Déterminisme génétique de la qualité du bois chez le pin

Transcription

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ENSA de Rennes
Ecole Doctorale : Vie - Agronomie - Santé
N° attribué par la bibliothèque
Thèse
Présentée pour l ’obtention du diplôme de :
Docteur de l’ENSAR
Mention : Biologie et Agronomie
Par David Pot
Déterminisme génétique de la qualité du bois chez le pin
maritime : du phénotype aux gènes
Soutenance publique à Bordeaux le 6 janvier 2004
1
Membres du jury :
Président
Rapporteurs
Avignon
Examinatrice
Orléans
Examinateurs
M. G. Thomas
Professeur, ENSA Rennes
M. J. C. Glaszmann Directeur de recherches, CIRAD Montpellier
M. A. Palloix
Directeur de recherches, INRA
Mme C. Bastien Chargé de recherches, INRA
M. G. Chantre
Directeur Station Sud-Ouest, AFOCEL Bordeaux
M. D. DeVienne
Professeur, Université de Paris XI
M. C. Plomion
Directeur de recherches, INRA Bordeaux
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_
UMR Biodiversité, Gènes et Ecosystèmes BIOGECO 1202, INRA, Equipe de Génétique,
69, route d ’Arcachon, 33612 Cestas Cedex
Table des Matières
Introduction.......................................................................................................10
I- Le pin maritime : une espèce d ’intérêt devant s’adapter à une nouvelle
conjoncture économique et écologique...........................................................17
I.1- Aire de distribution et intérêt économique....................................................................17
I.2- De nouveaux objectifs à atteindre ................................................................................18
I.2.1- La qualité du bois....................................................................................................18
I.2.2- L ’adaptation au milieu..........................................................................................19
II- La Qualité du bois.......................................................................................23
II.1- Comment la définir ?....................................................................................................23
II.2- Comment la mesurer ?..................................................................................................24
II.3- Le bois : un matériau variable......................................................................................26
III- Sélection pour la qualité du bois chez le pin maritime..........................30
2
III.1- Gains génétiques pour la qualité du bois....................................................................30
III.2- Intégration de la qualité du bois au programme d ’amélioration du pin maritime :
espoirs et limites ..................................................................................................................33
III.3- Evolution du contrôle génétique de la qualité du bois au cours de la maturation.....35
III.4- L ’amélioration traditionnelle de la qualité du bois est possible, mais sera confrontée
à certaines limites.................................................................................................................37
IV- Architecture génétique de la qualité du bois chez le pin maritime.......41
IV.1- Etude de l ’architecture génétique de la qualité du bois chez les arbres forestiers...41
IV.2- Identification des zones chromosomiques impliquées dans la variabilité de la qualité
du bois chez le pin maritime.................................................................................................41
IV.2.1- A la recherche d ’un pedigree adapté à la détection de QTL pour la qualité du
bois....................................................................................................................................41
IV.2.2- Méthodes statistiques de détection de QTL........................................................42
IV.2.2.1- De l ’ANOVA aux algorithmes génétiques.................................................42
IV.2.2.2.- Signification statistique des QTL détectés..................................................44
IV.2.3- Des hot spots de QTL de qualité du bois détectés chez le pin maritime............45
IV.2.4- Vers une validation des régions chromosomiques impliquées dans la qualité du
bois....................................................................................................................................46
IV.3- Evolution de l ’architecture génétique de la croissance radiale et de la qualité du
bois au cours de la maturation et au cours de la saison de végétation.................................47
IV.3.1- Mise en évidence de clusters de QTL..................................................................48
IV.3.2- Un contrôle génétique stable au cours de la maturation ?...................................49
IV.3.3- Un contrôle génétique stable au cours de la saison ?..........................................50
IV.3.4- Un contrôle oligogénique des caractères ?..........................................................51
IV.3.5- Des zones chromosomiques communes agissant sur différents caractères ?.....51
IV.3.6- Un effet très important de la maturation, non seulement au niveau intra mais
aussi inter-caractères.........................................................................................................52
IV.4- Détection de QTL chez les arbres forestiers: un outil de recherche fondamentale,
mais des espoirs d’application limités................................................................................53
V- Identification des gènes impliqués dans la variabilité de la qualité du
bois : 1- A la recherche des gènes candidats pertinents................................58
3
V.1-
L’approche
indirecte
« du
gène
au
phénotype » :
une
stratégie
riche
d ’enseignements mais inadaptée à l ’identification des gènes responsables de la
variabilité naturelle...............................................................................................................58
V.2- Approche directe « du phénotype au gène »................................................................59
V.2.1- Le clonage positionnel : une méthode peu adaptée aux espèces à grand génome...
59
IV.2.2- L’approche gène candidat..................................................................................60
V.3- L’approche gène candidat : une stratégie pour identifier les gènes responsables de la
variabilité de la qualité du bois chez le pin maritime..........................................................60
V.3.1- Une multitude de candidats potentiels..................................................................60
V.3.2- Le polymorphisme des gènes candidats : d’un processus manuel très laborieux à
un pipeline de détection automatique des SNP ...............................................................62
V.3.3- La structure de la diversité nucléotidique, une indication de la pertinence des
gènes candidats ?..............................................................................................................63
V.3.4- La qualité du bois : un caractère adaptatif ?.........................................................64
V.3.5- Comment tester si un gène est neutre ou sélectionné ?........................................67
V.3.5.1- Si on a le temps…..........................................................................................67
V.3.5.2- A la recherche d ’empreintes de la sélection naturelle au niveau de la
diversité nucléotidique..................................................................................................68
V.3.5.3- Des diversités nucléotidiques faibles et comparables chez le pin maritime et
le pin radiata.................................................................................................................68
V.3.5.4- KORRIGAN, un gène soumis à la sélection naturelle ? ...............................69
V.3.5.5- Une Glycine Rich Protein (GRP) et une cellulose synthase présentent des
diversités nucléotidiques très différentes chez Pinus pinaster et Pinus radiata : une
empreinte de la sélection naturelle ou un reflet de la diversité neutre ?......................70
V.3.5.6- Des signes de sélection balancée détectés sur une déhydrine.......................72
V.3.5.7- Des structures de diversité nucléotidique variables invalidant l ’hypothèse
démographique.............................................................................................................73
V.3.5.8- Des gènes soumis à la sélection, porteurs d’une amélioration adaptative? .74
4
VI- Identification des gènes impliqués dans la variabilité de la qualité du
bois : 2- Associations entre les gènes candidats et la variabilité des
caractères ? .......................................................................................................78
VI.1- L’approche « Pedigree » : co-localisation gène candidat - QTL..............................78
VI.1.1- KORRIGAN : un gène clé de la qualité du bois ?...............................................79
VI.1.2- Les limites de l ’approche « Pedigree »..............................................................80
VI.2- L’approche « Population »........................................................................................80
VI.2.1- Recherche d ’associations au sein d’un demi-diallèle......................................81
VI.2.1.1- Pr2 : une protéine de réponse au stress hydrique impliquée dans le
déterminisme de la variabilité du bois ?.......................................................................82
VI.2.1.2- PAL : Une enzyme clé de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes
responsable de la variabilité observée pour le contenu en lignines ?..........................83
VI.2.1.3- CAD : un gène impliqué dans le déterminisme moléculaire de la densité ? . .
84
VI.2.1.4- Une Glycine Rich Protein associée à la variabilité de la composition
chimique des parois ?...................................................................................................84
VI.2.1.5- KORRIGAN : un mutant d ’Arabidopsis contrôlant la variabilité de la
qualité du bois chez le pin maritime.............................................................................85
VI.2.1.6- Mais des résultats sur des marqueurs neutres dérangeants…......................86
VI.2.2- Validation des résultats au sein d’un test clonal................................................88
VII- Conclusions et perspectives.....................................................................91
VII.1- L’amélioration génétique de la qualité du bois.......................................................91
VII.1.1- Une amélioration traditionnelle efficace mais non optimale.............................91
VII.1.2- Utilisation de la SAM pour améliorer l ’efficacité de la sélection pour la
qualité du bois...................................................................................................................91
VII.2- Identification des gènes contrôlant les caractères quantitatifs : une démarche
obligatoirement intégrative...................................................................................................93
VII.2.1- A la recherche de l ’explication moléculaire.....................................................96
VII.3- SAM et amélioration de l ’adaptabilité : deux objectifs incompatibles ?................97
Références Bibliographiques.........................................................................101
5
Annexes............................................................................................................123
6
Liste des annexes
Liste des annexes
Annexe 1 : Pot D., Chantre G., Raffin A., Rozenberg P., Rodrigues J-C., Da Silva Perez D.,
Plomion C. (2002). Perspectives d ’amélioration génétique de la qualité du bois du pin
maritime. Compte rendus du Colloque ARBORA. Bordeaux. Juin 2002.
Annexe 2 : Pot D., Chantre G., Rozenberg P., Rodrigues J-C., Jones Gwynn L., Pereira H.,
Hannrup B., Cahalan C., Plomion C. (2002). Genetic control of pulp and timber properties in
maritime pine (Pinus pinaster Ait.). Annals of Forest Science. 59: 563-575.
Annexe 3 : Pot D., Eveno E., Rodrigues J-C., Rozenberg P., Chantre G., Tibbits J., Cahalan
C., Pichavant F., Garnier Géré P., Plomion C. (2003). QTL and candidate gene mapping for
wood quality traits in Pinus pinaster. En préparation
Annexe 4 : Chagné D., Brown G., Lalanne C., Madur D., Pot D., Neale D., Plomion C.
(2003). Comparative genome and QTL mapping between maritime and loblolly pines.
Molecular Breeding 12: 185-195.
Annexe 5 : Le Provost G., Paiva J., Pot D., Brach J, Plomion P. (2003). Seasonal variation in
transcript accumulation in wood-forming tissues of maritime (Pinus pinaster Ait.) with
emphasis on a cell wall glycine-rich protein. Planta 217: 820-830.
Annexe 6: Pot D., McMillan L., Echt C., Le Provost G., Cato S., Plomion C. (2003).
Nucleotide variation in two pine species. Soumis à New Phytologist.
Annexe 7 : Le Dantec L., Chagné D., Pot D., Cantin O., Garnier-Géré P., Bedon F., Frigerio
J-M., Chaumeil P., Léger P., Garcia V., Laigret F., de Daruvar A., Plomion P. (2004).
Automated SNP detection in expressed sequence tags: statistical considerations and
application to maritime pine sequences. Plant Molecular Biology 54(3) : 461-470.
Annexe 8 : Brendel O., Pot D., Plomion C., Rozenberg P., Guehl J-M. (2002). Genetic
parameters and QTL analysis of δ13C and ring width in maritime pine. Plant, Cell and
Environment. 25 : 945-953.
Annexe 9 : Résultats des analyses de détection de QTL menées sur les données de cinétique.
Annexe 10 : QTL détecté pour les composantes « bois initial » et « bois final » de chaque
caractère.
NB : seules les annexes 9 et 10 sont fournies dans ce document.
7
8
Introduction
9
Introduction
Introduction
Les arbres forestiers constituent l ’une des composantes majeures de la biosphère. Leur bois,
qui est utilisé comme source d ’énergie, matériau de construction et produit de
consommation courante (papier…), est un matériau naturel renouvelable et respectueux de
l ’environnement. L ’accroissement rapide de la population mondiale va s ’accompagner
d’une augmentation des besoins en bois de l ’ordre de 20 à 30% dans les 20 prochaines
années (FAO). Si l ’on considère l ’étendue actuelle du domaine forestier mondial, il
faudrait accroître de 40% l ’exploitation des forêts naturelles afin d ’atteindre de tels
objectifs. Néanmoins, étant donné l ’importance écologique de ces dernières, d ’autres
issues doivent être recherchées. La solution pourrait être de « cultiver » les arbres forestiers
comme des espèces de grandes cultures. L’amélioration des techniques de sylviculture
combinée à la mise en place de programmes de sélection génétique a d ’ores et déjà permis
un accroissement significatif des capacités de production. Toutefois, pour répondre de façon
optimale à la demande, outre l ’amélioration de la productivité, la qualité du matériau
« bois » doit aussi être prise en compte.
La forêt française soutient une filière économique de premier plan dans laquelle le pin
maritime (Pinus pinaster Ait.) représente environ 25% de la production nationale de bois
résineux. Afin d ’accroître la compétitivité de la filière forêt-bois-papier en Aquitaine,
l ’INRA a développé depuis 1960 un programme de sélection génétique du pin maritime,
visant à augmenter la production et la qualité du bois (Baradat et Patuszka 1992). Le critère
de qualité a été essentiellement pris en compte au travers de l ’architecture de l ’arbre :
rectitude du fût et branchaison. Cependant, les propriétés intrinsèques du bois, c ’est- à-dire
la composition chimique, la morphologie des fibres et les propriétés physiques du matériau,
n’ont pas été prises en compte dans les index de sélection. Leur intégration paraît
aujourd ’hui impérative et ce pour plusieurs raisons :
l ’amélioration de la productivité et l ’abaissement consécutif de l ’âge de rotation
(de 60 à 40 ans) s ’accompagnent d’une augmentation du taux de bois juvénile dont
les propriétés intrinsèques sont inférieures à celles du bois mature
10
Introduction
des corrélations négatives ont souvent été mises en évidence entre productivité et
qualité de la ressource
les différents partenaires de la filière forêt-bois-papier sont demandeurs d’un produit
de base répondant à leurs attentes qualitatives :
o amélioration des propriétés physiques du bois pour le marché du bois
d’œuvre
o amélioration du rendement en pâte, des propriétés papetières et réduction des
coûts de production dans le cas de l ’industrie de la trituration.
Les sélectionneurs sont donc confrontés à de nombreuses interrogations : quels sont les
caractères à prendre en compte et comment les mesurer ? Quels sont les gains génétiques
possibles et comment sélectionner de manière efficace et rapide la qualité du bois ?
Dans ce contexte, deux projets subventionnés par l ’Union Européenne, GENIALITY
(http://www.skogforsk.se/GENIALITY) et GEMINI (http://www.pierroton.inra.fr/Gemini/),
ont été initiés afin d’apporter des éléments de réponse quant au déterminisme génétique de
la qualité du bois et de fournir aux sélectionneurs des outils de sélection adaptés à leurs
objectifs.
La première étape de ces deux projets a été la mise au point de méthodes de mesure des
différentes propriétés du bois et du papier. En effet, si certains protocoles de mesure étaient
déjà disponibles, ces derniers souffraient soit de leur imprécision soit de leur lourdeur. Les
collaborations initiées entre des équipes spécialisées dans la chimie, l ’anatomie et le papier
ont porté leurs fruits et ont permis la mise au point de méthodes précises et rapides de
caractérisation des propriétés du bois et du papier. Disposant de ces méthodes, l ’objectif a
ensuite été d’étudier la variabilité des propriétés du bois chez le pin maritime. C ’est à ce
niveau précis que cette thèse financée par l ’Union Européenne s ’inscrit.
Dans un premier temps, les paramètres génétiques classiques (héritabilités et corrélations
génétiques) ont été estimés afin de définir les gains génétiques possibles et les conséquences
11
Introduction
induites par l ’amélioration de ces différentes propriétés. Si ces informations sont suffisantes
pour estimer l ’efficacité de la sélection dans le cas d ’espèces annuelles, chez les arbres
forestiers, il est par contre indispensable de définir par ailleurs quelles sont les corrélations
juvénile-adulte. Ces dernières vont en effet conditionner en grande partie l ’efficacité de la
sélection en autorisant ou non une sélection précoce des meilleurs génotypes.
Cependant, même si des gains génétiques significatifs peuvent être obtenus grâce à la
sélection traditionnelle, ils pourront encore être optimisés grâce à la compréhension précise
du déterminisme génétique de la variabilité de la qualité du bois et l ’identification de
marqueurs diagnostiques des propriétés adultes utilisables de façon très précoce.
Le développement des techniques de biologie moléculaire offre dorénavant un accès à
l ’étude fine du fonctionnement du génome. C ’est grâce à la disponibilité de tels outils
qu ’une démarche visant à identifier les gènes responsables de la variabilité de la qualité du
bois a été initiée.
Dans un premier temps, une étude de l ’architecture génétique a été mise en place au sein
d’un pedigree de cartographie afin d ’identifier les zones chromosomiques impliquées dans
le contrôle génétique de la variabilité qualité du bois (QTL), leur dynamique d ’expression
au cours de la maturation et en fonction des conditions environnementales.
Néanmoins, ces informations sont insuffisantes pour identifier précisément les gènes et pour
fournir des marqueurs chez les espèces non domestiquées, telles que les arbres forestiers.
Aussi, une approche « gène candidat » visant à identifier non plus uniquement les zones
chromosomiques mais directement les gènes responsables de la variabilité observée a-t-elle
été initiée. La mise en place d ’une telle approche a été possible grâce aux nombreuses
études qui ont été développées ces dernières années pour comprendre la formation du bois.
Ces dernières ont permis l ’identification de nombreux gènes impliqués dans les différentes
étapes de la xylogénèse (formation du bois). L’étude simultanée de l ’ensemble des gènes
candidats n ’étant pas envisageable, les meilleurs d ’entre eux doivent donc être identifiés
préalablement à la mise en place d’expériences permettant de tester leur implication dans la
variabilité observée.
12
Introduction
Certaines composantes de la qualité du bois semblent avoir une importance adaptative ; en
d’autres termes, elles sont soumises aux effets de la sélection naturelle. Dans ce cadre, les
gènes impliqués dans leur contrôle génétique doivent donc présenter des empreintes de ces
pressions de sélection. Ainsi, afin de restreindre la liste de gènes candidats disponibles, une
stratégie visant à identifier les gènes présentant des signes de déviation par rapport à la
neutralité sélective a été initiée.
