, par association avec les protéines
télomériques, permettrait d’éviter la dégradation du télomère et les fusions télomériques et jouerait
donc un rôle protecteur (De Lange, 2004).
A.
B.
Figure 5. (A) Image en microscopie électronique : large boucle formée par de l’ADN télomérique extrait de cellules
HeLa (noyaux traitées au psoralène et irradiation UV) (Griffith et al., 1999) ; (B) Modèle de la structure t-loop
(Greider, 1999)
13
In vitro, la formation de la t-loop est médiée par la protéine télomérique TRF2, une des
protéines du complexe Shelterin (Griffith et al., 1999; Stansel et al., 2001). Toutefois, in vivo, il
semblerait que TRF2 nécessite l’intervention d’autres protéines pour générer la t-loop (Stansel et al.,
2001; Amiard et al., 2007). Un modèle de la formation de la t-loop a été proposé en 1999 (Griffith et
al., 1999) (Figure 6). Ce modèle suggèrant en premier temps le repliement de l’ADN par TRF1, puis
le maintien de la t-loop formée par TRF2. Ce modèle a été confirmé plus tard par l’étude de T. De
lange en 2005 (De Lange, 2005).
Figure 6. Modèle de la formation de la t-loop par TRF1 et TRF2 (Griffith et al., 1999)
Une étude sur les cellules de souris a montré que la t-loop peut être résolue par l’hélicase
RTEL1. Le déroulement de la t-loop permettrait ainsi la réplication des télomères (voir chapitre II
paragraphe IV). La délétion du gène codant RTEL1, déclenche un raccourcissement des télomères. En
absence de RTEL1, le complexe nucléase SLX4 résout les t-loop en t-circles (Telomere-circles)
conduisant à un raccourcissement des télomères (Figure 7) (Vannier et al., 2012).
14
Figure 7. Modèle de résolution des structures t-loop en présence (A) et en absence (B) de RTEL1 (Vannier et al.,
2012)
IV.2. Les G-quadruplexes (G4)
IV.2.1. Généralités
La structure d’ADN en double hélice proposée par Watson et Crick n’est pas la seule forme
adoptée par l’ADN. En 1962, M. Gellert et son équipe ont observé la formation d’agrégats gélatineux
dans une solution à forte concentration d’acide guanylique, correspondant à la présence de quartets de
guanine (ou G-quartet), l’unité constitutive d’un G-quadruplexe (Gellert et al., 1962).
Un G-quartet est décrit comme étant un plateau de 4 guanines appariées entre elle par des
liaisons hydrogène de type Watson Crick (entre N (1) et O (6)) et stabilisées par des liaisons de type
Hoogsteen (entre (N(7) et NH2) (Figure 8A).
15
Les G-quadruplexes (G4) (Figure 8B) sont des structures secondaires que peuvent adopter les
acides nucléiques (ADN ou ARN) riches en guanine suite à l’empilement hydrophobe d’au moins 2 Gquartets, intercalant un cation monovalent dans la cavité centrale (Figure 8C). Le cation est chélaté par
les 4 oxygènes des fonctions carbonyles des guanines. Le nombre de G-quartet est équivalent au
nombre de guanines adjacentes dans la séquence primaire de l’ADN comportant les répétitions en G
(Riou et al., 2003).
A
B
C
Figure 8. . (A) G-quartet; (B) G-quadruplexe présentant 3 quartets de guanine; (C) Empilement de deux quartets
de Guanine intercalant un cation (en Jaune).
La formation d’un G-quadruplexe implique une structure primaire d’ADN contenant au moins 4
paires de G pouvant se situer sur des molécules d’ADN différentes dans le cas d’un G-quadruplexe
intermoléculaire à 4 brins (Figure 9A) ou 2 brins (Figure 9B) ou sur le même brin d’ADN pour former
un G-quadruplexe intramoléculaire (Figure 9C).
Figure 9. (A) Modèle de G-quadruplexe intermoléculaire à 4 brins ; (B) Modèle de G-quadruplexe intermoléculaire
à 2 brins (dimérique) ; (C) Modèle de G-quadruplexe intramoléculaire (Riou et al., 2003).
16
La formation des G-quadruplexes intramoléculaires et intermoléculaires dimériques entraîne
l’apparition de boucles nucléotidiques entre les quartets de guanine. L’orientation des brins détermine
la conformation de la boucle. Plusieurs conformations sont possibles : latérale, diagonale, en forme
de «N», ou en forme de «V» (Figure 10).
Figure 10. Les diffèrentes conformations possibles des boucles latérales d’un G-quadruplexe intramoléculaire
Selon l’orientation des brins, un G-quadruplexe peut adopter une structure anti-parallèle (Figure
11A), parallèle (Figure 11B) ou hybride (Figure 11C). Un G-quadruplexe anti-parallèle est caractérisé
par une orientation inverse (5’-3’ puis 3’-5’) des brins successifs permettant l’empilement des plateaux
de guanine, alors que dans un G-quadruplexe parallèle, les brins ont la même orientation. La variabilité
dans la polarité des brins est liée à un changement dans l’enchaînement base - sucre qui peut conduire
à la présence de guanine avec des conformations glycosidiques anti ou syn (pour revue voir (Collie and
Parkinson, 2011). Par ailleurs, la structure anti-parallèle présente trois boucles passant au-dessus et audessous des quartets terminaux: deux boucles centrales et une diagonale. La structure parallèle présente
trois boucles en forme de N passant sur les cȏtés des quartets (Phan and Patel, 2003).
Un G4 hybride correspond à une conformation où certains brins successifs sont parallèles entre
eux puis anti-parallèles. Cette conformation a été identifiée par RMN et elle a été observée avec le Gquadruplexe télomérique humain (Yagi et al., 2008).
A
C
B
Figure 11. (A) G4 anti-parallèle ; (B) G4 parallèle ; (C) G4 hybrid
17
La molécularité, l’orientation des brins et l’arrangement varié des boucles conduisent à un
polymorphisme important des structures G-quadruplexe.
Une séquence riche en G peut adopter en solution diverses conformations en fonction du cation
présent (Sen and Gilbert, 1990). En Na+, la structure qui se forme préférentiellement est anti-parallèle
(Wang and Patel, 1992; Parkinson et al., 2002). En K+, il y a un mélange de plusieurs conformations
avec une structure hybride majoritaire (hybride-1) (Yagi et al., 2008).
La stabilité et la topologie du G-quadruplexe dépendent essentiellement de la nature du cation
central qui est chélaté (Sen and Gilbert, 1988). Les cations sont classés en fonction de leur capacité à
stabiliser les G-quadruplexes selon l’ordre suivant K+>NH4+>Rb+>Na+>Li+=Cs+ (Wu et al., 2003).
Cette différence d’effet des différents ions métalliques peut être expliquée par la taille du cation et par
les niveaux d’interaction entre l’acide nucléique et le cation. Les ions K+ et Na+ sont les cations
majoritaires dans les cellules vivantes. Ainsi, la formation de structures en G4 à partir de séquences
riches en guanine est tout à fait possible dans les conditions physiologiques.
IV.2.2. G-quadruplexe télomérique humain
Chez l’Homme, la séquence télomérique, de motif répété 5’TTAGGG3’, est capable de former
plusieurs structures G4 (Tableau 4). En présence de Na+, la forme majoritaire est la forme
intramoléculaire anti-parallèle (Wang and Patel, 1993). Cette structure présente une orientation antiparallèle des brins reliés par des boucles successivement latérale-diagonale-latérale (Figure 12a).
Par contre, en K+, les études de la structure du G-quadruplexe formé montre un polymorphisme
important révélant des structures parallèle, hybrides et en «panier » (Tableau 4 et Figures 12 b-e).
Structure parallèle: Elle a été observée dans deux conditions d’analyse différentes en solution et dans
un cristal. Dans les deux cas, la structure obtenue présente une orientation parallèle des brins, reliés
par des boucles en forme de «N» (Tableau 4 et Figure 12b). En solution, elle a été observée dans des
conditions particulières, c’est-à-dire en présence du polyéthylène glycol (Parkinson et al., 2002 ; Heddi
and Phan, 2011). La formation de la structure G-quadruplexe en K+, a fait l’objet de plusieurs études
qui ont montré que le repliement du G-quadruplexe dépend des conditions de cristallisation et de la
présence de polyéthylèneglycol (Hänsel et al., 2011).
18
Structures hybrides : L’ajout, l’élimination ou la substitution d’un nucléotide suffisent souvent pour
changer complètement la structure du G4 formé. En effet, en modifiant légèrement les extrémités de la
séquence télomérique humaine, de nouvelles structures G4 ont été obtenues par RMN. Les structures
observées présentent 3 brins parallèles et 1 brin antiparallèle. Ce type de structure est noté sous le nom
de conformations «hybrides» ou (3+1). Tout d’abord, deux formes « hybrides » ont été identifiées : en
K+, la forme «hybride-1» est obtenue majoritairement à partir de la séquence TA(GGGTTA)3GGG et
présente successivement une boucle en “forme de N” et 2 boucles latérales (Figure 12c) (Dai, et al.,
2007a; Phan et al., 2007; Ambrus et al., 2006) tandis que la séquence TA(GGGTTA)3GGGTT conduit
essentiellement à la forme “hybride-2”, contenant successivement 2 boucles latérales et une boucle en
forme «N» (Figure 12d) (Dai, et al. 2007b; Phan et al. 2007). Les G4 télomériques humains sont en
équilibre dynamique entre 2 conformations, “hybride-1” et “hybride-2”. La modification des
extrémités de la séquence télomérique suffit à faire pencher la balance en faveur d’une des 2 structures
(pour revue voir (Yang and okamoto, 2011).
Structure «forme 3»: En 2009, l’équipe de AT. Phan a identifié une nouvelle structure G4
intramoléculaire dite «forme 3» formée par la séquence télomérique humaine (GGGTTA)3GGGT en
K+ (Lim et al., 2009). La « forme» 3 correspond à une structure antiparallèle en panier et ne comporte
que deux G-quartets avec des boucles GTTA et GTTAG (Figure 12e). L’empilement au niveau des
boucles et l’appariement extensif entre les bases que présente la «forme3 » pourraient être à l’origine
de sa stabilité bien supérieure à celle des structures « hybride-1» et « hybride-2 ».
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Figure 12. Représentation schématique des structures G-quadruplexe intramoléculaires formées par la
séquence télomérique humaine: (a) structure anti-parallèle formée en solution (basket-type) par
A(GGGTTA)3GGG en présence de Na+; (b) structure cristalline parallèle (propeller-type) formée par
A(GGGTTA)3GGG en présence du K+; (c) forme (3+1) (hybride-1) observée en solution en présence de K+ pour
TA(GGGTTA)3GGG; (d) forme (3+1) (hybride-2) observée en solution en présence de K+ pour
TA(GGGTTA)3GGGTT; (e) forme 3 observée en solution en présence de K + pour (GGGTTA)3GGGT.
(guanines « anti » (en bleu) ; guanines syn (en rose))
19
Organisme
Homo
sapiens
Séquence
télomérique
Condition
de
formation
Méthode
G4 "antiparallèle"
d[A(G3T2A)3G3]
Na+
RMN
Figure 12a; (1)
G4 "parallèle"
d[A(G3T2A)3G3]
K+
Rayon X
Figure 12b; (2)
G4 "parallèle"
d[TA(G3T2A)3G3]
K+ + PEG200
RMN
Figure 12b; (3) (4)
G4 "hybride-1"
d[TA(G3T2A)3G3]
K+
RMN
Figure 12c; (5)
G4 "hybride-2"
d[TA(G3T2A)3G3T2]
K+
RMN
Figure 12d; (5)
G4 "forme 3"
d[(G3TTA)3G3T]
K+
RMN
Figure 12e; (5)
Tableau 4. Etudes structurales menées sur la séquence télomérique humaine ; (1) (Wang and Patel, 1993); (2) (Wang
and Patel, 1992); (3) (Parkinson et al., 2002 ); (4) Heddi and Phan, 2011; (5) Phan et al., 2007; (6) Lim et al., 2009)
L’analyse thermodynamique par calorimétrie et spectroscopie de la séquence télomérique
humaine A(GGGTTA)3GGG (nommée Tel22) en présence de K+ suggère que la séquence télomérique
humaine se présente sous différents états en équilibre : un état «Foldé» (F) correspondant aux structures
hybrides 1 et 2, un état intermédiaire triplex (I) dont une des extrémités 5’ ou 3’ est sous forme simple
brin et un état «unfoldé» (U) où l’ADN est sous forme simple brin (Figure 13). Les conditions
physicochimiques (effet de la température et de la concentration en K+) influencent cet équilibre comme
présente la Figure 14 (Bončina et al., 2012).
F
K FU (T, K+)
K FI (T, K+)
U
I
K IU (T, K+)
Figure 13. Modèle représentant les trois états de l’ADN télomérique humain coexistant et en équilibre: F (foldedstructuré), I (Intermediaite-triplex) et U (unfolded-déplié).
20
Figure 14. Prédiction des conformations de Tel22 (A(GGGTTA)3GGG) en fonction de la température et de la
concentration en K+. De la gauche vers la droite : structures hybrid-1, hybrid-2 (en bleu), triplex-1, triplex-2 (en
rouge) et forme simple brin dépliée (en gris) (Bončina et al., 2012)
Au vue de la taille du G-overhang (150 à 300nt) et de la découverte des conformations
“hybrides” et “parallèles” observées en K+ on peut imaginer que plusieurs G-quadruplexes successifs
peuvent se former le long de l’extrémité 3’ simple brin sortante du télomère (Figure 15 A-C). Plusieurs
hypothèses de structures de G-quadruplexes sont envisagées : soit un enchaînement de G-quadruplexes
de conformation identique, soit une succession de G-quadruplexes de conformations diverses. En 2006,
les travaux de N. Sugimoto ont permis de caractériser la structure et la stabilité des G4 multiples formés
par de longues séquences télomériques humaines (d(TTAGGGG)n où n = 4 à 12). La détermination
des propriétés thermiques des G4 ainsi formés montre que les G4 successifs n’interagissent pas entre
eux (Yu et al., 2006). Plus récemment, M. Komiyama a observé par microscopie à force atomique
(AFM) la formation in vitro de G4 successifs avec la séquence télomérique d(GGGTTA)16 (Xu et al.,
2009) (Figure 15D).
Figure 15. Enchaînement hypothétique de G-quadruplexes intramoléculaires à l’extrémité 3’ sortante du télomère
humain. Succession de G4 homogènes “parallèles” (A) ou “hybrides” (B) ou “mixtes” (C) (Xu, 2011). Succession de
G4 hétérogènes (parallèle et anti-parallèle) formés par la séquence télomérique d(GGGTTA) 16 observée en AFM
(Xu et al., 2009)
21
Des structures G4 intermoléculaires sont possibles au niveau des télomères, permettant
l’association des extrémités chromosomiques en une conformation compacte qui jouerait un rôle non
seulement dans la protection des télomères en empêchant l’accès aux nucléases mais aussi dans la
régulation de la réplication, en empêchant l’accès à la télomérase (Crabbe et al., 2004; Sfeir et al.,
2009). De plus, les G4 intermoléculaires permettraient l’alignement interchromosomique et le
clustering des télomères pendant la prophase I de la méiose (Oganesian and Bryan, 2007).
IV.3. G-quadruplexe in vivo
Plusieurs éléments interviennent en faveur de l’existence des G4 in vivo :
G4 in vitro et PQS. La possibilité de l’existence des G4 in vivo s’appuie tout d’abord sur les
nombreuses études in vitro, utilisant des techniques de biophysique et de biologie moléculaire, réalisées
sur des séquences riches en guanine, issues de différents génomes. Ces études ont montré que la plupart
des ces séquences riches en G forment des structures G4 dans les conditions de sels et de pH
physiologiques (voir paragraphe IV.2.). Par ailleurs, le génome humain comprendrait environ 376 000
séquences susceptibles de former des structures en G4 qu’on appelle PQS (Putative G-quadruplex
Sequences). L’existence de motifs riches en G dans des régions clés du génome eucaryote, incluant la
région «switch» des immunoglobulines, des régions promotrices, l’ADN ribosomal et les télomères
suggèrent que les G4 pourraient avoir un rôle important in vivo et donc leur présence.
G4 chez les ciliés. Les observations les plus évidentes de l’existence des G4 in vivo viennent des
travaux de l’équipe de A. Plückthün réalisées chez les ciliés, dont la particularité est de posséder deux
noyaux : un micronoyau diploïde reproductif et un macronoyau qui sert à la synthèse des protéines et
qui contient des millions de minichromosomes. L’utilisation d’un anticorps synthétique affin et
spécifique d’une structure G4 parallèle, formée par la séquence télomérique du cilié Stylonichia
lemnae, a montré un marquage prononcé dans les macro-noyaux isolés des ciliées (Schaffitzel et al.,
2001). Ce résultat est la preuve de l’existence de structure G4 in vivo. De plus, l’absence du marquage
au niveau de la bande de réplication a permis de suggérer que les G4 étaient résolues au cours de la
réplication.
G4 formé au niveau de plasmide et de chromosome. Une étude menée sur un plasmide contenant un
insert dérivé soit de la répétition de la séquence télomérique humaine soit des régions «switch» des
immunoglobulines en aval du promoteur T7 a établi des données montrant la formation de G4 in vivo.
Ce plasmide a servi de matrice pour la transcription in vitro mais aussi dans Escherichia coli.
22
L’observation en microscopie électronique du plasmide en cours de transcription montre la formation
d’une boucle contenant un brin riche en G et une région hybride ADN/ARN (Figure 16). La présence
de G4 au niveau du brin riche en G a été démontré en testant la sensibilité de la boucle à des protéines
clivant l’ADN au niveau de la région simple brin adjacente à un G4 (Duquette et al., 2004). Plus
récemment, des structures G4 télomériques on été mises en évidence grâce à l’observation d’un
marquage des extrémités chromosomiques, dans les cellules humaines normales et tumorales, après un
traitement avec un ligand spécifique de G4 et tritié (3H-360A) (Granotier et al., 2005).
Figure 16. Modèle de boucle formée au cours de la transcription de région riche en G : le brin riche en G présente
des G4 tandis que le brin riche en C est hybridé au transcrit ARN (Duquette et al., 2004)
Interactions G4-Protéines. Un autre argument en faveur de l’existence des G4 in vivo réside dans le
fait que de plus en plus de protéines capables de les reconnaître et même possédant une activité sur les
G4, telle qu’une activité hélicase, sont mises en évidence (voir paragraphe IV.5). En 2011, l’équipe de
Nicolas a apporté deux arguments forts de l’existence des G4 in vivo en mettant en évidence des
interactions entre la protéine Pif1 (hélicase) et un G-quadruplexe formé par le minisatellite CEB, inséré
dans le génome de S.cerevisae.
Utilisation des ligands G4. Enfin, les nombreuses études sur les interactions ligands G4 et structures
G4, ainsi que sur l’effet des ligands G4 dans les cellules (détaillé dans le chapitre IV) sont des preuves
non négligeables de la présence de G4 in vivo.
IV.4. Fonctions biologiques des G-quadruplexes
L’accumulation des preuves de l’existence des G-quadruplexes in vivo suggère fortement une
fonction biologique de ces structures non canoniques. Les G-quadruplexes joueraient un rôle dans la
régulation de la transcription et de la traduction, dans la recombinaison et l’alignement des
chromosomes ainsi que dans la réplication (Figure 17a). Des preuves directes ou indirectes ont été
apportées sur leur présence aux télomères et ont permis de leur attribuer aussi un rôle au niveau des
télomères (Pour revue voir (Lipps and Rhodes, 2009).
23
Les G-quadruplexes télomériques pourraient protéger les extensions simple brin en 3’ de la
dégradation, de la fusion entre les extrémités télomériques ainsi que de l’élongation par la télomérase
(Figure 17b). En effet, la présence de G-quadruplexe inhibe l’activité de la télomérase in vitro
(Oganesian et al., 2006). De plus, les G-quadruplexes télomériques intermoléculaires pourraient
faciliter l’association télomère-télomère. De telles interactions ont été observées chez lez ciliés
protozoaires en microscopie électronique mais aussi grâce à l’utilisation des anticorps marqués et
spécifiques de G-quadruplexe (Lipps 1980; Schaffitzel et al., 2001).
(a)
(b)
Figure 17. Schéma représentant la formation d’un ADN G-quadruplexe pendant des évènements cellulaires:
(a) Des G-quadruplexes non télomériques peuvent se former transitoirement au niveau de l’ADN double brin
et participer à des évènements cellulaires comme la recombinaison et la transcription ou interférer avec la
réplication; (b) La formation de G-quadruplexes aux télomères permettrait l’alignement des chromosomes et
l’inhibition de la télomérase (Han and Hurley, 2000)
IV.5. Protéines reconnaissant les G-quadruplexes.
De nombreuses protéines interagissant avec les G-quadruplexe in vitro ont été identifiées (Pour
revue voir (Lipps and Rhodes, 2009; Fry, 2007). Certaines stabilisent les G-quadruplexes alors que
d’autres les déstabilisent.
Parmi celles qui déstabilisent les G-quadruplexes on trouve :
- La nucléoline, identifiée au niveau des plasmides utilisés par l’équipe de Duquette au niveau du brin
riche en G contenant les G4 (Duquette et al., 2004). Par ailleurs, il a été montré que la nucléoline
humaine présente dans les nucléoles est capable de se lier au G-quadruplexe (Hanakahi et al., 1999).
- La topoisomérase I humaine, enzyme impliquée dans la relaxation de l’ADN (Arimondo et al., 2000).
24
- Les protéines TEBP-β et Rap1: ces deux protéines identifiées respectivement chez Oxytricha nova
(Fang and Cech, 1993) et chez Saccharomyces cerevisae (Giraldo et al., 1994) sont impliquées dans le
maintien des télomères et favorisent la structuration de l’ADN en G-quadruplexes.
- La protéine MutSα humaine, capable de cibler les G-quadruplexes en interagissant au niveau des
boucles (étude in vitro). Elle intervient dans la réparation des mésappariement et favorise la synapse
des régions «switch», au cours de la transcription des immunoglobulines, régions capables de former
des structure G-quadruplexe (Larson et al., 2005).
Quant aux protéines déstabilisantes, la liste est bien plus longue, on y trouve:
1) Des protéines de liaison à l’ADN simple brin (SSDBP, pour single-stranded DNA Binding
Protein) :
- La protéine POT1 : c’est une protéine télomérique (appartenant au Shelterin) impliquée dans la
protection des télomères grâce à son affinité à l’extension 3’simple brin. Elle résout les G-quadruplexes
dans le sens 3’-5’ (Hwang et al., 2012) et permet ainsi de restaurer l’activité de la télomérase (Baumann
and Cech, 2001; Lei et al., 2004; Lei et al., 2003). De plus, elle stimule l’activité des hélicases
WRN/BLM qui déroulent l’ADN télomérique (Opresko et al., 2005).
- La protéine de réplication A (RPA): elle est hautement conservée chez les eucaryotes et essentielle
pour le maintien des télomères (Cohen, et al., 2004; Schramke et al., 2004). Cette protéine est capable
de lier et résoudre les G-quadruplexes in vitro (Salas et al., 2006).
- Les protéines hnRNP A1 et son dérivé UP1 ; hnRNP D : Ces protéines appartiennent à la famille des
protéines hnRNP qui se lient à l’ADN simple brin. Elles sont aussi capables de résoudre les Gquadruplexes en piégeant l’ADN simple brin télomérique en 3’ (Krüger et al., 2010).
2) Les hélicases :
- Les protéines Sgs1 et Cdc13 ches S.cerevisae et WRN et BLM chez l’Homme : Ces hélicases
déroulent les G-quadruplexes en présence de Mg2+ et d’ATP. Les protéines WRN et BLM se lient
préférentiellement au G-quadruplexe suggérant que ces enzymes participent au maintien des télomères
en facilitant la réplication ou la recombinaison aux télomères (Han and Hurley, 2000; Lee et al., 2007;
Oganesian and Bryan, 2007).
- La protéine Pif1 : C’est une hélicase de la levure S.cerevisae. Elle interagit avec le minisatellite
humain CEB inséré dans le génome de S.cerevisae et dont la séquence riche en G est capable d’adopter
25
des structures G4. L’hélicase Pif1 modulerait la réplication en résolvant les G-quadruplexes dans le
sens 5’-3’ (Paeschke et al., 2011 ; Monchaud et al., 2008).
3) Les nucléases :
- Les protéines GQN1, KEM1/SEP1 et Mre11: Ces protéines facilitent le déroulement des Gquadruplexes par clivage des régions simple brin au voisinage des G-quadruplexes. Une interaction
directe entre le G-quadruplexe et la nucléase humaine GQN1 a été détectée in vitro (Sun et al., 2001).
C’est aussi le cas des nucléases KEM1/SEP1 et Mre11 de la levure (Ghosal and Muniyappa, 2005; Liu
et al., 1993).
IV.6. G-quadruplexe et t-loop
En 2007, une étude in vitro de l’équipe de H.Sugiyama, suggérait une relation entre la structure
G-quadruplexe et la t-loop (Xu et al., 2007). Dans cette étude, la formation d’une structure t-loop à
partir d’un G-quadruplexe dimérique a été mise en évidence en présence du K+. Le modèle proposé
suggère que le G-quadruplexe pourrait favoriser l’invasion de l’extension simple brin en 3’ dans la
région double brin de l’ADN pour former la t-loop et la stabiliser (Figure 18).
Figure 18. Un G-quadruplexe peut se former entre l’extrémité 3’ et la région simple brin riche en G qui a été déplacée
lors de l’invasion par le G-overhang dans le duplexe (formation de la t-loop). La D-loop est stabilisée par la formation
d’un G-quadruplexe.
Du point de vue énergétique, la formation de la structure G-quadruplexe est favorisée par
rapport à la t-loop ; mais la co-existence des deux conformations n’est pas exclue (Xu, 2011).
26
Chapitre II: La réplication des télomères
27
28
I. Généralités
Les télomères sont comparés à une horloge mitotique. Ce rôle leur a été attribué d’après
l’hypothèse émise par A. Olovnikov en 1971. Son hypothèse a permis d’expliquer le potentiel limité
des cellules somatiques à se diviser (limite de Hayflick) et conduisant à la sénescence. Cette dernière
correspond au processus de vieillissement biologique caractérisé par des modifications
morphologiques et métaboliques irréversibles (Dimri et al., 1995). En effet, il a été proposé que les
télomères subissent un raccourcissement d’une dizaine de paires de base après chaque division
cellulaire (Olovnikov, 1971; Hayflick, 1965). Cette érosion est due principalement à une réplication
incomplète des télomères. Plusieurs années plus tard, l’hypothèse suggérant qu’un problème de
réplication terminale est à l’origine du raccourcissement des télomères a été confirmée par plusieurs
études (Allsopp et al., 1992, 1995).
Figure 19. La dépendance entre le nombre de divisions cellulaires et la taille des télomères dans différents types
cellulaires: cellules embryonnaires, cellules somatiques, et cellules transfectées par hTERT. (А) Le raccourcissement
des télomères aboutit au moment 1 (M1) où la limite de Hayflick est atteinte conduisant à la sénescence; (B) Les
cellules qui n’entrent pas en sénescence continuent de se diviser et leurs télomères atteignent une taille critique (M2)
conduisant à la crise suivie par la mort cellulaire ou à la transformation des cellules résistantes en cellules
cancéreuses ; (C) Transfection des cellules par le gène codant pour la télomérase permettant le maintien de la taille
des télomères (Skvortzov et al., 2009)
II. Le problème de la réplication terminale.
En se basant sur les nombreuses observations montrant que l’ADN télomérique présente une
extension simple brin en 3’, un mécanisme de réplication a été décrit pour expliquer le
raccourcissement des télomères à la fin de chaque divison cellulaire. En effet, la progression de l’ADN
29
polymérase s’effectue toujours dans le sens 5'-3', ce qui explique que l’avancement de la réplication
sur les deux brins de la fourche de réplication n’est pas identique (Olovnikov, 1973). Elle est continue
pour le brin direct (leading strand) et discontinue pour le brin indirect (lagging strand) (Figure 20a).
Dans ce dernier cas, de petits fragments (fragments d’Okazaki) dont la taille fait environ 100
nucléotides chez les eucaryotes, contenant l’amorce ARN et le fragment ADN, sont synthétisés. Les
amorces ARN sont ensuite excisées et remplacées par des fragments d'ADN synthétisés par l’ADN
polymérase I (Figure20b) qui sont ensuite rassemblés par une ligase (Figure 20c).
Toutes les lacunes formées en éliminant les amorces ARN sont comblées par l’ADN sauf celle
formée à l’extrémité 5’ du brin indirect des télomères (brin C). En conséquence, le brin néo-synthétisé
à partir du brin indirect sera plus court que le brin d’origine. Ce phénomène a été appelé le problème
de la réplication terminale.
Figure 20. Le problème de la réplication des extrémités: Les étapes de la réplication sur les brins direct (leading) et
indirect (lagging)
30
III. Formation de l’extremité télomérique
Cependant, la taille de l’extrémité 3’ sortante (G-overhang) des télomères humains ne
correspond pas ni à la taille de l’amorce perdue ni à la distance qui sépare la dernière amorce ajoutée
par la primase, de l’extrémité 3’ du télomère (70-100nt ) (Chow et al., 2012). Donc, la réplication seule
ne suffit pas à expliquer la totalité du raccourcissement. Le processus est le suivant (Figure 21) : La
réplication produit deux molécules d’ADN : celle issue du brin direct se terminant par un bout franc et
celle issue du brin indirect ayant une extension 3’ simple brin. D’une part, la molécule issue de la
réplication directe subit une étape de résection du brin C et un allongement du brin G par la télomérase
(Figure 21, à gauche). D’autre part, le produit de la réplication indirecte va subir une résection du brin
C et un allongement du brin G. A ce stade, ces mécanismes ont produit un brin G beaucoup plus long
au niveau du brin indirect qu’au brin direct. En phase G2, sur le produit de la réplication indirecte, le
brin C va donc être allongé (fill-in) en 5’ par la polα recrutée par CST (Figure 21, à droite). Ce
phénomène va permettre d’équilibrer la taille du G-overhang aux produits de la réplication directe et
indirecte (Chai et al., 2006).
Figure 21. Modèle de formation du G-overhang télomérique (Dai et al., 2010). A gauche : formation de l’extension
télomérique simple brin issue de la réplication directe, par résection du brin C et allongement du brin G par la
télomérase. A droite : formation de l’extension télomérique simple brin issue de la réplication indirecte, par
allongement du brin G, et résection puis fill-in du brin C
31
IV. Les obstacles de la réplication des télomères.
Comme nous avons décrit dans le chapitre précédent, la présence des structures de type t-loop
ou G-quadruplexes aux extrémités est un obstacle pour l’avancement de la fourche de réplication
(Figure 22). Plusieurs facteurs peuvent contribuer à l’élimination de ces structures : les hélicases BLM
et WRN, les protéines RPA et POT1 et le facteur TRF2. Ainsi, la résolution des structures Gquadruplexes et t-loop permet d’assurer la progression de la fourche de réplication (Pour revue, voir
(Sampathi and Chai, 2011)).
De plus, l’hétérochromatine des régions télomériques et sub-télomériques pourrait empêcher la
progression de la fourche de réplication. En effet l’absence de la méthylation de l’ADN induit un
raccourcissement des télomères et favorise les phénomènes de recombinaison indiquant un effet sur la
progression de la réplication (Benetti et al., 2007; Gonzalo et al., 2006).
Ces structures peuvent donc bloquer la réplication des télomères si elles ne sont pas résolues et
activer dans ce cas les voies de réparation médiées par ATM/ATR, induisant ainsi un arrêt de la
croissance cellulaire et des phénomènes de délétions ou de réarrangements chromosomiques par
exemple (Sfeir et al., 2009).