Les gènes intéressants ont ensuite été cartographiés et leur position comparée à celle des
QTL. Si cette étape fournit des informations quant à l ’implication probable de certains
gènes dans le contrôle génétique des caractères étudiés, elle ne permet pas une identification
certaine de ces gènes et nécessite donc des validations. Des tests d ’associations mettant en
jeu plusieurs individus non apparentés ont ainsi été utilisés pour tester la validité des
associations observées dans le pedigree de cartographie et la validité du choix des gènes
candidats.
Ce manuscrit s ’articulera autour de 7 chapitres qui nous mèneront progressivement de la
définition de la qualité du bois du pin maritime à l ’identification de gènes potentiellement
impliqués dans son déterminisme génétique.
Les deux premiers chapitres replacent cette étude dans un contexte plus global. Il s ’agira
notamment de rappeler les aspects économiques et écologiques sous-jacents à la forêt de pin
maritime ainsi que la qualité du bois dans un contexte de filière.
Dans le troisième chapitre, les gains génétiques espérés pour les différentes composantes de
la qualité du bois seront estimés et les contraintes liées à leur amélioration seront présentées.
Le quatrième chapitre présentera les résultats issus de l ’étude de l ’architecture génétique
de la variabilité des caractères quantitatifs liés à la qualité du bois et mettra en évidence les
limites d’une telle approche dans un contexte d’utilisation des résultats comme outils de
sélection.
Le chapitre V traitera de l ’identification des gènes impliqués dans le déterminisme
génétique de la qualité du bois et plus précisément de l ’étape de définition des gènes
candidats les plus pertinents.
13
Introduction
Au cours du chapitre VI, la validité des gènes candidats identifiés sera testée au travers de 2
approches distinctes mises en place sur deux dispositifs déconnectés. La pertinence des
résultats obtenus sera discutée par rapport aux informations disponibles par ailleurs sur ces
gènes.
Le chapitre VII, conclura ce manuscrit et s ’attachera à présenter d ’une part les nouvelles
perspectives d’études qu ’ouvre ce travail et les questions qu ’il pose.
Une partie des travaux réalisés dans ce document a d’ores et déjà fait l ’objet d’articles
publiés ou soumis qui sont indiques dans la liste d ’annexes (1 à 8). Le lecteur pourra dans
un premier temps lire la synthèse rédigée en français puis se référer aux articles pour accéder
à un niveau de détail plus fin. La synthèse a volontairement été allégée d’une description
complète des matériels et méthodes utilisées dans les différentes phases d ’études, leur
description précise est fournie au sein des articles indiqués dans la liste d’annexe.
Néanmoins lorsque les matériels et méthodes utilisés sont sujets á discussions, leur critiques
et justifications ont été présentées au sein de cette synthèse.
14
15
Chapitre I- Le pin maritime : une espèce d ’intérêt devant
s’adapter à une nouvelle conjoncture économique et écologique
16
I- Le pin maritime
I- Le pin maritime : une espèce d ’intérêt devant s ’adapter à
une nouvelle conjoncture économique et écologique
I.1- Aire de distribution et intérêt économique
Le pin maritime (Pinus pinaster Ait., Figure 1) appartient à la classe des Gymnospermes qui
est l ’un des plus anciens groupes de plantes supérieures. En 200 millions d’années, le
genre Pinus, auquel appartient le pin maritime, a colonisé l ’ensemble de l ’hémisphère
Nord, en se différenciant en une centaine d’espèces adaptées à des niches écologiques très
diverses (Richardson 1998). Le pin maritime a une aire de distribution naturelle de 4
millions d’hectares très fragmentée (Figure 2A) s ’étendant du Nord-Ouest de la France à la
Tunisie en passant par l ’Espagne, le Portugal, le Maroc, la Corse et l ’Italie. Cette aire
naturelle de répartition inclut des conditions climatiques très variables, de 100 mm de
précipitation à Oria (en Espagne) jusqu ’à plus de 1000 mm à Tova (en Corse), et des
environnements pédologiques allant du sable aux sols rocheux. Cette espèce a aussi été
introduite avec succès dans d ’autres parties du monde (Figure 2B) : au Chili (100 000 ha),
en Australie (500 000 ha), en Afrique du Sud (40 000 ha), en Grèce (10 000 ha), en
Nouvelle-Zélande (3000 ha) et en Argentine.
Son introduction réussie dans des pays éloignés de son aire naturelle de répartition témoigne
d’une part de l ’intérêt économique qu ’elle constitue, mais aussi de son adaptabilité à des
environnements variables. En France, le pin maritime est la première espèce de conifères
cultivée en terme de surface plantée (1,4 millions d’hectares) et de rendement (8,3 millions
de m3 par an). Avec 1 million d’hectares, le massif forestier des Landes de Gascogne
constitue l ’une des plus grandes forêts industrielles d’Europe.
Face à l ’accroissement des besoins en bois de l’industrie prévu au cours du XXIeme siècle
(FAO), les forêts cultivées principalement dévolues à une fonction de production auront un
rôle de plus en plus important à jouer. Dans cette logique, le programme d’amélioration
génétique du pin maritime vise d’abord à augmenter la productivité : le gain génétique
attendu sur le volume est de 30% pour les variétés améliorées actuellement commercialisées
en Aquitaine, et sera de 40 à 45% pour les prochaines variétés en cours de multiplication (en
référence aux témoins non améliorés) (Rapport interne du Groupe d ’Intérêt Scientifique «
17
I- Le pin maritime
pin maritime du futur »). Ceci se traduit par une réduction attendue des cycles
d’exploitation de 50-60 ans à 35-40 ans, ainsi que par une meilleure rentabilité de la filière
forêt-bois-papier.
Simultanément, la sélection a également visé une meilleure qualité du produit via
l ’amélioration de la rectitude du fût. En effet, la flexuosité basale du fût constitue le
problème majeur du pin maritime. Ce défaut de forme dévalue l'utilisation de la bille de pied
en bois d'œuvre (rendement au sciage). Il entraîne aussi une hétérogénéité du produit due à
la présence de bois de compression, ce qui induit une diminution des propriétés physiques du
matériau et une baisse de rendement en pâte. L ’obtention d ’une meilleure homogénéité du
bois au travers d’une amélioration de la rectitude reste la première demande qualitative de
la filière. Elle passe essentiellement par l ’utilisation de techniques sylvicoles adaptées
(densité de plantation, élagages, éclaircies) et par l ’amélioration génétique (Une description
détaillée du programme d amélioration du pin maritime a été présentée au sein du document
rédigé par le groupe « Pin maritime du futur » et est disponible sur le site :
http://mediaforest.net/francais/sciences/gis.htm).
Les
nouvelles
variétés
améliorées
fournissent un gain génétique de 30% sur la rectitude, qui devrait passer à 35% pour les
prochaines variétés, et au-delà de 40% pour la variété d ’hybrides « Landes x Corse »,
toujours en référence aux témoins non améliorés (Des données détaillées sur le
développement de l ’utilisation de graines et de plants améliorés sont présentées au sein du
document rédigé par le groupe « Pin maritime du futur »).
I.2- De nouveaux objectifs à atteindre
I.2.1- La qualité du bois
Bien que le programme de sélection du pin maritime ait pris en compte les attentes premières
de la filière forêt-bois-papier (productivité et forme), la qualité intrinsèque du bois n’a pas
été directement utilisée comme critère de la sélection. De plus, la baisse de l ’âge de rotation
s ’accompagne d ’une augmentation significative de la proportion de bois juvénile, aux
propriétés inférieures à celles du bois mature (Figure 3). Par ailleurs, l ’expérience acquise
dans le domaine de la sylviculture et de la génétique indique un lien défavorable entre
croissance et qualité du bois chez le pin maritime. Ainsi, ne pas prendre en compte les
critères de qualité intrinsèque du bois risquerait de conduire à terme à une diminution de sa
18
I- Le pin maritime
qualité. Les industriels auraient donc à leur disposition une matière première dont les
caractéristiques chimiques et technologiques ne seraient pas forcément les mieux adaptées
aux procédés de transformation, ce qui pénaliserait la compétitivité du massif aquitain, en
dépit des capacités d ’adaptation de l ’outil industriel.
Le faible effort consacré jusqu ’à aujourd’hui à l ’amélioration génétique de la qualité
intrinsèque du bois est assez général chez les arbres forestiers et ce malgré des avantages
certains : héritabilité élevée et bonnes corrélations juvénile-adulte. Le problème réside
d’une part dans l ’absence de prédicteurs facilement utilisables en routine pour mesurer des
milliers d’arbres à un coût raisonnable, et d’autre part dans la multiplicité des composantes
à sélectionner (chimiques, anatomiques, physiques, technologiques…) pour améliorer ce
caractère complexe qu ’est la qualité du bois.
Un autre défi auquel doivent faire face les améliorateurs de plantes pérennes tels que les
arbres forestiers est de prévoir l ’évolution des attentes de la filière dans les décennies
futures : Comment se définira la qualité du bois dans 10, 20 30 ans ? Ce sont les travaux
initiés aujourd ’hui qui devront permettre de répondre a ces attentes futures.
I.2.2- L ’adaptation au milieu
Les climatologues prédisent des changements du climat au cours du 21ème siècle (Briggs et
Walters, 1997). Ces bouleversements devraient intervenir sur une échelle de temps
correspondant au temps de génération des espèces forestières. Les variétés améliorées de pin
maritime devront donc faire face à de telles modifications. Il est donc primordial de fournir
aux acteurs de la filière forêt-bois-papier des variétés capables de réaliser les gains
génétiques espérés dans ces nouvelles conditions environnementales. La capacité
d ’adaptation des variétés améliorées dépendra à la fois de leur plasticité physiologique mais
aussi de leur diversité fonctionnelle au niveau des gènes contrôlant les caractères adaptatifs.
Des approches d ’expression différentielle au niveau du transcriptome et du protéome ont
déjà été engagées afin de d ’identifier les gènes impliqués dans la réponse au stress hydrique
chez cette espèce (Costa et al. 1998, Dubos et al. 2001, 2003a,b). D ’autres sont en cours
afin d’estimer leur niveau de diversité, et ainsi apporter des informations quant à leur
implication véritable dans des processus adaptatifs (Bedon 2002, cette thèse).
L’estimation de la capacité d’adaptation des populations d ’arbres forestiers aux
modifications de leur environnement ne peut être que prospective étant donné que les
19
I- Le pin maritime
hypothèses de départ ne sont pas claires : quel type de stress, sur quelle durée… Néanmoins,
nous verrons par la suite que les travaux menés sur la qualité du bois s ’avèrent aussi
pertinents pour fournir des informations sur le potentiel adaptatif des arbres.
20
21
Chapitre II- La Qualité du bois
22
II- La qualité du bois
II- La Qualité du bois
On se réfèrera à l ’annexe 1 présentée à la fin de ce manuscrit pour plus de détails sur cette
partie.
II.1- Comment la définir ?
Dans le cas du bois, matière première dévolue à de multiples usages, la qualité (aptitude à
satisfaire un besoin) doit répondre aux attentes des différents acteurs de la filière forêt-boispapier. 60% de la production de pin maritime sont destinés à l ’industrie du bois d ’œuvre et
40% à l ’industrie de la trituration (pâte, papier, panneaux de process) (Figure 4). Ces deux
grands types de valorisation présentent des cahiers des charges plus ou moins différents, qui
prennent en compte des propriétés du bois communes ou spécifiques.
Les attentes qualitatives de l ’ industrie papetière sont dirigées vers la composition chimique
du bois et la résistance des fibres. Celles de l ’industrie du bois d’œuvre sont en revanche
essentiellement axées sur l ’homogénéité du bois, les propriétés mécaniques et la
branchaison. Ces attentes correspondent à des caractères complexes mettant en jeu une
kyrielle de caractéristiques anatomiques et chimiques. Or, l ’amélioration d’un caractère
complexe n’est efficace que si l ’ensemble des composantes sous-jacentes est identifié et
leurs contributions au caractère composite évaluées. Plusieurs équipes françaises (dont
l ’INRA et l ’Association FOrêt CELlulose « AFOCEL ») et étrangères (Instituto Superior
de Agronomia « ISA » Lisbonne) se penchent actuellement sur ces questions en menant des
recherches sur le pin maritime. Les tendances suivantes commencent à se dégager :
La densité du bois, de par son influence sur les propriétés mécaniques du matériau et
ses relations avec la plupart des caractéristiques papetières est sans aucun doute le
caractère clé de la qualité du bois (Zobel et Jet 1995). De plus, sa variabilité intraarbre (bois juvénile vs. bois mature et bois initial vs. bois final) est avec la rectitude
du fût une composante essentielle de l ’homogénéité du bois.
L’orientation des microfibrilles de cellulose dans la paroi S2 est également un
caractère de premier plan. Son rôle dans la résistance des fibres et des propriétés
mécaniques du bois a été largement mis en évidence.
23
En ce qui concerne spécifiquement le bois d’œuvre, la propriété mécanique majeure
recherchée concerne la rigidité du bois, une raideur importante garantissant une
faible déformation en flexion.
L’ angle du fil du bois qui influence directement la stabilité dimensionnelle, et
indirectement la qualité des sciages semble être un caractère inévitable.
les critères de branchaison (nombre de verticilles et de branches par verticille,
diamètre et angle d’insertion des branches) sont également importants, tant d’un
point de vue mécanique (Module de Rupture : MOR) qu ’esthétique (présence de
nœuds).
Enfin, de par leur importance dans la qualité de la pâte et des panneaux de process
(thermoformage, interactions bois-polymères, etc.), la composition chimique et
notamment les teneurs en lignines, cellulose et extractibles ainsi que la
morphologie des fibres (longueur, diamètre, masse linéique) constituent des
caractères incontournables.
Si ces critères sont essentiellement ciblés vers les deux utilisations majeures du bois que sont
le papier et le bois d œuvre, la compréhension fine de leur variabilité devrait aussi être utile
dans le cas ou les qualités recherchées par la filière évoluent de façon radicale dans le futur.
En effet ces caractères correspondent a des caractéristiques générales du bois : de quoi est il
constitué ? Quelle est la variabilité de sa structure ? Et comment ces différentes composantes
interagissent pour mener a des bois de caractéristiques différentes ? Ces propriétés peuvent
en effet être considérées comme les caractères de bases su bois, or ces connaissances de
bases seront toujours utiles mêmes dans le cas ou les cibles de la sélection deviennent
beaucoup plus pointues.
II.2- Comment la mesurer ?
Etant donné leur coût élevé, les méthodes traditionnelles de mesure des propriétés physiques
et chimiques du bois ne peuvent être utilisées que pour caractériser des petites séries
d’échantillons. Il est clair que l ’intégration de la qualité du bois au sein d’un programme
de sélection doit faire appel à des méthodes de mesure d’une part fiable, mais aussi faciles à
mettre en œuvre et peu coûteuses. Les composantes de la qualité du bois précédemment
citées ont donc fait et font encore pour certaines d ’entre elles, l ’objet d ’optimisations tant
24
au niveau qualitatif (précision des mesures) que quantitatif (réduction des coûts et rapidité de
la mesure sur des milliers d ’échantillons) :
La rectitude du fût qui a toujours été une cible de la sélection, est mesurée de façon
précise et rapide au travers de l ’écart à la verticalité basale (mesurée en cm).
En ce qui concerne les critères de branchaison, pour lesquels des mesures
quantitatives seraient trop longues à mettre en œuvre, des tests visant à estimer la
fiabilité de notations visuelles (peu coûteuses et rapides) sont actuellement en cours
(programme prioritaire du GIS Pin Maritime du Futur).
La densité du bois et son hétérogénéité peuvent aujourd ’hui être estimées de façon
rapide et précise sur des carottes de petite taille dont le prélèvement ne nuit pas à
l'arbre. La méthode qui permet de décrire le plus finement les variations de densité du
bois sur un rayon (du cœur vers l'écorce) est la microdensitométrie. Des planchettes
fines d'épaisseur constante sont découpées dans chaque carotte puis radiographiées
aux rayons X. Les variations des niveaux de gris sur la radiographie sont alors liées à
la densité de fibres et à l ’épaisseur de leur paroi.
La mise au point de différentes méthodes de mesure du module d ’élasticité est
actuellement en cours : BING (Beam Identification by Non destructive Grading)
(Laboratoire de Rhéologie du Bois de Bordeaux LRBB : S. Casagrande), Hitman
(Forest Research, Rotorua, Nouvelle Zélande), Rigidimeter (Launey et al. 2002).
Elles devraient permettre d ’apprécier rapidement la rigidité du bois, aussi bien sur
pied (Rigidimeter) que sur les billons coupés (Hitman) ou sur des éprouvettes de bois
en laboratoire (BING).
Les mesures de morphologie des fibres (longueur, diamètre, courbure, masse
linéique) autrefois très lourdes à réaliser (micrographie) peuvent être aujourd ’hui
réalisées rapidement et à faible coût grâce à des appareils d’analyse d ’image
numérique en continu qui permettent d’évaluer simultanément la longueur, la
largeur, la masse linéique et la courbure de plusieurs milliers de fibres en quelques
minutes.
La mesure de l ’orientation des microfibrilles de cellulose encore coûteuse fait
actuellement l ’objet de développements en Australie (R. Evans : Silviscan,
25
http://www.forestry.ubc.ca/events/RobEvans2002/ROBEVANS.pdf), en France (P.
Perré, LERMAB, Nancy) et en Angleterre (M. Jarvis, Glasgow University).
En ce qui concerne l ’angle du fil du bois, une méthode rapide de mesure a été
développée au Forest Research Institute (Rotorua, Nouvelle Zélande) et sera bientôt
testée sur le pin maritime.
Enfin pour ce qui est de la détermination de la composition chimique du bois, la
technique SPIR (Spectrométrie Proche Infra-Rouge) utilisée dans le contrôle de la
qualité des aliments, a été adaptée à la pâte à papier et au bois brut de pin maritime
par l ’AFOCEL et l ’ISA. Cette technique permet de doser très rapidement des
composés tels que la cellulose, les lignines, les extractibles.
Des tests pour mesurer les propriétés physiques de la pâte à papier et du papier
ont été développées par l ’AFOCEL au sein du projet européen GEMINI. L ’objectif
est de mettre à jour des relations précises entre la structure du bois, la morphologie
des fibres, la composition chimique et les propriétés physiques des pâtes et du papier.
Bien qu elles soient pour certaines d’entre elles encore en cours d ’études, les corrélations
obtenues entre les mesures indirectes et directes des composantes de la qualité du bois se
révèlent très élevées. Il est de plus intéressant de noter que dans certains cas les mesures
indirectes se révèlent plus précises que les mesures directes, c ’est notamment le cas pour
l ’estimation de la composition chimique via la SPIR.
II.3- Le bois : un matériau variable
Le bois de pin maritime est constitué majoritairement d’un type cellulaire : les trachéides
(ou fibres) dont la paroi est essentiellement composée de cellulose, d’hemi-celluloses et de
lignines et en moindre quantité de protéines et d’extractibles. Les performances d ’une fibre
ou d’un groupe de fibres utilisés dans une application précise (bois d ’œuvre, pâte,
matériaux composites) dépendent de plusieurs paramètres incluant leurs propriétés
intrinsèques : composition chimique, propriétés physiques individuelles, interactions fibresfibres… Ces propriétés sont sous la dépendance de différents facteurs dont le génotype, les
effets environnementaux (Figure 5), les effets de maturation (Figure 4) et leurs interactions.
L‘amélioration de la qualité des fibres et donc plus généralement du bois ne sera donc
26
pleinement efficace que lorsque les effets de ces différents facteurs auront été étudiés et
quantifiés. La qualité du bois peut donc être résumée sous la forme d ’une équation multifactorielle conditionnelle :
QB= f (chimie, propriétés physiques…/ G, E, M, Interactions)
où G est l ’effet du génotype, E l ’effet de l ’environnement, M l ’effet de la maturation et
Interactions, les interactions entre ces différents facteurs.
L’un des objectifs de cette thèse est d’estimer les importances respectives de ces différents
effets sur la qualité du bois et d’en déduire les gains génétiques possibles sur les différentes
composantes de la qualité du bois.
27
28
Chapitre III- Sélection pour la qualité du bois chez le pin maritime
29
III- Sélection de la qualité du bois
III- Sélection pour la qualité du bois chez le pin maritime
La densité est de loin la propriété du bois qui a été la plus étudiée. Son contrôle génétique est
essentiellement additif et son niveau de variation est suffisant pour permettre des progrès par
sélection (Tableau 1). Néanmoins, hormis ce caractère qui a été étudié de façon intensive
chez la plupart des espèces forestières d ’intérêt économique peu de données sont
actuellement disponibles sur les paramètres génétiques des autres composantes de la qualité
du bois. Au cours de cette thèse, cinq groupes de caractères devant permettre de décrire de
façon précise la qualité du bois du pin maritime ont été étudiés : croissance, caractères
impliqués
dans les propriétés mécaniques du bois, composition chimique, paramètres
industriels de production de pâte Kraft et propriétés des fibres (Tableau 2). Les autres
caractères d’intérêt que sont la branchaison, l ’angle du fil du bois, l ’angle des
microfibrilles… n’ont pas été mesurés mais devront être intégrés aux prochaines études.
III.1- Gains génétiques pour la qualité du bois
Afin d’estimer les gains génétiques pour la qualité du bois, un demi-diallèle 12 x 12 âgé de
14 ans a été analysé pour les cinq groupes de caractères cités ci-dessus. Les 591 individus
analysés sont issus de 12 géniteurs contrastés quant à leur productivité et faisant partie de la
première génération (G0) du programme d’amélioration. Cet échantillonnage doit permettre
une bonne estimation de la variabilité présente au sein de la population d ’amélioration et
par conséquent une estimation correcte des gains génétiques attendus. Par ailleurs, l ’âge de
ce dispositif (> 12 ans) nous permet d ’avoir une bonne estimation des corrélations entre
qualité du bois et croissance. En effet, la sélection pour la croissance est actuellement
effectuée vers 12 ans, les corrélations juvénile-adulte étant trop faibles auparavant (Kremer,
1992).
L’ensemble des résultats issus de cette analyse a été présenté dans 2 articles publiés, l ’un
dans les Comptes Rendus des Conférences ARBORA (annexe 1) et l ’autre dans Annals of
Forest Science (annexe 2). Les articles étant disponibles en annexe, seuls les résultats
marquants ainsi que leurs limites seront présentés ici.
Chez le pin maritime, comme chez les autres conifères, les caractères de qualité du bois
présentent des variabilités phénotypique et génétique faibles, bien inférieures à celles
30
observées pour la croissance et la rectitude du fût (Tableau 2). Des analyses
complémentaires menées par l ’AFOCEL sur 67 clones G0 (taux de lignines) issus de la
première génération d ’amélioration ont permis de montrer que les estimations de variabilité
phénotypique obtenues sur le diallèle sont représentatives de celles observées au sein de la
population d’amélioration.
Des effets génétiques significatifs, essentiellement d’origine additive, ont été détectés pour
la croissance, la rectitude, les composantes de la densité, les teneurs en lignines et en alphacellulose ainsi que pour la morphologie des fibres (Tableau 2). Les héritabilités obtenues
sont généralement comprises entre 0,2 et 0,5 avec les valeurs les plus élevées pour
l ’hétérogénéité du bois (0,509) et la teneur en lignines (0,471). Cependant, pour sept
caractères, aucun effet génétique n ’a été détecté (Tableau 2). Ces résultats peuvent
s ’expliquer de trois façons :
i)
une absence réelle d ’effet génétique (peu probable),
ii)
une précision de mesure trop faible. C ’est sans doute le cas en ce qui
concerne la densité mesurée à l ’aide du pylodin,
iii)
une variabilité phénotypique trop faible pour permettre la détection d ’un
effet génétique, étant donné le faible nombre d ’arbres analysés. C ’est sans
doute le cas pour le rendement en pâte et la teneur en hémi-cellulose.
Une comparaison des héritabilités obtenues au sein de ce plan de croisement avec celles
obtenues dans d ’autres essais et sur d’autres espèces (Tableau 3) a été présentée dans
l ’annexe 2. Les analyses complémentaires menées au sein du projet Européen GEMINI sur
le pin maritime sont en cours d’analyse. Globalement, malgré un biais possible des résultats
obtenus sur le demi diallèle en raison d’une croissance effectuée dans des conditions
stressantes qui peut engendrer des modification d ’h éritabilités et des corrélations génétiques
(la croissance de cet essai est effectivement faible par rapport a la croissance normale
d’arbres de même âge) les résultats préliminaires obtenus sur les autres essais sont
cohérents avec ceux obtenus lors de cette étude (Tableaux 4 et 5).
Les résultats issus du test factoriel de Tronquats, ont permis de vérifier les héritabilités
faibles à moyennes des propriétés des fibres (0,2 à 0,3). Cependant, les corrélations
génétiques observées entre croissance et morphologie des fibres contredisent celles acquises
31
dans cette étude. Des études complémentaires vont donc être nécessaires pour vérifier ces
liaisons génétiques.
Au niveau de la composition chimique du bois, les résultats obtenus sur ces nouveaux essais
ont confirmé les héritabilités non significatives des extractibles et les héritabilités élevées des
contenus en lignines et en alpha-cellulose. Conformément à ces résultats des effets
génétiques significatifs ont été mis en évidence pour l ’indice kappa et le rendement en pâte,
ce qui confirme donc l ’hypothèse selon laquelle les échantillons du demi-diallèle ont été
trop cuits (indice kappa 30-40). Les corrélations obtenues entre rendement en pâte et
croissance sont encourageantes (non significatives à positives : 0,6), et laissent espérer des
gains conjoints possibles.
La variabilité génétique des propriétés papetières (volume massique, longueur de rupture,
indice d'éclatement, indice de déchirure) semble très faible et indique que des gains
génétiques directs sur les propriétés finales du papier seront difficilement envisageables.
La relative faiblesse de l ’héritabilité obtenue pour la densité au sein du demi-diallèle (0,3) a
souvent été à l ’origine de discussions. Il est en effet admis que la densité a une héritabilité
élevée (Tableau 1). Deux hypothèses peuvent être proposées pour expliquer ce résultat :
i)
Au vu des profils microdensitométriques obtenus sur le pin maritime, cette
essence semble répondre très rapidement aux variations climatiques, ce qui
pourrait donc engendrer un « bruit de fond » très important masquant en
partie les effets génétiques. Les résultats obtenus sur des tests clonaux
multi-sites semblent aller dans le sens de cette hypothèse. En effet une
variation très importante des héritabilités (0,393 à 1) a été mise en évidence
au sein des tests clonaux multi-sites de Blagon et Robinson (M. Ivkovich et
P. Rozenberg, communication personnelle).
ii)
L ’échantillon d ’arbres considéré peut aussi avoir une influence sur les
valeurs d’héritabilité obtenues. Les 12 parents, bien qu ’ils présentent des
Aptitudes Générales à la Combinaison (AGC) contrastées pour la croissance
en volume, sont issus de sélection massale en forêt (sélection pour la
croissance en volume et la forme). La variabilité existant au sein de cet
32
échantillon est donc probablement sous-estimée par rapport à celle existant
au sein de la population naturelle.
Les estimations d’héritabilités obtenues au cours de ces analyses pourront sans doute être
améliorées grâce à l ’utilisation de méthodes d’ajustement micro-environnemental, comme
la méthode de Papadakis (Papadakis 1937, Brownie et al. 1993).
Même en se cantonnant aux valeurs d’héritabilités obtenues au sein de ce demi-diallèle qui
sont sans doute sous-estimées, des gains génétiques significatifs sont envisageables pour
plusieurs composantes de la qualité du bois (Tableau 6). Les caractères pour lesquels les
gains génétiques espérés sont les plus importants sont la rectitude (+29%) et l ’homogénéité
du bois (+12%). Il faut toutefois noter que pour certains caractères, des gains génétiques
même faibles peuvent avoir un intérêt important. A titre d’exemple, une diminution de la
quantité de lignines de l ’ordre de 3% (1 point de lignines) pourrait être obtenue en une
génération de sélection. Cela peut paraître faible dans l ’absolu mais aurait un impact
considérable sur la compétitivité des sites industriels.
III.2- Intégration de la qualité du bois au programme d ’amélioration du pin
maritime : espoirs et limites
Des gains génétiques significatifs pourraient donc être obtenus pour de nombreuses
composantes de la qualité du bois. Cependant, pour une espèce destinée à de multiples
usages, la sélection multi-caractères est une nécessité. Aussi est-il indispensable de connaître
les effets de la sélection d’un caractère X sur un caractère Y. Bien que les connaissances
actuelles concernant la qualité du bois restent limitées, les caractères clés, ainsi que leur seuil
minimum d’acceptation et les gains minimums exploitables n ’ont pas encore été définis
avec précision, deux remarques peuvent être formulées :
1- il semble acquis que la densité et la rectitude constituent deux caractères
incontournables sur le plan de la sélection,
2- la sélection ne pourra pas porter sur une myriade de caractères, le coût de
caractérisation des arbres devenant alors trop élevé et les gains génétiques simultanés
trop faibles.
33
Aussi avons-nous essayé d’estimer les conséquences de différents types de sélection en
considérant trois caractères cibles (hauteur, rectitude et densité) paraissant aujourd ’hui
utilisables dans le cadre du programme d’amélioration du pin maritime.
Ces calculs ont été basés sur les corrélations génétiques obtenues au sein du demi-diallèle
(annexe 2). En ce qui concerne le lien entre densité et croissance, l ’idée générale est que la
qualité s ’oppose à la productivité. Si ce lien négatif a été maintes fois mis en évidence dans
le genre Picea (Rozenberg et Cahalan 1997), de nombreuses études au sein du genre Pinus
ont montré que cette relation n ’était pas toujours vraie (Tableau 7). Néanmoins, en ce qui
concerne les mesures les plus récentes effectuées dans le cadre du projet Européen GEMINI,
sur la population landaise du pin maritime, un lien négatif semble exister entre densité et
croissance (rG= -0,48 au sein du demi-diallèle étudié dans cette thèse, -0,696 dans un test
clonal multi-sites (Fonréaud, Robinson, Blagon), -0,633 au sein du test clonal de Robinson,
et –0,109 au sein du test clonal de Vacquey). Les corrélations obtenues entre les différentes
composantes de la qualité du bois et la croissance ont été discutées en détails dans l ’annexe
2 et comparées aux résultats déjà obtenus par ailleurs (Tableau 8).
Les principaux résultats obtenus au niveau des simulations de sélection multi-caractères
(Tableau 9) montrent que :
- la prise en compte de la densité comme critère de sélection permettrait non seulement
d’optimiser les gains pour ce caractère mais aussi pour l ’homogénéité du bois, les lignines
et la cellulose.
- l ’intégration au sein de l ’index de sélection, d’un critère de qualité du bois tel que la
densité (index B), pour lequel un gain maximum serait recherché, induirait une réduction
très nette des gains obtenus sur la croissance (gain génétique proche de 0%), alors que ces
derniers ont atteint 30% après deux cycles de sélection. Ce résultat n’est pas sans
conséquences et souligne l ’importance de la connaissance précise des besoins des
industriels.
Si une amélioration de la qualité du bois (composantes corrélés à la densité) devient
l ’objectif majeur des nouveaux cycles de sélection, ces derniers devront être réalisés au sein
d’une population déjà améliorée pour la croissance afin de conserver les gains génétiques
déjà obtenus pour ce caractère. Si au contraire, les industriels jugent que la qualité du bois
actuelle est suffisante, une sélection raisonnée associant une progression de la productivité à
34
un maintien global de la qualité intrinsèque du bois pourra être envisagée, au prix toutefois
d’une une légère diminution de l ’homogénéité du bois (index D).
Il faut cependant noter que même si de nombreux caractères liés à la qualité du bois
présentent des héritabilités intéressantes, garantes de gains génétiques significatifs,
l ’efficacité de la sélection dépendra aussi des capacités d’identification précoce des
génotypes élites et des coûts de mesures des caractères cibles. Des résultats intéressants ont
d’ores et déjà été obtenus au niveau de la réduction des coûts de mesures, mais des zones
d’ombre demeurent quant à la possibilité d ’opérer une sélection précoce, au terme de
quatre ou cinq années de croissance, voire dès le stade semis. Dans ce contexte il est donc
primordial d ’étudier l ’évolution du contrôle génétique de la qualité du bois au cours de la
maturation afin de définir l ’âge minimum de sélection.
III.3- Evolution du contrôle génétique de la qualité du bois au cours de la
maturation
A la différence de la très grande majorité des espèces de grandes cultures qui atteignent leur
maturité et donc le stade de la récolte, en 1 ou 2 années, les arbres forestiers sont récoltés
seulement au terme de plusieurs dizaines d ’années. Dans cet intervalle de temps, leur
physiologie évolue, induisant des modifications morphologiques et notamment le passage
d’un stade purement végétatif à un stade sexuellement mature. Ces modifications d’origine
ontogénique vont non seulement affecter leur capacité de reproduction mais aussi leur
anatomie. En effet, pour les caractères de croissance, des effets de maturation très forts ont
été observés chez plusieurs espèces forestières. Ces effets se traduisent par une diminution
des auto-corrélations génétiques lorsque l ’intervalle entre 2 mesures augmente. Ces faibles
corrélations juvénile-adulte impliquent donc une sélection relativement tardive, autour de 12
ans pour le volume chez le pin maritime (Kremer 1992). Il est primordial d ’acquérir le
même type d’informations pour les propriétés du bois.
Si la mesure de l ’ensemble des propriétés du bois pour chaque cerne est à l ’heure actuelle
difficilement envisageable en raison de leur coût de mesures, l ’étude de l ’évolution du
contrôle génétique de la densité et de son hétérogénéité devrait toutefois fournir les grandes
tendances en ce qui concerne l ’impact de la maturation sur la qualité du bois. La
35
technologie de micro-densitométrie par rayons X offre non seulement un accès à la densité
moyenne des arbres mais constitue surtout un enregistrement précis de l ’activité du
cambium tout au long de la vie de l ’arbre. L’activité du cambium régule non seulement la
croissance radiale (L), mais aussi les propriétés physiques du bois que sont la densité (D) et
son hétérogénéité (E). L ’évolution du contrôle génétique de ces 3 caractères a été étudiée au
sein du demi-diallèle présenté auparavant. Cette étude fait actuellement l ’objet d’un article
en préparation qui n ’est pas fourni en annexe.
Ces trois caractères présentent des évolutions phénotypiques distinctes au cours de la
maturation (Figure 6). Tandis que la densité diminue lors des premières années de croissance
puis augmente jusqu ’au cerne 9 pour se stabiliser ensuite, la croissance radiale suit une
évolution opposée. L’hétérogénéité du bois augmente quant à elle tout au long de la
maturation.
Comme cela a été observé pour les caractères mesurés globalement sur l ’ensemble de
l ’arbre (annexe 2), les effets génétiques détectés sont essentiellement d ’origine additive.
Lorsque les caractères sont considérés cerne par cerne, les héritabilités et les coefficients de
variation présentent de très fortes variations (Figure 7). Cette variabilité n’est pas cohérente
avec un effet de maturation et résulte sans doute d ’effets environnementaux (compétition
et/ ou effet climatique) qui n’ont pas été étudiés ici. Afin de s ’affranchir de cette variabilité
« non ontogénique », des caractères composites ont été recalculés sur la base des évolutions
phénotypiques observées (cernes 1-4, 5-8 et 9-11), l ’analyse conjointe de plusieurs cernes
devant permettre de s ’affranchir des effets environnementaux pouvant affecter les cernes
considérés individuellement. L ’analyse de ces caractères composites a mis en évidence une
augmentation progressive des héritabilités au cours de la maturation pour l ’ensemble des
caractères étudiés (Figure 8).