Figure 22. Les activités du complexe Shelterin et des facteurs de réplication au cours de la réplication des
télomères. Les protéines impliquées dans la résolution des structures secondaires qui pourraient bloquer la
progression de la réplication sont illustrées. Les hélicases WRN et BLM déroulent les G4 et favorisent la
resolution de la t-loop. TRF2, POT1, et RPA pourraient aussi participer à la résolution des G4 en stimulant
l’activité de WRN et BLM. Il est possible que POT1 et (ou en compétition avec) RPA, se lient à l’ADN
télomérique simple brin (brin G) au cours de la réplication et préviennent le blocage de la fourche de réplication
et l’activation de la kinase ATR. TRF2 est essentielle pour la résolution et la formation de la t-loop. La
progression de la réplication au niveau des télomères induit la résolution locale des structures secondaires et
l’accumulation des super-tours positifs au niveau de l’ADN non répliqué. TRF2, avec Apollo et Top2α, résoud
efficacement les super-tours ainsi formés (Sampathi and Chai, 2011)
32
V. Le complexe CST humain
V.1. Généralités
Le complexe CST est hautement conservé au sein des organismes (Gao et al., 2007; Martín et
al., 2007), il est composé des sous unités CTC1, STN1 et TEN1. La distribution des foyers CST au
niveau de l’ADN est indépendante du cycle cellulaire et 20% des foyers CST humain sont
télomériques. La délétion de CTC1 ou STN1 induit des modifications télomériques et non télomériques
(Wellinger, 2009; Miyake et al., 2009) suggérant l’implication du complexe CST au niveau des
télomères mais aussi au niveau du génome.
Au niveau des télomères, le complexe CST est recruté grâce à des interactions avec des
protéines télomériques non identifiées jusqu’à ce jour, la protéine TPP1 pourrait être l’une d’entre elle
(Xin et al., 2007; Zaug et al., 2010). Le recrutement du complexe CST aux télomères permettrait de
recruter dans un premier temps la télomérase et puis le complexe ADN polα/ primase (Figure 23).
Au niveau du génome, CST est impliqué dans les processus de réplication et de réparation
(Gasparyan et al., 2009). Il a été montré que le recrutement de CST aux fourches de réplication
bloquées stimule le complexe Polα/primase pour redémarrer la réplication et aussi contribuer à la
stabilité du génome.
Le complexe CST accomplit des fonctions similaires chez les différents organismes dans le
contexte télomérique et réplicatif, mais la prédominance de l’une des fonctions varie d’un organisme
à l’autre. Par exemple, chez S.cerevisae, CST est essentiel pour la protection des télomères, par contre
chez l’Homme ce complexe n’intervient que lors de la réplication des télomères pour bloquer l’activité
de la télomérase ou des exonucléases (Lue et al., 2013; Chen et al., 2012).
33
A.
B.
Figure 23. Modèle de focntionnement de CST : (A) Réplication des télomères chez la levure (budding yeast) et les
vertébrés. CST de S. cerevisiae interagit d’une part avec Est1 pour stimuler la replication de l’extension simple brin
du brin G des télomères et d’autre part avec Polα/primase pour faciliter la réplication du brin C retardé. CST des
vertebrés s’associe avec Polα/primase et stimule son activité d’amorçage. TPP1 du complexe Shelterin se met en
contact avec la télomérase et permet son recrutement aux télomères. Il se peut que TPP1 recrute CST aux télomères
via les interactions avec STN1. (B) Réplication de l’ADN non-télomérique. Des dommages d’ADN provoque un stress
au cours de la réplication et provoque la dissociation de la polymérase des hélicases. CST pourrait recruter et
stimuler l’activité de l’ADN polα/primase pour stimuler la réplication du brin retardé après un blocage de
réplication (Price et al., 2010)
Les caractéristiques de la liaison de CST des mammifères ressemblent à celles de RPA. En effet
CST des mammifères et RPA se lient avec une haute affinité à l’ADN simple brin (de l’ordre du nM)
avec un site de liaison étendu qui varie entre 20 et 32 nt (Fanning et al., 2006; Wold, 1997).
V.2. Structure du CST humain
Des études génétiques et structurales montrent que le complexe CST humain (et d’autres
espèces) présente une homologie importante avec RPA (Gao et al., 2007; Sun et al., 2009) (Figure 24).
Ces similitudes sont présentes au niveau des sous unités STN1 et TEN1 qui présentent des domaines
OB-fold ressemblant à ceux présents dans les sous-unités RPA2 (RPA2) et RPA3 (RPA3),
respectivement (Gao et al., 2007). Des expériences de cristallographie par rayons X ont confirmé la
similarité de structure du complexe STN1-TEN1 de C.tropicalis et RPA2-RPA3 de l’Homme. La
similarité réside au niveau des motifs OB-fold, des surfaces d’interaction entre les sous-unités et au
niveau des régions N et C-terminales de STN1 et celles de RPA2. En revanche, l’orientation relative
des deux sous-unités est différente et STN1 présente deux motifs Wh alors que RPA2 n’en comporte
34
qu’un seul. La similarité structurale entre CST et RPA est remarquable et consiste essentiellement dans
le fait que les deux complexes interagissent avec de nombreux partenaires protéiques et présentent des
modes de liaison à l’ADN alternatifs selon les domaines OB-fold impliqués dans la liaison à l’ADN.
Cette diversité d’interactions permet à CST de servir d’intermédiaire pour les événements séquentiels
au cours de la réplication des télomères de la même manière que RPA lors de la réplication, la
recombinaison et la réparation (Haring et al., 2008; Fanning et al., 2006).
Figure 24. Schéma des domaines protéiques de CST de différentes espèces (l’Homme, Arabidopsis thaliana, S. pombe
et S. cerevisiae) et de RPA humaine
VI. Mécanismes impliqués dans le maintien des télomères
Au fur et à mesure des divisions cellulaires, la taille des télomères se raccourcit jusqu’à
atteindre la taille critique qui déclenche l’arrêt de la prolifération cellulaire (Olovnikov, 1973).
Cependant, certaines cellules sont capables d’échapper à l’arrêt prolifératif et à la sénescence et
réussissent à réintégrer le cycle cellulaire: ces cellules, à télomères très courts, peuvent provoquer des
fusions chromosomiques. De telles altérations ne sont pas réparables dans les cellules somatiques
ordinaires et peuvent provoquer une apoptose (Shay and Wright, 2010). Or, des cellules peuvent
reprendre la division cellulaire accompagnée d’une élongation des télomères. L’élongation des
télomères est assurée en majorité grâce à une expression de la télomérase, une enzyme impliquée dans
la formation et le maintien des télomères. Le rôle de la télomérase a été mis en évidence par les travaux
de AG. Bodnar et ses collègues qui ont montré qu’une expression forcée de la télomérase inhibe la
perte des télomères et l’arrêt de la croissance dans les fibroblastes humains normaux en culture.
35
De plus, l’expression de la télomérase est suffisante à l’élongation du télomère et à l’immortalisation
cellulaire (Bodnar et al., 1998). A la différence de la majorité des cellules, certaines cellules, comme
les cellules souches, les cellules de la lignée germinale et 85 % des cellules cancéreuses, expriment la
télomérase. Par conséquent, ces cellules sont capables de maintenir la taille et la structure des télomères
durant un grand nombre de cycles de division cellulaire.
VI.1. La télomérase
La découverte de la télomérase en 1985 découle des travaux d’E. Balckburn et ses
collaborateurs, qui ont reçu en 2009 le Prix Nobel de Médecine.
La télomérase a été identifiée pour la première fois chez Tetrahymena thermophila, lorsque
CW. Greider et EH.Balckburn ont observé que la séquence télomérique était rallongée in vitro de
séquences identiques au motif répétitif des télomères (Greider and Blackburn, 1985). L’activité
télomérase a ensuite été mise en évidence dans de nombreux autres organismes. Quelques années plus
tard, et grâce à un essai d’élongation in vitro avec des extraits cellulaires, une activité télomérase a été
mise en évidence chez Oxytrichia, chez les Euplotes (Shippen-lentz and Blackburn, 1989; Zahler and
Prescott, 1988) et chez la levure (Kramer and Haber, 1993). La télomérase humaine a été mise en
évidence en 1989, d’abord dans les cellules tumorales HeLa (Morin, 1989), puis dans des leucocytes
issus de personnes saines et de patients atteints de leucémie (Broccoli et al., 1995).
VI.1.1. Structure de la télomérase
La télomérase est un complexe protéique associé à une séquence d’ARN indispensable à
l’activité catalytique. L’activité enzymatique in vitro de la télomérase, est portée par la protéine TERT
(Telomerase Reverse Transcriptase) et l’ARN TER (Telomerase RNA) (McEachern et al., 2000). De
nombreuses études in vivo, ont montré l’interaction de TERT avec d’autres protéines qui pourraient
être essentielles pour l’activité enzymatique de la télomérase (Nugent et al., 1996; Nugent and
Lundblad, 1998).
36
VI.1.2. La sous-unité catalytique TERT
Un ensemble d’études génétiques et biochimiques a permis d’identifier la sous-unité catalytique
de la télomérase. Des expériences réalisées chez la levure ont révélé que la mutation des gènes EST1,
EST2 et EST3 entraînait un raccourcissement des télomères. En parallèle, le clonage de EST2 a révélé
la présence d’un motif connu chez les enzymes de type transcriptase inverse (Lendvay and Jeannie,
1996). La partie catalytique de la télomérase humaine nommée hTERT a été mise en évidence en 1997
(Nakamura et al., 1997). hTERT contient les 7 motifs conservés de la transcriptase inverse du VIH
dans sa région centrale. Comme les autres polymérases, la protéine TERT contient une triade d’acides
aspartiques très conservée dont la mutation détruit l’activité catalytique de l’enzyme (Lingner et al.
1997). La région N-terminale de hTERT contribue aux propriétés uniques de la télomérase telles que
son association à l’ARN TERRA (telomeric repeat-containing RNA) et à l’ADN télomérique, la
fixation d’autres composants protéiques et la modulation de sa processivité (Gillis et al., 2008) (Figure
25). Le domaine C-terminal (CTE) semble jouer un rôle dans le maintien des télomères
indépendemment de l’activité catalytique de TERT. En effet, des levures ayant un mutant du CTE
représentent des télomères courts mais stables, alors que chez l’Homme, la mutation du CTE affecte le
maintien des télomères sans influencer l’activité catalytique de TERT (Autexier and Neal, 2006).
Figure 25. Modèle des différents domaines de TERT : GQ (bleu) correspond au domaine à faible affinité à l’ARN et
haute affinité à l’ADN et aux protéines ; CP, QFP,T (vert) correspondent aux régions très affines à l’ARN ; le
domaine catalytique Reverse Transcriptase (rouge) contient les résidus aspartiques nécessaires pour l’activité
catalytique de TERT(D)
Des expériences de cristallographie réalisées en 2009 sur TERT de Tribolium castaneum, révèle
un domaine structural en « main droite » caractéristique des polymérases, dans lequel les «doigts» et
la «paume» sont composés des motifs transcriptase inverse et le « pouce » est formé par le domaine Cterminal (Figure 26) (Gillis et al., 2008).
37
Figure 26. L’organisation des domaines de TERT : domaine de liaison de l’ARN (TRBD) en bleu; les doigts en
orange; la paume en beige et le pouce en rouge (Gillis et al., 2008)
VI.1.3. L’ARN de la télomérase (TER)
En 1987, Greider et Balckburn ont constaté l’existence d’une séquence ARN qui contribuerait
à assurer l’élongation des répétitions télomériques chez Tetrahymena. Cette hypothèse provenait du
fait que le traitement par une RNAse, inactivait la synthèse de répétitions télomériques in vitro (Greider
and Blackburn, 1987). Plus tard, cette hypothèse a été validée par une expérience de clonage d’un gène
codant l’ARN chez Terahymena. La transcription de ce gène produisait un ARN dont une partie de la
séquence était CAACCCAA, séquence complémentaire au motif répétitif de l’ADN télomérique chez
le même organisme (Greider and Blackburn, 1987).
La partie ARN a été clonée dans plusieurs organismes différents et montre une variabilité tant
dans la longueur et la séquence, que dans la structure générale. Cependant, tous les TER ont en commun
une petite séquence matrice complémentaire des séquences télomériques (Template) ainsi que quatre
domaines conservés au cours de l’évolution (Figure 27): le domaine pseudo-noeud, constituant le cœur
catalytique avec la matrice et la sous-unité catalytique protéique (Gilley and Blackburn, 1999), les
domaines CR4-CR5 et CR7 qui interviennent dans sa stabilisation, sa localisation cellulaire et son
assemblage avec TERT, et le domaine à boîte H/ACA scRNA à l’extrémité 3’, impliqué dans sa
maturation (Autexier and Lue, 2006). La figure 27 représente le TER humain (hTER) : Il comporte
451 nucléotides dont 11 constituent la matrice pour la synthèse des séquences télomériques (Chen et
al., 2000).
38
C’est l’ARN polymérase II qui assure la transcription du gène codant TER. Ce dernier est
stabilisé par son association avec un groupe de protéines : GAR1, NOP10, NHP2, impliquées dans
l’accumulation des petits ARN nucléolaires (snoRNA) et les petits ARN des corps de Cajal (Collins,
2008), ainsi qu’avec la dyskérine, impliquée dans la production des ribosomes (Marie-Egyptienne and
Autexier, 2006).
Template
Figure 27. La structure secondaire de l’ARN de la télomérase humaine et les facteurs protéiques associés: L’ARN
comporte le domaine cœur constitué du pseudo-nœud et de la séquence matrice, les domaines CR4/CR5, CR7 et le
domaine à boite H/ACA. CR4/CR5 et le coeur de l’ARN permettent l’asciation de TERT (cercle bleu) ; le domaine
à boite H/ACA se lie aux protéines accessoires de la télomérase (Dyskérine, GAR1 et NOP10 et NHP2) (Zhang et al.,
2011)
VI.1.4. Les autres composants de la télomérase
D’autres constituants protéiques de la télomérase ont été identifiés grâce à des études
biochimiques et génétiques. Certains sont impliqués directement dans la réplication des télomères,
d’autres dans la régulation de la télomérase. La majorité de ces sous-unités supplémentaires jouent un
rôle dans l’assemblage, la conformation et la localisation nucléaire de la télomérase (Beattie et al.,
2001; Cong et al., 2002).
Parmi ces protéines, la dyskérine, hautement conservée chez les mammifères, les levures et les
bactéries, a été identifiée suite à la caractérisation de TER et de la maladie humaine de dyskératose
congénitale (DC) (Mitchell et al., 1999). La DC est une maladie héréditaire rare qui se caractérise
39
notamment par des troubles de la pigmentation de la peau, une dystrophie des ongles et une leucoplasie
des muqueuses. Il existe deux formes de la maladie DC: une forme autosomale dominante liée aux
mutations de TERT et TER (Vulliamy et al., 2001; Armanios et al., 2005) et une forme liée à la
mutation du gène DKC1 situé sur le chromosome X et qui code pour la dyskérine. La mutation du gène
DKC1 provoque une diminution de la synthèse de hTER, ainsi qu’une baisse de l’activité de la
télomérase entraînant un raccourcissement accéléré de la longueur des télomères (Vulliamy et al.,
2006). La Dyskérine lie les domaines CR7 et à boite H/ACA. Elle est associée à la protéine TCAB1
dans le domaine CR7 (Figure 27).
Chez l’Homme, les protéines EST1A et EST1B sont associées à la télomérase (Reichenbach et
al., 2003; Snow et al., 2003). Il semble que EST1A participe au maintien de l’intégrité du télomère en
modulant l’accumulation de transcrits ARN télomériques (TERRA) (Azzalin et al., 2007).
VI.2. Mode d’action de la télomérase
C. Greider et E. Balckburn ont été les premières à proposer un modèle de maintien de la taille
des télomères par la télomérase. Dans ce modèle, la télomérase se sert de son ARN (TER) comme
matrice pour ajouter les nucléotides à l’extrémité des chromosomes, grâce à la sous-unité catalytique
munie d’une activité Transcriptase inverse (TERT). Le mécanisme consiste en trois étapes (Figure
28) :
a- Etape d’association télomères-télomérase et liaison de la matrice ARN à l’extrémité 3’ simple brin
de l’ADN télomérique par complémentarité de séquence.
b- Etape d’élongation par transcription inverse de la matrice ARN et addition de nucléotides à
l’extrémité 3’ de l’ADN télomérique.
c- Etape de translocation: une fois la transcription inverse de la séquence matrice ARN achevée, une
translocation du complexe de la télomérase a lieu pour permettre un autre cycle de synthèse. Cette
étape implique l’activité hélicase de Pif1 qui permet la dissociation de l’hybride (Mateyak and Zakian,
2006).
40
a
b
c
Figure 28. . Les étapes d’élongation de l’ADN télomérique humain par la télomérase humaine (Sabatier et al., 2006)
L’activité de la télomérase subit une régulation dans le but de maintenir une taille de télomères
normale. Plusieurs voies ont été suggérées pour la régulation de la télomérase: chez l’Homme, la
régulation de la télomérase s’effectue dans la majorité des types cellulaires via la régulation de
l’expression de la sous-unité hTERT. Cependant, dans certains types cellulaires, c’est la transcription
de hTER qui est limitante pour l’activité télomérase. (Pour revue voir (Cong et al., 2002; Bianchi and
Shore, 2008)).
Outre son rôle dans l’élongation des télomères, le complexe nucléoprotéique «télomérase»
intervient dans divers processus télomériques ou extra-télomériques. La télomérase est impliquée dans
la protection des télomères, la tumorigenèse, l’anti-apoptose, la réparation de l’ADN, la prolifération
cellulaire, la régulation de l’expression de gènes (Martínez and Blasco, 2011).
41
VII. Maintien des télomères par le mécanisme ALT
D’une façon intéressante, il a été remarqué que certaines cellules de S. cerevisae présentant
une mutation de hTER ou ayant perdu le gène EST1, survivent grâce à leur capacité à maintenir les
répétitions télomériques, alors que la plupart des autres cellules meurent après un raccourcissement
progressif de leurs télomères (Lundblad, 1993). De plus, il a été montré que certaines cellules de
mammifères peuvent maintenir la taille de leurs télomères après plusieurs divisions, malgré l’absence
de l’activité télomérase (Bryan et al., 1995; Rogan et al., 1995). Des évènements de recombinaison
entre les télomères des chromosomes homologues ou partiellement homologues sont alors mis en jeu
( Dunham et al., 2000). Ce mécanisme, nommé ALT (Alternative Lengthening of Telomere,) fait
intervenir la voie de recombinaison dépendante de Rad52 (McEachern and Blackburn, 1996). Le
mécanisme ALT nécessite la présence de protéines impliquées dans la recombinaison homologue ainsi
que dans la réparation des cassures d’ADN double brin (Lundblad, 1993; McEachern and Blackburn,
1996). Chez l’Homme, le mécanisme ALT n’a été détecté que dans les lignées cellulaires tumorales et
dans les lignées immortalisées par le virus SV40 (Chang et al., 2003; Bryan et al., 1995; Laud et al.,
2005). Il semble que ce mécanisme se produise en réponse à un dysfonctionnement des mécanismes
de régulation contrôlant la recombinaison des télomères. Ce type de maintien est observé dans 10 à 15
% des cellules cancéreuses humaines (Bryan et al., 1995). Parmi eux nous retrouvons des
ostéosarcomes, sarcomes des tissus mous, glioblastomes, carcinomes de cellules rénales, carcinomes
adénocorticaux, carcinomes à larges cellules de poumon (carcinome épidermoïde) et des carcinomes
ovariens. Le mécanisme ALT peut coexister avec l’activité télomérase (Cerone et al., 2001).
VII.1. Phénotype des cellules ALT
Les télomères des cellules ALT tumorales ou immortalisées dépourvues de télomérase,
présentent une hétérogénéité au niveau de la taille des télomères (Bryan et al., 1995). En effet,
l’analyse des télomères des lignées ALT par la technique FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)
(Figure 29A) montre que la longueur des télomères varie entre 2 kb et 50 kb alors que plusieurs
terminaisons chromosomiques sont dépourvues d’un signal détectable (Henson, 2002).
42
Les cellules ALT montrent aussi des caractéristiques inhabituelles dont la présence abondante
d’ADN extra-chromosomique. Ces séquences séparées des chromosomes peuvent adopter plusieurs
formes. L’ADN extra-chromosomique existe majoritairement sous forme d’ADN télomérique simple
brin circulaire (T-circles) (Figure 29B) (Wang et al., 2004), mais aussi sous forme d’ADN
partiellement monobrin circulaire (C-circle ou G-circle) ou sous forme d’ADN linéaire double brin
(Nabetani and Ishikawa, 2009). De plus une analyse par électrophorèse bi-dimensionnelle a révélé une
forme de t-complexe de très haute masse moléculaire. La forme t-complexe consiste en des
ramifications formées par des séquences simple brin d’ADN extra-chromosomique riche en G ou en C
(Figure 29B). Il a été suggéré que de telles structures d’ADN proviennent probablement d’un
mécanisme de recombinaison homologue détecté dans les cellules ALT ou du mécanisme de
réplication «rolling-circle» (Nabetani and Ishikawa, 2009). Ces différentes structures particulières
extra-chromosomiques peuvent servir de marqueur des cellules ALT.
Dans les cellules ALT, l’ADN télomérique (chromosomique ou extra-chromosomique) ainsi
que les protéines associées peuvent être inclus dans des structures subnucléaires, appelées corps APBs
pour ALT-associated PML bodies (Yeager et al., 1999). Lorsque le mécanisme ALT est inhibé, le
nombre d’APBs diminue dans la cellule suggérant un rôle important de ces plateformes dans le
mécanisme ALT (pour revue voir (Cesare and Reddel, 2010)).
A.
B.
Figure 29. (A). Analyse par CO-FISH d'une lignée ALT qui révèle de multiples échanges au niveau télomérique
(sonde G en vert, sonde C en rouge, signal jaune : colocalisation). (B) Les différentes formes adoptées par l’ADN
extra-chromosomique
43
Une autre caractéristique des cellules ALT est le taux important de T-SCEs (Telomeric-Sister
chromatids exchanges) qui est beaucoup plus élevé que dans les cellules normales ou télomérase
positive. Les études montrent que l’augmentation des échanges entre chromatides soeurs est spécifique
des télomères, puisque le taux de SCEs dans le reste du génome n’est pas altéré (Londoño-vallejo et
al., 2004).
VII.1.1. T-circles et C-circles
Il semble que les T-circles résultent de la résolution de la jonction présente au niveau de la tloop par des enzymes de recombinaison (Figure 7) (Wang et al. 2004). Cette réaction est inhibée par
le domaine basique de TRF2 qui est essentiel pour la formation de t-loop. Les protéines de
recombinaison NBS1, aussi nommée NBN, et XRCC3 dans les cellules humaines et Rad52 chez la
levure sont essentielles pour la formation des T-circles. (Wang et al., 2004; Pickett et al., 2009;
Compton et al., 2007). L’abondance de T-circles dans les cellules ALT pourrait être due à une délétion
télomérique rapide (telomere trimming) qui permet de réguler l’élongation des télomères. Les T-circles
ont été detectés aussi dans les cellules télomérase positive mais sont beaucoup moins abondants que
dans les cellules ALT. En effet, il a été montré que les T-circles se forment dans les cellules humaines
télomérase positive quand leurs télomères ont été allongés artificiellement en surexprimant les
composants de la télomérase. Une hétérogénéité de la taille des chromosomes a été également observée
(Pickett et al., 2009). Ces résultats indiquent qu’un mécanisme d’érosion des télomères via la résolution
de la t-loop permet de raccourcir les télomères trop longs. On admet que ce mécanisme est l’analogue
du mécanisme de délétion des télomères de la levure (Li and Lustig, 1996).
Les C-circles semblent être plus spécifiques des cellules ALT. Il y a 750 fois plus de C-cirles
dans les cellules ALT que dans les cellules télomérase positive. Il existe une relation entre le niveau de
l’activité ALT et le nombre de structures C-circles. L’origine de ces structures extra-chromosomiques
n’est pas encore connue. Elles sont 100 fois plus abondantes que les G-circles. On estime leur nombre
à 1000 C-circles par cellule ALT. De plus l’inhibition des mécanismes ALT entraine la disparition des
C-circles. D’après toutes ces données, les C-circles sont considérés comme les marqueurs spécifiques
des cellules ALT (Henson et al., 2009).
44
VII.1.2. APBs (Associated PML Bodies)
Les APBs sont spécifiques des lignées ALT et n’ont jamais été détectés dans les lignées
télomérase positive, par contre il existe des cellules ALT sans APBs (Yeager et al., 1999). Les APBs
sont constitués par l’association des corps PML formés par l’assemblage d’un grand nombre de
protéines (DAXX, SUMO, PML…) et de composants particuliers des cellules ALT, à savoir l’ADN
télomérique et les protéines télomériques : TRF1, TRF2, TIN2 et Rap1 (Jiang et al., 2007; Yeager et
al., 1999). Les APBs contiennent également des protéines impliquées dans la recombinaison, la
réplication et la réparation incluant, Rad51, Rad52 et RPA (Yeager et al., 1999), BLM (Stavropoulos
et al., 2002), WRN (Johnson et al., 2001), Rap1 et BRCA1 (Wu et al., 2003 a), MRE11, Rad50 et
NBS1 (Zhu et al., 2000), ERCC1 et XPF (Zhu et al., 2003), hRAD1, hRAD9, hRAD17 and
hHUS1(Nabetani et al., 2004), Rif1(Silverman et al., 2004) and hnRNP A2 (Moran-Jones et al., 2005).
La formation des APBs nécessite aussi la présence de NBS1, qui recrute MRE11, RAD50 et BRCA1
dans ces structures nucléaires (Wu et al., 2003 ; Jiang et al., 2005). La délétion de PML, des protéines
télomériques TRF1,TRF2, TIN2 et Rap1 et des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN
(MRE11, RAD50 et NBS1), bloque la formation des APBs, suggérant leur implication dans les
mécanismes ALT (Figure 30) (Pour revue (Cesare and Reddel, 2010)).
Le taux des APBs dans les cellules dépend du cycle cellulaire. Leur taux est surtout important
en G2/M (Yeager et al., 1999; Grobelny et al., 2000, 2001), qui correspond à la phase où les
recombinaisons homologues sont plus actives et où l’activité ALT se produit vraisemblablement.
L’ensemble des caractéristiques présentées ci-dessus semblent indiquer que les APBs sont
utilisés comme des compartiments de stockage des protéines et de l’ADN télomérique et jouent un rôle
dans le mécanisme ALT (Yeager et al., 1999; Grobelny et al., 2000; Wu et al., 2003).
Molenaar et al ont pu visualiser, par imagerie, le déplacement d’une sous-fraction de télomères
des APBs, suggérant que la structure des APBs n’est pas figée dans les cellules ALT, mais dynamique
(Molenaar et al., 2003). La quantification des APBs par immunohistochimie permet la caractérisation
du phénotype ALT dans les tumeurs. Cependant, il existe une lignée de cellules atypiques (AG11395),
dépourvue d’APBs détectables, qui présente les caractéristiques typiques du mécanisme ALT
(Marciniak et al., 2005).
45
Figure 30. Modèle hypothétique de la formation des APBs dans les cellules ALT. L’ADN télomérique se lie au
complexe MRN via RAP1, et s’associe au corps PML pour former les APBs. L’absence des protéines TRF1,TIN2,
TRF2,Rap1 et ou du complexe MRN bloque la formation des APBs. De même, un « knockdown » de PML empêche
la formation des corps PML et donc des APBs (Jiang et al., 2007)
VII.2. Mécanisme ALT
Le maintien des télomères en absence de la télomérase dépend du gène Rad52 codant la protéine
de recombinaison homologue (RAD52) (Grobelny et al., 2000). Ceci a permis de suggérer que le
mécanisme ALT était basé sur la recombinaison homologue. Plusieurs études renforcent cette
hypothèse. Par exemple, l’étude menée par M.A. Dunham a montré que lorsqu’un télomère unique est
étiqueté par une séquence d’ADN (tag), après quelques doublements de population, ce tag est retrouvé
aux télomères de plusieurs chromosomes dans les cellules ALT mais pas dans les cellules télomérase
positive (Dunham et al., 2000).
Bien qu’il soit connu que le mécanisme ALT nécessite une étape de recombinaison, le
mécanisme de l’étape d’élongation est mal connu. Deux mécanismes non exclusifs sont
suggérés (Cesare and Reddel, 2010):
1) Modèle basé sur les échanges asymétriques entre chromatides sœurs (T-SCE) (Figure 31a) :
Ce modèle a été proposé en se basant sur le fait que les cellules ALT présentent une fréquence de TSCE relativement élevée en comparaison avec les cellules télomérase positive. Les T-SCEs ont été
visualisés grâce à la technique de CO-FISH utilisée habituellement pour déterminer l’orientation des
46
chromosomes (Bechter et al., 2003; Londoño-vallejo et al., 2004). A l’heure actuelle, aucune
explication tranchante pour ces échanges ayant lieu aux télomères n’a été rapportée. D’ailleurs, il est
connu que les échanges de chromatides sœurs au niveau des autres régions du génome résultent de la
réparation des cassures générées lors de la réplication (Wilson and Thompson, 2007). Indépendamment
du mécanisme des T-SCEs, il a été suggéré que les T-SCEs peuvent entraîner une ségrégation non
aléatoire des chromosomes conduisant à l’obtention d’une cellule-fille avec des télomères longs
capable de proliférer indéfiniment au détriment de l’autre cellule fille dont les télomères sont plus
courts (Bailey et al., 2004; Muntoni and Reddel, 2005; Blagoev and Goodwin, 2008). Compte- tenu de
l’absence d’arguments prouvant la ségrégation non aléatoire, le modèle basé sur les T-SCEs reste
hypothétique et ne peut pas être considéré comme l’élément responsable de l’élongation des télomères.
2) Mécanisme basé sur la recombinaison homologue :
Ce modèle est fondé sur la réplication des télomères à partir d’une séquence télomérique adjacente par
la recombinaison homologue. Au cours de la recombinaison, le G-overhang envahit le duplex
télomérique du chromosome adjacent et s’hybride au brin C, ce qui permet l’élongation du brin G
(Figure 31b). Ce mécanisme pourrait aussi avoir lieu entre les télomères de chromatide-soeurs si l’un
des brins d’une des chromatides envahit le duplex de l’autre chromatide (Figure 32a). La
recombinaison peut également être intra-télomérique : la t-loop peut servir de matrice pour l’élongation
du télomère par rolling-circle (Figure 32b). En outre, les ECTRs linéaires peuvent aussi être utilisés
comme matrice ainsi que les cercles télomériques qui peuvent être amplifiés par rolling-circle (Figure
32c et d) (Henson, 2002). Le modèle de recombinaion homologue corrèle avec les résultats de M.A.
Dunham décrits ci-dessus. C’est pour cela que le modèle de recombinaison ALT par recombinaison
homologue reste le plus probable.
47
Figure 31. Deux modèles d’élongation des télomères par le mécanisme ALT. a) Des T-SCEs inégaux par crossingover entre deux chromatides soeurs permettent de rallonger le télomère d’une des deux chromatides-sœurs et de
raccourcir le télomère de l’autre chromatide-soeur. Une ségrégation non aléatoire des chromosomes permet
d’obtenir une cellule-fille avec des télomères longs capable de proliférer indéfiniment au détriment de l’autre cellule
fille dont les télomères sont plus courts. b) Des événements de RH interalléliques entre un télomère court et un autre
plus long selon un mécanisme similaire au BIR (Break-Induced Repair ) permet l’élongation des chromosomes. Le
G-overhang du télomère court envahit le duplex du télomère long. Le brin C sert alors de matrice pour l’élongation
du brin G qui sera lui même copié pour former une région double brin (Cesare and Reddel, 2010)
Figure 32. Les différents modèles de recombinaison homologue dans les cellules ALT. a) au sein de la t-loop par
rolling-circle, b) entre les télomères de chromatides soeurs sans crossing-over, c) entre le télomère et des ECTRs
linéaires, d) entre le télomère et des ECTRs circulaires par rolling-circle
48
VII.3. Facteurs protéiques du mécanisme ALT
Des analyses génétiques et des expériences de protéome ont mis en évidence la présence de
protéines dans la chromatine télomérique des cellules ALT et l’implication de certaines protéines de
recombinaison pour le mécanisme ALT (Pour revues voir (Cesare and Reddel, 2010 ; Nabetani and
Ishikawa, 2011).
En 2005, Reddel et son équipe ont montré par une étude de mutagenèse et par des expériences
d’immunofluorescence, l’implication de MRE11 (ou MRE11A), RAD50 et NBS1 dans le mécanisme
ALT (Jiang et al., 2005). Ces protéines forment le complexe MRN indispensable pour la recombinaison
homologue (Lee and Paull, 2007). De plus, il a été montré que l’inhibition de MRN dans les cellules
ALT entraîne un raccourcissement des télomères (Jiang et al., 2005).
Un autre complexe intervient dans le mécanisme ALT, il s’agit du complexe SMC5/6 (pour
Structure Maintenance of telomere Complex). Potts et Yu ont observé que l'apparition spontanée de
foyers nucléaires contenant le complexe SMC 5/6 est une caractéristique commune des cellules ALT
(Potts & Yu 2007). Le complexe SMC5/6 contient un hétérodimère SMC5–SMC6 et au moins 6
protéines non SMC, parmi lesquelles une ubiquitine dotée d’activité (SUMO) ligase, nommée MMS21.
Il a déjà été montré que ce complexe est recruté au niveau des cassures double brin et recrute, à son
tour, la cohésine (Potts et al., 2006). Cette dernière est impliquée dans les recombinaisons homologues
des chromatides sœurs (Ström et al., 2004). Il a été proposé que le complexe SMC5/6 facilite la
recombinaison homologue et l'allongement des télomères dans les cellules ALT en modulant les
interactions des protéines télomériques avec les télomères, facilitant le recrutement de ces derniers aux
APBs.
Les hélicases WRN et BLM sont également impliquées dans le maintien de la taille des
télomères (Bachrati and Hickson, 2003; Khakhar et al., 2003). L’interaction de BLM avec les protéines
télomériques TRF1 et TRF2 a été mise en évidence dans les cellules ALT (Lillard-Wetherell et al.,
2004; Stavropoulos et al., 2002). La surexpression transitoire de BLM augmente la synthèse de l’ADN
télomérique exclusivement dans les lignées humaines ALT (Stavropoulos et al., 2002), montrant
clairement que BLM est requise pour la mise en place du mécanisme ALT.
La Topoisomérase 3α (TOPOIIIα), pourrait aussi avoir un rȏle dans le mécanisme ALT en
intervenant dans la résolution des doubles jonctions de Holliday associées à la recombinaison. La
49
délétion de TOPOIIIα induit la délétion de TRF2 dans les cellules ALT et la perte de télomères
(Temime-Smaali et al., 2008). Toutefois TOPOIIIα, est impliquée dans la liaison de TRF2 aux
télomères dans les cellules ALT. Donc, il est difficile de préciser si c’est la délétion de TOPIIIα ou
celle de TRF2 qui entraîne la perte des téloméres.
D’autres protéines, incluant FEN1 (Saharia and Stewart, 2009), MUS81 (Zeng and Yang,
2009), FANCD2 (Fan et al., 2009 b) ont été identifiées et semblent être impliquées dans le maintien
de la taille des télomères dans les cellules ALT. FEN1 est une endo et exonucléase qui agit au niveau
de la réplication du brin retardé, de la recombinaison homologue ainsi que dans le redémarrage des
fourches de réplication bloquées (Liu et al., 2004 b). Elle semble être active également et en parallèle
avec WRN dans le maintien des télomères.
50
Chapitre III: RPA aux télomères
51
52
I. Historique et généralités
La Protéine de Réplication A (RPA) fut identifiée pour la première fois en 1988 par MS. Wold
ainsi que par MP. Fairman et B. Stillman (Wold, 1988; Fairman and Stillman, 1988) lors de
l’identification des facteurs protéiques nécessaires à la réplication du virus simien SV40, modèle de
réplication eucaryote. Les premières expériences d'analyse de la fonction de la RPA indiquaient que
cette dernière était capable de se lier fortement à l'ADN simple brin en particulier à la séquence
d’origine de réplication (Ori) et ainsi jouer le rôle d'une protéine de liaison à l’ADN simple brin (SSB),
aucune activité ATPase et hélicase n'ayant été détectée. La RPA humaine (hRPA) se présente sous la
forme d’un hétérotrimère composé de trois sous-unités de 70, 32 et 14 kDa, nommé RPA1, RPA2 et
RPA3, respectivement.
Depuis, le rôle de la RPA s’est élargi à un grand nombre de processus du métabolisme de
l’ADN tels que la réparation, les points de contrôle de l’ADN endommagé, la régulation de la
transcription et le maintien des télomères (Figure 38) (pour revue voir (Oakley and Patrick, 2010). Si
la fonction principale de la RPA est de se fixer à l’ADN simple brin, avec une affinité très élevée, ses
fonctions secondaires, toutes aussi importantes, sont de diriger et coordonner l'assemblage et le
désassemblage des protéines à l'ADN pendant ces différents processus. Pour agir efficacement la RPA
doit s’associer et se dissocier de nombreuses protéines et de l’ADNsb, suggérant fortement que la
liaison de la RPA à l’ADNsb est dynamique, en accord avec sa capacité à se fixer sous différents modes
de liaison. Dans ce chapitre nous nous attacherons à présenter le rôle de la RPA aux télomères et plus
particulièrement dans le maintien des télomères.
Figure 33. La RPA et le métabolisme de l’ADN
53
La RPA est une protéine abondante; chez l’homme elle semble être la SSB majoritaire. La
quantité de RPA humaine varie de 2x105 à 5x106 molécules par cellule (Wold, 1988; Seroussi and Lavi
1993; Takai et al., 2011), soit une concentration comprise entre environ 100 et 200 nM.
La majorité de la RPA est présente dans le cytoplasme, c’est au cours de la phase S que la RPA
est majoritairement localisée dans le noyau au niveau des sites de réplication. La localisation de la RPA
dans ces sites précède l’initiation de la réplication (en phase G). Cette localisation persiste jusqu'à la
synthèse totale du matériel génétique. La plupart des études d’immunofluorescence ont montré
qu’après la fin de la phase S, RPA1 se dissocie des chromosomes, et pendant la phase M, seule RPA2
reste associée aux chromosomes, la sous–unité RPA3 étant alors localisée dans le cytoplasme.
II. Les fonctions de RPA aux télomères
II.1. La réplication des télomères
Comme pour le reste du génome, la RPA joue un rôle fondamental dans l’initiation et
l’élongation de la réplication majoritairement au niveau du brin retardé. Lors de l’initiation, l’ADN est
déroulée par une hélicase permettant la fixation de RPA sur l’ADN simple brin ainsi généré. Cette
liaison permet le recrutement de l’ADN polymérase α-primase au niveau des origines de réplication où
la synthèse de l’amorce ARN est requise. La RPA stimule l’activité de l’ADN polymérase α-primase
mais aussi sa processivité et sa fidélité. La présence de RPA va permettre par la suite le recrutement
lors de la phase d’élongation de l’ADN polymérase Δ (« Switch » ADN polymérase α / ADN
polymérase Δ). RPA stimule l’activité de l’ADN polymérase Δ grâce à son interaction avec la protéine
PCNA. Lors de la maturation des fragments d’Okazaki, la RPA coordonne l’action séquentielle des
endonucléases DNA2 et FEN1, qui élimine l’amorce ARN (Loor et al., 1997; Braun et al., 1997).
Lors de la réplication des télomères, la RPA pourrait de plus intervenir en complément des
actions des hélicases BLM et WRN et de la protéine POT1, pour éliminer les structures G-quadruplexes
qui se formeraient sur le brin retardé et qui pourraient bloquer la fourche de réplication (Arnoult et al.,
2009).
54
Lors d’un blocage de fourche de réplication, la liaison de RPA au simple brin permet d’activer
les voies de réparation médiées par ATM/ATR, induisant ainsi un arrêt de la croissance cellulaire ou
une érosion accélérée des télomères (Liu et al., 2012).
II.2. Le maintien des télomères par la télomérase
Le rôle de RPA dans le maintien des télomères fut identifié pour la première fois en 1999 par
J. Smith et ses collègues. Ils ont observé, chez Saccharomyces cerevisae, que la mutation du gène
RFA1 (homologue de RPA1 humaine) en synergie avec la mutation du gène codant HDF1 ((homologue
de la protéine Ku humaine) provoquait un raccourcissement des télomères (Smith et al.,2000). De
même, il avait été montré chez la levure Schizosaccharomyces pombe, que Taz1 (orthologue de TRF1
et TRF2) et RPA1, identifiée au niveau des télomères par des essais de ChIP (Ono et al. 2003),
agissaient en synergie pour éviter la perte des télomères. Enfin, la fonction de POT1 dans la protection
des télomères serait perturbée en absence de RPA et Taz1 et un raccourcissement télomérique est ainsi
déclenché (Figure 34) (Kibe et al., 2007). Chez Schizosaccharomyces pombe, la mutation du gène
codant RPA1 (nommée Rad11), à elle seule, est capable de provoquer un raccourcissement des
télomères. De même chez l’humain, la mutation de RPA1 dans les cellules humaines fibroblastiques
cancéreuses provoque un raccourcissement des télomères (Kobayashi et al., 2010).
Figure 34. Modèle d’action de Taz1 et RPA aux télomères: dans les cellules de levure sauvages (Schizosaccharomyces
pombe) RPA et Taz1 agissent en synergie pour éviter la perte télomérique en contrôlant l’activité de l’hélicase Rqh1
et en modulant l’activité de POT1 aux télomères. Dans les doubles mutants des gènes codant Taz1 et RPA1,
l’interaction de POT1-télomères est perturbée. Par conséquent, les télomères sont déprotégés. De plus, l’activité de
l’hélicase Rqh1 est stimulée permettant l’accès aux nucléases qui participent au raccourcissement des télomères
(Kibe et al. 2007)
55
Des études in vitro ont montré, par des approches biochimiques et biophysiques que la RPA
humaine était capable de se lier au G-quadruplexe télomérique et de le dérouler (Salas et al., 2006;
Qureshi et al., 2012). Schramke et al. ont montré que chez S. cerevisiae, la RPA régule l’action de la
télomérase durant le cycle cellulaire en facilitant le recrutement de la sous-unité catalytique Est1 sur
les télomères pendant la phase S, via le domaine N-terminal de la sous-unité RPA2 (Figure 35)
(Schramke et al., 2004). Il a également été montré que la RPA humaine régule l’activité in vitro de la
télomérase (Cohen et al. 2004). De même, MP. Rubtsova et ses collègues ont montré que la RPA
humaine stimule l’activité de la télomérase in vitro et favorise sa processivité (Rubtsova et al., 2009).
Ces données confirment un rôle de RPA dans le maintien des télomères et suggère que RPA modulerait
l’activité de la télomérase en déroulant les structures secondaires (G-quadruplexes), qui pourraient se
former au niveau de l’extension simple brin des télomères, et qui inhibent l’accès de la télomérase.
Ainsi RPA maintiendrait l’extrémité 3’ sous forme simple brin, permettant l’accès à la télomérase.
Figure 35. Activité de la télomérase pendant le cycle cellulaire. Pendant la phase G1 Est2 est liée aux télomères sous
une forme inactive. Pendant la phase S tardive, RPA, Est1 et Cdc13 se lient aux télomères. La liaison de Est1 dépend
directement de RPA et de Cdc13, tandis que les liaisons de RPA et Cdc13 peuvent se produire indépendamment. Le
complexe formé entre l’extrémité 3’, RPA, Est1 et Cdc13 est indispensable pour l’activité de la télomérase à
l’extrémité du chromosome (Schramke et al., 2004)
Le rôle de RPA aux télomères a été confirmé par une étude chez les levures Saccharomyces
cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe. En effet, P. Luciano et ses collègues ont observé par des
essais de ChIP que le taux de RPA associée aux télomères augmente au cours de la phase S
correspondant à la phase de réplication. Ils ont observé également que RPA co-précipite avec yKu,
Cdc13 et la télomérase. Une analyse de différents mutants de ces protéines suggère que l’interaction
de RPA avec les télomères est médiée par yKu et la sous-unité catalytique de la télomérase Est1. De
plus, si on mute le gène codant RPA1 dans des cellules dépourvues de rif1 et rif2 (deux protéines qui
régulent négativement la télomérase) et qui présentent de très longs télomères, on observe que les
56
télomères raccourcissent à nouveau. Ces résultats montrent clairement que RPA facilite l’activité de la
télomérase au niveau des télomères chez la levure (Luciano et al., 2012).
II.3. Le maintien des télomères par le mécanisme ALT
La RPA étant impliqué dans le mécanisme de recombinaison homologue (Binz et al., 2004),
son implication dans le mécanisme ALT a été investie. RPA a été détectée, par immunomarquage, pour
la première fois dans les APBs des cellules ALT en 1999 (Yeager et al., 1999). La localisation et l’effet
de l’altération de RPA humaine dans les cellules ALT ont été explorés par l’équipe de Stig Ove Bøe.
Ils ont tout d’abord observé par des anticorps marqués et spécifiques pour RPA1, RPA2 et PML, un
marqueur protéique des corps nucléaires PML, qu’une fraction de RPA colocalisait avec PML.
L’analyse quantitative des foyers de colocalisation RPA/PML montrait que 15 à 60% des corps PML
contenaient RPA (Grudic et al., 2007). De plus, des expériences de FISH (Fluorescence in situ
hybridization) ont permis de montrer que tous les corps nucléaires PML, colocalisant avec RPA,
contenaient de l’ADN télomérique. Ces résultats indiquent que RPA est présente dans les APBs
conjointement à la présence d’ADN télomérique. La même équipe a observé que la mutation du gène
codant soit RPA1 soit RPA2, entraînait une accumulation de l’ADN simple brin télomérique riche en
G, un blocage des cellules en G2/M et une augmentation du nombre des APBs dans les cellules ALT
ainsi que la formation d’agrégats télomériques au niveau des chromosomes métaphasiques. Aucun de
ces effets n’a été observé dans les cellules télomérase positive suite à la mutation de RPA1 ou RPA2.
La surexpression de BLM impliquée dans le mécanisme ALT provoque les mêmes conséquences
observées suite à la mutation de RPA (Stavropoulos et al., 2002). Il a donc été suggéré que RPA
pourrait avoir un effet inhibiteur sur BLM aux télomères. Ces données suggèrent fortement un rôle de
RPA dans le maintien des télomères par le mécanisme ALT qui pourrait résulter de la coopération avec
BLM (Grudic et al., 2007).
57
III. Interactions RPA – ADNsb
III.1. Le motif OB-fold
La RPA humaine se présente sous la forme d’un hétérotrimère composé de trois sous-unités de
70, 32 et 14 kDa. Chaque sous–unité possède au moins un motif appelé OB–fold (Oligo–
saccharides/Oligonucléotides Binding structure), il s'agit d'une structure spécifique capable de se lier
à des séquences d'oligosaccharides ou d'oligonucléotides. La RPA fait donc partie de la famille des
protéines OB, dont le rôle essentiel est de garantir l’intégrité du génome par des fonctions multiples
(pour revue Flynn, 2010). Nous verrons plus tard le cas du complexe POT1-TPP1.
Le motif "OB–fold" est formé de 5 chaînes en feuillet β aboutissant à une structure en
"tonneau–fermé", et d'une hélice α positionnée entre la troisième et la quatrième chaîne β. On retrouve
cette structure particulière dans de nombreuses protéines de liaison à l’ADN simple brin (Figure 36).
B
A
Figure 36. (A) Structure du motif OB-fold : Les chaînes β sont indiquées par des flèches et l’hélice α par une forme
ovale (Bochkarev, 1997) ; (B) Représentation tridimensionnelle de la structure OB-fold, les chaînes β sont indiquées
en bleu, l’hélice α en vert et les boucles en rouge (Kerr et al., 2003)
La sous-unité RPA1 possède quatre motifs OB-fold localisés dans les domaines de liaison à
l’ADN (DBD = DNA Binding domain): les domaines DBD A et DBD B situés au centre de la séquence,
le domaine DBD C situé dans la région C-terminale et le domaine DBD F situé dans la région Nterminale. Les sous-unités RPA2 et RPA3 possèdent chacune un motif unique OB-fold correspondant
aux DBD D et DBD E, respectivement (Figure 37).
58
Figure 37. Domaines structuraux et fonctionnels de RPA. La protéine possède six domaines DBD nommés de A à F.
Les régions qui interagissent avec des protéines et/ou l’ADN sont indiquées par des lignes horizontales. Le motif en
doigt de Zinc est indiqué par des lignes verticales en jaune. La région de jonction entre les DBD A et F est indiquée
par des hachures blanches. Wh correspond au domaine « wild type Homo sapiens ». P correspond au domaine de
phosphorylation (Binz et al., 2004)
La RPA2 possède deux domaines fonctionnels en N et C-terminal. Le domaine en N-terminal
correspond au domaine de phosphorylation de la RPA (présenté dans le paragraphe III.5.); le domaine
en C-terminal correspond à la région Wh formée par les résidus 200 à 270 et est impliqué dans les
interactions protéine – protéine. Cette région contient une structure particulière de type hélice – boucle
– hélice (Mer et al., 2000).
III.2. Caractéristiques des interactions
La RPA étant une SSB, c’est à dire une protéine de très forte affinité pour l’ADN simple brin.
Son affinité pour l’ADN double brin, et aussi l’ARN, est au moins de trois ordres de grandeur plus
faible par rapport à l’ADN simple brin (Iftode et al., 1999).
Des études approfondies de l’activité de liaison réalisées avec la RPA humaine par titration
quantitative sur gel natif (gel retard) et par mesure de l’extinction de fluorescence de la protéine
considérée indiquent une constante de dissociation de la RPA variant entre 10-8 et 10-11 M.
La sous-unité RPA1 possède l’activité de liaison majoritaire via les domaines DBD A et DBD
B, définis comme les domaines de haute affinité à l’ADNsb. Les domaines DBD C et D montrent
chacun une faible affinité pour l’ADNsb (Bochkarev et al., 1999; Bochkareva et al., 2002; Brill and
59
Bastin-Shanower, 1998). Enfin, le domaine DBD F montre aussi une très faible affinité pour l’ADNsb
(Daughdrill et al., 2001). Quant au domaine DBD E, bien qu’il possède un motif OB-fold, aucune
activité de liaison à l’ADNsb n’a été observée (Bochkareva et al., 2002). Toutefois, des expériences
de photopontage ont récemment pu mettre en évidence un contact de la sous-unité RPA3 avec l’ADNsb
(Salas et al., 2009).
La constante de dissociation de la RPA humaine est dépendante d’un certain nombre de facteurs
liés à la séquence et la taille de l’ADNsb mais aussi des conditions utilisées pour sa détermination.
Bien que la liaison de la RPA humaine ne soit pas séquence spécifique, elle montre une préférence
pour les séquences polypyrimidines par rapport aux séquences polypurines avec une affinité 50 fois
supérieure pour les séquences polypyrimidines (Kim et al., 1992). L’affinité de la RPA humaine pour
l’ADN simple brin varie donc ainsi: séquences simple brin polypyrimidines > séquences simple brin
hétérogènes > séquences simple brin polypurines. De récentes expériences de SELEX ont permis de
discriminer la spécificité de séquence des différents domaines de liaison indiquant une préférence pour
les séquences riches en G des domaines DBD D et DBD E, et à l’inverse une préférence pour les
séquences riches en pyrimidines des domaines DBD A et DBD B (Prakash et al., 2011 b).
L’étude de l’activité de liaison de la RPA humaine, en présence d’oligonucléotides poly dT de
différente taille, montre que l’affinité varie en fonction de la longueur de l’ADN. En effet, plus la taille
de l’oligonucléotide croît, plus l’affinité augmente. La RPA est en effet plus stable sur des ADNsb de
grande taille car les contacts RPA-ADNsb, via les domaines DBD, sont plus nombreux.
Deux paramètres modulent l’affinité de la RPA humaine: la concentration en sels et la présence
de détergents non dénaturant ou de sérum albumine. L’augmentation de la concentration en sel
monovalent fait diminuer l’affinité de la RPA pour son substrat (Kim and Wold, 1995). De plus,
l’analyse de complexes RPA-ADNsb en microscopie électronique montre qu’en se plaçant dans des
conditions de faible force ionique ([NaCl] < 100 mM ou [MgCl2] < 1 mM), on observe un complexe
RPA-ADNsb étalé dans lequel la RPA recouvre une région de 30 nucléotides. A forte concentration en
sels ([NaCl] > 100 mM ou [MgCl2] > 1 mM), c’est un complexe RPA-ADNsb compacte, avec une
région recouverte d’environ 10 nucléotides, qui est observé (Treuner, 1996). Nous verrons
ultérieurement que ces changements conformationnels, dépendant de la concentration en sels,
correspondent à des modes de liaison bien distincts: un mode 30 nt stable favorisé à faible concentration
en sel et, un mode 8-10 nt peu stable favorisé à haute concentration en sels.
60
La présence de détergents non dénaturant (Nonidet et Tween 20) et/ou de la BSA améliore la
constante d’association (valeur de 2 à 6 fois plus élevée), leur rôle est de favoriser la solubilisation de
la protéine en empêchant son agrégation et son interaction non spécifique avec la surface des tubes
utilisés.
III.3. Site et mode de liaison sur l’ADN simple brin
Le site de liaison est défini comme la région d’ADN recouverte par la protéine et donc
inaccessible au milieu. Divers homologues de la RPA ont été analysés afin d’étudier la nature de ces
sites.
La RPA humaine lie l’ADNsb selon quatre modes de liaison : le mode 8-10nt, 12-23nt (ou 1322nt dans certaines publications), 23-27nt et 30nt. Le mode de liaison 30-nt a été le premier mode de
liaison défini pour la RPA humaine. Il s’agit du mode de liaison le plus stable. Par la suite des
expériences de pontage au glutaraldéhyde des complexes RPA-ADNsb formés, permettant de piéger
des interactions peu stables, un second mode de liaison 8-10nt a été mis en évidence. Les complexes
résultant de ces deux modes de liaison ont été visualisés par microscopie électronique: l’un présente
une silhouette globulaire (mode 8-10nt), alors que le second possède une forme plus allongée (mode
30nt), indiquant clairement que ces complexes diffèrent par la taille du site occupé par la RPA
(Blackwell et al., 1996). D’une part, on sait maintenant que ces complexes peuvent coexister en
solution et nous verrons qu’ils sont étroitement imbriqués. D’autre part, la présence de ces différents
modes de liaison dépend de la concentration de RPA humaine (Salas et al., 2009): le mode 8-10 nt est
obtenue lorsque la RPA est en très large excès par rapport à l’ADNsb (100 fois plus concentrée), le
mode 30 nt se forme lorsque l’ADNsb et la protéine sont en quantité stœchiométrique. Pour des
concentrations intermédiaires en protéine le mode de liaison 13-22 nt a été observé. Le mode de liaison
23-27nt a été mis en évidence par l’équipe de Cai (Cai et al., 2007).
Enfin, la possibilité pour la RPA de lier l’ADN sous différents modes de liaison lui permet de
moduler ses interactions RPA - RPA et RPA - autres protéines, et donc de réguler les différentes voies
métaboliques où elle est impliquée.
61
III.3.1. Mode de liaison 8-10-nt
La silhouette globulaire observée en microscopie électronique correspond à la fixation de la
RPA humaine sur une région allant de 8 à 10 nucléotides. Cette liaison est médiée par l’interaction des
domaines DBD A et B de RPA1 (Figure 38A); le domaine DBD A étant positionné du coté 5’. La
structure du tandem DBD A-B de RPA1 lié à un oligonucléotide de petite taille, déterminée par
cristallographie et présentée sur la figure 38B montre en effet que le site de liaison du tandem DBD
A-B est au moins de 8 nt (Bochkarev et al. 1997): les DBD A et B interagissent chacun avec trois
nucléotides à chacune des extrémités laissant une région centrale de deux nucléotides non impliquée
dans des interactions. La position des nucléotides présents dans les deux tunnels des motifs OB-fold
est maintenue par un réseau de liaisons hydrogène, formé entre les résidus basiques (lysines) et le
squelette ribose-phosphate du poly dC, ainsi que par des interactions d’empilement entre les résidus
phénylalanine et tryptophane et les bases de l’ADN.
A.
B.
Figure 38. (A). Séquences des DBD A et B de RPA1 alignées sur la base des structures tridimensionnelles. Les flèches
représentent les feuillets β et les carrés les hélices α ; les résidus entourés par un carré interagissent avec l’ADN. (B)
Structure du complexe formé entre les DBD A et B de la RPA70 et le polyC. (B) Les deux domaines sont liés à l’ADN.
Les chaînes β sont colorées en bleu les hélices α en violet et les boucles en orangé; l’ADN est présenté en rouge.
(Bochkarev et al., 1997)
Ce mode de liaison est peu stable mais il peut être stabilisé par la liaison coopérative d’autres
protéines de RPA, via des interactions RPA-RPA.
62
III.3.2. Mode de liaison 12-23-nt
La protéine peut recouvrir une région comprise entre 12 et 23 nt impliquant l’interaction du
domaine DBD C de la RPA1 du côté 3’, dont la structure cristalline a été obtenue par l’équipe de E.
Bochkareva (Figure 39A). La particularité du motif OB-fold du DBD C est de contenir deux structures
particulières : le motif en doigt de zinc et le motif «hélice-coude-hélice» (Figure 39C).
Figure 39. Comparaison des structures des domaines DBD C et DBD B. (A) Structure cristalline du DBD C avec
les feuillets β en vert, les hélicesα en vert foncé et les boucles en rouge. Une partie de l’extrémité N-terminale de
RPA2 (acides aminés 45-50) est représentée en jaune. Les acides aminés conservés et les quatre cystéines qui
coordonnent l’ion Zinc (sphère bleue) sont signalés. La boucle L4.5, qui n’est pas organisée, est indiquée par une
ligne discontinue. (B) Structure cristalline du DBD B en interaction avec l’ADN simple brin. Le DBD B est présenté
avec la même orientation que celle DBD C dans (A). L’ADN simple brin est coloré en violet. (C) Séquences des DBD
C et B alignées sur la base des structures tridimensionnelles. Les feuillets β sont indiqués par des flèches et les hélices
α par des carrés. Le motif en doigt de Zinc (Zn-Ribbon Motif) et le motif hélice-coude-hélice (Helix-Turn-Helix)
sont représentés. Les acides aminés fonctionnels du DBD C, les quatre cystéines et les deux acides aminés conservés,
sont en majuscule. Les résidus encadrés correspondent à la boucle L4.5 désorganisée (Bochkareva et al., 2002)
Le mode de liaison 12-23nt est appelé «mode de liaison contracté». La mesure de la
fluorescence intrinsèque du résidu tryptophane du domaine C (W528) de RPA1 en présence d’une
séquence variant de 12nt à 23nt, a permis de montrer l’implication du domaine C dans la liaison de
RPA sur cet ADNsb (Cai et al., 2007). En d’autres termes, le domaine C de RPA1 contribue avec A
et B au mode de liaison intermédiaire 12-23nt. Toutefois l’observation de complexes RPA/ADNsb de
31nt (polyT31) de stœchiométrie 2 /1 par gel retard, complétée par des expériences de photomarquage,
utilisant la 4-thiothymine, montre que la sous-unité RPA2 est aussi impliquée dans le mode de liaison
12-23nt (Salas et al., 2009).
63
III.3.3 Mode de liaison 23-27-nt
Cai et ses collègues, ont suggéré que la protéine puisse s’associer à l’ADNsb avec un mode de
liaison plus stable que le mode 12-23nt grâce à la liaison du domaine D de RPA2 (Cai et al., 2007;
Bastin-shanower and Brill, 2001) dont la structure cristalline est présentée sur la figure 40B.
Figure 40. Comparaison des structures cristallines des DBD E (A), DBD D (B) et DBD B (C). Les chaînes β sont
colorées en bleu, les hélices α en vert et les boucles en rouge. Les positions des acides aminés sont indiquées avec des
chiffres. Les résidus de RPA2 et RPA1 qui interagissent avec l’ADN sont représentés en rouge. Les extrémités 5’ et
3’ de l’ADN sont indiquées en bleu. Les boucles L1.2, L2.3 et L4.5 sont indiquées (Bochkarev et al., 1999)
En effet, lorsqu’on rajoute à un ADNsb de 23nt un nucléotide supplémentaire, le quenching du
résidu tryptophane (W107) du domaine D de RPA2 augmente significativement puis il reste constant
pour des ADNsb compris entre 24nt et 27nt. De plus, l’évaluation de l’arrangement spatial relatif des
domaines de RPA au niveau du complexe RPA-ADN simple brin, montre une distance de (~19 Å)
entre DBD B et DBD C et de (~34 Å) entre DBD C et DBD D (Cai et al., 2007). Ces résultats ont
permis de proposer un modèle de liaison des domaines DBD essentiels de RPA sur une séquence de
26nt (Figure 41).
Figure 41. Modèle de liaison proposé pour un 26mer : Les domaines DBD A, B, C et D sont représentés par les blocs.
L’ADN simple brin est représenté par la ligne (5’-3’). Les flèches (W) indiquent la position des résidus Tryptophane
de chaque domaine OB-fold dans la liaison à l’ADN (Cai et al., 2007)
64
Le fait que RPA2 soit à la fois impliquée dans le mode 12-23nt et le mode 23-27nt n’est pas
incohérent. En effet, il se pourrait que dans le mode 12-23nt la RPA2 implique une région autre que le
DBD D, le domaine N-terminal par exemple, et que le DBD D soit impliqué dans le mode 23-27 nt.
Il est à noter que la présence des hélices α en C-terminale des domaines DBD C, D et E
participent à la formation de l’hétérotrimère (Figure 42)
Figure 42. Structure cristalline d’un dimère du trimère DBD C, D et E. Le dimère est représenté selon un axe
perpendiculaire à l’axe de symétrie (ligne discontinue), la sphère bleue représente le Zn II (Bochkareva et al., 2002)
III.3.4. Mode de liaison 30-nt
La protéine peut se trouver sous une forme étendue, plus stable, lui permettant de recouvrir une
région d’environ 30 nucléotides. Des études biochimiques montrent que ce mode de liaison implique
des interactions supplémentaires avec le domaine DBD E (Salas et al., 2009) dont la structure cristalline
est présentée sur la figure 40A. En effet l’étude de photomarquage d’affinité utilisant la 4-thiothymine,
a permis de mettre en évidence pour la première fois un contact, probablement transitoire, entre la sousunité RPA3 et l’extrémité 3’ d’un ADNsb contenant 31 nt (Figure 43).
65
Figure 43. Modèle schématique des modes de liaison 30, 13-22nt et 8-10nt d’après l’étude de T. Salas. Les positions
de la 4-thiothymine sont indiquées par les lignes pointillées. RPA1, RPA2, RPA3 correspondent aux sous-unités de
RPA (Salas et al., 2009).