Tandis que les auto-corrélations génétiques calculées sur les cernes individuels présentent de
très fortes variations (données non présentées), celles calculées sur les caractères composites
présentent des décroissances progressives lorsque l ’intervalle entre les groupes considérés
augmente (Tableau 10). Bien que cette diminution des auto-corrélations affecte l ’ensemble
des caractères analysés, elle est légèrement plus faible dans le cas de la densité et de
l ’hétérogénéité du bois. Ces résultats sont concordants avec ceux disponibles dans la
littérature : les corrélations juvénile-adulte sont élevées et stables pour la densité (Talbert et
al. 1983, Loo et al. 1984, Williams et Megraw 1994, Cown et al. 1992, Hylen 1997, Vargas36
Hernandez et Adams 1992, Abel-Gadir et al. 1993, Woods et al. 1995) tandis qu ’elles
diminuent plus rapidement pour la croissance (Costa et Durel 1996, Kremer 1992). Il est
important de noter que les différentes composantes de la croissance en volume (croissance
en hauteur et en diamètre) ne présentent pas exactement le même type d’évolution de leurs
paramètres génétiques : les corrélations juvénile-adulte diminuent généralement plus
rapidement pour les accroissements en hauteur que pour ceux en diamètre (Costa et Durel
1996).
A la différence de la croissance en volume pour laquelle une sélection précoce (<12 ans)
n’est pas envisageable, les propriétés du bois corrélées à la densité et à son hétérogénéité
pourraient être sélectionnées précocement (après 3-4 années de croissance) chez le pin
maritime. Il faut cependant noter que ces sélections ne pourront pas porter sur des mesures
réalisées sur un cerne unique, mais devront être basées sur les informations relatives à
plusieurs années de croissance. Il est de plus évident que dans le cadre d’une sélection
traditionnelle, même si une sélection est envisageable à partir de quatre ou cinq années de
croissance, les croisements des parents sélectionnés ne pourront pas de toute façon être
effectués avant la maturité sexuelle qui est atteinte entre de 6-8 ans chez le pin maritime.
III.4- L ’amélioration traditionnelle de la qualité du bois est possible, mais sera
confrontée à certaines limites
Comme nous venons de le voir, de nombreuses composantes de la qualité du bois présentent
des caractéristiques génétiques (fortes héritabilités, corrélations juvénile-adulte stables et
élevées) garantissant des potentialités d ’amélioration intéressantes. Néanmoins l ’efficacité
de la sélection traditionnelle sera limitée pour plusieurs raisons :
i)
Malgré le développement de nouvelles techniques de mesures, telles que les
méthodes de proche et de moyen infra-rouge, qui sont déjà utilisées en routine
pour l ’estimation de la composition chimique du bois et qui devraient permettre
dans un futur proche l ’estimation de ces propriétés physiques, le coût lié à la
caractérisation phénotypique des populations d’amélioration restera très
important.
ii)
De plus, bien que le pouvoir prédicteur de la génétique quantitative ait fait ses
preuves aussi bien en sélection animale que végétale, cette dernière ne permet pas
l ’identification précise des gènes impliqués dans la variabilité des caractères
37
cibles de la sélection ni des bases génétiques des corrélations observées
(pléiotropie ou déséquilibre de liaison).
L’optimisation de l ’efficacité de la sélection passera entre autres par la compréhension
précise du déterminisme génétique et moléculaire de la qualité du bois, notamment la
détermination du nombre de gènes impliqués, de leurs effets et de leurs interactions.
L’identification de marqueurs moléculaires diagnostiques liés aux caractères matures de
qualité du bois constituerait de plus un bénéfice non négligeable en permettant une réduction
des coûts de sélection (pas de caractérisation phénotypique) et une identification très précoce
des génotypes élites.
38
39
Chapitre IV- Architecture génétique de la qualité du bois chez le
pin maritime
40
IV- Architecture génétique de la qualité du bois
IV- Architecture génétique de la qualité du bois chez le pin
maritime
IV.1- Etude de l ’architecture génétique de la qualité du bois chez les arbres
forestiers
Le développement des marqueurs moléculaires permet aujourd ’hui d ’avoir accès à la
variabilité génétique existante au sein des populations. Cette information autorise dans le cas
de populations adaptées la construction de cartes génétiques. La décomposition génétique
des caractères quantitatifs en leurs composantes mendéliennes vise à localiser sur ces cartes
les zones chromosomiques impliquées dans la variabilité des caractères d’intérêt (QTL :
Quantitative Trait Loci). Plusieurs études visant à identifier des QTL impliqués dans la
variabilité de la qualité du bois ont été réalisées chez diverses espèces forestières d’intérêt
économique (Eucalyptus sp : Moran et al. 2002 ; Pinus pinaster : Markussen et al. 2003 ;
Pinus taeda : Neale et al. 2002, Brown et al. 2003 ; Pinus radiata : Kumar et al. 2000 ;
Pinus sylvestris : Lerceteau et al. 2000 ; Larix sp : Arcade et al. 2000, 2002 et Populus :
Bradshaw et Stetller 1995). Ces études ont souligné le contrôle oligogénique des caractères
liés à la qualité du bois, avec seulement quelques QTL détectés pour les propriétés physiques
et chimiques du bois.
IV.2- Identification des zones chromosomiques impliquées dans la variabilité de
la qualité du bois chez le pin maritime
IV.2.1- A la recherche d’un pedigree adapté à la détection de QTL pour la
qualité du bois
Etant donné le temps de génération des arbres forestiers, la constitution de pedigrees
spécifiquement dédiés à des analyses QTL n ’est pas réaliste. Il est pourtant clair que
l ’efficacité de la détection des QTL dépend des caractéristiques de ces pedigrees. Le choix
d ’un pedigree a donc été basé sur les résultats obtenus grâce aux études de génétique
quantitative classique et sur les résultats issus de simulations (Beavis 1994). Une
descendance de pleins-frères appartenant à la troisième génération du programme
41
d’amélioration du pin maritime a finalement été retenue (Figure 9). Cette famille a été
choisie pour trois raisons :
1) Les 4 grands-parents (arbres élites sélectionnés de façon massale en forêt)
présentaient des AGC très différentes pour la croissance en hauteur. Cette
variabilité était garante, au vu des corrélations génétiques négatives observées au
sein de la population landaise, d ’une variabilité conjointe des propriétés du bois ;
2)
L’effectif relativement élevé de cette famille (202 individus) garantissait une
puissance de détection « correcte » ;
3) Enfin l ’âge des descendants (15 ans), étant supérieur à l ’âge de la sélection pour
la croissance, autorisait une bonne estimation des caractéristiques « adultes » des
arbres.
IV.2.2- Méthodes statistiques de détection de QTL
IV.2.2.1- De l ’ANOVA aux algorithmes génétiques
Outre le type de pedigree, sa taille (Beavis 1994) et l ’héritabilité des caractères analysés, les
méthodes statistiques utilisées dans la recherche de QTL vont aussi fortement influencer la
précision de l ’estimation des localisations et des effets des QTL. Les méthodes statistiques
simples telles que l ’analyse de variance ont ouvert la voie au développement de méthodes
de détection de QTL plus fines intégrant les informations disponibles au niveau de
marqueurs multiples (Interval Mapping : IM, Composite Interval Mapping : CIM, Multiple
Interval Mapping : MIM).
Si les modèles à marqueur individuel (ANOVA, régression linéaire, test-t) permettent
d ’identifier des marqueurs liés à la variation phénotypique, ces méthodes ne permettent pas
d ’apporter de réponses quant à la localisation précise des locus impliqués et de leurs effets.
De plus, en l ’absence de carte génétique, aucune information quant à la saturation du
génome n ’est disponible.
Afin de localiser précisément les zones chromosomiques impliquées dans la variabilité des
caractères, des méthodes utilisant l ’information fournie par les cartes génétiques ont été
développées. L ’Interval Mapping (IM) développé par Lander et Botstein (1989) permet de
tester la présence de QTL non seulement au niveau des marqueurs (comme les modèles à
marqueur unique) mais aussi dans l ’intervalle entre ces marqueurs. Néanmoins cette
42
méthode présente une limite majeure car la détection de QTL est réalisée de façon linéaire :
le même test est appliqué à tous les points de l ’intervalle et les effets des QTL détectés ne
sont pas pris en compte dans les tests successifs.
Des approches permettant la prise en compte de l ’information disponible sur l ’ensemble
des marqueurs ont été développées par la suite et ont été regroupées sous le terme de
Multiple QTL Mapping. Les stratégies de Composite Interval Mapping (CIM) et de Multiple
Interval Mapping (MIM) proposées simultanément par Zeng et Jansen en 1993, étendent la
méthode d ’IM en y incluant la prise en compte de marqueurs présentant un effet significatif
comme co-facteurs. Elles permettent donc d ’estimer les positions et les effets des QTL
indépendamment des autres QTL détectés. Bien que ces méthodes aient permis d ’améliorer
de façon très significative les résultats obtenus (Figure 10), elles restent encore monodimensionnelles (recherche d’un QTL à la fois) et les interactions entre les QTL ne sont pas
considérées. La méthode proposée par Kao et al. (1999) et Zeng (2000) dénommée MIM se
distingue des méthodes précédentes par la prise en compte des interactions entre les
différents QTL. La sélection du modèle (incluant le nombre de QTL, leur position, leurs
effets principaux et d ’interaction) le mieux adapté aux données suit une procédure itérative
en plusieurs étapes. Après avoir identifié le nombre de QTL et leur position respective dans
le génome par CIM (modèle sans interaction), la stratégie MIM consiste à poursuivre la
recherche de QTL additionnels au cours de cycles de sélection « backward » « forward » en
intégrant les informations d’interaction entre les différents QTL. Au sein de chaque cycle,
les positions et les effets principaux et d’interaction des QTL sont réévalués. Si cette
stratégie a apporté des améliorations significatives par rapport au CIM (Figure 11), elle ne
permet pas encore de détecter les QTL non significatifs au niveau individuel mais présentant
des effets d’épistasie.
Ainsi, si le concept qui vise à localiser des QTL multiples en prenant en compte leurs
interactions est simple, son implémentation, étant donné le nombre de QTL potentiels et le
nombre d ’interactions résultantes, est relativement difficile. Le problème n ’est donc plus à
ce niveau génétique mais réside dans la capacité de tester tous les modèles possibles et de
sélectionner celui qui s ’adapte le mieux à la variabilité observée (« model selection »).
L’utilisation d’algorithmes génétiques a donc été proposée pour permettre l ’identification
des modèles les plus pertinents (Baker 1987, Carlborg et al. 2000).
43
Une approche alternative a récemment été proposée par Sen et Churchill (2001). Elle
consiste à séparer le problème complexe de la détection des QTL en 2 parties distinctes : la
relation entre le QTL et le caractère quantitatif d’une part et la localisation des QTL et la
quantification de leurs effets d’autre part. Le fait de déconnecter ces deux composantes de
la détection permet dans un premier temps de se focaliser sur la définition des génotypes au
niveau des QTL. Une fois que les génotypes des QTL sont estimés, tous les modèles
possibles (différents nombres de QTL) sont explorés. Etant donné que les génotypes des
QTL sont définis indépendamment de leur effet et de leur localisation, les questions
d’épistasie et de QTL liés n’ont plus lieu d’être.
Il faut aussi noter que des algorithmes utilisant l ’information disponible au niveau de
plusieurs caractères corrélés ont été développés afin d ’améliorer la puissance de détection
des QTL (Jiang et Zeng 1995, Ronin et al. 1995, Korol et al. 1995).
IV.2.2.2.- Signification statistique des QTL détectés
Suite au choix de la méthode statistique appropriée, qui doit tenir compte des objectifs de
l ’étude (pourquoi faire du CIM si la seule chose qui nous intéresse est l ’obtention d’un
marqueur prédicteur du caractère au sein du pedigree utilisé ?), et de la taille de la
population disponible (par exemple, tester des interactions multiples entre marqueurs avec
200 individus ne paraît pas très pertinent), le problème reste de définir la signification
statistique des QTL observés. Si tous les caractères analysés présentaient une distribution
normale, que les données génotypiques ne présentaient pas de valeurs manquantes, que les
chromosomes comportaient le même nombre de marqueurs disposés à des intervalles
réguliers et qu ’il n’y avait pas de distorsion de ségrégation, la valeur de LOD score (ou de
toute autre statistique) associée au QTL détecté pourrait être considérée comme une bonne
indication de la significativité du QTL. Néanmoins ces hypothèses sont rarement respectées.
Dans ce contexte, il est donc important de vérifier si la valeur observée de la statistique liée
au QTL n’a pas été obtenue par chance. Pour répondre à cette question, il faut connaître la
distribution de cette statistique. Afin d ’avoir accès à cette distribution, la méthode de rééchantillonnage par permutation est fréquemment utilisée (Churchill et Doerge 1994). Les
jeux de données ré-échantillonnées (tirage des phénotypes sans remise, les génotypes
n’étant pas modifiés pour conserver une carte génétique aux propriétés identiques), au sein
44
desquels les liaisons entre génotypes et caractères phénotypiques ont été brisées, sont
analysés avec la même méthode de détection. La valeur de la statistique obtenue sur les
données de départ est finalement comparée aux valeurs obtenues sur les données permutées,
ce qui permet d’obtenir l ’erreur de type I associée à chaque QTL.
IV.2.3- Des hot spots de QTL de qualité du bois détectés chez le pin maritime
Les résultats détaillés issus de la détection des QTL sont présentés dans l ’annexe 3. Seuls
les résultats marquants ainsi que les questions qu ’ils peuvent soulever seront exposés ici. Le
logiciel MultiQTL (http://esti.haifa.ac.il/~poptheor/MultiQtl/MultiQtl.htm) a été utilisé pour
l ’ensemble des analyses (Encadrés 1 et 2). Des QTL ont été détectés pour la totalité des
caractères à l ’exception de TH, Pyl-east, aext et PulpY-40. Les pourcentages de variation
phénotypique expliquée varient entre 3,7 et 12,3% (Figure 12).
Aucun lien n ’a été observé entre l ’héritabilité des caractères, le nombre de QTL et le
pourcentage de variation expliquée. Deux hypothèses peuvent être avancées pour expliquer
ce résultat quelque peu surprenant :
dans le cas où aucun ou seulement quelques QTL à effet faible ont été détectés
pour des caractères présentant de fortes héritabilités :
o les parents du pedigree de cartographie peuvent être monomorphes au
niveau des gènes impliqués dans la variabilité des caractères,
o des effets d’épistasie qui n ’ont pas été recherchés au cours de la
détection de QTL peuvent être à l ’origine des effets génétiques détectés
dans le diallèle.
Dans le cas inverse, où aucun effet génétique n ’a été observé dans le diallèle,
mais qu ’un fort pourcentage de la variation est expliqué par les QTL observés, il
faut considérer que la puissance de détection des effets est sans doute plus forte
au sein du pedigree G2 pour les caractères présentant de faibles niveaux de
variation (100 individus par classe génotypique vs. 8 individus par famille dans le
cas du diallèle).
Des co-localisations entre des QTL impliqués dans la composition chimique du bois ont été
détectées sur les groupes GL4m (lignin, alfacel), GL8f (alfacel, hemicel, lignin), et GL12f
(hemicel, alfacel). Des co-localisations entre des QTL de propriétés des fibres ont aussi été
45
détectées sur les groupes de liaisons GL4m (afl, wfl, coars, zspan), GL8f (afl, fw, coarc, curl,
wfl), et GL12m (fw, afl, wfl, coarc, curl, zspan). D ’autres co-localisations ont aussi été
identifiées entre des QTL pour les propriétés physiques du bois, les propriétés des fibres et la
composition chimique (e.g. lignin et pyl, pyl et zspan sur le GL2m, kappa-30 et lignin sur le
GL10f, kappa-30, kappa-40 et zspan sur le GL5m, composition chimique du bois et
propriétés des fibres sur le GL8f, et hemicel et propriétés des fibres sur le GL12m). Ces colocalisations multiples suggèrent l ’implication des mêmes régions chromosomiques dans
l ’expression de la qualité du bois et donc l ’existence de « hot spots » de qualité du bois
dans le génome du pin maritime.
Il est clair qu’étant donné la taille des intervalles de confiance des QTL, de telles colocalisations sont attendues par chance. Néanmoins deux raisons peuvent être invoquées
pour plaider en faveur de leur existence. D ’une part, certaines co-localisations observées
entre deux caractères sont détectées plusieurs fois dans le génome, c ’est notamment le cas
pour les co-localisations entre les propriétés des fibres et la composition chimique du bois
(GL4m, GL8f, GL12m, GL12f). D ’autre part les co-localisations observées coïncident avec
les corrélations génétiques obtenues dans le demi-diallèle (annexe 2).
IV.2.4- Vers une validation des régions chromosomiques impliquées dans la
qualité du bois
Bien que cette étude ait permis la mise en évidence de zones chromosomiques impliquées
dans la qualité du bois, la précision des estimations des effets et des positions des QTL est
relativement faible. Beavis (1994) a en effet montré que l ’utilisation de pedigrees de faible
taille (<500 génotypes) non seulement diminue la puissance de détection des QTL, mais
aussi mène à une sur-estimation des effets, accompagnée d’une forte imprécision sur la
position. Dans ce contexte la validation des QTL apparaît donc indispensable. Plusieurs
stratégies peuvent alors être utilisées.
Si le nombre de descendants du pedigree est suffisant, 2 lots, sur lesquels les recherches de
QTL seront menées indépendamment, peuvent être constitués. Dans notre cas, l ’effectif
étant trop faible, une telle stratégie n’a pas pu être appliquée.
Une seconde option consiste à cloner les individus du pedigree et à réitérer la détection de
QTL sur cette « nouvelle » population. Cette approche a été utilisée avec succès chez
46
plusieurs espèces forestières répondant bien à la reproduction végétative telles que
l ’eucalyptus, le chêne et le peuplier. Mais là encore, en raison de la faible aptitude au
bouturage de pins maritimes adultes, cette stratégie n’a pas pu être appliquée.