La localisation exacte de ce contact n’a pas été identifiée mais suggère fortement que le
domaine DBD E soit impliqué. Ces dernières données ont permis de montrer que la totalité de l’ADN
recouvert est en contact avec les domaines DBD A, B, C, D et E (Figure 43). Bien que le domaine
DBD-F possède une structure OB-fold, aucune évidence biochimique ne permet pour l’instant de savoir
si ce domaine est impliqué dans des interactions avec l’ADNsb dans le mode de liaison 30-nt.
La structure cristalline de la protéine presque entière (domaine N-terminal de RPA1 et domaine
Wh C-terminal de RPA2 tronqués) du champignon Ustilago maydis a été récemment obtenue en
présence d’un oligonucléotide (dT)62 et (dT)32 avec une résolution de 2,8 Å et 3,1 Å respectivement
(Fan & Pavletich, 2012). Le complexe quaternaire, présenté dans la figure 44, montre l’interaction des
domaines DBD-A,B et C de RPA1 et du domaine DBD-D de RPA2 avec l’ADN simple brin, la sousunité RPA3 n’ayant pas de contact avec l’ADN. Les structures des domaines pris individuellement sont
très similaires à celles obtenues avec les domaines de la protéine humaine à savoir, les domaines DBDD et DBD-E (Figure 40) et la structure des domaines DBD-A, B avec (dC)8 (Figure 38).
66
Figure 44. Structure cristalline de la RPA tronquée du domaine N-terminal (OBN) avec un polyT (Fan and
Pavletich, 2012)
Toutefois, l’orientation des domaines A et B varie entre les deux structures montrant une
rotation de 30° entre les deux domaines dans la structure entière. On retrouve aussi l’interaction des
hélices α en C-terminal des domaines DBD C, D et E observées précédemment sur le trimère humain
DBD C, D et E (Figure 42) (Bochkareva et al., 2002), une interaction essentielle pour la formation de
l’hétérotrimère. Cette nouvelle structure montre de nouvelles zones d’interface: (i) entre les domaines
DBD B, DBD C, le linker (en rose sur la figure 44) de 10nt présent entre DBD B et DBD C, et l’ADN,
(ii) entre le DBD A et l’hélice α en C-terminal du domaine DBD C. Ces nouvelles interactions
contribuent à la stabilité de l’édifice. Enfin, on remarque que le trajet que l’ADN adopte, en traversant
les OB-fold des DBD A, B, C et D, une structure en U (U shape).
67
Les interactions mises en jeu dans le complexe sont indiquées sur la figure 45 et correspondent
à des interactions de type liaisons hydrogène, interactions électrostatiques et interactions de van der
Waals. On retrouve des contacts équivalents à ceux observés dans la structure de Bochkarev (Figure
38) impliquant des résidus d’acides aminés aromatiques (F236, F267, W359, F388).
Figure 45. Représentation schématique des contacts RPA-ADNsb. Les traits bleus indiquent les liaisons hydrogène
entre les résidus d’acide aminé et les groupements phosphate de l’ADN (cercles) ou les bases (rectangles). Les traits
verts fins indiquent les interactions van der Waals entre bases et sucre. Les traits verts épais indiquent l’empilement
entre les bases adjacentes. Les limites des quatre DBDs sont indiquées par les traits pointillés
Dans la protéine entière, le domaine DBD F, localisé en N-terminal du domaine DBD A,
pourrait se positionner dans le même sens que le DBD A, entre le DBD A et le DBD E, comme proposé
dans le modèle de Bochkareva 2002 (figure 46), impliquant pour la sous–unité RPA3 un rôle essentiel
pour la stabilisation du DBD F et donc de la protéine entière (Bochkareva et al., 2002). Seule la
structure du domaine DBD F n’est pas élucidée à ce jour.
68
Figure 46. Modèle suggéré pour la formation de l’hétérotrimère. Le diagramme montre la protéine comme un
hexamère d’ OB-fold autour d’un système multi – hélices. Les hélices sont représentées par des cercles, l’hélice
transitoire du DBD F par un cercle avec un point d’interrogation et les six motifs OB-fold par des mains. Le site de
trimérisation est signalé par un triangle (Bochkareva et al., 2002)
L’ensemble de ces données montrent clairement que la RPA humaine se lie à l’ADN avec une
polarité bien définie positionnant la RPA1 du côté 5’ puis successivement les RPA2 et RPA3 lorsqu’on
se dirige vers le côté 3’. Il est maintenant bien admis que cette polarité joue un rôle essentiel dans le
mode de liaison de la RPA. En effet, Iftode et Borowiec, à partir de structures d’ADN double brin
contenant des régions simple brin de 8 nt, mimant le site d’origine de la réplication du SV40, ont
retrouvé cette orientation 5’-3’ de RPA (Iftode and Borowiec, 1997, 1998, 2000).
III.4. Mode de liaison séquentiel de la RPA humaine
Des études biochimiques ont permis de définir le mode de liaison de la RPA à l’ADN simple
brin (De Laat et al., 1998; Kolpashchikov et al., 2001). Entre autres De Laat et al. ont étudié par la
technique d’électrophorèse native l’affinité de la RPA pour des structures en épingle à cheveu (hairpin)
possédant une région simple brin poly (dT) soit à l’extrémité 3’ soit à l’extrémité 5’. Les résultats ont
montré que la RPA se liait avec une plus grande affinité sur les structures hairpin possédant la région
simple brin du côté 5’. Depuis, pourtant de nombreuses autres études ont montré une préférence de
RPA du côté 3’ de l’ADNsb (Delagoutte et al., 2011).
Un mécanisme multi-étapes a été proposé en 2003 par l’équipe de Wyka (figure 47) (Wyka et
al., 2003) impliquant la liaison séquentielle des différents domaines DBD de RPA. Ce modèle est basé
d’une part sur la polarité 5’-3’ de la RPA humaine et d’autre part sur les résultats de Patrick et al obtenu
en 2001 qui ont montré que la vitesse de fixation de RPA sur l’ADN simple brin, selon le mode 8-10nt,
69
était plus élevée que celle du mode 30nt (Patrick and Turchi, 2001). Ainsi, la RPA commence par
accrocher les domaines centraux de plus haute affinité DBD A et DBD B à l’extrémité 5’ de l’ADN
simple brin (le DBD A étant plus proche de l’extrémité 5’) (# 1 et # 2 dans la figure 47) pour conduire
au complexe 8-10 nt, qui est peu stable. Cette première étape est suivie de la fixation du domaine DBD
C, adjacent au tandem DBD A-B, du côté 3’; ce changement de conformation conduit à la formation
d’un premier complexe intermédiaire plus stable (# 3). Par la suite, la fixation du DBD D du coté 3’
aboutit au complexe 23-27 nt (# 4). Ce modèle a été depuis affiné en plaçant du côté 3’ le DBD E pour
assurer le recouvrement du 30mer par la RPA. Bien qu’il ait été montré que le DBD F se lie très
faiblement à l’ADN, il n’y a aucune donnée quant à sa localisation précise sur l’ADN. Toutefois, la
structure de la protéine impose la présence du DBD F du coté 5’.
Le modèle séquentiel de RPA corrèle bien avec le modèle de formation des complexes 2 :1 et
3 :1 proposé par Salas qui montre la liaison de RPA1 en 5’, puis l’association de RPA2 en s’orientant
de 5’ vers 3’ et finalement l’association de RPA3 en 3’ (Salas et al., 2009).
Figure 47. Modèle de fixation séquentielle polarisée de RPA sur l’ADNsb. A, B, C, D, E et F correspondent aux
différents domaines DBD de RPA, la ligne ondulante et le cercle signalent le domaine de phosphorylation et le
domaine C-terminal de RPA2, respectivement. Le point d’interrogation indique l’absence de données sur les
interactions de l’ADNsb avec le DBD F (Wyka et al., 2003)
70
III.5. Les domaines de phosphorylation
La RPA est phosphorylée pendant le cycle cellulaire ou après l’apparition d’une lésion dans
l’ADN (Binz et al., 2004; Liu et al., 2012). La quantité de RPA phosphorylée varie au cours du cycle
cellulaire : pendant la phase S, 40 à 50% de la RPA endogène est phosphorylée chez l’homme. Des
cellules contenant de l’ADN endommagé peuvent contenir entre 50 et 100% de molécules de RPA
phosphorylée, ce pourcentage dépend du type et de la quantité de lésion présente dans l’ADN.
Les sites de phosphorylation sont localisés majoritairement dans le domaine N-terminal de
RPA2 (résidus 1-45).
III.5.1. Le domaine N-terminal de RPA2
Pendant un cycle cellulaire normal, les premières formes phosphorylées de RPA2 apparaissent
durant la transition G1/S et persistent à travers la phase S. C’est à la fin de la phase M que la sous–unité
RPA2 sera déphosphorylée. La région N-terminale de RPA2 est un domaine flexible qui contient de
multiples résidus sérine et thréonine. La phosphorylation cycle cellulaire dépendant est catalysée par
l’action de kinases appartenant à la famille des cyclines CDK, telle que la cdc2-kinase. Les sérines 23
et 29 sont les sites consensus des CDK (Liu et al. 2012). La serine 23 est phosphorylée durant la phase
S alors que la sérine 29 l’est uniquement lors de la mitose. Cette phosphorylation supplémentaire induit
l’exclusion de RPA des chromosomes lors de la mitose. La déphosphorylation rapide de la RPA après
la cytokinèse relocalise la RPA dans le noyau en G1.
Dans des cellules irradiées aux UV ou aux rayons X ou aux radiations ionisantes, ou soumises
à des agents chimiques (hydroxyurée, camptothécine) ou en apoptose, le taux de phosphorylation
augmente dramatiquement et de nouveaux sites de phosphorylation apparaissent. Cette
hyperphosphorylation est catalysée par la famille des kinases PIKK homologues à la
phosphatidylinositol 3-kinase (PI – 3) incluant ATM (ataxia-telangiectasia mutated), ATR (ATM et
Rad3) et l’ADN-PK (kinase ADN dépendante). Des études de phosphorylation in vitro et des études in
cellulo de mutants de phosphorylation de RPA ont permis d’identifier les sites de phosphorylation des
kinases : ATM et ADN-PK phosphorylent préférentiellement les Ser 4, ser8 et Thr21 alors que ATR
phosphoryle uniquement la Ser 33.
71
Le signal cellulaire qui induit l’hyperphosphorylation de la RPA implique la liaison de la
protéine à l’ADN simple brin ou à l’ADN endommagé.
L’hyperphosphorylation de la RPA modifie ses interactions avec les protéines et l’ADN. En
effet il a été montré que l’antigène T, l’ADN polymérase α, l’ADN-PK et l’ATM ont moins d’affinité
pour la RPA hyperphosphorylée, alors que les interactions impliquant les protéines de réparation de
l’ADN (XPA) et de recombinaison (Rad51 et Rad52) restent inchangées. De plus,
l’hyperphosphorylation de la RPA semble ne pas avoir d’effet sur son rôle dans la réparation de l’ADN
in vitro ou in vivo, mais réduit son association aux centres de réplication inhibant ainsi la réplication.
Ces données suggèrent probablement que l’hyperphosphorylation de la RPA, en réponse aux
dommages de l’ADN, permet de dévier une partie du pool cellulaire de RPA des sites de réplication
vers les sites de réparation (Figure 48) (Binz et al., 2004).
Figure 48. Modèle de régulation de la RPA par la phosphorylation. Seule la forme non phosphorylée de la RPA est
active dans la réplication, alors que les formes non phosphorylée et hyperphosphorylée de la RPA participent à la
réparation de l’ADN et la recombinaison (Binz et al., 2004)
72
IV. Interactions RPA G-quadruplexe
Nous avons cité précédemment les protéines majeures qui peuvent être en interaction avec les
structures G-quadruplexes (chapitre I paragraphe IV.5.). Dans cette partie nous aborderons les
interactions in vitro entre la RPA humaine et les structures G-quadruplexes.
La RPA est présente au niveau des télomères essentiellement durant la phase S et sa présence
est indispensable pour le maintien des télomères (Smith et al., 2000; Ono, 2003). De plus, cette
dernière régule l’activité de la télomérase in vitro et in vivo (Schramke et al., 2004; Cohen et al., 2004;
Rubtsova et al., 2009; Luciano et al., 2012). Sachant que les structures G-quadruplexes inhibent la
progression de la fourche de réplication des télomères et l’activité de la télomérase et que l’ouverture
de ces structures est indispensable à la réplication et l’élongation des télomères, il a donc été suggéré
que RPA, en interagissant dans ces régions riche en G, maintenait l’ADN sous forme simple brin.
Cette hypothèse laissait à penser que la RPA humaine était donc capable de s’associer aux structures
G-quadruplexes et de provoquer leur résolution, permettant ainsi la progression de la fourche et l’accès
à la télomérase. Une étude in vitro par gels retard et des essais de pontage ADN/protéine a mis en
évidence la formation de complexe RPA/ G-quadruplexe télomérique humain dans des conditions
comparables aux conditions physiologiques (Salas et al., 2006). De plus, il a été montré que l’affinité
de RPA au G-quadruplexe télomérique est plus importante en Na+ qu’en K+, indiquant que l’affinité de
la RPA pour les G-quadruplexes dépend des conditions de l’expérience et donc de la stabilité des Gquadruplexes (Wu et al., 2008; Salas et al., 2006). En parallèle, des expériences de transfert d’énergie
de fluorescence par résonance ont montré l’ouverture du G-quadruplexe télomérique en présence de
RPA. Ces résultats ont confirmé que RPA était capable de lier et de résoudre le G-quadruplexe
télomérique in vitro. Etant donné que RPA est une protéine qui se lie à l’ADN simple brin et en
supposant qu’un équilibre existe entre les structures G-quadruplexes stables et semi- ouvertes en
solution (Figure 14) (Bončina et al., 2012), un modèle de liaison RPA/G-quadruplexe a été proposé
(Figure 49). Ce modèle suggère que RPA se lie à une région simple brin du G-quadruplexe, au niveau
des extrémités ou des boucles, et déstabilise le G-quadruplexe entrainant sa résolution (Salas et al.,
2006).
73
Figure 49. Modèle sequentiel de la liaison de hRPA au G-quadruplexe représenté par F-hTelo-T (Fluoresceinehuman Telomeric G-quadruplexe-TAMRA). F-hTelo-T représente le G-quadruplexe semi-ouvert générant une
extrémité simple brin permettant la liaison d’une première molécule de hRPA (complexe 1:1) qui va dérouler le Gquadruplexe et faciliter la fixation d’une deuxième molécule de hRPA (complexe 2:2) (Salas et al., 2006)
La nécessité d’une région simple brin pour la fixation de RPA au G-quadruplexe a aussi été
observée pour des G-quadruplexes non télomériques (Fan et al., 2009). En effet, la présence d’une
extension simple brin aux G-quadruplexes favorise la liaison de RPA au G-quadruplexe.
En comparant la fixation et l’ouverture de différents G-quadruplexes ayant des Tm différents,
l’équipe de H. Balci a montré que la résolution des structures G-quadruplexes par la RPA humaine
était indépendante de la stabilité thermique (Qureshi et al., 2012); RPA est capable d’ouvrir avec la
même efficacité des G-quadruplexes comportant 2, 3 ou 4 quartets de guanine. En effet, le temps
nécessaire pour la résolution des G-quadruplexes est presque équivalent (0,3 secondes). Ce résultat
montre que l’étape limitante pour l’ouverture du G-quadruplexe est l’étape de fixation de RPA, qui elle
dépend bien de la stabilité thermique des G-quadruplexes, c’est-à-dire du nombre de plateaux de
guanine inclus dans le G4 ainsi que de la taille des boucles.
Les différents domaines de liaison de la RPA humaine ont été étudiés vis à vis de leur
implication dans l’interaction avec les G-quadruplexes. Pour cela, les constructions AB, CDE, DE, C
et le noyau CDE ont été établies (Figure 50). Par une étude SELEX, les auteurs ont montré que le noyau
CDE avait une très forte affinité pour les séquences riches en G, capables de former des Gquadruplexes, contrairement aux domaines AB qui montraient une forte affinité pour des séquences
riches en thymine et cytosine, incapables de former des structures secondaires; quant au domaine C,
aucune préférence de séquence n’a été mise en évidence. Les expériences de dichroïsme circulaire
74
réalisées par la suite sur une séquence riche en G (Gq23), capable de former un G-quadruplex antiparallèle en présence du sodium, ont montré que, si RPA et CDE se liaient et ouvraient les Gquadruplexes, DE pouvait lier le G-quadruplexe mais n’était pas capable de l’ouvrir (Prakash et al.,
2011a). Il semble donc que D et E soient responsables de l’étape initiale de reconnaissance et de
fixation du G-quadruplexe et que le recrutement des autres domaines permettrait la déstabilisation et
la résolution du G-quadruplexe. Il a été suggéré que A, B et C contribuent à la fonction de «liaison
universelle» de RPA alors que D et E interviennent dans son interaction au niveau des G-quadruplexes
(Prakash et al., 2011a). Par ailleurs, Prakash et ses collègues ont également testé l’effet des sels et d’un
ligand G4 « TMPyP4 » sur la capacité de RPA et CDE à résoudre le G-quadruplexe (G23q). Ils ont
tout d’abord réalisé des expériences de RMN et de dichroïsme circulaire pour étudier l’effet des sels
sur la conformation de Gq23 : en K+, un mélange de structures parallèles et anti-parallèles a été observé
alors qu’en Na+ G23q adopte uniquement des structures parallèles (Prakash et al., 2011b). En rajoutant
RPA ou CDE, ils ont observé que la stabilisation du G-quadruplexe par TMPyP4, en présence du K+,
inhibait complètement le déroulement du G-quadruplexe par CDE et partiellement par RPA. En
présence de Na+, aucun effet inhibiteur n’a été observé. Ces résultats confirment que les interactions
RPA/G-quadruplexe dépendent de la stabilité et de la structure du G-quadruplexe.
Figure 50. Les différentes constructions des domaines de RPA utilisées dans l’étude de Prakash et les structures
correspondantes. RPA-AB contient RPA1181-441. RPA-CDE comporte RPA1382-616, RPA2 et RPA3. Le noyau RPACDE consiste de RPA338-616, RPA243-171, et RPA3. RPA-DE est formé de RPA243-171 et RPA3. RPA-C est composé de
RPA332-595 avec 7 mutations ponctuelles (V435T, W442Q, V465T, V469T, F523S, F567S, and I571T). Les structures
cristallisées de RPA-AB, RPA-AB + dC8, RPA- noyau CDE, et RPA-DE sont représentées à coté de chaque
construction
75
L’étude des interactions RPA G-quadruplexe est en plein essor depuis 2006 et apporte déjà des
réponses pour appréhender le rôle de RPA aux télomères. Toutefois, cette étude ne peut être menée
sérieusement sans tenir compte de la présence de la protéine de liaison à l’ADN simple brin
télomérique, à savoir la protéine POT1. Dans ce contexte nous avons entrepris de présenter la protéine
POT1 et la dualité entre RPA et POT1 aux télomères.
V. POT1 humaine
V.1. Les fonctions de hPOT1 aux télomères
hPOT1 fait partie des protéines du Shelterin aux télomères (Figure 3). Elle se localise au niveau
de la région simple brin riche en guanine. hPOT1 reconnaît et interagit spécifiquement avec la séquence
télomérique humaine grâce à son interaction avec TPP1 (autre protéine du Shelterin) avec qui elle
forme un hétérodimère (Liu et al., 2004; Xin et al., 2007; Baumann and Cech 2001; Nandakumar et
al., 2010). En effet, un mutant de hPOT1 déficient de son domaine d’interaction avec TPP1 montre
une incapacité à s’associer aux télomères.
hPOT1 participe à la protection des télomères. L’inactivation de hPOT1 par ARN interférence
entraîne une diminution de la viabilité cellulaire caractérisée par un arrêt de la croissance cellulaire et
une entrée en sénescence, des fusions de la chromatine en interphase, des fusions chromosomiques en
métaphase, des ponts anaphasiques, un raccourcissement de l’ADN simple brin télomérique ainsi que
des dommages transitoires à l’ADN (Hockemeyer et al., 2005; Veldman et al., 2004). De plus, en
absence de hPOT1, la voie de réparation ATR est déclenchée (Guo et al., 2007; Churikov and Price,
2008). En effet, l’absence de hPOT1 aux télomères permet le recrutement de RPA déclenchant à son
tour le recrutement d’ATRIP (Shiotani and Zou, 2009; Baumann and Price, 2010).
hPOT1 peut réguler positivement ou négativement l’activité de la télomérase (Zaug et al., 2005;
Gomez et al., 2006; Armbruster et al., 2004; Colgin et al., 2003). Dans le contexte t-loop, hPOT1 fixe
le simple brin de la D-loop et coopère avec TRF2 pour maintenir la t-loop empêchant l’accès du
télomère à la télomérase (Loayza and De Lange, 2003; Yang et al., 2005). Dans le contexte simple
brin, la présence de hPOT1 à l’extrémité du télomère peut activer ou inhiber la télomérase selon sa
localisation sur le simple brin (voir ci-dessous, figure 55) (Zaug et al., 2005). Cette activité de
régulation nécessite une interaction avec TRF2 (Kendellen et al., 2009) et est stimulée par l’interaction
76
avec TPP1 (Xin et al., 2007; Wang et al., 2007). TPP1 permet une bonne stabilité de la télomérase aux
télomères et facilite l’étape de translocation de la télomérase (Latrick and Cech, 2010).
hPOT1 intervient également dans la réplication du brin C des télomères. En effet, en absence
de l’hélicase WRN, hPOT1 permet de maintenir la réplication des télomères grâce à un découplage de
la fourche de réplication (figure 51A). Dans ces conditions, seul le brin C est répliqué (leading strand)
; la région simple brin, générée sur le brin G, est prise en charge majoritairement par hPOT1 et dans
une moindre mesure par RPA. Si hPOT1 est limitant ou absent, RPA devient majoritaire sur le brin G
et entraine un blocage de la fourche (figures 51 B et C). Enfin, le découplage peut être restauré si on
exprime hPOT1 dans la cellule (figure 51D) (Arnoult et al., 2009).
Figure 51. Modèle de découplage de fourche de réplication en absence de WRN
A noter que chez la souris, POT1 intervient dans la résection/remplissage du brin C. Sa présence
à l’extrémité 3’ simple brin inhibe Apollo (étape de résection) et active le complexe CST (remplissage).
Ainsi en jouant sur la longueur du brin C, on module la taille du G-overhang (wu et al., 2012).
V.2. Interactions hPOT1 – ADNsb
hPOT1 est une protéine de 70kDa constituée de deux domaines OB-fold (OB1 et OB2) localisés
du côté N-terminal (Figure 52) (Lei et al., 2004; Loayza et al., 2004; Kelleher et al., 2005).
77
Figure 52. Structure des protéines POT1 et TPP1 humaines (Wang et al. 2007)
hPOT1 se lie à l’ADN télomérique simple brin via ses deux domaines de liaison de type OBfold. La structure cristallisée de hPOT1 humaine liée à un décamère TTAGGGTTAG (inclut le motif
répétitif télomérique humain) a été obtenue en 2004 (Lei et al., 2004). Dans cette structure, OB1 lie les
six premiers nucléotides du décamère (T1-G6) et OB2 lie les quatre derniers nucléotides en 3’ (T7G10) (Figure 53). OB1 et OB2 interagissent avec l’ADN via des interactions de type van der Waals et
des liaisons hydrogène, préalablement observées dans la structure de POT1 de levure (Trujillo et al.,
2005; Croy et al., 2006). Contrairement à ce qui a été observé dans la structure cristalline des domaines
DBD A et B de RPA avec le polyd(C)8 où les deux cavités des OB-fold en contact avec l’ADN sont
orientées dans la même direction (figure 38), dans la structure de hPOT1, les deux OB n’ont pas la
même orientation ce qui confère une légère courbure à l’ADN. OB1 montre une similarité avec l’OB1
de POT1 de levure alors que OB2 montre une homologie avec le domaine OB-fold du domaine DBD
B de RPA1 (Bochkarev et al., 1997).
a
b
Figure 53. (a) Structure de hPOT1-ADN simple brin: les feuillets β des domaines OB-fold en bleu, l’hélice α en vert
et les boucles en orange ; (b) Représentation schématique des interactions d’empilement entre la hPOT1 et l’ADN :
les OB-fold représentés par les deux ellipses en bleu, les bases sont indiquées par les barres en jaune, les
phosphodiesters sont en rose, les sucres en blanc et les résidus de la protéine sont indiqués par les barres en bleu
(Lei et al., 2004)
78
Chez les mammifères, le site de liaison minimale de POT1 correspond à une région de 8
nucléotides avec une préférence pour la séquence 5'-TAGGGTTAG-3’de l’ADN télomérique simple
brin.
hPOT1 forme un hétérodimère avec la protéine TPP1. Cette dernière (figure 52) possède un
domaine d’interaction avec hPOT1 (PBD) et un domaine OB-fold dont la structure cristalline a été
résolue (Figure 54) (Wang et al., 2007). Toutefois, il semble que ce complexe se lie à l’ADN simple
brin uniquement par les OB-fold de hPOT1 (Taylor et al., 2011).
Figure 54. Structure du domaine N-terminal de TPP1 contenant le motif OB-fold (Wang et al., 2007)
V.3. Interactions hPOT1 – G quadruplexe
La régulation positive ou négative de hPOT1 sur la télomérase a été expliquée par l’équipe de
T. Cech en 2005. En effet, ils ont montré que hPOT1 pouvait éliminer les G-quadruplexes et permettre
le recrutement de la télomérase sur le simple brin ainsi généré. Toutefois, le positionnement de hPOT1
à l’extrémité 3’ du télomère ne serait pas favorable pour fixer la télomérase (Figure 55) (Zaug et al.,
2005).
79
Figure 55. Modèle d’activation de la télomérase par déroulement des structures G-quadruplexes par hPOT1 (Zaug
et al., 2005)
Une étude, basée sur la technique de la molécule unique, propose un modèle de liaison de
hPOT1 à l’extension simple brin télomérique où hPOT1 déroulerait les G-quadruplexes par un
mécanisme dynamique stérique (Figure 56B), au contraire d’un système de fixation passive de hPOT1
sur des régions simple brin obtenues par ouverture des G-quadruplexes (condition thermodynamique)
(figure 56A) (Wang et al., 2011).
Figure 56. Modèles statique passif (A) et stérique dynamique (B) de modulation des structures G-quadruplexes
télomériques par POT1 (Wang et al., 2011)
Une nouvelle étude en molécule unique propose un modèle plus précis de liaison de hPOT1 au
G quadruplexe (Hwang et al., 2012). Dans ce modèle, 2 hPOT1 fixent et ouvrent le G quadruplexe de
façon séquentiel dans la direction 3’- 5’. Le mécanisme proposé sur la figure 57 montre la fixation du
domaine OB2 de la première hhPOT1 à l’extrémité 3’ puis celle de son domaine OB1. La liaison des
domaines est accompagnée de l’ouverture partielle du G-quadruplexe. La fixation d’une seconde POT1
sur le reste de l’ADN, suivant le même mode de liaison OB2 puis OB1, conduit à une ouverture
complète du G-quadruplexe.
80
La même étude a été réalisée avec l’hétérodimère hPOT1-TPP1. De façon très intéressante, le
modèle proposé montre la fixation du complexe hPOT1-TPP1 via le domaine OB2 de hPOT1 suivie
de la fixation du domaine OB1 ; TPP1 n’étant pas au contact de l’ADN. Ce complexe est alors capable
de maintenir l’ADN sous forme simple brin grâce à une activité de glissement «sliding» le long de
l’ADN, activité possible par la présence de TPP1. Dans ce modèle de glissement, il n’y a pas la place
pour fixer une seconde hPOT1.
Figure 57. Modèles de liaison et d’ouverture du G-quadruplexe par POT1 ou POT1-TPP1 (Hwang et al., 2012)
VI. RPA versus POT1 aux télomères : adversaires ou amis ?
L’absence de POT1 aux télomères induit une accumulation de RPA aux télomères et déclenche
l’activation des points de contrôle d’ADN ATR- dépendante (Gong and De Lange, 2010; Flynn et al.,
2011). Le même phénomène est observé lorsqu’on supprime l’interaction POT1-TPP1 (Barrientos et
al., 2008). Ces résultats suggèrent que la liaison de POT1 aux télomères empêche la liaison de RPA et
de ce fait bloque la voie ATR, activée lors de cassures d’ADN double brins (Flynn et al., 2011)
De nombreuses études comparatives entre RPA et POT1 ou POT1-TPP1 montrent que leur
affinité respective pour l’ADN télomérique est très similaire (Flynn et al., 2011; Takai et al., 2011;
Arnoult et al., 2009). De plus, POT1 (1-2.104 molécules/cellule) est moins abondante dans la cellule
que RPA (2.105-5.106 molécules/cellule) (Seroussi et al., 1993 ; Takai et al., 2011).
81
L’implication de RPA et POT1 aux télomères dans le maintien des télomères et leur
antagonisme soulève la question suivante : comment RPA et POT1 agissent de concert aux télomères ?
Deux modèles ont été proposés pour expliquer la régulation de POT1 et RPA aux télomères au cours
du cycle cellulaire (Pour revue voir (Flynn et al., 2012))
Dans le premier modèle proposé par l’équipe de T. de Lange, la protéine TIN2 est indispensable
pour la fixation du complexe POT1-TPP1 aux télomères (Takai et al., 2011) (Figure 58). En outre, la
surexpression d’un mutant de TPP1 (TPP1ΔRD) capable de remplacer TPP1 endogène au niveau de
TIN2 sans interagir avec POT1 induit l’apparition des foyers de RPA aux télomères (Xin et al., 2007).
L’interaction du complexe POT1-TPP1 avec TIN2, elle même en interaction avec les protéines TRF1
et TRF2, présentes dans la région double brin, est un bon moyen pour concentrer localement POT1 aux
télomères et ainsi l’aider à entrer en compétition avec RPA pour la liaison à l’ADN simple brin
(Baumann and Price, 2010). Le Shelterin, via TIN2, TRF1 et TRF2, serait donc un régulateur positif
pour la liaison de POT1 à l’extrémité 3’ simple brin et par conséquent un régulateur négatif de la liaison
de RPA.
Figure 58. Modèle d’interaction du Sheterin avec l’ADN télomérique permettant le positionnement de POT1-TPP1
via TIN2 et empêchant la liaison de RPA aux télomères
Dans le second modèle proposé par Flynn et al. (Figure 59) la réplication et la protection des
télomères sont régulées au cours du cycle cellulaire grâce à l’ARN non codant TERRA (telomere
repeat-containing RNA) et les hnRNPs (Ribonucléoprotéines) (Flynn et al., 2011; Flynn et al., 2012).
Pendant la phase S précoce et intermédiaire, les protéines hRNPs sont séquestrées par TERRA présent
aux télomères, permettant à RPA de rentrer en compétition avec POT1 au niveau des fourches de
réplication mais aussi au niveau de l’extrémité simple brin 3’ des télomères. Quand TERRA décline
en fin de phase S, les hRNPs relarguées déplacent RPA des télomères pour s’y fixer à sa place. En G2,
comme TERRA s’accumulent de nouveau aux télomères, les hRNPS sont de nouveau séquestrées par
82
TERRA. C’est au cours de cette phase, où hnRNPs fait la navette entre l’ADN télomérique et TERRA,
que POT1 ou RPA pourraient avoir accès aux télomères. Cependant, puisque POT1 est présente aux
télomères grâce au complexe Shelterin, celle-ci peut se lier à l’ADN télomérique plus efficacement et
ainsi rétablir la protection des télomères après réplication de l’ADN. Le processus dynamique
impliquant TERRA et les hRNPs favorise le « switch » RPA-POT1 aux télomères.