La validation peut aussi être réalisée sur des pedigrees différents. A la différence des deux
options précédentes, ce n ’est plus seulement la réalité des QTL qui est testée, mais aussi
leur stabilité dans des fonds génétiques différents. Bien qu’une autre étude ait porté sur la
détection de QTL pour la qualité du bois chez le pin maritime (Markussen et al. 2003),
aucune comparaison n’a pu être réalisée en raison de l ’absence de marqueurs communs
permettant d ’aligner les deux cartes, basées essentiellement sur des marqueurs AFLP.
Si la validation intra-spécifique des QTL n’a pas été possible, leur comparaison avec les
résultats obtenus chez Pinus taeda a pu être réalisée grâce au développement de marqueurs
orthologues (Thèse de David Chagné, CCGP : Comparative Conifer Genome Project:
http://dendrome.ucdavis.edu/Synteny/about.html). Cette comparaison interspécifique a
permis d ’identifier une zone impliquée dans le contrôle génétique de la composition
chimique du bois sur le GL 8 chez ces deux espèces (Figure 13, annexe 4).
IV.3- Evolution de l ’architecture génétique de la croissance radiale et de la
qualité du bois au cours de la maturation et au cours de la saison de végétation
Comme nous l ’avons vu auparavant, le contrôle génétique de la croissance et de la qualité
du bois évolue pendant la maturation (augmentation des héritabilités et diminution des
corrélations génétiques). Plusieurs auteurs ont repris l ’hypothèse faite par Kremer (1992)
qui expliquait la décroissance des corrélations génétiques juvénile-adulte observée pour la
croissance en hauteur par une modification du pool de gènes impliqués dans le contrôle
génétique.
Il a de plus été observé que l ’héritabilité des caractères au sein d ’un même cerne variait de
façon significative entre le bois initial et le bois final (Figure 8, Louzada et al. 2003,
Nyakuengama et al. 2000), soulignant là encore la possibilité d’une évolution du contrôle
génétique au cours de la saison.
L’analyse QTL offre la possibilité de valider ou d’infirmer ces hypothèses en donnant un
accès direct aux zones chromosomiques impliquées dans le contrôle génétique des
différentes composantes de la croissance et de la qualité du bois, non seulement au cours de
la maturation mais aussi au sein d ’une même saison de végétation. Comme pour l ’étude de
47
l ’évolution des héritabilités et des corrélations génétiques, la croissance radiale, la densité et
son hétérogénéité ont été analysées. Outre l ’analyse des caractères mesurés cerne par cerne
et type de bois par type de bois, des caractères composites ont aussi été utilisés : caractères
moyens sur l ’ensemble du cerne (La, Do, Et) et caractères recalculés sur des groupes de
cernes (cernes 1-4, 5-8, 9-11, 1-11).
Une variation phénotypique (évolution des valeurs moyennes, coefficients de variation)
comparable à celle du demi-diallèle (Figure 6) a été observée au sein du pedigree de
cartographie utilisé pour la détection de QTL (Figure 14). Pour les 135 caractères analysés
(11 cernes * 9 caractères et 46 caractères « composites »), 291 QTL ont été détectés (215
chez le mâle et 76 chez la femelle). Etant donné le haut niveau de redondance des caractères
analysés, un tri des QTL les plus « pertinents » basé sur la comparaison des niveaux de
signification des QTL a été réalisé (Figure 15). Finalement, 117 et 47 QTL ont été conservés
pour la carte mâle et la carte femelle. 41 QTL ont été détectés pour la densité, 61 pour la
croissance radiale et 62 pour l ’hétérogénéité du bois. L ’ensemble des résultats de détection
est présenté en annexe 9.
IV.3.1- Mise en évidence de clusters de QTL
Afin de tester si les QTL obtenus étaient distribués de façon aléatoire, leur distribution
spatiale au sein de l ’espace défini par les groupes de liaison a été comparée à une
distribution aléatoire de Poisson (Encadré 3). La conformité de la distribution des QTL à une
distribution aléatoire mettrait en évidence une instabilité complète du contrôle génétique au
cours de la maturation et des saisons (Hypothèse H0). Une telle hypothèse a pu être rejetée,
en effet une distribution agrégée des QTL a été mise en évidence (Figures 16 et 19, Tableau
11). Cette agrégation a été observée non seulement lorsque l ’ensemble des QTL détectés
était considéré simultanément mais aussi lorsque les analyses ont été menées de façon
indépendante pour chaque caractère (Tableau 11). Ces résultats montrent que la distribution
des QTL observée résulte au moins en partie, i) d ’une stabilité des QTL au cours de la
saison de végétation et de la maturation et que ii) des régions communes contrôlent la
variabilité génétique des différents caractères analysés.
Il faut néanmoins bien noter, comme l ’a fait remarquer Dominique DeVienne, que les
résultats de cette analyse sont sujets à une double imprécision. En effet deux types de QTL
48
n’ont pas été détectés au cours de cette étude : 1) les QTL à effet faibles et 2) ceux étant
proches et ayant des effets opposés sur un caractère donné. Ce manque de puissance de
détection laisse donc penser que la distribution observée est plus morcelée qu’elle ne l ’est
en réalité. L’observation d’une distribution agrégée des QTL pourrait donc simplement
révéler la distribution que l ’on attend dans le cas d une faible puissance de détection. Une
analyse plus fine prenant en compte la distance à laquelle 2 QTL ayant des effets opposés ne
sont plus détectés (distance dépendante de l ’effet des 2 QTL) et le nombre de QTL à effet
faible qui ne sont pas détectés devrait permettre de tirer des conclusions plus précises. La
modélisation d’une distribution aléatoire intégrant ces deux informations et sa comparaison
à la distribution observée serait probablement plus pertinente que la comparaison à une
distribution simple de poisson.
Néanmoins comme nous allons le voir par la suite, la distribution des QTL observée semble
être en accord avec une certaine stabilité du contrôle génétique au cours de la maturation et
un contrôle génétique partiellement identique des différents caractères comme le suggère les
analyses préalables de génétique quantitative.
IV.3.2- Un contrôle génétique stable au cours de la maturation ?
Dans le cas d ’une stabilité complète du contrôle génétique au cours de la maturation, le
même nombre de QTL devrait être détecté à tous les âges cambiaux et leur localisation sur le
génome devrait être stable. Cette configuration contredirait donc l ’hypothèse faite par
Kremer (1992 : modification du contrôle génétique au cours de la maturation) pour
expliquer la décroissance des corrélations juvénile-adulte.
Néanmoins, une augmentation du nombre de QTL détectés a été mise en évidence au cours
de la maturation (Figure 17). Cet accroissement correspond d’ailleurs à l ’augmentation des
héritabilités observées au cours de la maturation (Figure 8). De plus, le tableau 12 montre
que la moitié des QTL détectés est spécifique à un âge cambial tandis que l ’autre moitié a
une action sur plusieurs âges cambiaux. La distribution agrégée des QTL peut donc
s ’expliquer en partie par la stabilité partielle du contrôle génétique des caractères au cours
de la maturation. Cette observation ne contredit en aucune façon l ’hypothèse faite par
Kremer (1992), et bien au contraire la valide en mettant en évidence une modification
49
partielle du pool de gènes impliqués dans le contrôle génétique des différents caractères au
cours de la maturation.
Ces résultats concordent avec les travaux menés sur différentes espèces forestières qui ont
montré que seule une portion des zones chromosomiques mises en évidence présente des
effets à plusieurs stades de la maturation (Bradshaw et Stettler 1995, Plomion et al. 1996,
Verhaegen et al. 1997, Emibiri et al. 1998, Kaya et al. 1999). Si l ’on s ’attarde sur
l ’analyse de l ’évolution des effets spécifiques à une zone chromosomique donnée, on peut
remarquer que plusieurs types de cinétique sont observables (Figure 18).
Ces résultats confirment ceux obtenus au cours des études d ’expression qui ont mis en
évidence une modification partielle des pools de gènes et de protéines exprimés au cours de
la maturation (transcriptome : G. Le Provost ; Protéome : J.M. Gion, communications
personnelles).
IV.3.3- Un contrôle génétique stable au cours de la saison ?
La distribution agrégée des QTL peut aussi s ’expliquer par une stabilité partielle du
contrôle génétique pendant la saison de végétation. En effet, l ’analyse QTL a permis de
mettre en évidence que la moitié des QTL détectés était spécifique à un type de bois (bois
initial, bois final), tandis que l ’autre moitié correspondait à des zones chromosomiques
ayant une action stable au cours de la saison (Tableau 13, annexe 10). Cette stabilité partielle
du contrôle génétique des propriétés du bois au cours de la saison fournit une explication
supplémentaire à la distribution agrégée des QTL.
Il est aussi intéressant de noter que la variabilité du pourcentage de QTL stables au cours de
la saison de végétation pour les différents caractères (40% pour D, 55% pour E et 58% pour
L) correspond à la variation des corrélations génétiques obtenues entre les différents types de
bois au sein du demi-diallèle (rG D=0,368, rG E =0,951, rG L= 0,929). En effet c’est pour la
densité, qui présente la corrélation génétique la plus faible entre bois initial et bois final, que
le plus faible nombre de QTL stables a été mis en évidence.
Ces résultats correspondent d’une part aux résultats obtenus par Sewell et al. (2000) qui ont
montré que le contrôle génétique de la densité du bois variait fortement entre le bois initial et
le bois final (4 QTL spécifiques au bois initial, 3 QTL spécifiques au bois final et 2 QTL
détectés pour le bois initial et le bois final) et à ceux obtenus au cours des études
50
d’expression qui ont montré que les gènes exprimés lors de la formation du bois initial et du
bois final variaient de façon très importante (Le Provost et al. 2003).
IV.3.4- Un contrôle oligogénique des caractères ?
Les analyses QTL menées chez les arbres forestiers ont mis en évidence un nombre
relativement faible de QTL (entre 0 et 7) par caractère (revue par Sewell et Neale 2000).
Bien que la plupart des caractères analysés présente une distribution continue, signe d ’un
déterminisme polygénique, les résultats obtenus coïncident avec un déterminisme
oligogénique (Bradshaw et Stettler 1995, Grattapaglia et al. 1996, Verhaegen et al. 1997,
Kaya et al. 1999). Il est cependant primordial de noter que la plupart de ces études ont été
menées sur des caractères mesurés à une seule reprise (spécifiques à un stade de maturation
ou mesurés globalement sur l ’ensemble de l ’arbre), et ne permettent donc pas une analyse
globale du contrôle génétique des caractères. L’analyse présentée ici a permis de mettre en
évidence un nombre beaucoup plus élevé de QTL par caractère (30 QTL « uniques » pour la
densité, 42 pour l ’hétérogénéité du bois et 33 pour la croissance radiale). Cette
augmentation du nombre de QTL détectés, qui avait aussi été mise en évidence par Sewell et
al. (2000), révèle la complexité du contrôle génétique des caractères étudiés, ce dernier
variant en fonction du stade de maturation, mais aussi en fonction de l ’environnement
extérieur (effet saison : interaction génotype environnement). L ’hypothèse d ’un contrôle
oligogénique, impliquant un très faible nombre de QTL à effet majeur, doit donc être
tempérée.
Il faut de plus noter que la taille souvent limitée des pedigrees utilisés pour la détection de
QTL (généralement inférieure à 500 génotypes), n’autorise pas la détection des QTL à effet
faible et mène de plus à une sur-estimation des effets (Beavis 1994).
IV.3.5- Des zones chromosomiques communes agissant sur différents
caractères ?
Outre la stabilité partielle du contrôle génétique des caractères au cours de la maturation et
des saisons, l ’implication d’une même zone chromosomique dans le contrôle des différents
caractères peut aussi contribuer à l ’observation d’une distribution agrégée des QTL. Afin
de tester cette hypothèse, des tests de co-localisation ont été réalisés selon la méthode
développée par Lin et al. (1995) (encadré 4). Ces analyses ont permis de mettre en évidence
51
un excès de co-localisations entre les QTL obtenus pour les différents caractères par rapport
à celles attendues par chance (Tableau 14, Figure 19, Figure 20). Outre le fait que ces colocalisations contribuent à expliquer la distribution agrégée des QTL, les sens des effets des
QTL sur les différents caractères coïncident avec les corrélations génétiques observées (DoLa = -0,678, Do-Et = -0,262, La-Et= 0,225).
IV.3.6- Un effet très important de la maturation, non seulement au niveau intra
mais aussi inter-caractères
En raison du nombre de caractères analysés simultanément, il n’a pas été possible
d ’étudier précisément l ’ensemble de la matrice de corrélations obtenue. Afin de fournir
une image globale des co-régulations entre les caractères, et donc de définir les principaux
facteurs agissant sur ces régulations, une analyse d’agglomération hiérarchique a été
réalisée en utilisant le coefficient de corrélation de Pearson comme indice de similarité
(« cluster correlation analysis », Myers et al. 1997). Cette analyse a été effectuée sur les
données du demi-diallèle et du pedigree de cartographie. Afin de réduire la redondance entre
les caractères analysés, seuls les caractères spécifiques à un âge cambial et à un type de bois
ont été considérés (66 caractères : 6 caractères par cerne * 11 cernes).
A partir des données brutes, deux matrices contenant d’une part les distances euclidiennes
entre chaque caractère et d’autre part les coefficients de corrélation ont été calculées. Afin
de fournir un résultat facilement lisible, la matrice de corrélations a alors été ordonnée en
fonction des distances euclidiennes entre les caractères. Au sein de cette matrice, les
corrélations positives sont présentées en rouge, tandis que les corrélations négatives sont
présentées en vert. Au sein de la matrice supérieure, seules les corrélations significatives ont
été présentées (Figure 21).
Même si les matrices de corrélations obtenues sur le demi-diallèle et le pedigree de
cartographie divergent légèrement, des tendances communes ont néanmoins pu en être
dégagées. Outre la confirmation des effets de la maturation et de la saison sur l ’expression
des caractères considérés individuellement, cette analyse a permis de mettre en évidence les
effets très importants des âges cambiaux non seulement au niveau intra mais aussi intercaractères. En effet les clusters de co-régulation observés sont très souvent définis en
fonction des âges cambiaux et englobent des caractères différents. A titre d’exemple, des
clusters comprenant des caractères de densité et de croissance entre les âges cambiaux 4-11,
52
ainsi que de nombreux clusters comprenant des caractères d ’hétérogénéité du bois et de
densité pour différents âges cambiaux ont été mis en évidence. Ce niveau de co-régulation,
correspondant à la co-régulation de différents caractères pour un âge ou un groupe d ’âges
cambiaux donné, n’avait pas été exploré lors de l ’analyse QTL. Il est néanmoins clair
qu ’une telle co-régulation existe aussi au niveau génétique. Des clusters de QTL « âges
cambiaux spécifiques » agissant sur plusieurs caractères ont d ’ailleurs pu être mis en
évidence (Figure 20).
IV.4- Détection de QTL chez les arbres forestiers: un outil de recherche
fondamentale, mais des espoirs d ’application limités
L’étude de l ’architecture génétique a permis de mettre en évidence des zones
chromosomiques impliquées dans le contrôle génétique de la qualité du bois et de la
croissance. Même si leur détection résulte seulement de l ’analyse d’un pedigree unique, la
correspondance des co-localisations observées avec les corrélations génétiques obtenues
dans un dispositif indépendant (demi-diallèle), leur détection dans les mêmes zones
chromosomiques chez une espèce proche (cartographie comparée, Pinus taeda), et leurs
détections multiples au cours de la maturation et de la saison constituent des signes forts de
leur validité. L’approche QTL a de plus permis de valider l ’hypothèse faite par Kremer
(1992) pour expliquer la décroissance des corrélations juvénile-adulte pour la vigueur. Le
pool de gènes impliqués dans le déterminisme génétique des caractères de croissance, mais
aussi de qualité du bois, évolue au cours de la maturation. Une telle évolution a également
été mise en évidence au niveau de l ’alternance des saisons. Ces résultats confirment ceux
obtenus au cours des études du transcriptome et du protéome qui ont montré des
modifications des niveaux d’expression au cours de la maturation et au cours de
l ’alternance des saisons (Figure 22).
Néanmoins, outre leur intérêt au niveau fondamental, la mise en place de dispositifs
autorisant la détection de QTL a été au départ motivée par des objectifs appliqués visant
l ’utilisation des QTL comme outil de sélection précoce. Plusieurs études de simulations ont
montré que les bénéfices de la sélection assistée par marqueurs étaient optimaux dans le cas
de caractères à faible héritabilité (Lande et Thompson 1990). Toutefois, une telle stratégie
est tout de même justifiée pour des caractères présentant des héritabilités élevées mais dont
la mesure est coûteuse, tardive voire destructive comme c’est le cas pour la qualité du bois
53
(Strauss et al. 1992, Williams et Neale 1992). Cependant, s ’ il est vrai que les travaux
présentés ici ont permis l ’identification de zones chromosomiques impliquées dans le
contrôle génétique de caractères matures, l ’utilisation directe de ces résultats au sein de
programme de sélection est confrontée à de nombreux obstacles.
La mise en évidence de QTL ne correspond pas à l ’identification précise d’un gène
impliqué dans la variabilité d ’un caractère, elle permet simplement l ’identification d ’une
zone chromosomique contenant ce gène. L’utilisation directe des marqueurs flanquant les
QTL sera uniquement possible dans des contextes bien déterminés (Strauss et Lande 1992):
i)
Sélection intra-famille au sein du pedigree ayant servi à la détection de QTL
ii)
Sélection intra-famille au sein de pedigrees contenant au moins un des parents
du pedigree utilisé pour la détection de QTL.
Si de telles stratégies permettent l ’identification d ’individus élites cumulant des allèles
favorables aux marqueurs flanquant les différents QTL, l ’utilisation des individus
sélectionnés en plantation dépendra par la suite de la disponibilité de méthodes de
multiplication rapide telles que l ’embryogénèse somatique. Des simulations ont montré que
de telles stratégies, malgré les coûts associés du génotypage et du phénotypage peuvent être
efficaces (Wilcox et al. 2001).