Figure 59. Modèle schématique de la coordination des fonctions de RPA et POT1 aux télomères. L’assemblage de
POT1-TPP1 par TIN2 au complexe Shelterin lié à l’ADN double brin télomérique est nécessaire pour que POT1
atteigne une concentration critique aux télomères. Le « switch » RPA-POT1 aux télomères régulé au cours du cycle
cellulaire et orchestré par TERRA et hnRNPs permet à RPA d’intervenir dans la réplication des télomères sans
compromettre la protection des télomères (Flynn et al., 2012)
83
84
Chapitre IV: Les ligands G4
85
86
I. Généralités
Les fonctions biologiques attribuées aux structures G4 et décrites précédemment (chapitre I.
paragraphe IV.4.) leur permettent d’être des cibles thérapeutiques potentielles (Figure 60). Du fait de
leur fréquence au niveau des télomères, des régions promotrices et des ARNm d’un grand nombre de
gènes impliqués dans l’oncogenèse, une approche pharmacologique anti-tumorale à l’aide de ligands
ciblant spécifiquement les G4 est envisageable.
Figure 60. Cibles potentielles des ligands G4 (Collie and Parkinson, 2011)
En 1991 et pour la première fois, Zahler et ses collègues ont montré que l’activité de la
télomérase des ciliés est inhibée in vitro par la formation des structures G4 (Zahler et al., 1991).
Quelques années plus tard, il a été montré que la stabilisation des G4 par des dérivés d’anthraquinone
provoquait l’inhibition in vitro de l’activité de la télomérase (Sun et al., 1997). Depuis, plusieurs séries
de molécules chimiques ciblant les G4 (ligands G4) ont été synthétisées et caractérisées dans le but de
bloquer la prolifération des cellules tumorales exprimant la télomérase.
En effet des études montrant que le dominant négatif de hTERT et des oligonucléotides ciblant
spécifiquement hTER inhibent la télomérase et induisent un raccourcissement télomérique ainsi qu’un
arrêt du cycle cellulaire associé à la sénescence (Kraemer et al., 2003).
Initialement, l’intérêt thérapeutique des ligands G4 était de bloquer l’activité de la télomérase
essentielle pour la réplication des télomères et l’acquisition du potentiel de division illimité des cellules
tumorales (Figure 61). Cependant, la caractérisation du mécanisme d’action cellulaire des ligands G4
a montré que ces molécules présentent bien une action au niveau des télomères des cellules tumorales,
87
mais que l’inhibition de la télomérase n’était pas responsable de l’activité antiproliférative de ces
ligands (Riou et al., 2002; Gowan et al., 2001; Gomez et al., 2004 b). De plus, si les ligands G4 peuvent
bloquer la fixation de la télomérase sur son substrat, ces dérivés n’ont qu’un faible effet sur l’activité
et la processivité de l’enzyme une fois fixée sur son substrat (De Cian et al., 2008).
Des travaux du laboratoire et d’autres groupes ont montré que ces molécules étaient actives
aussi bien dans les lignées télomérase positive que dans les lignées ALT et que la télomérase n’était
pas leur cible d’action principale (De Cian et al., 2008). La stabilisation de G4 télomérique provoque
principalement une altération de la réplication et de la stabilité des télomères (Pennarun et al., 2008;
Thèse Sidibe, 2012).
Figure 61. Modèle représentant la stratégie d’inhibition de la télomérase par les ligands de G4. En stabilisant les G4
au G-overhang, le ligand rend inaccessible le substrat de l’enzyme qui ne peut plus allonger le télomère (Riou et al.,
2002)
La résolution de la structure des G4 télomériques ainsi que plusieurs structures G4 de
promoteurs de gènes (c-myc, c-kit…) montre un polymorphisme de topologie relativement important.
D’un point de vue pharmacologique, ce polymorphisme pourrait théoriquement permettre de cibler
spécifiquement certaines classes de structures G4 qui diffèrent au niveau des boucles et des sillons. Par
contre, bien qu’il soit peu vraisemblable que tous les PQS (Putative G-quadruplex sequences) forment
des G4 in vivo, leur nombre important multiplie le nombre de cibles potentielles (Figure 60) au niveau
cellulaire et complique l’interprétation de leur activité biologique et de leur sélectivité thérapeutique.
88
II. Types de ligand G4 et interaction avec les G-quadruplexes
Les ligands G4 peuvent être classés selon :
1- Leur structure chimique : par exemple, on trouve des ligands de la famille des porphyrines
(TMPyP4), des dérivés de pérylènes (PIPER), des dérivés d’éthidium, des dibenzophénanthrolines, des
dérivés de triazine (12459), des fluoroquinophenoxazine (QQ58), des acridines trisubstituées
(BRACO19), des acridines pentacycliques (RHSP4) (Monchaud, 2008; Luedtke, 2009) (Figure 62).
Figure 62. Structures de quelques ligands G4
2- Leur type d’interaction avec les G4 (Figure 63) : interactions π sur les quartets terminaux du G4
(empilement terminal), intercalation éventuelle des ligands entre les quartets, interactions avec les
boucles, interactions avec les sillons du G4 ou une combinaison des différents modes. Parmi les
différents types d’interaction, l’intercalation des ligands entre les quartets semble peu probable, car elle
demanderait un coût énergétique important pour "désempiler" deux quartets et chasser le cation
coordonné entre eux.
89
A
B
Figure 63. (A) Représentation schématique des différents sites d’interaction entre ligand G4 (ovale orange) et G4 :
(a) “Empilement terminal” ; (b) intercalation entre les quartets, jugée improbable ; (c) interactions avec les boucles
; (d) interaction avec les sillons du G4 (Thèse Tran 2011) ; (B) Modes d’interaction par empilement terminal et
interactions avec les boucles visualisées par cristallographie aux rayons X (Collie and Parkinson, 2011)
Les ligands conçus pour interagir sélectivement et avec une affinité élevée aux G4 télomériques
présentent des caractéristiques structurales communes (Collie and Parkinson, 2011) :
1- Un large coeur aromatique (permet d’optimiser les interactions d’empilement π sur la surface du
G-quartet)
2- Des charges positives (pour assurer une interaction avec les phosphates du squelette phosphodiester)
3- Des chaînes latérales fonctionnelles (permettent d’optimiser les opportunités d’introduire des
groupes fonctionnels afin d’augmenter les interactions avec les sillons ou les boucles des G4).
90
III. Ligands G4 : effet biologique
De nombreux ligands G4 ont été synthétisés (>900) et leur interaction biophysique avec les G4
a été caractérisée. Par contre l’activité biologique des ligands est réduite à quelques séries chimiques.
Parmi ces ligands nous citons les dérivés d’acrydine (BRACO19), les pyridines dicarboxamides (360A,
307A, Pyridostatine) ou les triazines (12459, 115405), le dérivé d’acridine pentacyclique RHPS4 et la
Télomestatine (TMS), un ligand d’origine naturelle extrait de Streptomyces anulatus (Shin-ya et al.,
2001) (Figure 64). Dans ce chapitre, nous décrivons les propriétés biologiques de ces quelques dérivés.
Figure 64. Structure chimique des ligands G4 cités ci-dessus
III.1. Effet des ligands G4 sur la prolifération et le cycle cellulaire
Tous les ligands G4 présentent des capacités antiprolifératives avec un effet retardé. La plupart
de ces ligands induisent à long terme, à des concentrations subtoxiques, un arrêt du cycle cellulaire qui
s’accompagne d’une sénescence, d’une catastrophe mitotique ou de l’induction de l’apoptose (Riou et
al., 2002; Pennarun et al., 2005). Certains ligands, comme les dérivés de triazine provoquent aussi la
91
mort cellulaire par apoptose à court-terme, à des concentrations plus importantes (Douarre et al., 2005;
Riou et al., 2002).
L’effet des ligands sur le cycle cellulaire varie fortement. Le RHSP4 et le 12459 induisent un
blocage en G2/M (Douarre et al., 2013; Gowan et al., 2001), tandis que les dérivés de pyridine
dicarboxamide 360A et 307A induisent un blocage en S et un allongement de la durée de la métaphase
(Pennarun et al., 2005).
L’effet antiprolifératif des ligands G4 varie aussi fortement en fonction de la lignée cellulaire
étudiée. Par exemple, le 360A est actif sur plusieurs lignées de gliomes télomérase positive et inactif
sur la lignée ALT SAOS2, alors que le 307A est actif sur cette lignée (Pennarun et al., 2005). C’est le
cas aussi pour la Pyridostatine qui possède une meilleure activité sur les lignées Hela et HT1080 que
sur la lignée ALT U2OS, alors que des dérivés proches sont aussi actifs sur les trois modèles cellulaires
(Müller et al., 2012).
III.2. Effet des ligands G4 sur la taille des télomères
L’altération des capacités prolifératives des cellules traitées par les ligands de G4 peut dans
certains cas s’accompagner d’une érosion télomérique détectable par TRF (Telomere Restriction
Fragments). Le BRACO19 et le RHSP4 induisent à long terme, un raccourcissement télomérique
détectable par TRF (Burger et al., 2005; Salvati et al., 2007). Ce n’est pas le cas dans les cellules
traitées avec le 307A et le 360A où la diminution de la longueur des télomères n’est pas détectable au
moment de l’arrêt de la prolifération (Pennarun et al., 2005). On notera qu’ici encore cet effet peutêtre lignée-dépendant. En effet, le 12459 par exemple, induit l’érosion des télomères de cellules A549
mais n’a pas d’effet sur les télomères de lignées tumorales ayant des télomères plus courts (A431)
suggérant que les mécanismes conduisant à l’arrêt de prolifération ne peuvent pas être directement
corrélés avec les variations de la longueur des télomères (Riou et al., 2002).
92
III.3. Dysfonction télomérique et altération de l’extension simple brin télomérique
L’analyse des chromosomes mitotiques montre que le traitement par les ligands G4 provoque
des altérations caractéristiques d’une dysfonction télomérique.
Les altérations induites par les ligands G4 comme par exemple le BRACO19, correspondent à
des fusions entre les extrémités chromosomiques, qui sont caractéristiques d’une réparation des
dommages par le NHEJ (Incles et al., 2004). De plus, ces ligands (RHSP4, 307A, TMS) peuvent
générer des fusions télomériques, des ponts anaphasiques ou télophasiques et des chromosomes
dicentriques (Leonetti et al., 2004; Pennarun et al., 2005; Tahara et al., 2006).
La dysfonction télomérique observée en réponse au traitement avec les ligands G4 peut
s’expliquer par une altération de l’extension simple brin télomérique (G-overhang). La diminution du
G-overhang est observée sous l’effet de la Télomestatine dans les lignées télomérase positive et ALT
(Gomez et al., 2006; Tahara et al., 2006; Temime-Smaali et al., 2009), la Pyridostatine dans la lignée
HT1080 (Müller et al., 2012) et le 12459 dans la lignée A549 (Douarre et al., 2005). D’autres dérivés
comme le 307A et le 360A induisent une dégradation limitée du G-overhang dans les lignées de
gliomes (Pennarun et al., 2005). Cependant la diminution du signal mesurée n’est pas forcément liée à
un raccourcissement du G-overhang et pourrait aussi s’expliquer par l’accumulation de fusions aux
télomères.
Récemment, il a été montré que le 360A-Br peut induire des modifications significatives de la
préférence en base du brin C (Sidibe et al., 2012). Ces résultats montrent que les ligands altèrent la
protection des télomères.
La dysfonction télomérique et la perte du signal du G-overhang peuvent s’expliquer par la perte
des protéines essentielles TRF1, TRF2 et POT1 qui participent à la protection des télomères. Plusieurs
ligands provoquent le déplacement des protéines télomériques dans les cellules, comme par exemple
la Télomestatine qui empêche la fixation de POT1 et/ou TRF2 dans les cellules télomérase positive
(Gomez et al., 2006) et dérégule également les protéines impliquées dans le mécanisme ALT (BLM,
TRF2, TopoIIIα) (Temime-Smaali et al., 2009). Les télomères ainsi déprotégés sont accessibles à la
machinerie de signalisation et de réparation des dommages, d’où l’accumulation de TIFs (Telomere
Induced Foci) et de télomères dysfonctionnels.
93
III.4. Activation de voies de réponses aux dommages de l’ADN
L’accumulation de TIFs suite au traitement avec les différents ligands G4 indique que les voies
de signalisation et de réparation des dommages à l’ADN sont activées aux télomères. Cependant tous
les ligands n’activent pas les mêmes voies. La Télomestatine provoque la phosphorylation de ATM et
Chk2 dans une lignée déficiente en p53 tandis que le 12459 induit l’activation de la voie ATR dans le
cas d’un traitement à long-terme qui déclenche l’arrêt en G2/M (Tauchi et al., 2003; Douarre et al.,
2013). Pour le 12459, dans le cas d’un traitement à plus court terme, une voie peu commune est activée
: aucun foyer ɣH2AX n’est observé, ni de réponse ATM/ATR. Le 12459 génère un stress oxydatif qui
induit la phosphatase WIP1/PPM1D qui permet la déphosphorylation de ɣH2AX et les facteurs de
signalisation des dommages (Chk1, p53,...) Ainsi, la réponse aux dommages à l’ADN induite par le
ligand est masquée. (Tauchi et al., 2003; Douarre, 2007; Douarre et al., 2013).
Il est important de noter que pour la majorité des ligands G4 étudiés, la formation de TIFs ne
représente qu’une fraction des foyers des dommages à l’ADN induits par les ligands G4. C’est le cas
par exemple de la Télomestatine et de la Pyridostatine qui induisent des dommages qui ne colocalisent
pas avec les télomères (Gomez et al., 2006; Rodriguez et al., 2008). En effet, les foyers de dommages
induits par la Pyridostatine localisent avec d’autres régions du génome enrichis en PQS (Rodriguez et
al., 2012). De plus, des expériences de localisation de 360A[3H] au niveau des chromosomes
mitotiques montrent une fixation préférentielle du ligand au niveau des extrémités chromosomiques et
des sites de fixation dans les régions chromosomiques intersticielles (Granotier et al., 2005).
III.5. Altération de la réplication
Plusieurs ligands provoquent des aberrations télomériques typiques d’un défaut de la
réplication détectables par FISH (STL (Sister Telomere Loss), délétions, fragilité télomérique)
(Pennarun et al., 2005; Vannier et al., 2012; Thèse Sidibe, 2012). Le nombre d’extrémités
chromosomiques sans signal télomérique dans les cellules A549 augmente de 9 à 25% après le
traitement par le 115405 (Riou et al., 2002) et les dérivés de pyridine dicarboxamide (360A, 360A-Br)
induisent la formation des sites fragiles et des STLs dans certains modèles cellulaires (Pennarun et al.,
2008; Thèse Sidibe, 2012).
94
La stabilisation de G4 est à l’origine de perturbations de la progression de la réplication qui
sont réparées par les voies de réponse aux dommages de l’ADN. Cela implique l’intervention
d’hélicases qui vont permettre de résoudre les G4. En accord avec cette hypothèse, une des G4
résolvases, Pif1 se colocalise au niveau des dommages provoqués par la Pyrodistatin (PDS) suggérant
que cette hélicase y est recrutée pour supprimer l’obstacle et permettre de reprendre la réplication
(Rodriguez et al., 2012). Cependant, l’accumulation des aberrations télomériques indique que les
ligands bloquent efficacement l’activité de ces G4 résolvases, ce qui a été démontré in vitro pour les
hélicases BLM et WRN (Li et al., 2001).
Les aberrations télomériques induites par le 360A impliquent les voies ATM et ATR : des
lignées déficientes en ATM et/ou ATR potentialisent les altérations télomériques détectées par Q-FISH
(Pennarun et al., 2008, 2010; Gauthier et al., 2012).
III.6. Effet des ligands G4 sur la trancription et la traduction
Les ligands G4 ciblent aussi les sites d’initiation de transcription des gènes (TSS) dont la
séquence présente un enrichissement en PQS (Figure 65). Ils affectent principalement l’expression des
gènes contenant des motifs G4 potentiels. Par exemple, il a été montré que les ligands G4 (PhenDC3,
360A, 360A-Br) modulent l’expression d’une petite fraction des gènes (<10%). L’analyse
bioinformatique des données montre que l’effet des ligands G4 module l’expression de gènes contenant
un ou plusieurs PQS autour du TSS avec des valeurs hautement significatives. (Halder et al., 2012).
Les analyses bioinformatiques montrent la présence de PQS dans les régions 5’ non traduits
des ARNm (5’-UTR) et dans les introns de certains ARNm (Bugaut and Balasubramanian, 2012).
Figure 65. Illustration schématique des rôles possibles des G-quadruplexes des régions 5’-UTR de l’ARN dans la
régulation de l’initiation de la traduction selon un mode dépendant ou indépendant de la coiffe. (Feu rouge indique
l’inhibition de la traduction et le feu vert indique sa stimulation)
95
La stabilisation des G-quadruplexes au niveau des 5’-UTR régule négativement la traduction
des protéines (par exemple Bcl2, TRF2, NRAS) et les ligands G4 (360A, Phen DC3 et Pyridostatine)
induisent une forte diminution de la traduction de TRF2 ou NRAS (Gomez et al., 2010; Bugaut et al.,
2010)
Le 12459 stabilise le G4 présent dans l’intron 6 du gène de hTERT, altère l’épissage alternatif
de l’ARNm et provoque l’accumulation d’une forme inactive de l’enzyme (Gomez et al., 2004 a). Le
360A se lie au G-quadruplexe se formant au niveau de l’intron 3 de l’ARNm de TP53 et régule
l’épissage alternatif des isoformes de l’ARNm de p53 (Marcel et al., 2011).
IV. Propriétés du 360A-Br et du 9944
En plus des ligands G4 décrits dans les paragraphes précédents (Télomestatine et 360A), nous
avons utilisé lors de notre travail le 360A-Br et le 9944 (Figure 66) dont les propriétés sont décrites cidessus :
Figure 66. Structure chimique du 360A-Br et du 9944
Le 360A-Br est un dérivé halogéné du 360A qui a été synthétisé dans le but d’améliorer sa
spécificité pour les G4 et sa capacité de pénétration cellulaire. Ce ligand possède un effet
antiprolifératif amélioré par rapport à celui du 360A. Une étude sur l’effet du 360A-Br sur la
composition du brin C des télomères, qui est contrôlée par POT1(Sfeir et al., 2010; Hockemeyer et al.,
2005) a été réalisée dans notre laboratoire. Cette étude a montré que le 360A-Br induit des variations
modestes mais significatives de la préférence en base qui correspondrait à une altération partielle
(<50%) de la localisation télomérique de POT1 dans les cellules télomérase positive (Sidibe et al.,
2012). Ces données ont été confirmées dans plusieurs modèles cellulaires à l’aide d’une technique de
STELA (Single telomere length analysis) modifiée permettant d’étudier l’ensemble des télomères.
96
Dans le meilleur des cas, le 360A-Br induit une altération partielle de la préférence de base du brin C
et seule la déplétion complète de POT1 par un shARN inductible provoque une dysfonction de
l’ensemble des télomères et une altération complète de la préférence en base du brin C (Thèse Sidibe,
2012; Gomez et al., résultats non publiés).
Le bromure d’éthidium est un agent intercalant décrit aussi pour interagir avec l’ADN triplex
et quadruplexe (Koeppel et al., 2001). Des dérivés du bromure d’éthidium ont été sélectionnés lors
d’un criblage dirigé contre l’activité de la télomérase dans une banque d’inhibiteurs de la Reverse
transcriptase d’HIV (J.F.Riou et P. Maillet, Aventis pharma SA) et évalués pour leurs propriétés à
interagir avec l’ADN G-quadruplexe. Parmi ces composés, le 9944 (produit n°4) présente une bonne
sélectivité pour l’ADN G-quadruplexe vis-à-vis de l’ADN duplexe (10-20 fois)(Koeppel et al., 2001;
Rosu et al., 2003) et bloque le test TRAP avec une CI50 sub-micro-molaire. Une des caractéristiques
du 9944 est une fluorescence intrinsèque qui est exaltée en présence d’acides nucléiques. Sa relative
sélectivité vis-à-vis des G-quadruplexes anti-parallèles permet de l’utiliser comme marqueur des Gquadruplexes in vitro.
97
98
Objectifs du projet de thèse
99
100
Les télomères représentent une structure nucléoprotéique absolument essentielle pour le
maintien de la stabilité des chromosomes dont la complexité fonctionnelle et structurale est l’objet de
travaux dans de nombreux laboratoires. L’organisation en t-loop et l’assoctiation aux protéines du
complexe Shelterin assurent leur protection afin d’éviter que l’extrémité télomérique soit reconnue
comme une cassure de l’ADN par les systèmes de réparation de la cellule. Ces protéines contrôlent le
recrutement des facteurs nécessaires à la réplication des télomères et répriment les voies de
signalisation de contrôle du cycle cellulaire et de la réparation de l’ADN (ATM et ATR).
Le brin G des télomères peut aussi former des structures en quadruplexes de guanines (G4). tloop et G4 correspondent à un obstacle pour la réplication des télomères. De nombreuses protéines ont
été identifiées in vitro pour résoudre les structures G4 aux télomères (telles WRN, BLM, et RTEL1)
ou empêcher leur formation au cours de la réplication (telles POT1 et RPA). La réplication des
télomères nécessite aussi la réplication du brin C par la Polα qui est recrutée par le complexe CST sur
le brin à synthèse discontinue. L’action des différents acteurs protéiques au cours de la réplication
permet la progression de la fourche de réplication, la dissociation de la t-loop, la résection du brin C,
l’allongement du brin G par la télomérase, la synthèse du brin C et la reformation de la t-loop.
Dans les tissus somatiques normaux qui ne présentent pas un renouvellement cellulaire
important, l’activité de la télomérase est absente dans les cellules, conduisant à une diminution de la
longueur des télomères induite inévitablement par la réplication des chromosomes linéaires. Cette
érosion télomérique conduit à la sénescence réplicative qui correspond à une barrière contrôlant
l’instabilité génomique. Dans les tumeurs, les cellules acquièrent un potentiel prolifératif illimité, en
contournant cette barrière notamment. Ceci a lieu par le rétablissement de l’allongement des télomères,
restauré dans la plupart des cas par une activité de la télomérase retrouvée. Néanmoins, il existe dans
15 % des tumeurs un mécanisme d’allongement des télomères alternatif mis en place en l’absence de
la télomérase, basé sur la recombinaison homologue entre les télomères (Alternative Lengthening of
Telomeres). Les structures nucléaires APBs (ALT-associated PML Bodies) pouvant servir de
plateformes à la recombinaison sont fréquemment observées dans les cellules ALT et regroupent les
télomères et les protéines du complexe Shelterin, ainsi que des facteurs de recombinaison. Ce
mécanisme spécial de maintien des télomères constitue donc une cible spécifique pour le
développement de molécules thérapeutiques destinées à l’élimination des cellules cancéreuses ALT.
101
Un grand nombre de ligands fixant spécifiquement les G4 ont été synthétisés et étudiés au cours
de cette dernière décennie. La synthèse, la caractérisation de l’interaction in vitro de ces ligands avec
les G4 ADN et ARN, l’effet de ces ligands sur la fixation de protéines interagissant avec l’ADN simple
brin telles que POT1, RPA et TopoIIIα, leur mécanisme d’action au niveau de l’intégrité et de la
stabilité des télomères dans des modèles ALT ou exprimant la télomérase font l’objet de l’activité de
recherche de mon laboratoire de thèse.
Dans ce cadre, un axe d’étude de la protéine RPA en particulier a été développé au laboratoire.
RPA est une protéine de liaison à l’ADN simple brin (SSB) qui joue un rôle indispensable dans la
réplication des télomères au niveau des fourches de réplication et lors de l’action de la télomérase, en
maintenant l’ADN sous une forme simple brin. En effet, une étude in vitro des interactions entre la
RPA humaine (hRPA) et une séquence télomérique humaine repliée en G4 a montré que la hRPA lie
et ouvre «activement» les G4 dans des temps compatibles avec une action biologique au cours du cycle
cellulaire (Salas et al., 2006). Ces résultats ont permis de suggérer que RPA intervient dans le maintien
des télomères via son interaction avec les G4 télomériques.
Dans ce contexte, j’ai abordé au cours de ma thèse, différentes problématiques liées à RPA et
aux ligands G4 aux télomères, en utilisant des approches variées. Mon projet a consisté à :
(i) Définir le mécanisme d’action de la RPA sur les structures G4.
(ii) Etudier l’effet de ligands G4 dans les cellules ALT.
Dans une première partie, j’ai donc poursuivi l’étude in vitro des interactions RPA / G4 afin de
caractériser le mécanisme de liaison et d’ouverture des G4. Pour cela nous avons utilisé une approche
interdisciplinaire (biochimie et biophysique) associant des techniques de gel retard et de FRET ainsi
que des expériences de photomarquage, en utilisant la 4-thiothymine. Cette étude a permis de proposer
un modèle de liaison hRPA / G4. Lors de ces travaux, j’ai utilisé les ligands G4 comme outil afin de
stabiliser les structures G4.
Dans une seconde partie, une étude in cellulo d’un nouveau ligand G4, le 9944 (Koeppel et al.,
2001; Rosu et al., 2003), a été initiée dans des cellules cancéreuses ALT. Par des techniques de biologie
cellulaire (cytométrie en flux, immunofluorescence) et moléculaire (TRF, telomere restriction
fragment…) et de biochimie (western blot), nous avons ainsi cherché à caractériser et comprendre les
effets du 9944 au niveau cellulaire, au niveau de l’ADN et des télomères en particulier, et au niveau de
RPA.
102
Résultats et discussion
103
104
I. Etude du mécanisme de liaison et d’ouverture des G-quadruplexes
télomériques humains par la RPA humaine
I.1. Introduction
Le modèle de liaison RPA / G-quadruplexe proposé en 2006 implique une ouverture partielle
du G-quadruplexe pour permettre la fixation de RPA puis une ouverture totale du G-quadruplexe par
déstabilisation suite à la liaison de la protéine. Pour affiner ce modèle, nous avons poursuivi l’étude in
vitro des interactions RPA / G-quadruplexe en modulant la stabilité du G-quadruplexe télomérique
humain et en réalisant des experiences de photopontage à l’aide de la 4-thiothymine.
I.2. Résultats: Article (soumis dans Nucleic Acids Research journal)
The molecular assembly of hRPA subunits at telomeric G-quadruplex DNA:
small molecule and photo-crosslinking approaches
Layal Safa1,2, Emmanuelle Delagoutte1, Irina Petruseva3, Patrizia Alberti1, Olga Lavrik3, Jean-François Riou1,4
and Carole Saintomé1,2,4
1
Structure des Acides Nucléiques, Télomères et Evolution, Inserm U565, CNRS UMR 7196, Muséum National
d’Histoire Naturelle, 43 rue Cuvier 75231 Paris cedex 05, France.
2
University of Pierre et Marie Curie, 4 place Jussieu, 75005 Paris, France.
3
Novosibirsk Institute of Bioorganic Chemistry, Siberian Division of Russian Academy of Science, 630090
Novosibirsk, Russia.
4
correspondance to Carole Saintomé: [email protected] or Jean-Francois Riou: [email protected] or FAX:
(33) 1 40 79 37 05
105
Abstract
Replication protein A is a single-stranded DNA binding protein that plays essential role in
telomere maintenance. RPA is able to bind and unfold G-quadruplex (G4) formed in telomeric DNA,
thus facilitating lagging strand DNA replication and telomerase activity. To gain more insights into the
mechanism of binding and unfolding of telomeric G4 by RPA, we used a combination of biochemical
and biophysical approaches under conditions that modulate G4 stability. To elucidate the positioning
of the RPA subunits along the unfolded G4, we carried out photo-crosslinking experiments. Based on
our results, we propose a novel model in which RPA binds the G4 from the 3’ side via the RPA2
subunit and unfolds it in the 3’ to 5’ direction, positioning the RPA1 subunit in the central part of the
sequence. This allows the binding of a second RPA at the 5’ extremity, via the RPA1 subunit.
INTRODUCTION
Replication protein A (RPA) is a highly conserved protein in eukaryotes (1,2) and is one of the
key cellular players involved in essential processes such as replication, recombination, and DNA repair
(3). RPA binds single-stranded DNA (ssDNA) sequences with high affinity and is a key regulator of
checkpoint activation during S phase. RPA-coated ssDNA recruits ATR to stalled or broken replication
forks through a direct interaction with its binding partner ATR-interacting protein (ATRIP) and
activates the ATR checkpoint (4). RPA is a heterotrimeric protein composed of 70-, 32-, and 14-kDa
subunits that are commonly referred to as RPA1, RPA2, and RPA3, respectively. RPA carries six
DNA-binding domains (DBD), four of them are located in RPA1 (DBD-A, DBD-B, DBD-C and DBDF), one is located in RPA2 (DBD-D) and one belongs to RPA3 (DBD-E). It has been proposed that
RPA can bind unstructured ssDNA with four different binding modes implicating five of the six DBD
domains: DBD A-B-C-D-E (3,5-7).
The role of RPA in telomere maintenance stems from several studies showing: (i) the telomere
shortening induced by mutations in yeast and human RPA(8-10), (ii) the activation of telomerase by
RPA in yeast cells (11,12) and (iii) the requirement of RPA during the processing of telomeres in ALT
(alternative lengthening of telomeres) cells(13). In addition, Cohen et al. showed that in vitro low
concentrations of human RPA (hRPA) stimulate in vitro extension of G-rich DNA primers by the
telomerase (while high concentrations are inhibitory)(14).
106
While RPA binds ssDNA in a non-sequence specific manner, other ssDNA binding proteins
containing OB-fold motifs, such as POT1-TPP1 and the CST complex, specifically recognize telomeric
repeats(15-17). Telomeres are composed of tandem repeats of the sequence TTAGGG and bear a 3’
ssDNA extension (G-overhang) that associates with POT1 and TPP1, two proteins of the Shelterin
complex(15). The nucleoprotein structure at telomeres is essential to avoid the ends of chromosomes
to be recognized as a DNA damage(18). POT1 suppresses ATR activation at telomeres and antagonizes
RPA binding to telomeric ssDNA(19-21). Furthermore, the CST complex that participates to telomere
replication(22,23) was recently shown to regulate telomerase activity through a competition with
POT1-TPP1 for telomeric DNA (24).
The G-rich telomeric sequence can adopt non-canonical DNA conformations known as Gquadruplexes (G4)(25). These four-stranded structures are based on guanine quartets stabilized by
Hoogsteen hydrogen bonds and coordinated by central cations. Human telomeric sequence can form
intramolecular G4 of different conformations (26,27). Evidence is accumulating that G4 can form in
vivo at telomeres during lagging strand DNA replication and at the 3’ G-overhang(28,29). Several
helicases (such as the Werner helicase, WRN) able to unwind G4 are essential for telomere stability
and replication(30). Both RPA and POT1 were shown to bind and to unfold telomeric G4(31,32) and
to interact with WRN(33,34). In the absence of WRN, the competition between POT1 and RPA triggers
either the uncoupling or the blockage of the replication fork at telomeres(20).
We previously reported that hRPA efficiently binds and unfolds telomeric G4 (named htelo;
see Table for sequence) and proposed a sequential mode of binding of hRPA on telomeric G4(31). In
this model, hRPA initially takes advantage of the natural G4 breathing that exposes ssDNA at its
extremities allowing its binding and the breakage of the Hoogsteen hydrogen bonds from the guanine
quartets. Then, destabilization of the G4 structure makes possible the binding of a second molecule of
hRPA. A recent study identified the DBDs of hRPA implicated in the interaction with a non telomeric
G4. The DBD-CDE core was shown to unfold the G4, while the DBD-DE binds to but not opens the
G4(35). Single molecule FRET experiments indicated that hRPA-mediated unfolding of G4 is related
to hRPA binding accessibility (36).