Cependant l ’utilisation de telles stratégies, si elles sont pertinentes dans un objectif de
déploiement d’une foresterie clonale, n ’est pas applicable à la gestion courante des
programmes d’amélioration forestiers. En effet, afin de conserver une diversité génétique
garante de l ’adaptabilité future des populations améliorées, les programmes d’amélioration
sont basés sur la sélection récurrente au sein de populations comprenant plusieurs centaines
d’individus non apparentés. L’utilisation de marqueurs flanquant des QTL détectés au sein
d’un pedigree unique comme outil de sélection dans de telles populations se solderait dans
la plupart des cas par un échec. En effet, en raison du faible niveau de déséquilibre de liaison
persistant au sein de ces populations, les associations entre marqueurs bordants et gènes sont
brisées. Contrairement aux pedigrees de cartographie au sein desquels du déséquilibre de
liaison à longue distance est créé, au sein de populations non apparentées, la fenêtre de
déséquilibre de liaison est beaucoup plus étroite (Figure 23). Afin de fournir des outils de
sélection utilisables dans le cadre de la gestion des programmes d ’amélioration (individus
non apparentés), deux approches sont donc possibles :
i)
baliser le génome avec des marqueurs très rapprochés
54
ii)
ou identifier non plus la zone chromosomique où se trouve le gène, mais le gène
lui-même, voire le polymorphisme responsable.
C ’est vers cette seconde option que les recherches menées chez le pin maritime
s ’orientent actuellement.
55
56
Chapitre V- Identification des gènes impliqués dans la variabilité de la
qualité du bois : 1- A la recherche des gènes candidats pertinents
57
V- Identification des gènes impliqués dans la variabilité de la
qualité du bois : 1- A la recherche des gènes candidats pertinents
Deux approches peuvent être envisagées pour identifier les gènes sous-jacents aux QTL.
V.1- L ’approche indirecte « du gène au phénotype » : une stratégie riche
d ’enseignements mais inadaptée à l ’identification des gènes responsables de la
variabilité naturelle
Bien que son utilisation soit très controversée, la transformation génétique (transformation
ciblée ou mutagénèse aléatoire) constitue un outil de choix pour l ’étude du rôle des gènes et
de leur régulation. L’approche indirecte est basée sur l ’utilisation de cette méthodologie.
Elle consiste à observer les conséquences phénotypiques des modifications de la régulation
des gènes. Une telle approche a été appliquée avec succès aux gènes de la voie de
biosynthèse des lignines. Des plantes transgéniques de tabac et de peuplier sur- et sousexprimant les différents gènes de cette voie de biosynthèse ont été « construites ».
L’analyse de leur phénotype a alors permis de définir avec précision le rôle des gènes
« modifiés » sur l ’expression des caractères phénotypiques (revue par Boerjan et al. 2003).
Néanmoins cette approche est confrontée à plusieurs limites :
i)
si elle permet d’identifier les gènes impliqués dans l ’expression des
caractères, elle n’autorisera en revanche pas l ’identification précise des
gènes responsables de la variabilité observée au sein des populations
naturelles ;
ii)
mis à part chez quelques espèces modèles (le peuplier pour les arbres
forestiers), ce type d’étude ne peut pas être appliqué à de nombreux gènes de
façon simultanée, et ne constitue donc pas une méthode rapide d’évaluation
du rôle des gènes sur l ’expression des caractères ;
iii)
ces études sont pour la plupart menées sur un génotype bien précis. Les
variations liées à la modification du contexte génétique entourant le gène
transformé sont rarement explorées. A titre d ’exemple chez le peuplier, la
quasi totalité des études de transformations sont réalisées avec le clone 717
1B4 ;
V- A la recherche des gènes candidats
iv)
chez les espèces forestières, aucune technique permettant l ’obtention de
recombinaisons homologues ciblées n ’est disponible. Or cette stratégie est la
seule permettant la mise en évidence de l ’effet d’un polymorphisme précis
sur l ’expression d’un caractère.
Même si cette approche fournit des informations primordiales à la compréhension du rôle
des gènes, elle ne permet pas l ’identification directe des gènes responsables de la variabilité
observée au sein des populations. Ce type d’étude a néanmoins des intérêts, d ’une part en
amont de la recherche des gènes impliqués dans la variabilité des caractères pour identifier
les candidats fonctionnels les plus pertinents, et d’autre part en aval de ces recherches dans
le cas où le rôle des gènes identifiés n’est pas bien connu.
V.2- Approche directe « du phénotype au gène »
Contrairement à l ’approche indirecte qui va aller du gène vers le phénotype, l ’approche
directe va suivre une direction opposée : du phénotype vers le gène. L’idée est d’identifier
quels sont les facteurs génétiques qui peuvent expliquer la diversité des phénotypes
observés. L ’approche QTL, dont les résultats ont été présentés auparavant, s ’inscrit dans
cette stratégie. Néanmoins l ’idée n’est ici plus d ’identifier seulement les zones
chromosomiques importantes mais directement les gènes sous-jacents.
V.2.1- Le clonage positionnel : une méthode peu adaptée aux espèces à grand
génome
Lorsqu ’un QTL est localisé sur une carte, il peut être envisagé de le cloner avec pour
unique information sa position, d’où le terme de clonage positionnel qui est donné à cette
méthode. Le principe est le suivant : les marqueurs co-ségrégeant avec le gène à cloner sont
utilisés pour cribler une banque génomique (BAC, YAC, Cosmides) en vue d’isoler le ou
les clones contenant le gène cible. Le clonage est effectué par marche sur le chromosome : si
les clones obtenus ne contiennent pas le gène recherché, une nouvelle sonde est synthétisée
puis de nouveaux clones sont recherchés (Figure 24).
Si cette approche a permis chez plusieurs espèces à petit génome d ’identifier les gènes
sous-jacents aux QTL (riz : Song et al. 1995 ; tomate : Frary et al. 2000, Isaacson et al.
2002, Park et al. 2002), elle est néanmoins difficilement applicable chez les espèces à grand
génome telles que les conifères. A titre d’exemple, 1cM correspond en moyenne à 220 kb
59
chez Arabidopsis et 13000kb chez le pin maritime (Chagné et al. 2002). Si trouver un
marqueur à 1 centimorgan d ’un gène peut être suffisant pour entamer une marche
chromosomique dans le cas d’une espèce à petit génome telle Arabidopis, une telle
information reste insuffisante chez le pin.
IV.2.2- L ’approche gène candidat
Une approche alternative à la stratégie de clonage positionnel consiste à essayer d’identifier
directement les gènes responsables de la variation observée en testant leurs associations avec
la variation des caractères étudiés (Pflieger et al. 2001).
V.3- L ’approche gène candidat : une stratégie pour identifier les gènes
responsables de la variabilité de la qualité du bois chez le pin maritime
V.3.1- Une multitude de candidats potentiels
Sans information sur les positions des gènes au sein du génome, deux types de candidats
peuvent être identifiés :
i)
les candidats fonctionnels, dont l ’implication dans des voies de biosynthèse
en liaison avec le caractère phénotypique a été mise en évidence (voies de
biosynthèse des lignines (Boerjan et al. 2003), cellulose (Doblin et al. 2002),
gènes impliqués dans les différentes étapes de la formation du bois (Plomion
et al. 2001, Tableau 15), mutants de formation des parois des cellules
d’ Arabidopis (Mouille et al. 2003)
ii)
les candidats expressionnels qui sont différentiellement exprimés au sein de
xylèmes en formation présentant des caractéristiques différentes (bois initial
vs. bois final, bois opposé vs. bois de compression, bois juvénile vs. bois
mature) (annexe 5).
Ces deux sources de gènes candidats sont susceptibles de fournir une multitude de gènes
potentiellement impliqués dans le contrôle génétique des caractères étudiés. Il est donc
primordial de définir un crible permettant de trier ces gènes afin d’en extraire les plus
pertinents. Une première stratégie relativement simple à mettre en œuvre pourrait être de
sélectionner les candidats fonctionnels présentant les variations d’expression les plus fortes.
Il faut néanmoins noter qu’un crible basé uniquement sur la différence d’expression des
gènes (niveau des transcrits) serait une erreur pour plusieurs raisons.
i)
Les études d ’expression différentielle ignorent totalement une des sources de
variabilité qui est sans doute responsable de la majeure partie des différences
entre individus observées dans la nature : le polymorphisme de séquences. En
effet un gène peut être exprimé de façon totalement identique, mais présenter
des variations qui vont induire des modifications de la structure de la protéine,
et donc de son activité.
ii)
Il n ’y a pas forcément de relation entre l ’accumulation des transcrits et celle
des protéines. Or ce sont les protéines disponibles qui vont affecter
l ’efficacité des réactions au niveau de la cellule (Griffin et al. 2002).
iii)
Un soin particulier doit être apporté à la définition de la fonction des gènes
candidats sélectionnés. En effet, les banques de données de séquences sont
criblées d ’erreurs d ’annotation qui peuvent entraîner des choix inopportuns.
A titre d ’exemple, un des gènes candidats retenus lors de cette étude (Pp6,
annexe 6), qui avait été isolé lors d ’études d ’expression différentielle et qui
avait été annoté comme étant une « putative senescence protein » (Blast X :
Evalue = 1E-68), s ’est révélé finalement correspondre à un ARN 26S
ribosomique (Blastn). Or ces séquences sont connues pour leur faible niveau
de polymorphisme intraspécifique, ce que nous avons d ’ailleurs pu revérifier ! S ’il ne fait aucun doute que cette séquence est différentiellement
exprimée au sein de différents types de bois, elle ne sera aucunement
impliquée dans la variabilité naturelle des propriétés du bois.
iv)
Outre la définition précise de la fonction des gènes candidats potentiels, leur
cinétique de régulation doit aussi être prise en compte. Est-ce que
l ’expression différentielle d’un gène est à l ’origine de la modification des
propriétés des tissus analysés, ou fait-elle simplement partie de la
modification globale de la machinerie cellulaire ? A titre d’exemple, un gène
impliqué dans la biosynthèse de l ’éthylène (Pp4 = ACC oxydase, annexe 6),
présentant une expression différentielle entre bois comprimé et bois opposé, a
été inclus à la liste de gènes candidats à analyser dans le cadre de cette thèse.
Or des études récentes (Hellgren et al. 2003a,b,c) ont montré que
61
l ’augmentation de la synthèse d ’éthylène était seulement détectée
tardivement après un stimulus gravitropique (menant à la mise en place de
bois de réaction). Ce gène n ’est donc pas directement impliqué dans les
modifications des propriétés intrinsèques du bois, et n’est donc probablement
pas impliqué dans la variabilité naturelle de la qualité du bois.
Ainsi, s ’il n ’existe pas de formule prédéfinie pour la sélection des gènes candidats, leur
choix ne doit pas être cantonné aux gènes différentiellement exprimés, mais doit prendre en
compte l ’ensemble des informations disponibles : fonction, cinétique d ’activation, niveau
d ’expression dans les banques, niveau de polymorphisme déjà observé (éviter les gènes
totalement monomorphes au niveau intra-spécifique).
Au cours de cette thèse, une liste de gènes candidats a été élaborée pour tenter d ’identifier
quelques gènes responsables de la variabilité de la qualité du bois chez le pin maritime
(Tableau 16). Cependant l ’ensemble des critères de sélection cités ci-dessus n’a pas été
pris en compte, ce qui a donc mené à la sélection de gènes peu pertinents (Pp4, Pp6).
Suite à l ’établissement d ’une liste de candidats « pertinents », plusieurs questions se
posent :
i)
ces gènes candidats sont-ils polymorphes ?
ii)
si oui, quel niveau et quel type de polymorphisme sont observés ?
Après avoir répondu à ces questions, nous verrons que ces informations peuvent être
utilisées pour affiner le choix des gènes candidats les plus pertinents.
V.3.2- Le polymorphisme des gènes candidats : d ’un processus manuel très
laborieux à un pipeline de détection automatique des SNP
Afin d ’avoir une vision globale de la diversité des gènes candidats à l ’échelle de l ’aire de
distribution du pin maritime, un échantillonnage englobant des individus issus de différentes
provenances a été effectué (Tableau 17, Figure 25). La pertinence ainsi que les limites liées à
cet échantillon ont été décrites en détail au sein de l ’annexe 6.
Simultanément, une même étude, restreinte quant à elle à la population d’amélioration de
pin radiata du Forest Research Institute (Rotorua, Nouvelle Zélande) a été menée lors d ’un
séjour que j ’ai effectué dans cet institut.
Suite au séquençage des différents gènes candidats, des polymorphismes d’INSertionDELétion (INDEL) et de substitution ponctuelle (SNP) ont été mis en évidence au terme
d’un laborieux processus d ’alignement et de vérification visuelle des séquences obtenues
(Figure 26). Le développement récent de processus automatiques de détection des
polymorphismes devrait permettre une optimisation de cette étape. Les résultats issus de
cette étude ont notamment été utilisés dans le cadre de la mise au point d’une chaîne de
détection automatique de SNP en collaboration avec le Centre de Bio-Informatique de
Bordeaux (CBIB) (annexe 7).
Une forte variabilité des niveaux et des types de polymorphisme (INDEL, SNP, synonyme,
non synonyme) a été mise en évidence au sein des gènes candidats analysés au niveau intra
et inter-spécifique (Tableaux 18 et 19). En moyenne, 1 mutation toutes les 100 pb a été
détectée. Ces résultats sont discutés en détail par la suite.
V.3.3- La structure de la diversité nucléotidique, une indication de la pertinence
des gènes candidats ?
La diversité nucléotidique (niveau et structure) observée au sein d’un gène est la résultante
de son histoire. En effet, elle résulte de la conjugaison des différentes forces évolutives que
sont la dérive génétique, la mutation, la migration et la sélection.
La sélection naturelle peut agir dans trois directions : la sélection de la norme (sélection
stabilisante), la sélection d’un phénotype extrême (sélection directionnelle) et la sélection
pour les deux phénotypes extrêmes (sélection disruptive) (Figure 27). Afin d’essayer
d ’expliquer de façon très simplifiée le fonctionnement de ce processus, faisons l ’hypothèse
que le caractère qui est soumis à la sélection est sous le contrôle d’un gène unique biallélique. Les différentes évolutions phénotypiques observées résultent dans ce cas
directement des différences entre les fitness des génotypes. Ce cas est évidemment
extrêmement simpliste mais a le mérite de montrer comment l ’apparition d’une mutation
induisant des modifications de la fitness des individus qui la portent va modifier la
distribution des caractères phénotypiques et influencer l ’évolution de la diversité génétique
des populations (élimination, fixation ou conservation d’allèles).
La mise en évidence de structures de diversité nucléotidique non neutres, indiquera donc que
le gène indiqué est impliqué dans le déterminisme d ’un caractère soumis à la sélection.
63
V.3.4- La qualité du bois : un caractère adaptatif ?
Des études anatomiques, chimiques et physiologiques ont montré que les modifications
environnementales pouvaient être suivies au sein du bois. Ces effets peuvent être observés à
l ’échelle annuelle (bois initial vs. bois final) mais aussi sur des périodes beaucoup plus
longues (Barber et al. 2000). Il est néanmoins clair que de tels arguments ne suffisent pas à
montrer que la qualité du bois, ou du moins certaines de ses composantes, sont des caractères
adaptatifs, ces modifications pouvant simplement résulter d ’un effet environnemental
affectant de façon identique tous les individus (plasticité phénotypique) et n’ayant donc pas
de conséquences sur l ’adaptation des populations aux contraintes extérieures.
Il est important de rappeler que les propriétés du bois sont caractérisées par une héritabilité
relativement élevée (Zobel et Van Buijtenen 1989). Mais là encore cet argument n ’est pas
suffisant pour montrer que les propriétés du bois sont des caractères adaptatifs. En effet une
héritabilité significative signifie simplement qu ’il existe une variabilité génétique, condition
nécessaire à l ’action de la sélection, mais ne montre en rien que ces caractères y sont
réellement soumis.
En revanche, des études ont montré que la modification de la densité du bois en réponse à un
stress hydrique était sous contrôle génétique (Rozenberg et al. 2002). En d’autres termes,
les individus seraient pourvus d ’une capacité de réponse variable aux contraintes
climatiques, capacité de réponse observable au niveau de la structure anatomique du bois.
Cette capacité de réponse variable des individus pourrait induire une variabilité du succès
reproducteur, en affectant leur résistance aux conditions environnementales extérieures.
Cette relation entre la variation des caractéristiques du bois et le potentiel adaptatif à des
contraintes environnementales comme le stress hydrique est d’ailleurs facilement
compréhensible étant donné que les dimensions des cellules (qui déterminent la densité) vont
directement influencer l ’efficacité du transport de la sève. De plus, des modifications de la
composition chimique des parois des cellules végétales ont souvent été mises en évidence en
réponse à des stress biotiques et abiotiques. Casler et al. (2002) ont notamment mis en
évidence un effet du contenu en lignines sur la fitness.
Ainsi, les propriétés du bois telles que la densité ou la composition chimique des parois
sembleraient être des caractères corrélés à la capacité de survie des arbres en étant impliqués
dans les réponses à des stress climatiques et biotiques.
Il faut cependant noter que de nombreuses études ont montré que les caractères liés à la
fitness présentaient des héritabilités proches de 0 (Mousseau et Roff 1987, Roff et Mousseau
1987, Kruuk et al. 2000). Intuitivement, cette observation paraît effectivement logique. En
effet, considérons un caractère mono-génique, si une mutation conférant un avantage sélectif
apparaît au sein de ce gène, elle va rapidement se fixer dans la population. En l ’absence de
variabilité génétique à ce locus, le caractère va donc être homogène sur l ’ensemble de la
population et son héritabilité sera donc nulle. Ce résultat contredirait donc le fait que les
propriétés du bois, généralement caractérisées par des héritabilités élevées, sont des
caractères adaptatifs. Néanmoins, des écarts à cette règle « caractère adaptatif => Héritabilité
faible voire nulle », peuvent exister. Des caractères adaptatifs peuvent présenter des
héritabilités significatives dans plusieurs cas :
i)
Dans le cas où la population est analysée avant fixation des allèles
favorables, une variabilité génétique existera et le caractère présentera donc
une héritabilité supérieure à 0
ii)
Dans le cas d’une sélection balancée, où les hétérozygotes sont avantagés
par rapport aux deux homozygotes (cf. sélection stabilisante dans Figure
27), les deux allèles sont conservés et une variabilité génétique est donc
maintenue.
iii)
Un différentiel sélectif peut également exister en fonction des zones
géographiques (sélection disruptive) : sélection positive dans l ’une et
sélection négative dans l ’autre. Ces forces sélectives vont aboutir à la
fixation d ’allèles différents, et une variabilité génétique, garante d ’une
héritabilité significative, sera conservée.
iv)
Les optimaux sélectifs peuvent aussi évoluer rapidement (sélection
disruptive), n ’autorisant donc pas la fixation d’un type d ’allèle et menant
à une conservation de la variabilité génétique.
65
Etant donné l ’aire de distribution souvent étendue des arbres forestiers et leur longévité, ces
derniers doivent faire face à des conditions environnementales très variables. Une variabilité
génétique significative pourrait donc être maintenue au sein des populations pour assurer
une adaptabilité optimale à cette diversité de conditions. Les résultats obtenus pour la
discrimination isotopique du carbone (δ13C) vont d’ailleurs dans ce sens. Ce caractère qui
fournit une indication de l ’efficience d ’utilisation de l ’eau (WUE), paramètre lié à
l ’adaptation des arbres à leur environnement, présente une héritabilité significative au sein
des Landes de Gascogne (annexe 8).
Si la mise en évidence d ’héritabilités significatives pour la qualité du bois ne permet pas de
l ’invalider en tant que caractère adaptatif, les résultats obtenus au niveau inter-population
tendraient même à prouver son importance au niveau de l ’adaptation des arbres à leur
environnement. En effet, des différences significatives entre provenances de pin maritime,
caractérisées par des environnements climatiques, pédologiques et biologiques très
contrastés (Figure 28), ont été observées pour la croissance, mais aussi pour l ’hétérogénéité
de la densité et la composition chimique du bois (Tableau 20, Figure 29).
L’observation d ’un effet « Provenance » sur la croissance a déjà été souligné à maintes
reprises, et illustre bien que les arbres issus de différents environnements mettent en place
des stratégies adaptatives différentes : compétition pour la lumière dans les zones où la
ressource nutritive n ’est pas limitante, réduction de la transpiration dans les zones arides….
La mise en évidence d ’effets « Provenance » pour certaines propriétés du bois montre que
l ’adaptation à des environnements variables passe aussi par des modifications de celles-ci.
Si aucune différence significative n’a été mise en évidence pour la densité, en revanche une
variabilité importante de son hétérogénéité en fonction des provenances a été observée. Cette
variation pourrait traduire les sensibilités différentes des populations aux modifications des
conditions environnementales, les populations présentant une forte hétérogénéité du bois
étant moins tolérantes aux modifications environnementales. Il est intéressant de noter que
c ’est l’hétérogénéité du bois final qui présente la plus forte variabilité entre provenances.
Or le bois final correspond à une période de la saison où les conditions climatiques sont les
plus difficiles (stress hydrique).
La mise en évidence d’un effet « Provenance » relativement fort sur le contenu en lignines
rejoint les résultats de Casler et al. (2002) qui ont mis en évidence un lien entre la fitness et
ce caractère chez des plantes herbacées pérennes.
Il est intéressant de noter que les corrélations génétiques observées au sein du demi-diallèle
analysé dans cette thèse corroborent ces différentes observations. En effet des corrélations
fortement significatives ont été mises en évidence entre le δ13C (caractère adaptatif avéré),
l ’hétérogénéité du bois (Et : -0.666, Ei : -0.648, Ef : -0.711) et le contenu en lignines
(0.709).
La mise en avant du rôle adaptatif de la qualité du bois simplement sur la base d observation
de différences significatives entre population est très facilement critiquable. En effet les
différences entre population peuvent aussi résulter de processus purement neutre (dérive).
Néanmoins, des raisons physiologiques semblent pouvoir expliquer les profils de variabilité
observé en fonction des populations, il parait donc pertinent de penser que l ’observation de
telles structures de variabilité résultent d adaptation écologiques locales, ce qui souligne
donc le caractère adaptatif de la qualité du bois.
V.3.5- Comment tester si un gène est neutre ou sélectionné ?
Bien que la quasi-totalité des gènes impliqués dans la xylogénèse soit probablement
polymorphe, seuls quelques-uns d ’entre eux seront responsables de la variation génétique
observée au niveau des différentes propriétés du bois. L ’objectif va donc être d’identifier
ces gènes. Si, comme nous venons de le voir, certaines composantes de la qualité du bois ont
une valeur adaptative, l ’identification de ces gènes pourra suivre deux voies.
V.3.5.1- Si on a le temps…
Lorsqu ’il y a sélection, il y a un différentiel au niveau de la contribution des individus à la
génération suivante, les individus les plus adaptés contribuant de façon majoritaire. Une
façon simple d’identifier les gènes responsables de la variabilité des caractères adaptatifs
est donc d ’observer le succès reproducteur des individus pourvus de génotypes différents au
niveau de ces gènes. Si ce type de démonstration est possible dans le cas d’organismes à
67
temps de génération très court, il n ’est par contre pas envisageable dans le cas d’espèces
telles que les arbres forestiers.
V.3.5.2- A la recherche d ’empreintes de la sélection naturelle au niveau de la
diversité nucléotidique
La sélection naturelle laisse son empreinte sur le polymorphisme des gènes soumis à la
sélection. Cette empreinte dépend du type de sélection que va subir le caractère (Tableau
21). Plusieurs tests permettant de tester si la diversité nucléotidique observée est compatible
avec les effets de la sélection naturelle ont été mis au point (revue de Mc Vean 2003, Ford
2002, Nielsen 2001). Plutôt que de présenter ici l ’ensemble de ces tests, les résultats des
analyses réalisées seront présentés, et leur compatibilité avec l ’existence d ’effets de la
sélection discutée.
V.3.5.3- Des diversités nucléotidiques faibles et comparables chez le pin
maritime et le pin radiata
Les études basées sur les isozymes ont montré que les arbres forestiers faisaient partie des
organismes présentant les plus fortes diversités génétiques (Hamrick et Godt 1990). Les
études de diversité nucléotidique semblent contredire cette tendance (Tableau 22). Cette
divergence pourrait s ’expliquer par la « sensibilité » différente des gènes candidats et des
isozymes à la sélection naturelle.
Chez les conifères, des structures de diversité compatibles avec des effets de sélection
naturelle ont rarement été mis en évidence pour les isozymes (Alden et Loopstra 1987,
Furnier et al. 1991, Yang et al. 1996, Jaramillo-Correa et al. 2001). Ces résultats concordent
avec ceux de Isabel et al. 1995, Isabel et al. 1999 et Szmidt et al. 1996 qui ont observé des
niveaux de différenciation comparables entre isozymes et marqueurs neutres.
Les gènes candidats qui ont été analysés ont quant à eux été choisis pour leur implication
potentielle dans le déterminisme génétique de caractères adaptatifs (stress hydrique, qualité
du bois…). L’observation d ’une diversité nucléotidique faible pourrait donc résulter des
fortes pressions de sélection naturelle. La sélection directionnelle, qui tend à augmenter la
fréquence des allèles favorables et diminuer celle des allèles désavantageux, pourrait en effet
mener à de tels niveaux de diversité.
Cette hypothèse serait d ’ailleurs en accord avec les niveaux de diversité identiques obtenus
chez les deux espèces de pins (Pinus pinaster et Pinus radiata) étudiées dans cette thèse
(Tableau 18).
Une diversité nucléotidique plus faible était attendue chez le Pinus radiata, et ce pour 2
raisons :
i)
le pin radiata est caractérisé par une taille de population effective plus faible que
le pin maritime ce qui se traduit par des niveaux de diversité génétique neutre
plus faibles (Moran et al. 1988, Petit et al. 1995).
ii)
De plus les échantillons considérés auraient dû accroître encore ces différences.
En effet, tandis que des individus de l ’ensemble de l ’aire de répartition du pin
maritime ont été analysés, seuls des individus issus de la population
d’amélioration du Forest Research Institute, elle-même basée sur seulement
deux populations de l ’aire naturelle de distribution, ont été considérés pour le
pin radiata.
Une telle divergence entre les résultats attendus sous une hypothèse neutre et ceux obtenus
sur nos données renforcent l ’hypothèse d’une action de la sélection sur la diversité des
gènes étudiés. Une telle hypothèse serait cohérente avec celle de Maynard-Smith et Haigh
(1974) qui ont suggéré que la sélection directionnelle était susceptible de réduire la diversité
génétique à des niveaux comparables chez des espèces caractérisées par des tailles effectives
de population différentes. Cette hypothèse a d ’ailleurs été validée par simulation par
Gillespie (1999).
V.3.5.4- KORRIGAN, un gène soumis à la sélection naturelle ?
Le test de Tajima permet de tester si la structure de la diversité nucléotidique du gène étudié
est compatible avec une hypothèse de neutralité sélective et d’équilibre démographique.
Dans le cas de KORRIGAN une valeur négative significativement différente de 0 a été
obtenue pour le pin radiata (Tableau 23). Cette valeur négative indique un excès
d’haplotypes rares. Une telle structure de diversité est attendue dans deux cas :
i)
le gène est soumis à une sélection directionnelle (effet d ’ « hitchhiking » menant
à un « selective sweep » : Kaplan et al. 1989 ou à une « background selection » :
Charlesworth et al. 1993)
ii)
la population analysée est en cours d’expansion.
69
Aucune déviation par rapport à la neutralité n’a été mise en évidence au travers du test de
Tajima chez le pin maritime. Néanmoins la structure de diversité observée est quelque peu
intrigante (Tableau 24). En effet des polymorphismes « quasi-spécifiques » ont été mis en
évidence chez les populations du Nord (Landes et Médoc) et du Sud de l ’Europe, la
population de Castets faisant office de population « hybride ». Une telle structure de
diversité peut faire penser à une structuration dictée par une sélection disruptive, qui serait
d ’ailleurs cohérente avec la forte diversité haplotypique observée pour ce gène chez le pin
maritime. Une analyse plus large des populations de pin maritime couplée à une étude de
diversité neutre devrait permettre de tester cette hypothèse.
Aussi, bien que les structures de diversité nucléotidique observées chez les deux espèces ne
concordent pas exactement, elles soulignent toutes deux l’implication probable de ce gène
dans le déterminisme génétique de caractère soumis à la sélection.
Le gène KORRIGAN est impliqué dans la biosynthèse de la cellulose, qui fournit solidité et
flexibilité aux vaisseaux et dont le contenu dans le bois est génétiquement contrôlé (Zobel et
Buijtenen 1989, annexes 1 et 2, Sewell et al. 2002). L ’expression de ce gène est régulée en
fonction du tissu. En effet, Le Provost et al. (2003) ont mis en évidence une sur-expression
de ce gène dans le bois de compression qui est caractérisé par une modification de sa
composition chimique par rapport au bois normal.
Ainsi, si l ’hypothèse démographique ne peut être indubitablement rejetée sans des
informations précises sur la diversité neutre des populations analysées, la concordance des
structures de diversité nucléotidique observées et du rôle de KORRIGAN, est en faveur de
l ’hypothèse sélective.
V.3.5.5- Une Glycine Rich Protein (GRP) et une cellulose synthase présentent
des diversités nucléotidiques très différentes chez Pinus pinaster et Pinus
radiata : une empreinte de la sélection naturelle ou un reflet de la diversité
neutre ?
Deux gènes (Pp1 et CesA3) présentant des niveaux de diversité très différents chez Pinus
radiata et Pinus Pinaster ont été identifiés. De telles différences peuvent avoir deux
origines :
i)
les gènes sont neutres, et les différences résultent donc des différences de taille
effective des populations,
ii)
les gènes sont soumis aux effets de la sélection naturelle. Dans ce cas plusieurs
hypothèses peuvent être formulées : soit le gène est soumis à la sélection chez
une espèce uniquement, soit chez les deux. Dans le second cas, il subit
probablement des « contraintes » différentes selon l ’espèce considérée (âges des
mutations différents, différents types de sélection).
Pour CesA3, aucune déviation par rapport à la neutralité sélective n ’a été détectée. Une
confirmation de ces résultats sur un échantillon d’individus plus large et une zone plus
étendue validerait la neutralité sélective de ce gène. Il est par ailleurs intéressant de noter
qu ’aucune déviation par rapport à la neutralité n ’a été détectée pour les cellulose synthases
étudiées.
Pour la Glycine Rich Protein (GRP : Pp1), des tests D de Tajima significatifs ont été obtenus
chez le pin maritime (P<0.1) et le pin radiata (P<0.05). Les valeurs positives du D de Tajima
indiquent un excès d’haplotypes en fréquence intermédiaire. De telles structures de
diversité nucléotidique peuvent résulter d’une structuration des populations étudiées ou de
l ’action de la sélection naturelle.
Des études d ’expression chez le pin taeda et le pin maritime ont montré que cette GRP était
différentiellement exprimée au sein de bois caractérisés par des propriétés chimiques et
physiques différentes : initial vs. final (annexe 5) et opposé vs. comprimé (annexe 5, Zhang
et al. 2000; Allona et al. 1998). Les Glycine Rich Protein sont supposées être impliquées
dans l ’élasticité et la résistance des tissus vasculaires durant le développement (Cassab,
1998). Bien que les polymorphismes observés au sein de ce gène n ’aient pas de
conséquence sur la séquence protéique, il pourraient néanmoins affecter l ’efficacité de la
transcription (Powell et Moriyama 1997, Brown 1996 et Cai et al. 1998). L’implication de
ce gène dans le contrôle de propriétés soumises aux effets de la sélection naturelle semble
donc possible. Si tel est le cas, plusieurs phénomènes sélectifs peuvent avoir abouti à
l ’obtention d’une telle structure de diversité :
i)
sélection balancée ;
ii)
sélection diversifiante (disruptive) ;
iii)
un phénomène récent de sélection directionnelle en cours de fixation.
L’analyse de la différenciation de ce gène au sein des différentes populations devrait
permettre de définir quelle hypothèse est la plus solide. Bien que les différenciations n ’aient
pas été calculées en raison d ’un effectif faible et très variable d’individus par population,
71
la simple observation des données semble indiquer qu ’une sélection balancée serait la plus
probable chez le pin maritime (Tableau 25). Si l ’on exclut les SNP 8, 11 et 21 qui sont en
fréquences très faibles et sont probablement de nouvelles mutations, seuls trois haplotypes
peuvent être distingués (haplotype recodé). Deux de ces haplotypes (le troisième (5) en
découle probablement par recombinaison) sont en fréquence très élevée (haplotypes 1 = 10 ;
haplotypes 2 = 10) et sont présents dans l ’ensemble des populations analysées.
Dans le cas du pin radiata, l ’interprétation du test de Tajima significatif est confrontée à
plusieurs limites : faible niveau de polymorphisme, origine précise des individus inconnue…
Il est néanmoins possible, si ce gène est soumis à la sélection chez le pin maritime, qu ’il le
soit aussi chez le pin radiata. Même dans le cas d’une hypothèse sélective, le plus faible
niveau de polymorphisme observé chez le pin radiata pourrait résulter i) du bottleneck subi
par la population de pin radiata analysée, d ’une part lors de son introduction en Nouvelle
Zélande et d ’autre part lors de la sélection phénotypique menée sur la population locale
pour constituer la population d’amélioration.
Néanmoins, comme dans le cas de KORRIGAN, l ’hypothèse démographique (structuration
des populations) ne pourra pas être éliminée définitivement tant que des données précises sur
la diversité neutre ne seront pas disponibles chez le pin maritime et le pin radiata.
V.3.5.6- Des signes de sélection balancée détectés sur une déhydrine
Plusieurs signes indiquent que le gène Pr2, différentiellement exprimé entre bois juvénile et
bois mature chez le pin radiata, est impliqué dans la variation d’un caractère soumis à la
sélection. En effet, un haut niveau de polymorphisme, des tests de Tajima positifs chez les
deux espèces, et un excès de mutations non synonymes ont été observés pour ce gène. La
mise en évidence d ’une signature moléculaire de la sélection naturelle sur ce gène serait en
accord avec les résultats obtenus par ailleurs qui ont mis en évidence l ’importance
adaptative de ce gène.
Ce gène appartient à la famille des déhydrines qui sont parmi les protéines les plus
couramment induites en réponse à des stress de déshydratation ou de froid (Close 1997,
Choi et al. Close 1999). En plus de cette relation entre l ’expression des gènes de déhydrines
et les stress abiotiques, leur variabilité génétique a été mise en cause dans les capacités de
résistance au stress :
i)
co-localisation avec des QTL de résistance au stress hydrique (Campbell et Close
1997)
ii)
variation d’expression au sein de génotypes plus ou moins résistants au stress
hydrique chez le blé (Suprunova et al. 2002)
iii)
association entre mutation affectant la structure protéique d’une déhydrine et
résistance au froid chez Vigna unguiculata (Ismail et al. 1999)
L’observation de 21 polymorphismes intra-spécifiques chez les 2 espèces de pins étudiées,
et l ’absence totale de différence fixée entre les deux espèces constituent d ’autres
caractéristiques originales de ce gène. Une telle structure de diversité serait concordante avec
une sélection balancée (« over-dominance »). Cette hypothèse est d ’ailleurs renforcée par la
structuration de la diversité nucléotidique au sein des différentes populations de pin maritime
(Tableau 26) : les haplotypes en fréquences intermédiaires (5, 1 et 3) sont présents au sein
des différentes populations analysées. La détection d ’un polymorphisme conservé entre
Pinus pinaster et Pinus radiata au sein de ce gène (le seul détecté dans cette étude) constitue
un autre indice allant dans le sens de l ’hypothèse de sélection balancée (Takahata et Nei
1990).