In this work, we have used a combination of biochemical and biophysical approaches to gain
insights into the mechanism of binding and unfolding of telomeric G4 by hRPA under conditions that
modulate the stability of the G4. In addition, we examined the effect of extended htelo oligonucleotide
107
by a single-stranded tail, and we performed photo-crosslinking experiments to elucidate the positioning
of the hRPA protein subunits along the unfolded G4. Our results led us to propose a model in which
hRPA binds the G4 from the 3’ side via the RPA2 subunit and unfolds it in the 3’ to 5’ direction,
positioning the RPA1 subunit in the central part of the sequence. This allows the binding of a second
RPA at the 5’ extremity, via the RPA1 subunit.
MATERIALS AND METHODS
Materials
BSA was from Roche, γ[32P]ATP (3000 Ci/mmol) was from PerkinElmer and T4
polynucleotide kinase (PNK) from NEW England BioLabs. The sequences of the oligonucleotides used
here are listed in the Table. DNA concentrations were determined by UV spectroscopy using the
extinction coefficients provided by the manufacturer. Unmodified oligonucleotides were from
Eurogentec. The thiolated oligonucleotides (htelo-S) were from MWG (The Genomic Company).
Recombinant hRPA was expressed in the Escherichia coli BL21 (DE3) strain transformed with the
plasmid pET11ahRPA that permits the co-expression of RPA1, RPA2 and RPA3. Purification of hRPA
included an Affi-Gel Blue, Hydroxyapatite (Biorad) and Q-Sepharose chromatography columns and
was as described in(37). Mouse anti-RPA1 monoclonal antibody was from Millipore. Mouse antiRPA2 monoclonal antibody was from Novus Biologicals.
Telomestatin (see Figure 2A for structure) was a generous gift from Kazuo Shin-ya (University
of Tokyo, Japan). The pyridine dicarboxamide derivatives 360A and 360A-Br (see Figure 2A for
structures) were synthesized by Patrick Mailliet in our Laboratory and provided by Marie-Paule
Telaude-Fichou (Institut Curie, Orsay, France), respectively. Telomestatin, 360A, 360A-Br were
dissolved at 10 mM and diluted in 100% DMSO solution before use.
Electrophoretic mobility shift assay
Oligonucleotides were labeled with γ[32P]ATP using T4 polynucleotide kinase. Nonincorporated γ[32P]ATP were removed using a Biospin 6 column (Bio-Rad) equilibrated in TE buffer.
For all EMSA experiments, hRPA was diluted and pre-incubated (10 min at 4°C) in buffer containing
108
50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 10% glycerol, 0.2 mg/mL BSA and 0.1 mM
EDTA. In a standard reaction, radiolabeled oligonucleotide (2 nM) was incubated with various
amounts of protein in 10 µL reaction buffer [50 mM HEPES pH 7.9, 0.1 mg/ml BSA, 100 mM KCl
(or NaCl or LiCl when indicated) and 2% glycerol] for 15 min at 20°C. Longer incubation times (up
to one hour) did not affect the patterns or intensities of the bands, indicating that the system had reached
thermodynamic equilibrium within 15 min. Samples were then loaded on a native 1% agarose in 0.5X
TBE buffer. Electrophoresis was performed for 90 min at 5 V/cm at room temperature. For experiments
studying the effect of the temperature, electrophoresis was performed at the temperature of hRPADNA incubation. After electrophoresis, the gel was dried and exposed on a phosphorimager screen.
After being exposed for at least 10 h, the screen was scanned with the Phosphorimager TYPHOON
instrument (Molecular Dynamics). The samples in the gel were quantified using ImageQuant version
5.1. Each experiment was reproduced at least twice. When indicated, error bars correspond to the
standard deviation calculated from at least two independent experiments. When G4-ligands were used,
radiolabeled oligonucleotide (2 nM) was pre-incubated with G4-ligands (0.5µM) for 10 min at room
temperature in the standard reaction buffer before adding hRPA.
Energy Transfer measurements
Fluorescence spectra of 100 nM FhteloT or FhteloT-10t were taken at 20°C in a buffer
containing 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 and 5 mM lithium cacodylate pH 7.2. The total volume was 50
µl. FhteloT and FhteloT-10t was pre-incubated (10 min at 20°C) with G4-ligand (0.5µM). The protein
(0.5 µl) was directly added to the F21T solution or the F21T G4-ligand mixture. The spectra were
collected after 2 min of incubation between 490 and 660 nm while exciting at 470 nm. The fluorescence
intensity of individual fluorophores was measured at 518 nm (ID) for the donor (FLUO) and 586 nm
(IA) for the acceptor (TAMRA). The ratio P was calculated as P = ID/(ID + IA), where ID and IA are
the emission intensities of D and A, respectively.
Spectroscopic studies
UV-melting profiles were acquired on an Uvikon XL spectrometer (Secoman). Absorbance of
oligonucleotides was recorded at 245, 260, 273, 295 and 400 nm, as a function of temperature: samples
109
were heated at 90°C for a few minutes, cooled at 5°C, kept at 5°C for 30 min, heated at 90°C and one
more time cooled at 5°C; heating and cooling were done at a rate of 0.2°C/min. UV-absorbance were
collected at an oligonucleotide concentration of 3 µM, with an optical path of 1 cm, in 50 mM HEPES
pH7,9, in the presence of 100 mM KCl or NaCl. Melting temperatures (Tm) were graphically
determined, as the intercept between the melting curve at 295 nm and the median line between lowtemperature and high-temperature absorbance linear baselines. At the end of melting experiences, CD
spectra were collected, at 5°C, on a Jasco J-810 spectropolarimeter.
Photo-crosslinking experiments
Radiolabeled htelo-S (30 nM) were mixed with the indicated amounts of protein using the
protocol described in the EMSA section. Each sample (20 µL) was irradiated for 30 min at 10°C at 360
nm (UV lamp). Laemmli gels (10%) were used to separate multiple crosslinked species. In order to
identify the stoichiometry of the hRPA-DNA complexes formed at different hRPA concentrations and
implicated in the photo-crosslinking, binding mixtures were loaded onto a native 8% polycarylamide
in 0.5x TBE. Electrophoresis was performed for 2 hours 20 min at 7V/cm at room temperature.
Immunoblotting procedure
Laemmli gels used to separate multiple crosslinked species were treated overnight at room
temperature with benzonase (90U/ml) in 20 ml of benzonase buffer (20 mM Tris HCl pH 8.0, 20 mM
NaCl, 2 mM MgCl2) to liberate polypeptides from crosslinked DNA and thus to facilitate protein
antigen-antibody interactions. The protein species were transferred from the Laemmli gel to a PVDF
membrane. The membrane was washed in PBST (Phosphate Buffered Saline- 0.1% Tween) buffer for
1 hour (4mL/cm2) at room temperature using an orbital shaker and then incubated in PBST buffer
containing 5% non-fat milk (at room temperature for 1 hour in an orbital shaker) and finally rinsed 5
min with PBST. The standard ECL western blotting protocol from Amersham Biosciences served to
reveal the identity of the cross-linked RPA subunit with antibodies specific of RPA1, RPA2 subunits.
110
RESULTS
Cations and temperature influence the binding of hRPA to telomeric G-quadruplex.
In order to assess if hRPA/G4 interaction is affected by G4 stability, we carried out binding
experiments under conditions modulating G4 stability (i.e. cations and temperature). The stability of
G4s depends on the cation present in solution(38). The melting temperatures (Tm) of the human
telomeric sequences htelo (d GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG) in KCl, NaCl and LiCl (100mM),
determined by UV absorption, are 68, 59 and 25°C respectively (Table). We characterized the
association of hRPA with htelo in the presence of K+, Na+ or Li+ (100 mM) by electrophoretic mobility
shift assays (EMSA) on a native agarose gel (Figure 1A). As the hRPA concentration increases, helto
is trapped into a single retarded band corresponding to 1:1 or 2:1 hRPA-htelo complexes as previously
reported(6,31). The percentage of htelo in complex with hRPA was quantified as a function of hRPA
concentration. Results indicate that hRPA binds the htelo oligonucleotide with different efficiencies
depending on the cation in solution (Figure 1C). The concentration of hRPA required to form 50% of
hRPA-htelo complex is equal to 15, 20 and 65 nM in the presence of Li+, Na+ and K+, respectively.
These EMSA experiments indicate that hRPA has the lowest affinity for the telomeric G4 assembled
in the presence of K+ and the highest affinity for the telomeric G4 assembled in the presence of Li +.
Thus, the affinity of hRPA for telomeric G4 is inversely correlated with the stability of the G4 DNA.
As a control, EMSA experiments were performed with htelomut (Table for sequence) in which four
guanines in htelo were replaced by cytosines and which is not able to form G4. As shown in Figures
1B and D, hRPA binds htelomut more efficiently than htelo whatever the nature of the cation in
solution.
We next analyzed the effect of temperature on hRPA binding to htelo. The fraction of htelo
folded into G4 decreases as temperature increases. We performed EMSA experiments in K+ conditions
where both incubation and electrophoresis were temperature-controlled at 4, 10, 20 and 40°C. Results
indicate that the affinity of hRPA for htelo increases with temperature (Figure 1E). In contrast, control
experiments performed with htelomut did not show such temperature dependency (Figure 1F).
From these experiments, we conclude that conditions modulating the stabilization of telomeric
G4 also affect its interaction with hRPA.
111
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114
G4-ligands inhibit the binding of hRPA to telomeric G-quadruplex.
We next investigated the effect of G4 stabilizing agents on hRPA binding to htelo. A large
number of G4-ligands have been synthesized(39). Among them, telomestatin and the pyridine
dicarboxamide derivatives 360A and 360A-Br, showed remarkable selective G4 binding and
stabilizing properties relative to duplex DNA(40-43). Thus, we investigated the effect of these three
different ligands, telomestatin, 360A and 360A-Br on hRPA binding (Figure 2A).
We previously used fluorescence resonance energy transfer (FRET) experiments to monitor the
conformation of FhteloT (Table) bound to hRPA (31). To this purpose, the htelo oligonucleotide was
labeled with a fluorescein (F) and a tetramethylrhodamine (T) at its 5’ and 3’ ends, respectively. When
FhteloT is folded into a G4 structure with the 3’ and 5’ extremities in close proximity, the fluorescence
emission of fluorescein (F, maximum at 518 nm) is efficiently quenched by TAMRA (see red curve in
Figure 2B). Fluorimetric titrations of FhteloT with hRPA were performed in the absence or in the
presence of G4-ligands (Figures 2B and C). The spectrum of fluorescence emission of free FhteloT in
the presence of telomestatin after 10 minutes of incubation is not changed compared to free FhteloT
indicating that telomestatin binding does not significantly perturb the emission spectrum of FhteloT.
Data were quantified by measuring the variation of energy transfer (P) as a function of r (Figure 2D).
P increases with r, up to reach a plateau, indicating the opening of FhteloT by hRPA. In the presence
of telomestatin, the opening of FhteloT by hRPA is however less efficient since higher ratios of r are
needed to reach the same P value. Similar results were obtained with 360A and 360A-Br (data not
shown).
To verify if the observed unfolding is due to inhibition of hRPA binding to G4, we performed
EMSA experiments in conditions where htelo was pre-incubated with the G4-ligand before adding
increasing amounts of hRPA (see Materials and Methods). Figure 3A illustrates the results of EMSA
experiments performed in the absence (left panel) or in the presence (right panel) of telomestatin (0.5
µM). The results show that treatment with telomestatin strongly reduces the proportion of hRPA-htelo
complexes (see Figure 3B and C for quantifications). Similar results were obtained with 360A and
360A-Br (Figure 3B and C). Telomestatin and 360A-Br were more potent than 360A to inhibit hRPA
binding to htelo. In contrast, control experiments indicate that these ligands do not affect the efficiency
of binding of hRPA to htelomut (Figure 3D).
115
We conclude that G4-ligands decrease the affinity of hRPA for htelo via the stabilisation of the
folded G4 state.
116
The presence of a single stranded tail attached to the telomeric G-quadruplex enhances the hRPA
binding and reveals a 3’ binding preference
Our initial model of sequential binding of hRPA to htelo G4 includes the binding of hRPA to
the single-stranded (ss) region of a partially unfolded structure (31). Here, we next investigated whether
a ss tail attached to htelo G4 had any effect on the efficiency of binding and unfolding of the G4
structure by hRPA. We designed four oligonucleotides: (i) 5t-htelo and htelo-5t that carry a 5
thymidines long ss tail on their 5’ or 3’ end, respectively, and (ii) 10t-htelo and htelo-10t that carry a
10 thymidines long ss tail on their 5’ or 3’ end, respectively (see Table for sequence). The CD spectra
of the extended htelo sequence did not strongly differ from htelo (data not shown), suggesting that the
ss tails did not affect the G4 conformation. The presence of a ss tail decreased the Tm of the G4 structure
(Table) independently of the ss length (5 or 10 nt), compared to htelo (ΔTm varied from 6.5 to 9 °C in
K+ and from 13 to 8°C in Na+).
The binding of hRPA to these extended htelo sequences in the absence or in the presence of
G4-ligands was examined by EMSA (Figure 4). The results indicate that the presence of a ss tail
increases the affinity of hRPA for htelo in the absence of G4-ligand (Figures 4A and B). As a control,
hRPA binds none of the two short oligonucleotides (polyT5 and polyT10) that mimic the ss tails of
extended htelo DNAs under our experimental conditions (data not shown), suggesting that binding of
hRPA to extended htelo DNAs requires the htelo sequence. The highest affinity of hRPA for htelo-10t,
suggest a binding preference for the 3’ DNA extension.
Interestingly, the presence of telomestatin decreases the affinity of hRPA for all four extended
htelo sequences, but to different extents (Figures 4C, D, and Figure 3D). While a nearly equal inhibitory
effect of telomestatin is found for 5t-htelo and htelo-5t, a less inhibition of hRPA binding by
telomestatin is measured for 10t-helo and htelo-10t, with a very low inhibition for htelo-10t (Figure
4D). This results shows that telomestatin has a poor inhibitory effect when the 10t extension is present
at the 3’ extremity. Similar results were obtained with 360A and 360A-Br (Figure 3D). This behaviour
supports a binding preference of hRPA for the 3’ ends.
To verify if the binding of hRPA to htelo-10t was associated with unfolding of the G4 structure,
we designed an extended FhteloT bearing 10 thymines at the 3’ extremity (FhteloT-10t, Table) and
followed the opening of the G4 by FRET. The P value increased with the ratio r (Figure S1) indicating
117
that FRET was suppressed. The maximal P value was nearly the same as the one obtained for FhteloT
(Figure 3C). These results suggest that hRPA is able to completely unfold the G4 structure of the
extended FhteloT-10t oligonucleotide.
Figure 3A
118
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121
122
RPA2 and RPA1 subunits bind and unfold G-quadruplex from 3’ to 5’
To gain insight into the positioning of hRPA along the htelo sequence during the unfolding
process, a photo-crosslinking strategy based on thionucleobases was developed (6,44,45). Three
different htelo analogues, containing a single photoactivable 4-thiothymine residue (s4T), at three
different positions (at the 5’ side, in the middle and at the 3’ side, for htelo-S0, htelo-S10 and htelo-S22,
respectively) (Table), were used. Upon UV irradiation of a hRPA-htelo-S complex, the s4T residue can
form a covalent bond with the protein.
Figure 5A shows photo-crosslinked complexes, separated by SDS-PAGE, obtained with the
radiolabeled htelo-S and at three hRPA concentrations (30, 100 and 600 nM) in SDS-PAGE conditions.
At these concentrations, the hRPA-htelo stoichiometry was mainly 1:1, 1:1 and 2:1 respectively (Figure
S2). No crosslink was formed without UV-irradiation (data not shown). Upon UV-irradiation, each
htelo-S gave two bands, in addition to the free htelo-S band. The molecular weight of these bands were
about 38 and 76 kDa, and were consistent with the DNA-crosslinked RPA2 and RPA1 subunits,
respectively (Figure 5A). To confirm the identity of the bands, immunoblotting experiments using
specific antibodies directed against RPA1 and RPA2 were performed (Figure 5B). Each antibody lights
up two bands, a major one corresponding to the free hRPA subunit and a minor one corresponding to
the crosslinked subunit. The difference in migration for each couple of bands corresponds to a mass
increment of ~6 kDa confirming that the 38 and 76 kDa products correspond to RPA2 and RPA1
crosslinked to htelo-S, respectively. We conclude that RPA interacts with htelo sequence via its RPA1
and RPA2 subunits. The absence of bands corresponding to the crosslinked RPA3 subunit suggests
that this subunit does not interact with the htelo sequence.
To determine the positioning of hRPA along the htelo sequence, we calculated the percentage
of total crosslinked htelo-S at the different hRPA concentrations (Figure 5C). At low hRPA
concentration (30 nM, conditions where the 1:1 complex predominates), the maximum crosslinking
(15%) occurs predominantly at the 3’ side of the DNA. At high hRPA concentration (600 nM, where
the 2:1 complex predominates), the maximum crosslinking efficiency (18%) is obtained in the middle
of the sequence. Under all conditions, crosslinking efficiency at the 5’ end of the DNA is lower than
that at the 3’ end or in the middle. The crosslinking efficiency in the middle and at the 5’ end of htelo
increases with hRPA concentrations, while it remains constant at the 3’ end. Overall, these results show
that the initial interaction of hRPA with DNA is predominantly made on the 3’ end of the G4. In
123
addition, when a second hRPA is bound, interactions of hRPA with the inner region and the 5’ end
increase, suggesting that G4 is opened by hRPA in the 3’ to 5’ direction.
To determine the positioning of hRPA subunits along the htelo, the percentage of DNA
crosslinked to RPA1 or RPA2 was determined at each position and at each hRPA concentration (Figure
5D-F). Interestingly, in the 1:1 complex, the cross-links are mainly present at the 3’ side with RPA2
(10%) and in the middle with RPA1 (10%). However we can observe minor crosslinks with RPA1 on
the 3’ and 5’ sides (less than 5%). In the 2:1 complex, the crosslink with RPA2 at the 3’ end decreases
to ~5% while the crosslink with RPA1 increases along the DNA, with a strong crosslinking in the
middle (18%). All together the results of photo-crosslinking experiments show that RPA2 binds almost
exclusively at the 3’ end, while RPA1 can bind all along the htelo sequence, with the highest
crosslinking efficiency in the middle of the sequence.
124
125
126
DISCUSSION
In this work, we investigated (i) the interaction of hRPA with the G4 formed by the human
telomeric motif under conditions modulating G4 stability, (ii) the effects of single strand tails at the 5’
or 3’ ends of the G4 on hRPA binding and (iii) the positioning of hRPA and its subunits along the
telomeric sequences.
EMSA experiments under conditions that modulate the stability of G4 (nature of the
monovalent cation, temperature and G4-ligands) revealed an inverse relationship between G4 stability
and hRPA affinity. This can be explained by the requirement of a single-stranded region for hRPA
binding. G4 structures are in a dynamic equilibrium with unfolded and partially folded (intermediate)
states(46), in which single strands are transiently accessible. Factors that shift the equilibrium towards
the intermediate or unfolded states favor hRPA binding; conversely shifting the equilibrium towards
the folded G4 state inhibits hRPA binding. Notably, we show that stabilisation of telomeric G4 by
small ligands can impair binding of hRPA to telomeric sequences, as previously reported for the
telomere interacting proteins POT1 and Topo IIIα (47,48) and for the hRPA for a non-telomeric
G4(49). Our result suggests that inhibition of hRPA binding to telomeres may be one of the factors
determining telomere instability induced by G4-ligands.
The study of the extended htelo G4 confirms the requirement of a singlestranded region for
hRPA binding. Indeed, the presence of a 5 or 10 nt-long single-stranded tail on either side of the G4
increases the affinity of hRPA for DNA. This can be explained by a lower stability of the extended G4,
implying a higher proportion of intermediate or unfolded species and/or by an increase in the number
of potential binding sites due to the presence of the ss tail(1,2,50,51).
Interestingly, the affinity of hRPA for the G4 bearing a 10 nt-long single strand tail at the 3’
end, in the absence and in the presence of G4 stabilising ligands, is comparable to its affinity for the
unstructured sequence htelomut. These data indicates that hRPA preferentially binds G4 from the 3’
DNA end. This preference has been previously observed on a double-stranded/single-stranded junction
with a 3’ tail (52, 53).
Photo-crosslinking experiments indicate that in the majority of the 1:1 complexes RPA2 is
positioned at the 3’ end of the DNA, while RPA1 is positioned in the center. This positioning of hRPA
on G4 is in accordance with the polarity observed for the heterotrimer on an unstructured ssDNA(1).
127
Previous reports on hRPA binding on unstructured ssDNA showed that among the three hRPA
subunits, RPA1 had the highest ssDNA binding affinity and established the initial interaction with
DNA(1). Here we show unambiguously that the initial and preferential binding of hRPA occurs at the
3’ extremity of the G4 with RPA2. Interestingly and in agreement with our data, a recent study showed
that the RPA2 and RPA3 subunits bind preferentially G-rich DNA and that unfolding of the G4 requires
the DBD-C domain of RPA1(35). This latter result is in agreement with the crosslinking preference of
RPA1 for the center of the htelo sequence that we observed. Our data are consistent with a scenario
where the initial binding of hRPA to G4 is mediated by the interaction of the RPA2 subunit with the
3’ end and followed by the positioning of RPA1 and the unfolding in the 3’ to 5’ direction of the
sequence (Figure 6). The increase of hRPA concentration leads to the formation of 2:1 complexes
where a second RPA1 subunit is bound on a completely extended G4 (see FRET experiments). Thus,
we demonstrate that RPA binds G4 in a binding mode opposed (3’ to 5’ direction) to those observed
with an unstructured ssDNA (5’ to 3’ direction) (1) suggesting that the binding mode of RPA is
modulated by the structure of DNA.
The presence of minor crosslinks with RPA1 at the 5’ end, in the 1:1 complexes, could be
explained by an initial contact of hRPA with the 5’ end of the partially unfolded htelo (Figure 6).
Indeed, the DBD-C domain of RPA1 was shown to display a good affinity for G4 DNA (35). However,
we can not exclude that in the 1:1 complexes (Figure 6), RPA can slide along the unfolded G4
positioning RPA1 at the 5’ or 3’ ends of the DNA.
The new binding and unfolding model that we propose for hRPA is similar to the one recently
proposed for the telomeric protein POT1. POT1 was recently found to unfold telomeric G4 through a
stepwise mechanism in which the two OB-folds bind sequentially in the 3’ to 5’ direction and complete
unfolding of the G4 is achieved when two POT1 molecules (four OB-folds) are bound (54). However,
the addition of the OB-fold domain of TPP1 modulates the binding activity of POT1 to generate a
sliding activity leading to a continuous folding and unfolding of the G4. The open question is how RPA
and POT1 functions are coordinated at telomeres during lagging strand DNA replication and to activate
telomerase. We will pursue our study in order to determine which DBD domains of hRPA are involved
in the binding and unfolding of telomeric G4.
128
129
SUPPLEMENTARY DATA
Supplementary Figures S1 and S2 are available at NAR online
FUNDING
This work was supported by grants from the “Ligue Nationale contre le Cancer, Equipe
Labellisée 2010”, the Agence Nationale de la Recherche (ANR-09-BLAN-0355), the Institut National
du Cancer (TP53-INTRON3), to J.F.R., E.D., P.A. and C.S. and the RFBR Project 12-04-00487-а to
I.P. and O.L. Layal Safa was supported by a doctoral fellowship from the “Ligue Nationale contre le
Cancer”.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Dr A. Bugaut for critical reading of the manuscript and fruitful discussion and P.
Mailliet, K. Shin-ya and M.P. Teulade-Fichou for providing the G4-ligands used in this report.
130
131
132
TABLE AND FIGURES LEGENDS
Table. Sequence of different oligonucleotides and Tm values
Figure 1. Effects of salt and temperature on G-quadruplex hRPA binding. P32-htelo (A) or htelomut
(B) (2 nM) was incubated with various amounts of hRPA (from 5 to 100 nM) in the presence of 100
mM KCl or LiCl and separated on a native 1% agarose gel. (C) hRPA-htelo binding quantification at
different amounts of hRPA in K+, Na+ and Li+ solutions. (D) hRPA-htelomut binding quantification at
different amounts of hRPA in K+, Na+ and Li+ solutions. hRPA-htelo (E) and hRPA :htelomut (F)
binding quantification at different amounts of hRPA in K+ at 4, 10, 20 and 40°C.
Figure 2. Effect of G4-ligands on G-quadruplex opening by hRPA. (A) Structure of stacking G4ligands. Fluorimetric titration of 90 nM of FhteloT by increasing amounts of hRPA was performed in
50 mM K+ in absence (B) or in the presence of telomestatin (C). (D) The increase of P as a function
of the hRPA/FhteloT ratio (r) in the absence (circles) or in the presence of telomestatin (squares)
indicates that unfolding of FhteloT by addition of hRPA is impeded by the presence of telomestatin.
Figure 3. Effect of G4-ligand on G-quadruplex hRPA binding. (A) P32-htelo (2 nM) was incubated
with various amounts of hRPA (from 5 to 100 nM) in the absence or in the presence of telomestatin in
K+ and separated on a native 1% agarose gel. The control without RPA in the presence of telomestatin
was from an independent experiment. (B) hRPA-htelo binding quantification at different amounts of
hRPA in the absence or in the presence of different G4-ligands in K+. (C) hRPA-htelomut binding
quantification at different amounts of hRPA in the absence or presence of different G4-ligands in K+.
(D) Percentage of inhibition of hRPA binding for different oligonucleotides (htelo, htelomut and
extended htelo) in the presence of different G4-ligands in K+ and at 100 nM of hRPA.
Figure 4. Effect of extended G-quadruplex on hRPA binding. hRPA-DNA binding quantification at
different amounts of hRPA in K+ with the different 5t extended htelo (A) or 10t extended htelo (B).
(C) Comparison of hRPA-DNA binding quantification in the absence or in the presence of telomestatin
for 5t-htelo and htelo-5t (C) and for 10t-htelo and htelo-10t (D).
Figure 5. Identification of the hRPA subunits implicated in the interactions with htelo G-quadruplex.
133
(A)
32
P-labeled htelo-S (30 nM) were mixed with the indicated amounts of hRPA then irradiated at
10°C for 30 min. SDS-PAGE (10%) were used to separate multiple crosslinked species (arrows). (B)
The immunoblot shown here identifies each subunit implicated in photo-cross-linking with htelo-S22
with a hRPA/htelo ratio of 50 (lane 2). Antibodies AbRPA1 and AbRPA2 were used. For comparison,
free hRPA was loaded (lane 1). (C) The total amounts of cross-linked species for each photoactivable
DNA used were quantified for each hRPA concentration. The amounts of DNA cross-linked with
RPA1 and RPA2 subunits were quantified for each photoativable DNA with s4T in 5’ (D), central (E)
and 3’ (F) positions. Error bars were around 15%.
Figure 6. Model of hRPA binding to G-quadruplexes. hRPA binding is preferentially directed by
single-stranded regions, generated at the 3’ extremity of partially unfolded structures (triplex). This
first binding step would be mediated by RPA2 subunit and DNA destabilization would be realized by
RPA1. In the 1:1 complex, the bound DNA could be partially or totally unfolded allowing the binding
of a second hRPA. In the 2:1 complex, the DNA is totally extended.
Figure S1. htelo-10t opening by hRPA. Increasing of P as a function of the hRPA/FhteloT-10t ratio
(r) indicates that hRPA unfolds the extended FhteloT-10t.
Figure S2. Titration of htelo with hRPA. P32-htelo (30 nM) was incubated with various amounts of
hRPA (from 30 to 600 nM) and loaded on a native 8% PAGE to separate free htelo from the 1:1 and
2:1 complexes (A). The relative amounts of 1:1 complex (solid line) and 2:1 complex (dashed line)
were quantified for each hRPA concentration (B).
134
Table
Name
Sequence
Tm °C
Tm °C
Tm °C
K+
Na+
Li+
htelo
GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
68
59
25
htelomut
GGCTTACGGTTAGCGTTACGG
nd
nd
nd
5t-htelo
tttttGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
59.5
46
nd
htelo-5t
GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGttttt
61.5
51
nd
10t-htelo
ttttttttttGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
59
46
nd
htelo-10t
GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGtttttttttt
60.5
47
nd
5t-htelomut
tttttGGCTTACGGTTAGCGTTACGG
nd
nd
nd
htelomut-5t
GGCTTACGGTTAGCGTTACGGttttt
nd
nd
nd
10t-htelomut
ttttttttttGGCTTACGGTTAGCGTTACGG
nd
nd
nd
htelomut-10t
GGCTTACGGTTAGCGTTACGGtttttttttt
nd
nd
nd
htelo-S0
s4TGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
nd
nd
nd
htelo-S10
GGGTTAGGGs4TTAGGGTTAGGG
nd
nd
nd
htelo-S22
GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGs4TT
nd
nd
nd
FhteloT
Fluo-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-TAMRA
nd
nd
nd
FhteloT-10t
FhteloT-tttttttttt
nd
nd
nd
nd : non determined
135
I.3. Conclusion et perspectives
Les résultats, présentés sous forme d’article, ont donc permis de proposer un nouveau modèle
de liaison et d’ouverture des G-quadruplexes par la RPA humaine et dans lequel RPA arrive
préférentiellement du côté 3’ via la sous-unité RPA2 et déroule le G-quadruplexe dans la direction 3’5’ grâce à la sous-unité RPA1.
La nécessité de la présence d’une région simple brin aux extrémités des G4 pour la fixation de
RPA est maintenant bien établie. Pour confirmer ce résultat, nous avons recherché des moyens pour
bloquer complètement les extrémités des G4 et ainsi inhiber probablement totalement la fixation de
RPA. La construction de G4 étendu aux deux extrémités par des régions simple brin complémentaires
conduisant à la formation d’une double hélice stable bloquant le G4 sous un état fermé a été envisagée.
Toutefois, le protocole de formation de ces hybrides G4-double hélice est à mettre au point. Nous
envisageons plutôt un moyen plus simple qui serait d’utiliser une ADN ou ARN ligase capable de lier
des extrémités d’ADN de petites tailles.
Les régions simple brin des boucles pourraient être aussi un site de liaison de RPA, bien que la
taille (3 nt) ne soit pas favorable. Connaissant le polymorphisme des G4, certains contacts pourraient
se faire au niveau de boucles de plus grandes tailles. C’est pourquoi, il serait intéressant d’étudier
l’interaction de RPA avec des G-quadruplexes ayant des boucles de taille variable. Cette étude pourrait
entre autre s’étendre à d’autres séquences du génome, pour lesquelles de longues boucles peuvent se
former.
L’identification par Western Blot des sous-unités impliquées dans les crosslink nous a permis
de positionner ces dernières le long de l’ADN. Les expériences ont été réalisées dans des conditions
thermodynamiques, c’est à dire après 20 minutes d’incubation de RPA avec le G4. Or, il a été montré
que l’ouverture du G-quadruplexe par RPA prend environ 0,3 secondes (Qureshi et al., 2012). Ceci
montre que les premiers contacts entre la protéine et le G-quadruplexe se font à des temps inférieurs à
la seconde. Même si les résultats suggèrent fortement que le premier contact se fasse avec RPA2, il est
évident que seules des expériences de crosslink dans des conditions cinétiques pourront sans ambiguïté
révéler la nature des premiers contacts. Ainsi, nous nous sommes dotés d’un mélangeur rapide
(Stopped-Flow) couplé à une cuve d’irradiation qui nous permettra de réaliser des irradiations de
l’ordre de la milliseconde.
136
Enfin, pour affiner ce modèle, l’identification des domaines DBD impliqués, voire des résidus
impliqués, dans la liaison de chacune des sous-unités, est nécessaire. Pour RPA2, il n’existe qu’une
seule région OB-fold (DBD D) alors que RPA1 possède 3 OB-fold (DBD A, B et C) susceptibles
d’interagir avec l’ADN. Pour identifier les contacts sur RPA nous réaliserons une étude des espèces
pontées par spectrométrie de masse. Une collaboration avec Emmanuelle Sachon, chimiste de
l’Université Pierre et Marie Curie, a été initiée.
Le modèle que nous avons proposé corrèle bien avec le modèle de liaison de POT1 au G4
proposé par l’équipe de S. Myong. Il serait intéressant de faire une étude comparative et/ou de
compétition entre RPA et POT1 sur notre système in vitro pour mieux définir les interactions et le
mode d’action de ces deux protéines. Nous avons actuellement des échantillons POT1 humaine,
produite à l’Institut Curie, qui possède une bonne activité de liaison à l’ADN htelo étudié dans l’article.
137
II. Effet biologique du 9944 dans les cellules ALT
II.1. Introduction
Comme nous l’avons exposé dans l’introduction générale (chapitre II. paragrahe IV.), deux
mécanismes permettent aux cellules cancéreuses de maintenir la taille des télomères et ainsi de
proliférer indéfiniment. Le premier nécessite la réactivation de la télomérase, qui se produit dans 85 %
des cancers, et le deuxième implique la recombinaison homologue entre les télomères (mécanisme
ALT), processus existant dans 15% des cancers.
Les cellules ALT sont caractérisées notamment par des télomères de taille très hétérogène, par
la présence de structures APBs comprenant des séquences télomériques, les protéines du complexe
Shelterin et d’autres facteurs impliqués dans la réparation et la recombinaison de l’ADN, la présence
des C-circles et un taux important de T-SCEs (Telomere-Sister Chromatid exchanges).
En particulier, la topoisomérase IIIα, est considérée comme un facteur essentiel pour l’intégrité
et le maintien des télomères dans les cellules ALT et est une des protéines spécifiquement enrichie au
niveau de la chromatine des télomères des cellules ALT ( Déjardin and Robert, 2009; Temime-Smaali
et al., 2008). En effet, la TopoIIIα humaine colocalise au niveau des APBs et co-immunoprécipite avec
TRF2 et BLM. Chez la levure, TopoIIIα est impliquée dans la recombinaison des télomères en absence
d’activité télomérase (type II survivor) (Tsai et al., 2006). Chez l’Homme la déplétion de TopoIIIα
par ARN interférence provoque une dysfonction télomérique des cellules ALT qui se traduit par une
perte du G-overhang, une augmentation des TIFs (Telomere Induced Focis) et une réduction du niveau
de BLM et TRF2 dans les cellules ALT. De plus, la déplétion de TopoIIIα, bloque spécifiquement la
prolifération des cellules ALT et n’a pas de conséquence sur la croissance des cellules télomérase
positive (Temime-Smaali et al., 2008). L’importance de la TopoIIIα dans le mécanisme ALT pourrait
résider dans sa capacité à résoudre les doubles-jonctions Holliday lors de la recombinaison ou à faciliter
la dissociation de la t-loop (Pour revue voir (Amor-Gueret and Riou, 2012)). Une étude du laboratoire
a montré que la TopoIIIα fixait moins bien l’ADN télomérique structuré en G-quadruplexe et que les
ligands G4 (Télomestatine, 360A, dérivés de perylène di-imides) bloquaient la fixation de la TopoIIIα
sur le G-quadruplexe télomérique (Temime-Smaali et al., 2009; Hampel et al., 2010).
138
De plus, le traitement des cellules ALT (lignée MRC5V1) par la Télomestatine provoque une
dysfonction télomérique dont le phénotype mime celui de la déplétion de TopoIIIα par siRNA (TIFs,
déplétion de TRF2/BLM, raccourcissement du G-overhang). Cependant, il n’est pas clair dans ces
travaux si le phénotype observé correspond à une atteinte directe de la TopoIIIα ou de l’ensemble du
complexe TopoIIIα/BLM/TRF2 associé aux APBs des cellules ALT. La protéine RPA possède aussi
une fonction importante au niveau des APBs des cellules ALT. RPA co-localise au niveau des APBs
d’une fraction des APBs et sa déplétion par siRNA provoque une dysfonction télomérique des cellules
ALT et un blocage en G2/M (Grudic et al., 2007; Draskovic et al., 2009). Et puisque nous avons montré
que RPA joue un rôle essentiel dans la stabilité des G-quadruplexes télomériques, nous avons voulu
étudier l’effet des ligands G4 sur la localisation et les fonctions de RPA dans les cellules ALT.
Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à étudier l’effet de plusieurs ligands G4 sur
RPA dans les cellules ALT. Nous avons initié le travail en testant une série de ligands G4 disponibles
dans le laboratoire, la Télomestatine, le 360A et le 9944 dans la lignée MRC5V1, en analysant par
immunofluorescence leurs effets sur la localisation de RPA au niveau des APBs.
Les expériences préliminaires n’ont montré un effet qu’avec le 9944, un ligand dont l’effet
cellulaire n’avait jamais été étudié jusque-là. En conséquence, nous avons choisi de focaliser notre
étude sur l’effet du 9944 dans les cellules MRC5V1 en caractérisant son effet sur le cycle cellulaire,
l’intégrité des télomères et sur la localisation de RPA.
II.2. Matériels et méthodes:
Ligand G4
Le 9944 est fourni généreusement par Aventis Pharma. Il est préparé à 5mM en DMSO 50% et
conservé à -20°C.
Culture cellulaire et traitement
La lignée cellulaire MRC5V1 de phénotype ALT dérive de la lignée de fibroblastes
pulmonaires normaux MRC5 qui ont été immortalisés par l’antigène T de SV40, elle est fournie par
Frédérique Megnin-Chanet (Institut Curie, INSERM U350 ORSAY). Les cellules sont cultivées à 37°C
en atmosphère humide avec 5 % de CO2 dans du milieu DMEM Glutamax (GIBCO), additionné avec
139
10% de sérum de veau foetal (SVF) (Invitrogen) décomplémenté, en présence de 1% d’antibiotiques
(pénicilline, streptomycine) (GIBCO).
Pour les traitements au 9944, les cellules sont ensemencées à 450 000 cellules dans des boîtes
de 75 cm2 et cultivées pendant 4 jours en présence de 9944 dans le milieu de culture aux concentrations
indiquées ou de DMSO 50% pour le témoin non traité. Au bout de 4 jours, les cellules sont lavées au
PBS(1X) (GIBCO), puis décollées à la trypsine (0,05%)-EDTA (GIBCO) et comptées au compteur de
cellules Countess Automated Cell Counter (Invitrogen) en présence de bleu de trypan. Ainsi, 450 000
cellules sont prélevées et réensemencées dans une nouvelle boîte de 75cm2 en renouvelant le milieu de
culture auquel est additionné du 9944 ou du DMSO 50%. 4 jours après, la même opération est réalisée,
et les cellules sont ré-ensemencées pour être cultivées 4 jours supplémentaires en présence du 9944 ou
du DMSO 50%. Des cellules sont récoltées après 4, 8 et 12 jours de traitement pour analyse. Après
chaque passage, le nombre de doublement de population (PD) des cellules traitées ou non traitées est
calculé selon la formule :
PD = [Log (nombre de cellules à Jn) - Log (450 000)] / Log 2.
Western Blot
Les cellules sont lysées dans un tampon de lyse contenant 350 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH
7.5, 1% NP-40, additionné d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Thermo
scientific). Le lysat est ensuite soniqué. Les protéines des extraits cellulaires sont dosées par le test de
Bradford.
Pour chaque échantillon, 15µg d’extraits protéiques sont soumis à un SDS-PAGE en gels précoulés polyacrylamide-SDS NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris (Invitrogen). Les protéines retenues dans
les gels sont électro-transférées sur des membranes de nitrocellulose (AmershamTM HybondTM ECL
GE Healthcare) dans un tampon de transfert contenant 25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192 mM glycine, 20%
méthanol, pendant 4h avec le système XCell II™ Blot (Invitrogen). Le système est maintenu à froid
avec de la glace. Les membranes sont saturées dans du TBS - 5% lait - 0,1% Tween 20, pendant 1h à
température ambiante, puis incubées avec les anticorps primaires, dans les conditions indiquées par le
fournisseur et les dilutions mentionnées ci-après. Après 3 lavages au TBS-0,1% Tween20, les
membranes sont incubées avec les anticorps secondaires comme indiqué ci-dessous. Les membranes
sont ensuite lavées 3 fois 10 minutes au TBS-0,1% Tween 20. La révélation des Western-blots est
140
effectuée à l’aide du kit ECL Western blotting Detection ReagentsTM (GE Healthcare). Lorsque
nécessaire, les membranes sont déshybridées avec le Re-blot plus mild antibody Stripping Solution
(Millipore) et retraitées comme indiqué ci-dessus.
Les anticorps utilisés sont les suivants :
Anticorps primaires:
Mouse anti RPA2 [1/300] (abcam), rabbit anti-phospho RPA2 (S33) [1/500] (Bethyl), rabbit anti-RPA2
(S4/S8) [1/500] (Bethyl), mouse anti-phospho Histone H2AX (Ser139) [1/1000] (upstate), mouse antichk1 [1/250] (cell signaling), rabbit anti-phospho chk1(Ser345) [1/250] (cell signaling), rabbit antichk2 [1/500] (cell signaling), rabbit anti-phospho chk2 (Thr68) [1/500], mouse anti-β-actin [1/5000]
(Sigma).
Anticorps secondaires:
HRP-Goat anti-mouse IgG (H+L) [1/5000] (Invitrogen), HRP-Goat anti-Rabbit IgG (H+L) [1/5000]
(Invitrogen).
L’anticorps anti-phospho chk1(Ser345) est dilué dans du TBS contenant 0,1% Tween20 et 5% BSA.
Tous les autres anticorps sont dilués dans du TBS contenant 0,1% Tween20 et 5% lait.
Cytométrie en flux
Analyse du cycle cellulaire
Les cellules sont récoltées après traitement par centrifugation 5 min à 1500 rpm à température
ambiante, puis lavées au PBS-20 mM EDTA et fixées pendant au moins 1h à -20°C en éthanol 70%
préalablement refoidi à -20°C. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois au PBS-20mM EDTA puis
incubées 30min à 37°C dans une solution de PBS-20 mM EDTA, 100 mg/ml RNase A (Sigma), 20
mg/ml d’iodure de propidium (Sigma). L’analyse du cycle cellulaire est réalisée par le cytomètre en
flux BD Accuri C6 (Becton Dickinson Biosciences). Le traitement des données est effectué par le
logiciel FCS Express 4.
Analyse du point de contrôle G2-M
Les cellules sont récoltées après traitement par centrifugation 5 min à 1500rpm à température
ambiante, puis lavées au PBS-20 mM EDTA et fixées au méthanol (85%) à -20°C pendant au moins
30min. Ensuite, les cellules sont lavées 2 fois au PBS - 20mM EDTA et perméabilisées au PBS- Triton
0,5% pendant 5min sur la glace. Après un lavage en PBS-20 mM EDTA, les cellules sont incubées 2h
141
à température ambiante en présence de l’anticorps primaire anti-phospho Histone H3 (Ser10)
(Euromedex) dilué au 1/100 dans du PBS - 1%BSA - 20mM EDTA - 0,5% Tween 20. Les cellules
sont ensuite lavées au PBS - EDTA 20 mM puis incubées 30min à température ambiante en présence
de l’anticorps secondaire Alexa fluor Goat anti-mouse 488 dilué au 1/200 en PBS - 1% BSA - 20mM
EDTA - 0,5% Tween 20. Après un lavage, les cellules sont incubées pendant 30min à 37°C dans du
PBS - 20mM EDTA contenant 100 mg/ml RNase A (Sigma), 20 mg/ml d’iodure de propidium (Sigma).
L’analyse des cellules est réalisée par le cytomètre de flux BD Accuri C6 (Becton Dickinson
Biosciences). Le traitement des données est effectué par le logiciel FCS Express 4. Les cellules
présentant une hyperphosphorylation de l’Histone H3 sur la Ser 10 au sein de la population des cellules
en phase G2-M du cycle cellulaire correspondent aux cellules en mitose (Amor-Gueret et al., 2002).
Immunofluorescence
Les cellules MRC5V1 traitées ou non au 9944 sont ensemencées dans les puits de labtek (30
000 cellules / puits). Les cellules sont lavées au PBS (1X) puis fixées au paraformaldéhyde 4% pendant
20 min à température ambiante. Elles sont ensuite lavées au PBS(1X) puis perméabilisées pendant 20
min avec du PBS(1X) - 0,5% Triton. Après deux lavages au PBS(1X), les lames sont mises en
saturation pendant 1 heure à 37°C dans une solution de PBS(1X) -10% SVF. Les labtek sont ensuite
incubées pendant 1 h à 37°C avec les anticorps primaires dilués dans la solution de saturation comme
indiqué ci-dessous, puis lavées trois fois au PBS(1X) avant d’être incubées pendant 1 h à 37°C avec
les anticorps secondaires appropriés indiqués ci-dessous. Trois lavages sont ensuite également
effectués. Ensuite, les cellules sont incubées 30min à température ambiante, avec du DAPI (0,1µg/ml)
ou du Hoechst (0,4mM) puis lavées une fois au PBS (1X). Par la suite, les lamelles sont montées sur
les lames à l’aide du milieu de montage Shandon Immu-mount (Thermo scientific).
Pour les images présentées dans les figures 70, 74, 75 et 76 les cellules ont été observées au
microscope à fuorescence inversée Leϊca DMIRE2, au grossissement 100X et l'acquisition des images
a été faite à l'aide du logiciel Metamorph (Roper Scientific, Duluth, GA). Dans ce cas, le traitement
des images est réalisé par ImageJ.
Les cellules de l’image 80 sont observées à l'aide d'un microscope de fluorescence à
illumination structurée « Zeiss
Axio Observer 2.1» en utilisant des filtres appropriés et au
142
grossissement 63X. Le traitement de données et la déconvolution sont effectués avec le logiciel
« TANGO ».
Les anticorps utilisés sont les suivants :
Anticorps primaires:
mouse anti-RPA2[1/800] (abcam); rabbit anti-PML[1/300](abcam) ; rabbit anti-TopoIIIα [1/1000]
(clone D6, wu et al., 2000); rabbit anti-TRF2 [1/150] (abcam); anti-phospho-RPA2 (S33) [1/250]
(Bethyl).
Anticorps secondaires:
Alexa fluor 568 Goat anti-mouse [1/1000] (Invitrogen), Alexa fluor488 Goat anti- rabbit [1/1000]
(Invitrogen).
Telomere restriction fragments (TRF)
L’ADN des cellules récoltées est extrait à l’aide du kit QIAamp DNA Mini kit (Qiagen) et
dosé par le nanodrop (Spectrophotometer ND-100). Ensuite, 1µg d’ADN est digéré à 37°C pendant
une nuit par les enzymes HinfI et RsaI (à 2U/µg) (Biolabs). L’ADN digéré est soumis à une
électrophorèse sur un gel d’agarose 0,8% - TBE 0,5X de 25 cm, dans un tampon de migration TBE 0,5
X pendant 16h à 70V. La migration est ensuite controlée par une coloration du gel au BET. Le gel est
ensuite préparé pour un transfert par capillarité : il est incubé à température ambiante successivement
en solution de dénaturation (0,5M NaoH, 1,5M NaCl) puis de neutralisation (0,5M Tris HCl pH 7.2,
1,5M NaCl), pendant 1h par lavage,. L’ADN est transféré par « Southern Blot » en SSC 20X (GIBCO)
sur une membrane de nylon (Amersham HybondTM –N+). La membrane est ensuite séchée 1h à 80°C
et « crosslinkée » aux UV à 1200J/cm2 pour fixer l’ADN à la membrane. Une préhybridation pendant
2h à 50°C en tampon Church (0,25M phosphate de sodium pH 7.2, 1%BSA, 7%SDS, 1mM EDTA)
est effectuée. La sonde télomérique 24CA (CC-(CTAACC)3-CTAA) marquée avec l’ATP [γ-32P]
(Chang and Harley, 1995) est ensuite hybridée toute une nuit à 50°C. Enfin, la membrane est lavée
successivement en SSC(4X), SSC(2X), SSC(0,5X) et SSC(0,2X)-0,1% SDS pendant 30min à 50°C
par lavage. Un écran autoradiographique est ensuite exposé pendant une nuit ou 2 jours, puis révélé au
PhosphorImager Typhoon (Amersham Biosciences).
143
Extraction des ARNs totaux
Les ARNs totaux des cellules sont extraits en utilisant le kit «E.Z.N.A.® Total RNA Kit» en
suivant le protocol indiqué par le fournisseur (OMEGA bio-Tek).
144
II.3. Résultats
II.3.1. Effets du 9944 sur la prolifération et le cycle cellulaire de la lignée ALT MRC5V1
La lignée MRC5V1 correspond à un clone de la lignée MRC5 immortalisée par l’antigène T de
SV40 qui ne possède pas d’activité télomérase (test TRAP), n’exprime pas les transcrits de hTERT et
de TERC et présente des APBs caractéristiques du phénotype ALT (Thèse Lemarteleur, 2005;
Temime-Smaali et al., 2009)
Nous avons tout d’abord étudié l’effet du 9944 (3 et 6 µM) sur la croissance cellulaire de la
lignée MRC5V1 pendant une durée de 12 jours. Les cellules sont repiquées tous les 4 jours à la même
concentration cellulaire et le traitement par le ligand est ajouté dans le milieu de la culture cellulaire
au moment de l’ensemencement des cellules, soit à J0, J4 et J8. La numération des cellules au bleu
trypan à J4, J8 et J12 permet de calculer le doublement de population des cellules traitées et non traitées
(voir Matériels et Méthodes). Les résultats présentés dans la figure 67 montrent qu’avec 3µM de 9944,
le ligand n’a pas d’effet marqué jusqu’à J8 et bloque la croissance cellulaire à J12. En présence de 6
µM de 9944, une faible inhibition de prolifération est observée dès J4, qui est beaucoup plus marquée
à J8 et totale à J12. Nous n’avons pas observé d’effet du 9944 sur la viabilité, qui est en moyenne de
89% dans les conditions traitées et non traitées. Ces résultats indiquent un effet cytostatique du 9944
sur les cellules MRC5V1 qui dépend de la concentration du ligand et de la durée de traitement.
Nombre de doublement
de population
10
Contrȏle
8
6
4
2
0
0
4
8
12
Durée de traitement par le 9944 (Jours)
Figure 67. Effet du 9944 (3 et 6 µM) sur la prolifération de la lignée MRC5V1 au cours du temps. Expérience
représentative de 3 expériences indépendantes.
145
L’effet antiprolifératif et cytostatique du 9944, principalement observé pour la concentration
de 6µM, suggère un effet sur le cycle cellulaire des cellules MRC5V1. Nous avons donc étudié l’effet
du 9944 (6µM) sur le cycle cellulaire des MRC5V1 traitées pendant 4, 8 et 12J par cytométrie de flux
(voir Matériels et Méthodes).
Les résultats présentés dans les Figures (68A et 68B) montrent que les cellules non traitées, aux
différents temps de l’expérience (J4 à J12), conservent la même distribution en G1, S et G2/M pour la
fraction de cellules 2N et une quasi absence de cellules en sub-G1 (<2%). Un doublement de la fraction
de cellules > 2N est observé pour les cellules à J12 (11,2%) comparativement aux cellules à J4 et J8
(4,8-5,0%).
La comparaison entre les cellules traitées et non traitées indique tout d’abord que le nombre de
cellules en sub-G1 indicatif de la mort cellulaire par apoptose n’est pas augmenté par le traitement avec
le 9944. Ce résultat est en accord avec l’absence de mortalité cellulaire évaluée par l’exclusion au bleu
trypan.
Le 9944 provoque entre J4 et J12 une modification du cycle cellulaire correspondant à une
augmentation de la fraction en G2/M et à une diminution de la fraction en G1 et en S associée à
l’inhibition de prolifération. De plus, une forte proportion de cellules >2N (tétraploïdes) est induite par
le traitement. L’augmentation en G2/M, la diminution en G1 et l’augmentation de cellules tétraploïdes
(>2N) sont observées dès le 4ème jour de traitement. La diminution de la phase S est détectée après le
8ème jour de traitement. Ce résultat corrèle avec l’inhibition de prolifération qui est importante à J8.
Ces résultats suggèrent un blocage en G2/M qui diminue le nombre de cellules passant en G1 puis en
S. L’augmentation du nombre de cellules tétraploïdes pourrait s’expliquer par une fraction de cellules
qui contournent le blocage en G2/M en induisant un processus d’endoréplication de l’ADN sans
s’engager en mitose. En effet, la fraction de cellules >2N augmente au cours du temps de traitement en
parallèle avec la diminution de la fraction de cellules en S (Figure 68B). L’arrêt de prolifération
provoque au 12ème jour une légère diminution de la fraction en G2/M et en cellules tétraploïdes.
En conclusion, le traitement avec le 9944 déclenche un blocage en G2/M accompagné par
l’apparition d’une population tétraploïde des cellules MRC5V1 et une absence de mortalité cellulaire.
146
A.
B.
Figure 68. (A) Le cycle cellulaire analysé par cytométrie de flux des cellules non traitées et traitées au 9944 à 4, 8
jours et 12 jours. (B) Histogramme indiquant le pourcentage de cellules en fonction de leur phase du cycle cellulaire.
Les résultats sont représentatifs de 3 expériences indépendantes
Afin de préciser la nature du blocage G2/M et d’étudier le mécanisme d’apparition des cellules
tétraploïdes, nous avons voulu savoir si le 9944 induisait un blocage des cellules en G2 ou en mitose.
Nous avons donc étudié le point de contrôle G2/M en réalisant un double marquage IP et phosphoHistone H3 (Ser 10) (voir Matériels et Méthodes). Le marquage avec l’anti phospho-Histone H3 (Ser
10) permet de distinguer les cellules en G2 des cellules en M dont la proportion varie entre 1 et 5%
dans une population cellulaire asynchrone (Amor-gueret et al., 2002)
Les résultats présentés dans la Figure 3A montrent la population en mitose (M) correspondant
à la fraction de la population encadrée (Figure 69A). Cette fraction en M correspond à 1,4 % de la
147
population cellulaire pour les cellules non-traitées (Figure 69B). Le traitement par le 9944 provoque
une diminution de la fraction de cellules en M à J4 (0,62%), encore à J8 (0,17 %). Etant donné que le
pourcentage de cellules en G2/M augmente sous l’effet du 9944, alors que le pourcentage de cellules
en M diminue, nous déduisons que le 9944 induit un blocage en G2. Ce résultat renforce également
l’hypothèse du mécanisme d’endo-reduplication sans mitose pour contourner ce blocage et donner
naissance aux cellules tétraploïdes.
A.
B.
Figure 69. (A) Analyse du point de contrôle G2/M par cytométrie de flux des cellules MRC5V1 non traitées (control)
ou traitées par le 9944 (6µM) pendant 4 ou 8 jours (+9944 4J ou +9944 8J). Le double marquage à l’iodure de
propidium et avec un antiphospho-Histone H3 (ser10) indiqué par un carré correspond aux cellules en mitose (M) ;
(B) Pourcentage des cellules en mitose sans ou après traitement au 9944 (6µM) à 4J ou 8J
II.3.2. Le 9944 induit des dommages de l’ADN
Les ligands G4 perturbent un certain nombre de fonctions cellulaires comme la réplication de
l’ADN aux télomères dans les régions riches en PQS (Putative G-quadruplex Sequences), mais aussi
148
la transcription des gènes contenant des PQS dans les régions régulatrices (promoteur,….). Une des
régions du génome fortement enrichie en PQS correspond à l’ADN ribosomique.
Avant d’étudier l’effet du 9944 sur les fonctions télomériques de la lignée MRC5V1, nous avons voulu
dans un premier temps déterminer si l’arrêt de prolifération et le blocage en G2 induits par le 9944 étaient dus à
un effet sur la transcription de l’ADNr et/ou à l’accumulation de dommages de l’ADN.
II.3.2.1. Le 9944 n’induit pas de défaut de transcription de l’ADNr
Chez les eucaryotes, l’ADNr comporte essentiellement les gènes dont la transcription produit
les ARNs ribosomaux 5S, 5,8S, 28S et 18S. Les régions transcrites de l’ADN ribosomal présentent des
régions très riches en guanine (32,4% chez l’Homme). Ces séquences ont le potentiel de former des
G-quadruplexes au niveau de l’ADN ribosomal (Hanakahi et al., 1999).
La transcription de l’ADNr s’effectue dans le nucléole. Les nucléoles sont enrichis en
nucléoline dont une des fonctions est de stimuler la transcription de l’ARNr. La nucléoline possède
une activité ADN et ARN hélicase et interagit avec l’ADN G-quadruplexe (Drygin et al., 2009; Bates
et al., 2009). En effet, le CX-3543, un ligand G4 dérivé de fluroquinolone, inhibe l’ARN polymérase
I impliquée dans la transcription de l’ADNr dans les cellules A549 (Drygin et al., 2009) et le NMM,
un ligand G4 dérivé de porphyrine, bloque la transcription de l’ADNr chez la levure (Hershman et
al., 2008). De plus, plusieurs études de fluorescence montrent une accumulation de ligands G4 au
niveau du nucléoles (Drygin et al., 2009).
Lors des expériences d’immunofluorescence, nous avons observé dans les noyaux de certaines
cellules traitées au 9944 (6µM) un signal fluorescent rouge sous forme de « foyers diffus» qui semblent
se localiser au niveau des nucléoles et sont absents dans les noyaux des cellules non traitées (données
non montrées). Pour vérifier que ce signal fluorescent correspond au ligand, nous avons traité des
cellules avec le 9944 et réalisé la fixation /perméabilisation des échantillons en absence des anticorps
primaires et secondaires. Le résultat présenté dans la figure 4 montre un signal fluorescent du 9944
dans l’ensemble du noyau qui est plus intense au niveau des nucléoles (fléches et ronds pointillés
figure70A) détectés par la coloration au DAPI.
149
Afin de déterminer si l’accumulation du ligand dans les nucléoles provoque un effet sur la
transcription de l’ADNr, et donc potentiellement sur la croissance cellulaire, les ARNs totaux des
cellules non traitées et traitées par le 9944 ont été préparés (voir Matériels et Méthodes) et analysés par
électrophorèse en gel d’agarose (Figure 70B). Les résultats montrent que la quantité des ARNr (28S,
18S et 5S) ne varie pas après le traitement par le 9944. Ce résultat suggère que l’effet antiprolifératif
du 9944 n’est pas dû à un effet du ligand sur la transcription des ADNr.
A.
DAPI
merge
+9944 (6µM)
Contrȏle
Pas de marquage
B.
Figure 70. Cellules MRC5V1 non traitées (contrôle) ou traitées par le 9944 (6 µM, 4 jours). L’ADN est révélé par
coloration au DAPI (bleu). La coloration rouge révèle la fluorescence du 9944. (B) Migration sur gel d’agarose
(1,5%) des ARN totaux extraits des cellules non traitées (-) ou traitées par le 9944 (+) à différents temps de
traitement.
150
II.3.2.2. Le 9944 induit des dommages de l’ADN
Pour déterminer si le 9944 induit des dommages de l’ADN, pouvant être à l’origine du blocage
en phase G2 nous avons étudié par Western blot (voir Matériels et Méthodes) l’expression de la forme
phosphorylée (Ser 139) de la protéine H2AX (ɣH2AX) dans les extraits de cellules non traitées et
traitées, dans les mêmes conditions de concentration et de durée de traitement (6 µM à J4, J8 et J12).
Comme contrôles pour l’induction de dommages de l’ADN, nous avons utilisé des cellules MRC5V1
traitées par différents agents génotoxiques : Hydroxyurée (HU), Doxorubicine (Dox), Eau oxygénée
(H2O2) et Campthotécine (CPT). Les résultats montrent que les cellules MRC5V1 présentent un taux
basal de ɣH2AX et que le 9944 induit une faible stimulation de l’expression de ɣH2AX détectable
après 8 et 12 jours de traitement comparativement aux dommages induits par les agents génotoxiques
(Figure 71A). La quantification du signal ɣH2AX par rapport à l’actine, puis normalisée par rapport
aux cellules non traitées, indique une stimulation de 40% après 12 jours de traitement (Figure 71B).
Ces résultats montrent que l’arrêt de prolifération à 12 jours corrèle avec une accumulation de
dommages à l’ADN. Cependant, nous avions observé un effet sur le cycle cellulaire dès 4 jours de
traitement et dans les conditions de traitement à long terme, les cellules sont ré-ensemmencées tous les
4 jours. Il est donc possible que le ligand induise un effet plus précoce masqué par le protocole
expérimental que nous avons utilisé. Afin de vérifier si le 9944 n’induit pas un effet plus précoce nous
avons étudié la cinétique d’induction des dommages de l’ADN et les effets sur le cycle cellulaire entre
J1 et J4.
A.
B.
Figure 71. (A). Analyse de l’expression de ɣH2AX par western blot dans les cellules non traitées, et traitées (9944 à
6 µM) à 4J, 8J et 12J ; (B). Quantification de l’expérience de western blot présentée en (A). L’expression de ɣH2AX
est normalisée par rapport à l’expression de la β-Actine et au signal moyen des cellules non traitées à 4 et 12J.
151
L’effet du 9944 (6µM) sur le cycle cellulaire entre J1 et J4 est présenté dans la figure 72 (A et
B). Dans le cas des cellules non traitées, les résultats montrent que le cycle cellulaire présente quelques
variations (entre 3 et 6% en fonction de la phase du cycle) entre J1 et J4. Le % de cellules en sub-G1 à
J1 est légèrement plus important que dans les cellules à J2, J3 et J4. De même, une légère augmentation
de la fraction de cellules >2N est observée pour les cellules à J3 et J4 (≈ 9%) comparativement aux
cellules à J1 et J2 (≈6%). Les cellules traitées montrent des variations en sub-G1, S et pour les cellules
tétraploïdes qui restent dans la limite des variations observées pour les cellules non traitées, à
l’exception du traitement à J4 qui révèle une augmentation des cellules tétraploïdes. Par contre, nous
observons une diminution de la fraction des cellules en G1et une augmentation de la fraction des
cellules en G2/M induite par le 9944. Cet effet est clairement détectable à partir du 3ème jour. Mais la
tendance est observée dès J2. Ce résultat est en accord avec le ralentissement de prolifération induit
par le 9944 (6µM) observé entre J0 et J4 (Figure 67).
En conclusion, le traitement avec 9944 induit un blocage en G2/M détectable au 3ème jour,
accompagné par l’apparition d’une population tétraploïde des cellules MRC5V1 à partir du 4 ème jour
de traitement.
152
A.
B.
Figure 72. (A) Le cycle cellulaire analysé par cytométrie de flux des cellules non traitées et traitées au 9944 pendant
1,2, 3 et 4 jours. (B) Histogramme présentant les variations relatives induites par le 9944 par rapport au cellules non
traitées en G1 et en G2/M après 1, 2, 3 et 4 jours de traitement. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences
indépendantes.
La cinétique d’expression de ɣH2AX a été réalisée entre 2 heures et 4 jours sur des échantillons
traités et non traités (Figure 73). Il est à noter que suite à un problème technique nous n’avons pas pu
déterminer l’expression de l’actine. La coloration au rouge ponceau des protéines migrant à 42 kDa est
présentée. L’expérience présentée dans la figure 73A n’indique pas d’effet significatif du 9944 sur
l’expression ɣH2AX entre 2h et 24h. L’expérience présentée dans la figure 73B montre que le 9944
induit une augmentation de ɣH2AX détectable à J3 et J4. Ces résultats préliminaires, à confirmer par
des expériences complémentaires, suggèrent que le 9944 induit des dommages de l’ADN associés à
un arrêt en G2/M après 3 jours de traitement.
153
B.
A.
Figure 73. Analyse de la cinétique d’expression de ɣH2AX par western blot dans les cellules MRC5V1 non traitées
et traitées par le 9944 (6 µM), (A) entre 2h et 24h et (B) entre J1 et J4.
II.3.3. Effet du 9944 sur RPA et les télomères
Afin de comprendre et de caractériser plus finement l’effet du 9944 dans les cellules ALT, et
compte tenu de l’importance de RPA au niveau des télomères, nous avons analysé l’effet du 9944 sur
RPA.
II.3.3.1. RPA est présente dans les APBs des MRC5V1
Dans le but de mieux caractériser RPA dans les cellules MRC5V1, nous avons tout d’abord
précisé sa localisation par rapport aux APBs par des expériences d’immunofluorescence. Nous avons
utilisé comme marqueurs des APBs les protéines TopoIIIα (Figure 74) et PML (Figure 75). Le noyau
est marqué par le DAPI.
Les résultats présentés dans les figures 74 et 75 montrent la présence d’un signal nucléaire
diffus et de foyers de RPA, PML et TopoIIIα. Une partie des foyers de RPA colocalise avec les foyers
PML, ainsi qu’avec les foyers TopoIIIα (voir les flèches sur les figures). Le nombre de foyers de PML
ou de TopoIIIα qui colocalisent avec RPA varie d’un noyau à l’autre et représente environ 35% (±7)
pour RPA-PML et 52% (±4) pour RPA-TopoIIIα. Ces résultats indiquent que RPA colocalise
partiellement avec les APBs dans les MRC5V1, ce qui suggère une fonction possible sur une fraction
des télomères de cette lignée.
154
Figure 74. Colocalisation de RPA (rouge) avec Topo ΙΙΙα (vert) dans les cellules la lignée MRC5V1. L’ADN est coloré
par le DAPI (bleu). Les flèches indiquent la colocalisation des foyers de RPA et TopoIIIα
Figure 75. Colocalisation de RPA (rouge) avec PML (vert) dans les cellules la lignée MRC5V1. L’ADN est coloré
par le DAPI (bleu). Les flèches indiquent la colocalisation des foyers de RPA et PML
155
II.3.3.2. Effet du 9944 sur la localisation, l’expression et la phosphorylation de RPA
Nous avons ensuite étudié l’effet du 9944 sur la localisation de RPA aux APBs. Les cellules
sont traitées par le 9944 (6µM) pendant 4, 8 et 12 jours (voir paragraphe II.3.1.) et la localisation de
RPA par rapport à la protéine PML a été étudiée comparativement aux cellules non traitées aux mêmes
temps par immunofluorescence (Figure 76).
Note à l’attention des rapporteurs, ces résultats découlent d’observations qualitatives et d’une
première quantification préliminaire, une autre étude est en train d’être quantifiée et le résultat sera
inclus dans le manuscrit définitif.
A J4, nous n’observons pas d’effet majeur du traitement sur l’expression, le nombre de foyers
de RPA ou sur sa localisation par rapport à PML. Après 8 et 12 jours de traitement au 9944, une fraction
importante des cellules présente une augmentation notable des foyers RPA (Figures 76 et 77), ainsi
que dans la plupart des cas du marquage nucléaire diffus (Figure 76).
Ces observations suggèrent une augmentation de l’expression globale de RPA en réponse au traitement.
Les expériences d’immunofluorescence indiquent aussi une augmentation du nombre, de la
taille et de l’intensité des foyers PML (flèches jaunes sur la figure 76D) dans les cellules traitées par le
9944 à J12 par rapport au non traitées. Ce résultat pourrait refléter l’effet du 9944 sur les télomères aux
APBs et/ou sur le cycle cellulaire. Les données de la littérature indiquent en effet que les APBs sont
régulés au cours du cycle cellulaire et que leur taux est surtout important en G2/M (Yeager et al., 1999;
Grobelny et al., 2000, 2001).
De plus, nous n’observons pas de modification apparente du nombre de foyers de colocalisation
RPA-PML (voir les flèches sur la figure 76 et figure 77). Ces données indiquent que les foyers de RPA
apparus suite au traitement ne colocalisent pas avec PML et donc avec les APBs.
156
A.
B.
157
C.
D.
Figure 76. Effet du traitement au 9944 (6µM) sur la localisation de RPA (rouge) et PML (vert) sur les cellules
MRC5V1 : Cellules contrôles (A) ; Cellules après traitement par le 9944 à 4J (B), 8J (C), et 12J (D). Le noyau est
coloré par le DAPI (bleu).Le contrôle présenté en (A) correspond à un résultat représentatif des cellules non traitées
à J4, J8 et J12. (Flèches jaunes: foyers PML; flèches blanches: foyers de colocalisation RPA-PML).
158
Nombre de foyers
30
25
Contrôle
9944
20
15
10
5
0
RPA
PML
RPA-PML/PML
Figure 77. Quantification préliminaire de la moyenne du nombre de foyers de RPA, PML et des foyers de
colocalisation RPA-PML par rapport au nombre total de PML dans les cellules MRC5V1 non traitées et traitées
par le 9944 (6µM) à 12 jours
L’augmentation du nombre de foyers de RPA peut résulter de plusieurs facteurs : effets non
télomériques du 9944, modification du cycle cellulaire, altération de la ploïdie cellulaire, augmentation
de l’expression de RPA…
Nous avons tout d’abord étudié l’expression de la protéine RPA par western blot dans les
cellules traitées par le 9944. Les résultats présentés dans la figure (78A) montrent que l’expression de
RPA2 est fortement augmentée à J12. La quantification du niveau d’expression de RPA2 par rapport à
l’expression de la β-Actine (Figure 78B) indique une augmentation de RPA2 de 1,4 à J4 et de 2,4 à J12
par rapport au contrôle non traité. Ce résultat confirme l’observation par immunofluorescence et
indique donc que le traitement au 9944 induit une augmentation de l’expression globale de la protéine
RPA.
A.
B.
Figure 78. (A). Analyse de l’expression de RPA2 par western blot dans les cellules non traitées et traitées par le 9944
(6µM) à 4J, 8J et 12J. (B). Quantification de l’expérience de western blot présentée en (a). L’expression de RPA2 est
normalisée par rapport à l’expression de la β-actine et par rapport au signal des cellules non traitées. Le résultat de
quantification est représentatif de 2 expériences indépendantes
159
L’état de phosphorylation de RPA renseigne sur sa fonction dans les cellules. Lorsque RPA
intervient dans la réparation, elle est phosphorylée sur différents résidus de l’extrémité N-terminal de
la sous-unité RPA2. Un des sites de phosphorylation majoritaire est la Sérine 33 (S33) (Liu et al.,
2012). De plus, il a été démontré que RPA est phosphorylée sur les résidus S4/S8 suite à des dommages
de l’ADN, provoquant un blocage en G2/M (Liaw et al., 2011). C’est pourquoi nous avons étudié par
western blot le niveau de phosphorylation de RPA suite au traitement au 9944 à l’aide d’anticorps
spécifiques.
Le résultat présenté dans la figure 79A montre que l’expression de RPA2(S33) ne varie pas par
rapport au niveau d’expression de la β-Actine. Le traitement par le 9944 induisant une augmentation
de l’expression de RPA2, le taux de phosphorylation de la protéine diminue donc au cours du traitement
par le ligand (Figure 79B).
A.
B.
Figure 79. (A) Analyse de l’expression de RPA2(S33) et RPA2(S4/S8) par western blot dans les cellules non traitées
et traitées par le 9944 (6µM) à 4J, 8J et 12J. Des cellules traitées au Cis-platine sont utilisées comme contrȏle positif.
(B) Quantification de l’expérience de western blot présentée en (A). L’expression de RPA2 (S33) est normalisée par
rapport à l’expression de la β-Actine, de RPA2 et au signal des cellules non traitées. Le résultat de quantification est
représentatif de 2 expériences indépendantes
Une expérience préliminaire montre que le niveau d’expression de RPA2 (S4/S8) ne varie pas
par rapport à la β-Actine (Figure 79A).
En conclusion, ces expériences indiquent que l’effet à long terme du 9944 ne correspond pas à
une induction de la phosphorylation globale de RPA2 mais reflète apparement uniquement une
augmentation de l’expression de RPA.
160
II.3.3.3. Effets télomériques du 9944
Les expériences présentées dans le paragraphe précédent indiquent que le 9944 provoque une
augmentation de l’expression totale et du nombre de foyers de RPA, sans modifier la colocalisation de
RPA avec les APBs. De plus, une proportion importante des foyers de RPA ne colocalise pas avec les
APBs.
Nous avons également observé une augmentation du nombre et de l’intensité des foyers PML,
suggérant l’existence d’un effet du 9944 sur les APBs et donc sur les télomères dans ces cellules.
Afin de savoir s’il existe un effet réel du 9944 sur les télomères, d’une part et dans le but de
déterminer si les foyers de RPA induits par le 9944 sont localisés au niveau des télomères hors des
APBs, d’autre part, nous avons étudié par immunofluorescence l’expression et la localisation de TRF2,
et la colocalisation RPA-TRF2.
Cette expérience montre d’abord que, comme PML, le nombre de foyers de TRF2, leur intensité
et leur taille semblent augmenter sous l’effet du 9944 (Figure 80) (Quantification et confirmation en
cours).Ces données suggèrent fortement que le 9944 a un impact sur les télomères.
Comme dans le cas de PML, le traitement au 9944 ne semble pas modifier la colocalisation de
RPA avec TRF2. Ces résultats suggèrent que les foyers de RPA induits par le 9944 ne sont pas formés
aux télomères. Ceci suggère à nouveau l’existence d’un effet génomique non télomérique du
9944.Toutefois nous ne pouvons pas exclure la présence de RPA aux télomères dans le cas où ceux-ci
seraient extrêmement courts (signal TRF2 non détectable) ou déprotégés de TRF2.
161
Figure 80. Effet du traitement au 9944 (6µM, 12J) sur RPA (rouge) et TRF2 (vert) sur les cellules MRC5V1. Le
noyau est coloré par le DAPI (bleu). (Flèches jaunes : foyers TRF2 ; flèches blanches : foyers de colocalisation RPATRF2).
Compte-tenu de l’effet du 9944 sur PML et TRF2, nous avons voulu savoir si ce ligand induit
aussi un effet sur la longueur des télomères des cellules MRC5V1. Pour cela, nous avons réalisé
l’expérience de TRF (voir matériels et méthodes) sur des extraits d’ADN de cellules non traitées et
traitées par le 9944 à 4J et 12J (Figure 81).
Les cellules non traitées (4 et 12 jours) présentent des télomères de taille hétérogène qui varie
entre 23kb et 1kb, une caractéristique des cellules ALT. Les cellules traitées montrent également une
hétérogénéité de la taille télomérique. Cependant, elles présentent plus de télomères de grande taille
(>23kb) et une diminution des télomères courts (<2kb). Cet effet est particulièrement net à 12 jours.
162
D’une manière surprenante, ce résultat préliminaire semble indiquer que le 9944 induit un
rallongement des télomères, ce qui est le contraire de ce qu’on attendait, mais pourrait corrèler avec
l’augmentation du nombre de foyers TRF2 et PML induits par le traitement avec le 9944.
pb
pb
Figure 81. Analyse par TRF des extraits d’ADN des cellules non traitées (-) et traitées (+) par le 9944 après 4 et 12
jours de culture.
II.4. Discussion et perspectives
Arrêt de prolifération sans mortalité associée : sénescence ?
Les résultats que nous avons obtenus montrent que le 9944 induit un arrêt de prolifération
retardé de la lignée ALT MRC5V1, ce qui correspond à un phénotype observé pour de nombreux
ligands G4 sur des lignées cellulaires ALT ou télomérase positive et dénommé du terme génétique
«sénescence». En effet, de nombreux travaux associaient le phénomène de sénescence réplicative, dû
à l’érosion des télomères, au phénotype d’arrêt de prolifération induit par différents ligands G4, grâce
à la présence de marqueurs tels que l’induction de p21 et l’expression de SA-β-galactosidase.
163
De nombreux travaux ont montré que la sénescence pourrait être due à des facteurs
extrinsèques, comme par exemple la surexpression d’une protéine oncogène produisant une hyper
prolifération cellulaire initiale (stress réplicatif) ou l’accumulation de dommages à l’ADN (Trentesaux,
2010). Dans la plupart des cas, la sénescence réplicative est associée à un arrêt en G1/S du cycle
cellulaire et à une différenciation cellulaire.
Nos résultats de cycle cellulaire indiquent un blocage des cellules en phase G2, qui ne
correspond pas au phénotype classique décrit par la sénescence réplicative ou extrinsèque. Un blocage
du cycle cellulaire non typique de la sénescence a aussi été observé pour différents ligands G4 : le
RHSP4 induit une augmentation de la phase G2/M dans la lignée GM847 (Gowan et al., 2001), le
dérivé cyclique HXDV provoque un arrêt en mitose dans la lignée KB-3-1 (Tsai et al., 2009) et le
dérivé de triazine 12459 provoque un blocage en G2/M dans la lignée A549 (Douarre et al., 2013).
Des travaux récents ont remis en question le paradigme de l’arrêt en G1/S induit par l’érosion
des télomères dans des modèles de lignées non tumorales (Jullien et al., 2013). Ces travaux suggèrent
que des dommages post-réplicatifs au niveau des télomères peuvent conduire à un arrêt en G2/M, ce
qui peut conduire soit à une sénescence ou à une catastrophe mitotique en fonction des checkpoints du
cycle cellulaire de ces lignées.
Il serait particulièrement intéressant de poursuivre notre travail en déterminant l’expression de
marqueurs de sénescence tels que p16 et p19/ARF et/ou de SA-β-galactosidase, suite au traitement par
le 9944 de la lignée MRC5V1. (Ces cellules étant immortalisées par l’antigène T de SV40 qui inactive
les fonctions de p53, le marqueur de sénescence p21 n’est pas ici le plus adapté).
Le 9944, contrairement à d’autres ligands G4 comme le 12459 dans les cellules A549 (Douarre
et al., 2013), ou le 360A dans des modèles de gliomes (Pennarun et al., 2005), ne provoque pas
d’apoptose lors du traitement à long-terme (absence de sub-G1). De plus, les cellules traitées au 9944
ne montrent pas plus de 11% de perméabilisation cellulaire au bleu de trypan comparativement au
contrôle des cellules non traitées.
L’arrêt de prolifération sans mortalité associée induit par le 9944 n’exclut pas d’autres
mécanismes d’action cellulaires minoritaires comme la mort nécrotique ou l’induction d’une
autophagie conduisant à la mort cellulaire. En effet, un dérivé d’anthracènes (ANT 1,5) induit un arrêt
de prolifération provoquant une autophagie qui protégerait les cellules tumorales de dommages
164
télomériques persistants et de l’apoptose (Orlotti et al., 2012). L’absence d’apoptose après le traitement
par le 9944 pourrait résulter d’un tel processus et l’étude des principales voies de l’autophagie (mTOR,
beclin) pourrait compléter notre travail.
L’absence d’une voie p53 fonctionnelle dans les cellules MRC5V1 pourrait expliquer l’absence
de checkpoint G1/S. Il serait particulièrement intéressant d’étudier l’effet du 9944 dans un contexte
p53 positif, soit en réactivant la voie p53 dans la lignée MRC5V1, soit en utilisant un modèle ALT p53
positif (cellules U2OS par exemple). Enfin, il sera intéressant de déterminer la (ou les) voie(s) de
réponse de dommages de l’ADN impliquée(s) suite aux dommages induits par le 9944. Ceci sera
accompli en étudiant le taux d’expression et la phosphorylation des protéines impliquées dans les points
de contrôle du cycle cellulaire (ATM, ATR, Chk1, Chk2). Ces expériences permettront de mieux
définir le type de réponse aux dommages de l’ADN provoquée par le 9944.
Tétraploïdisation des cellules
Nous avons observé que les cellules MRC5V1 présentent une tétraploïdisation importante en
réponse au 9944, qui est précoce et croissante avec le temps de traitement, et observée de façon
concomitante avec les dommages de l’ADN et le blocage en phase G2.
Des résultats du laboratoire montrent aussi que le ligand dérivé de triazine, le 12459, induit un
phénomène de polypoïdisation dans la lignée A549, qui est dans un contexte a priori p53 positif.
Cependant ce ligand induit des ROS (Reactive Oxygen Species) qui activent PPMID/WIP1, une
phosphatase qui déphosphoryle p53 et Chk1. L’activation de PPMID/WIP1 équivaut donc à un blocage
de la voie p53. Un autre ligand G4, le HXDV, a aussi été décrit comme induisant la polyploïdisation
des cellules (Tsai et al., 2009).
Plusieurs mécanismes ont été décrits pour être à l’origine de la tétraploïdie : la fusion cellulaire,
l’absence de mitose et un blocage de la cytokinèse (Ganem et al., 2007). De plus, la tétraploïdie est
fréquemment observée dans les stades pré-tumoraux en association avec la perte de p53 et elle précède
l’aneuploïdie observée dans les tumeurs (Davoli et al., 2010). Récemment, plusieurs études ont montré
qu’une altération des télomères conduit à la tétraploïdisation, soit par une accumulation de dommages
télomériques dans des cellules murines déficientes en POT1a, soit au moment de la crise dans des
fibroblastes humains immortalisés par l’antigène T de SV40 (Figure 82) (Davoli et al., 2012; Davoli
165
et al.,2010). Ce mécanisme de tétraploïdisation correspond à une endo-reduplication des chromosomes,
c’est-à-dire l’absence de mitose entre deux phases de réplication de l’ADN.
Nos résultats avec le 9944 vont dans le sens d’un mécanisme d’endo-reduplication, puisque
nous observons une forte diminution des cellules en mitose, associée à l’apparition des cellules
tétraploïdes. A l’inverse, la polyploïdie observée avec le HXDV correspond à un blocage de la mitose
et correspondrait davantage à une absence de cytokinèse (Tsai et al., 2009).
Figure 82. La dysfonction télomérique favorise la tétraploïdie. (A) L’endo-reduplication après des
dommages d’ADN persistants dans les cellules déficientes en p53. (B) la tétraploïdisation due à un défaut
de la cytokinèse. Les deux mécanismes de tétraploïdisation provoquent une amplification des centrosomes
et une instabilité chromosomique (Varetti and Pellman, 2012)
Il sera donc aussi nécessaire de déterminer si la tétraploïdisation induite par le 9944 est
retrouvée dans un contexte p53 fonctionnel, ou si, comme le suggère le modèle proposé par l’équipe
de T. De Lange ( Davoli et al., 2010), elle n’est induite que dans le cas d’un blocage de la voie p53.
Dans les cellules MRC5V1, il serait intéressant de déterminer si l’augmentation de la phase G2
induite par le 9944 correspond à un blocage en G2 ou à une augmentation de durée de la phase G2. De
plus, il faudra déterminer si la tétraploïdie résulte d’une endo-reduplication et/ou d’un défaut de la
cytokinèse. Des expériences de vidéomicroscopie et de FISH (Fluorescence In Situ Hybrization)
permettraient de répondre à cette question.
Il sera également intéressant de connaitre le devenir des cellules tétraploïdes à long terme et de
savoir si l’induction de la polyploïdie leur permet de reprendre la division cellulaire ou s’il s’agit d’un
phénotype associé à l’arrêt de la prolifération cellulaire. Ceci pourra être évalué par des expériences de
166
tri cellulaire puis remise en culture des cellules tétraploïdes. Enfin, dans une perspective plus appliquée,
nous souhaitons tester la combinaison de différentes drogues avec le 9944. Nos résultats suggèrent en
effet que des poisons du fuseau mitotique ou des molécules génotoxiques pourraient avoir un effet
cytotoxique optimisé par un pré-traitement au 9944.
Effets génomiques et télomériques
Nous avons montré que le 9944 entraîne l’apparition de dommages de l’ADN, détectés par
western blot dès 3 jours de traitement. Dans un premier temps, il sera nécessaire de confirmer ces
résultats et de les compléter par la détection de foyers H2AX en immunofluorescence (expériences en
cours).
Puisque le 9944 induit des dommages à l’ADN, il est important de préciser la proportion de
dommages induits au niveau des télomères et en dehors des télomères. En effet, le 9944 provoque une
accumulation de RPA en dehors des APBs, suggérant l’existence de dommages non télomériques d’une
part, et une accumulation de foyers de PML et TRF2, indiquant un effet aux télomères d’autre part.
Cependant, il n’est pas exclu que cette augmentation soit due à la polyploïdisation induite par le 9944.
Celle-ci pourrait aussi expliquer l’augmentation du taux global de RPA détectée par western blot.
L’analyse quantitative des données d’immunofluorescence actuellement en cours nous permettra de
répondre au moins partiellement à cette question. Cependant, des expériences d’immunofluorescence
associant le marquage de nos protéines d’intérêt avec un marquage centromérique sera nécessaire pour
confirmer ou non cette hypothèse.
La fonction des foyers de RPA apparus après traitement au 9944 reste ambigüe. L’accumulation
de RPA est décrite lors de l’arrêt des fourches de réplication, lors de la réparation de l’ADN ou lors
des processus de recombinaison. Nos résultats de western blot n’indiquent pas d’augmentation globale
de certaines formes phosphorylées de RPA impliquées dans la réparation, ce qui n’exclut pas
l’existence de foyers de RPA phosphorylée au niveau de sites spécifiques du génome, détectables par
des techniques d’immunofluorescence (expériences en cours). Des expériences d’IF permettront aussi
de tester l’hypothèse de fourches de réplication bloquées ou d’évènements de recombinaison, en
associant un marquage de RPA avec celui de marqueurs spécifiques de ces deux phénomènes.
Notons que quelque soit le processus impliqué, des données montrant une absence de RPA
impliquée dans une réparation active des dommages seraient en accord avec les données publiées
167
concernant les ligands G4 : l’activation des voies de réponse aux dommages de l’ADN, détectée par
l’analyse en western blot des formes phosphorylées de p53, Chk1/Chk2 et ATM/ATR, est
généralement faible par rapport aux effets induits par des agents ciblant l’ADN de façon non spécifique
(Douarre et al., 2013, Trentesaux , résultats non publiés).
Le 9944 provoque aussi de façon surprenante une augmentation de la taille des foyers PML,
TRF2 et RPA dans une fraction des cellules après 8 et 12 jours de traitement. Ce résultat suggère une
altération de la composition des APBs. Dans la littérature, ce phénomène a été associé à l’effet des
protéines virales (Draskovic et al., 2009) et/ou à l’accumulation de protéines suite à un blocage de leur
dégradation par le protéasome (Everett et al., 1998). Dans notre cas, il sera important de préciser la
localisation de RPA par rapport aux télomères des APBs. L’analyse quantitative de la colocalisation
RPA/PML et RPA/TRF2 nous donnera des informations, mais ce sont des expériences de CHIP qui
permettront de savoir si RPA est en contact direct avec l’ADN télomérique pour enfin mieux
comprendre l’effet du 9944 sur RPA aux télomères dans ces cellules.
Enfin, l’altération de la structure des APBs pourrait expliquer l’effet surprenant que nous avons
obtenu dans notre expérience de TRF et qui correspond à une augmentation de la taille des télomères
induit par le 9944. Remarquons que nous ne pouvons pas exclure que le 9944 pourrait aussi induire un
raccourcissement télomérique, puisque nous avons observé que les télomères courts disparaissent suite
au traitement par le 9944. Des expériences de FISH télomérique sont prévues afin de confirmer ce
résultat. Il permettra également de détecter d’éventuelles anomalies au niveau des télomères comme la
fragilité ou les fusions télomériques.
168
Conclusion générales
169
170
Au cours de ma thèse, j’ai étudié les interactions RPA / G-quadruplexe / Ligands G4 dans deux
systèmes modèles in vitro et in cellulo.
L’étude in vitro du système RPA / G-quadruplexe a permis d’affiner le modèle proposé en
2006. En effet, plusieurs caractéristiques de l’interaction ont été mises en évidence :
-
nécessité d’une région simple brin pour la fixation de RPA
-
préférence de fixation de RPA du côté 3’ du G-quadruplexe
-
intervention des sous-unités RPA1 et RPA2
-
contact de RPA2 à l’extrémité 3’ et RPA1 du côté 5’
-
déroulement du G-quadruplexe de 3’ vers 5’.
Pour continuer à explorer les caractéristiques de cette interaction et son rôle aux télomères,
deux études en parallèle peuvent être réalisées : (i) étudier les interactions de RPA avec d’autres
séquences du génome capables de former des G-quadruplexes, afin de savoir si les caractéristiques
nommées ci-dessus sont spécifiques de la séquence télomérique humaine, ou bien généralisable à
l’ensemble du génome, et (ii) étudier les interactions de hPOT1 avec la séquence télomérique humaine,
en présence de RPA (étude compétitive) ou non (étude comparative).
Enfin, l’utilisation de ligands G4 dans cette étude in vitro a montré que ces derniers pouvaient
fortement inhiber (dans le cas de la Télomestatine et le 360A bromé) l’interaction RPA / G-quadruplexe
télomérique. Cette inhibition avait déjà été observée avec des G-quadruplexes non télomériques en
présence d’un autre ligand G4, le TMpyP4. Ces résultats laissent à penser que les ligands G4 pourraient
donc moduler l’interaction de RPA aux télomères, mais aussi dans le reste du génome où de nombreux
G-quadruplexes peuvent se former (PQS). L’étude in cellulo que j’ai réalisée sur l’effet du ligand G4
« 9944 », dans les cellules ALT et sur RPA dans les APBs, en est une bonne illustration.
En effet, dans un deuxième temps, nous avons mené une étude in cellulo et analysé l’effet du
ligand G4 « 9944 » dans les cellules ALT MRC5V1 et son impact sur l’expression et la localisation de
RPA dans ces cellules. D’une part, le 9944 possède un effet antiprolifératif dans les cellules MRC5V1,
caractérisé par un blocage du cycle cellulaire en phase G2 et associé à l’apparition d’une population de
cellules tétraploïdes, de façon concomitante à l’induction de dommages de l’ADN. D’autre part, nous
avons constaté que le 9944 a un impact sur les télomères. En effet, il affecte des protéines télomériques
constituantes des APBs des cellules ALT, PML et TRF2. De plus, nos expériences préliminaires
171
suggèrent que le 9944 affecte la taille des télomères. Nous avons suggéré que la tétraploïdie et le
blocage en G2 pourraient être liés à une dysfonction télomérique, une hypothèse qu’il nous reste à
démontrer.
Concernant RPA, nous avons montré qu’elle existe dans les APBs de la lignée MRC5V1.
Cependant, nous avons montré que le 9944 induit une surexpression de RPA hors des APBs, suggérant
que le ligand pourrait provoquer un blocage des fourches de réplication ailleurs dans le génome. Des
expériences complémentaires seront nécessaires pour préciser la part des effets du 9944 sur RPA aux
télomères ou ailleurs dans le génome.
En conclusion, nous avons proposé un modèle de liaison RPA / G-quadruplexe. Ce modèle
permettra d’envisager la synthèse de molécules qui pourront cibler spécifiquement RPA impliquée
dans le maintien des télomères des cellules cancéreuses. Par ailleurs, les effets des ligands G4 dans les
cellules dépourvues d’activité télomérase sont peu documentés. Notre étude a permis de caractériser
l’effet d’un nouveau ligand G4 dans les cellules ALT.
172
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Abstract
Telomeres play a critical role in genome stability, aging and cancer. Human telomeric DNA
consists of a duplex region composed of TTAGGG repeats, which terminates in a G-rich singlestranded overhang able to adopt secondary structures such as G-quadruplex (G4). The Goverhang could be elongated in cancer cells through telomerase or by alternative lengthening
of telomeres (ALT) pathway that corresponds to homologous recombination between telomeres
occuring in nuclear bodies called APBs (ALT-associated PML Bodies).
Human Replication Protein A (hRPA) is able to bind and unfold G4 in vitro. Furthermore
hRPA has been detected at APBs in ALT cells, although its role was not defined in telomere
recombination.
ALT pathway is found in 15% of cancer cells, hence the significance of targeting this
mechanism by small molecules such as G4 ligands.
Here, we investigated hRPA / G4 binding mechanism in vitro. Moreover, we studied the
effects of 9944, an ethidium derivative, on ALT cells and on the presence of hRPA in APBs.
Studies by gel shift, energy transfer and photochemical crosslinking allowed to suggest a
model in which hRPA binds the G4 from the 3’ side via the RPA2 subunit and unfolds it in the
3’ to 5’ direction, positioning the RPA1 subunit in the central part of the sequence. This allows
the binding of a second RPA at the 5’ extremity, via the RPA1 subunit.
In MRC5V1 ALT cells, we brought out that 9944 does not affect the hRPA localization in
APBs although it induces its overexpression outside of APBs. Otherwise, 9944 induces DNA
damage and triggers a G2 arrest driving to tetraploïdy. Furthermore, 9944 shows an impact on
APBs and seems triggering telomeres lengthening.
Résumé
Les télomères jouent un rôle important dans la stabilité génomique, le vieillissement et le
cancer. L’ADN télomérique humain consiste en une région double brin de séquence répétitive
TTAGGG se terminant par une extension simple brin riche en G, capable d’ adopter des
structures secondaires telles que le G-quadruplexe (G4). Les télomères sont répliqués soit par
la télomérase soit par un mécanisme de recombinaison homologue dit ALT (alternative
lengthening of telomeres) qui se déroulerait dans les corps nuléaires APBs (ALT-associated
PML Bodies).
La protéine de réplication A humaine (hRPA) est capable de lier et d’ouvrir le G4 in vitro.
De plus, hRPA a été détectée dans les APBs des cellules ALT, Cependant, son rôle dans la
recombinaison aux télomères est mal connu.
Le mécanisme ALT existe dans 15% des cellules cancéreuses, d’où l’intérêt de cibler ce
mécanisme par des petites molécules comme les ligands G4.
Nous avons étudié le mécanisme de liaison hRPA/G4 in vitro. De plus, nous avons étudié
l’effet du 9944, un dérivé d’éthidium, sur les cellules ALT et sur la présence de hRPA aux APBs.
Les études par gel retard, transfert d’énergie et pontage photochimique ont permis de
suggérer un modèle selon lequel hRPA se lie au G4 en 3’ via la sous-unité RPA2 provoquant
l’ouverture du G4 dans le sens 3’-5’ et positionnant RPA1 au centre de la séquence. Ainsi, une
deuxième molécule de RPA pourrait se lier en 5’ via RPA1.
Dans les cellules ALT MRC5V1, nous avons montré que le 9944 n’affecte pas la localisation
de hRPA aux APBs, mais induit sa surexpression hors des APBs. D’ailleurs, le 9944 induit des
dommages de l’ADN et un blocage en G2 provoquant une tétraploïdie. En outre, le 9944 a un
impact sur les APBs et semble favoriser l’élongation des télomères.

Etudes des interactions hRPA / G-quadruplexe / Ligands G4 aux

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