V.3.5.7- Des structures de diversité nucléotidique variables invalidant
l ’hypothèse démographique
Trois gènes présentant des signes de sélection ont donc été mis en évidence (KORRIGAN,
GRP, Pr2). Le fait que différents types de sélection aient été détectés souligne en partie la
validité de ces résultats. En effet si des processus démographiques étaient à l ’origine des
signatures moléculaires détectées, ces dernières devraient être identiques pour tous les gènes
au sein d’une espèce. Or ce n ’est pas le cas ici. L ’observation de déviations par rapport à
la neutralité correspondant à différents types de sélection a par ailleurs été mise en évidence
pour d’autres gènes impliqués dans la biosynthèse des lignines sur le même échantillon
d’individus (Garnier Géré et al, en préparation). L ’absence de mise en évidence de
sélection pour les autres gènes ne signifie néanmoins pas que ceux-ci sont neutres. En effet,
étant donné la taille des fragments étudiés, peu de polymorphisme a été détecté ce qui
diminue fortement la puissance de détection des tests utilisés.
Des analyses complémentaires vont donc devoir être menées :
73
i)
d’une part au niveau neutre pour vérifier l ’état démographique des populations
analysées (des marqueurs microsatellites sont en cours de développement, Thèse
de David Chagné),
ii)
et d’autre part sur les gènes étudiés : extension des zones analysées, calcul des
déséquilibres de liaison et études des différenciations nucléotidiques.
V.3.5.8- Des gènes soumis à la sélection, porteurs d’une amélioration
adaptative?
La détection d ’une signature moléculaire imputable à la sélection naturelle constitue la
preuve que le gène étudié est impliqué dans le contrôle génétique d’un caractère soumis à la
sélection. Une telle mise en évidence souligne donc l ’intérêt de ce gène dans un contexte de
recherche de marqueurs utilisables en sélection. En revanche, si l ’objectif est d ’identifier
les gènes ayant participé à l ’évolution adaptative de l ’espèce, ces résultats ne sont pas
suffisants. Il est dans ce cas nécessaire de montrer que la signature de la sélection détectée
résulte de l ’apparition de mutations adaptatives.
Ni l ’élimination des mutations délétères (sélection directionnelle négative, « purifiante »),
ni la sélection balancée ne contribuent à l ’évolution à long terme des espèces (Hugues
1999, Mc Vean 2003). En revanche la fixation des allèles avantageux au sein des
populations constitue la base de l ’adaptation des individus à leur environnement. Ce type de
sélection correspond à deux des cas qui ont déjà été discutés auparavant : sélection
directionnelle positive et sélection disruptive.
Si la sélection disruptive partage de nombreuses propriétés avec la sélection balancée, ces
deux phénomènes peuvent cependant être différenciés grâce à l ’étude de la structuration de
la diversité nucléotidique entre les populations (cf Pp1).
La distinction des cas de sélection directionnelle positive et négative est quant à elle plus
ardue. Des tests basés sur les fréquences haplotypiques ont été mis au point, mais ils restent
difficiles à utiliser dans le cas d ’espèces pour lesquelles la distribution du taux de
recombinaison est mal connue (Htest : Fay et Wu 2000, Kim et Stephan 2000, 2002). Des
tests applicables dans le cas d’apparitions successives de mutations favorables ont été mis
au point, mais ces derniers ne sont pas puissants dans le cas de l ’apparition d ’une seule
mutation favorable (Test de Mac Donald Kreitman, test dN/dS…).
Dans le cadre de cette étude, à l ’exception du gène Pr2 chez le pin maritime et
probablement chez le pin radiata (si les INDEL sont pris en compte), aucune sélection
positive n’a été mise en évidence (Tableau 23). Mais là encore, les résultats doivent être
interprétés prudemment. En effet, en raison du faible nombre de polymorphismes détectés au
sein des régions codantes, ces tests ne sont pas très puissants.
75
76
Chapitre VI- Identification des gènes impliqués dans la variabilité
de la qualité du bois : 2- Associations entre les gènes candidats et la
variabilité des caractères ?
77
VI- Association Gène candidat – Caractère ?
VI- Identification des gènes impliqués dans la variabilité de la
qualité du bois : 2- Associations entre les gènes candidats et la
variabilité des caractères ?
Suite à la définition d’une liste de gènes candidats polymorphes, l ’idée est de tester
l ’action de leurs polymorphismes sur les caractères cibles que l ’on souhaite sélectionner.
Deux approches ont été suivies, l ’une basée sur l ’utilisation d ’un pedigree et l ’autre sur
des populations d ’arbres « non » apparentés.
VI.1- L ’approche « Pedigree » : co-localisation gène candidat - QTL
Une des approches pour tenter de mettre en évidence l ’effet du polymorphisme d’un gène
candidat sur des caractères cibles est la recherche d ’une co-localisation entre sa position sur
une carte génétique et celle de QTL identifiés pour le caractère (Byrne et al. 1996, Lage et
al. 1997, Prioul et al. 1997)
Outre ceux déjà présentés dans ce document, plusieurs autres gènes candidats impliqués dans
la biosynthèse des lignines, des polysaccharides et des protéines pariétales ont aussi été
inclus à cette étude (Tableau 27). Suite au séquençage des 2 parents du pedigree de
cartographie, les gènes polymorphes ont été génotypés sur 90 individus en utilisant la
technique d’extension d ’amorce (Figure 30). Afin d’éviter des co-localisations fortuites
résultant de l ’imprécision de la carte consensus générée à partir des marqueurs ségrégeant
dans des proportions ¾ ¼, les comparaisons entre les positions des QTL et celles des gènes
candidats n’ont été menées que sur les cartes parentales.
En ce qui concerne les données de la cinétique, des co-localisations ont été observées sur le
groupe de liaison 6. PAL, CCoAOMT et CesA01 co-localisent avec des QTL de densité et
de croissance. Il est de plus intéressant de noter qu’un QTL d ’efficience d’utilisation de
l ’eau est aussi cartographié sur ce même groupe de liaison à proximité de la CCoAOMT
(δ13C, annexe 8).
Ces 3 gènes sont impliqués dans les voies de biosynthèse de la cellulose et des lignines
(Figure 31). Au sein du diallèle des corrélations génétiques significatives ont été mises en
évidence entre ces composés chimiques (cellulose et lignines), la croissance, la densité
78
(annexe 2) et δ13C. Les co-localisations observées ici sont donc en accord avec ces résultats.
Néanmoins, aucun QTL de contenu en lignines, en cellulose ou d’autres propriétés du bois
n’a été mis en évidence à proximité de ces gènes. Ce résultat pourrait résulter de
l ’évolution du contrôle génétique de la qualité du bois durant la maturation. En effet les
QTL détectés sur ce groupe de liaison sont spécifiques à des groupes d’âges cambiaux bien
précis.
VI.1.1- KORRIGAN : un gène clé de la qualité du bois ?
Sur le groupe de liaison 12, une co-localisation entre des QTL de densité, de croissance,
d ’hétérogénéité du bois et KORRIGAN a été mise en évidence. Cette co-localisation a été
détectée non seulement sur la carte mâle mais aussi sur la carte femelle (Figure 32). De plus,
des QTL de composition chimique et de propriétés des fibres ont été mis en évidence dans la
même zone chromosomique (alfacel, hemicel, morphologie et propriétés physiques des
fibres) chez les deux parents. Enfin, un QTL de δ13C a été mis en évidence dans cette même
zone chromosomique chez la femelle (annexe 8).
KORRIGAN est une β 1-4 endo-glucanase qui a été isolée chez un mutant de paroi
d ’ Arabidopsis (Nicol et al. 1998). Si son rôle précis reste encore obscur (Hermann Hofte,
communication personnelle), plusieurs études ont montré son implication dans la voie de
biosynthèse des polysaccharides. L’observation de co-localisations entre sa position et des
QTL de contenu en cellulose et en hémicellulose est donc tout à fait cohérente. Le
regroupement de QTL de densité, de croissance, de propriétés des fibres et de δ13C dans cette
même zone chromosomique coïncide de plus avec les résultats issus du diallèle.
Ces résultats corroborent ceux obtenus lors de l ’analyse de la structure de la diversité
nucléotidique de ce gène. Cette analyse avait en effet montré que KORRIGAN semblait être
soumis aux effets de la sélection naturelle. La mise en évidence de l ’implication probable
de KORRIGAN dans le déterminisme génétique de la cellulose (qui est fortement corrélée
au contenu en lignines), la croissance, l ’hétérogénéité de la densité et du δ13C, caractères
pouvant être définis comme non neutres, est donc tout à fait logique.
L’ensemble de ces indices laissent donc penser que KORRIGAN pourrait avoir un rôle au
niveau de l ’adaptation des arbres à leur environnement au travers de la modulation de leurs
propriétés du bois.
79
VI.1.2- Les limites de l ’approche « Pedigree »
L’observation d ’une co-localisation entre un gène candidat et des QTL est parfois avancée
comme une forte présomption du lien existant entre un gène et un caractère. Si cette
conclusion est vraie dans le cas où la détection de QTL est faite dans le contexte d’une
cartographie très fine (densité de marqueurs très élevée nécessitant des tailles de pedigree
très grandes), elle est par contre sujette à caution dans le cas où la précision de la carte est
faible. En effet, dans ce cas, qui est d’ailleurs le plus courant,
i)
la fenêtre de déséquilibre autour du site responsable de la modification du
caractère est très large (Figure 23)
ii)
la taille des intervalles de confiance des QTL est très grande et contient souvent
plusieurs centaines de gènes.
L’utilisation directe de gènes candidats présentant des co-localisations avec des QTL au
sein d ’un programme d ’amélioration présenterait donc des risques. La mise en évidence
d ’une co-localisation gène-QTL, même si celle-ci est cohérente avec les données
physiologiques disponibles, doit être interprétée comme une indication et non comme une
validation.
VI.2- L ’approche « Population »
A l ’inverse des pedigrees de cartographie au sein desquels un déséquilibre de liaison très
fort est généré par croisement, les populations naturelles d’arbres forestiers sont quant à
elles supposées être proches de l ’équilibre. En effet, en raison des nombreuses générations
qui ont eu lieu, la fenêtre de déséquilibre autour d’un site donné du génome est très étroite
(Figure 23).
L’approche « population » a largement été utilisée en Génétique humaine. Originellement
cantonnée aux études qualitatives (Case Control test), cette approche a été adaptée à l ’étude
des caractères complexes (Emahazion et al. 2001). Les premiers résultats issus de cette
approche chez les plantes ont été obtenus par Thornsberry et al. (1998) qui ont mis en
évidence l ’effet du gène dwarf8 sur la phénologie du maïs. Mis à part cette étude, peu
d ’exemples sont encore disponibles chez les plantes.
80
VI.2.1- Recherche d ’associations au sein d ’un demi-diallèle
Disposant de données phénotypiques sur une population d’individus « partiellement »
indépendants (demi-diallèle, annexes 1, 2 et 8), l ’idée a été de tester si les différences
observées pouvaient être reliées aux génotypes des parents. Cette approche a été utilisée
auparavant par Arcade et al. (1996) et Verhaegen et al. (1998) sur des plans de croisement
factoriels d ’hybrides inter-spécifiques de mélèze et d ’eucalyptus. Ces deux études ont
permis la mise en évidence de relations significatives entre les doses alléliques parentales et
les performances des familles de pleins-frères (Tableau 28, Figure 33). Le même principe a
ensuite été appliqué par Kumar et al. (2003) à un test de pin radiata impliquant 45 parents
mâles et 5 parents femelles. Des relations significatives ont là encore été mises en évidence.
Néanmoins, les auteurs ont souligné le fait que le type de plan de croisement utilisé pouvait
influencer très fortement les résultats. Il est en effet clair que la structuration de la population
utilisée peut induire l ’obtention de tests significatifs n’ayant aucune valeur biologique
(Emahazion et al. 2001, Pritchard et al. 2000). Par ailleurs, au sein de plans de croisement
tels que des factoriels ou des diallèles, un autre biais vient s ’ajouter. En effet les
performances des familles de pleins-frères ne sont pas indépendantes et sont même
fortement auto-corrélées. Cette structure d’auto-corrélation peut donc mener à la détection
de liaisons entre polymorphismes de marqueurs sans véritable cause biologique.
La solution serait donc de prendre en compte cette information (matrice de variancecovariance des coefficients d’apparentement) au sein d’un modèle mixte d’analyse
linéaire. Néanmoins, étant dans l ’incapacité de trouver un logiciel autorisant l ’utilisation
d ’une matrice de variance-covariance personnelle dans le modèle, celui-ci n ’a pas pu être
implémenté (ASREML pourrait peut-être le permettre). Les analyses ont donc été réalisées
simplement en testant, non plus l ’effet de la dose allélique sur les performances familiales
comme l ’avait fait Arcade (1996) et Verhaegen (1998), mais l ’effet du génotype parental
sur les AGC.
Le calcul des AGC prend en compte les apparentements existant entre les individus et
fournit donc des valeurs indépendantes. Si ce modèle d ’analyse est moins biaisé que les
modèles classiques, sa puissance est en revanche très faible. Dans notre cas, seules 12 AGC
étant disponibles, l ’analyse se résume donc à tester si un lien existe entre ces 12 AGC et les
12 génotypes parentaux. Cette analyse a été réalisée d ’une part en considérant le génotype
81
parental comme régresseur et d ’autre part comme un facteur afin de détecter les effets
additifs et de dominance.
Les relations entre les polymorphismes de 11 gènes candidats et les AGC de 13 caractères
ont été testées (Tableau 29). Si aucune des associations mises en évidence ne supporte la
correction pour des tests multiples (Bonferroni : pv < 0.000112 pour 455 tests), plusieurs
d’entre elles peuvent toutefois être considérées comme « potentiellement » significatives
(pv < 0.05). Comme nous allons le voir dans les paragraphes suivants, leur validité
potentielle est d’autant plus légitime qu ’elle est cohérente avec les études physiologiques
et génétiques menées précédemment.
VI.2.1.1- Pr2 : une protéine de réponse au stress hydrique impliquée dans le
déterminisme de la variabilité du bois ?
Pr2 fait partie de la famille des déhydrines qui sont parmi les protéines les plus couramment
induites en réponse à des stress de déshydratation ou de froid. Leur variabilité génétique a
été liée chez plusieurs espèces aux capacités de réponse à ces stress. Ce gène précis (Pr2) a
été isolé quant à lui chez le pin radiata, chez lequel il présente une expression différentielle
entre bois juvénile et mature, deux types de bois présentant des caractéristiques anatomiques,
chimiques et physiques très différentes (figure 3). Il est d’ailleurs intéressant de noter que
les caractéristiques du bois mature au sein duquel il est sur-exprimé sont très proches de
celles du bois final, qui est synthétisé lorsque les conditions environnementales deviennent
plus difficiles (stress hydrique notamment).
La mise en évidence d ’une association entre son polymorphisme et l ’hétérogénéité de la
densité du bois concorde avec ces résultats. En effet, il semble, au vu de l ’analyse du test de
provenances, que ce caractère soit lié à la capacité de réponse au stress (tableau 21). Ces
résultats rejoignent aussi ceux issus de l ’analyse de la structure de sa diversité nucléotidique
qui avait révélé une déviation significative par rapport à la neutralité sélective. La diversité
nucléotidique observée au niveau de cette déhydrine semble donc constituer un des
déterminants majeurs des capacités de réponse au stress hydrique non seulement chez les
espèces de grandes cultures, mais aussi chez les arbres forestiers.
82
VI.2.1.2- PAL : Une enzyme clé de la voie de biosynthèse des
phénylpropanoïdes responsable de la variabilité observée pour le contenu en
lignines ?
PAL (Phénylalanine Ammonia-Lyase) est la première enzyme de la voie de biosynthèse des
phénylpropanoïdes (Figure 31). Des associations significatives ont été trouvées entre deux
de ses polymorphismes, la croissance (SNP 193), le contenu en lignines (SNP 542) et le
rapport isotopique du carbone (δ13C, SNP 542).
Ces résultats sont cohérents avec l ’ensemble des études menées sur ce gène :
i)
des études transgéniques ont montré qu’une sous-expression de ce gène induisait
une réduction du contenu en lignines (Sewalt et al. 1997; Bate et al. 1994 ;
Elkind et al. 1990) et une altération de la croissance (Elkind et al. 1990).
ii)
La proximité entre PAL et un QTL de composition chimique du bois a été mise
en évidence chez le pin taeda (Brown et al. 2003). De plus, des co-localisations
entre croissance et densité ont été observées chez le pin maritime (Tableau 26).
Ces résultats indiqueraient donc l ’effet probable des polymorphismes de PAL sur la
composition chimique du bois et notamment sur les lignines. Cet effet serait d’ailleurs tout
à fait complémentaire avec la mise en évidence de l’implication de PAL dans des
phénomènes de résistance au stress :
i)
des études d ’expression différentielle menées chez le pin maritime ont mis en
évidence une sur-expression de la PAL chez des pins maritimes soumis à un
stress hydrique (Frigerio et al. 2003) et au sein du bois final (Le Provost et al.
2003).
ii)
Maher et al. (1994) et Pallas et al.(1996) ont souligné une sensibilité accrue des
plantes présentant une activité PAL réduite aux pathogènes.
De plus, des résultats récents encore en cours d ’analyse semblent indiquer que ce gène
présente une structure de diversité génétique compatible avec un effet de la sélection
naturelle (Garnier Géré et al. en préparation).
Ces différents signes :
i)
les associations des polymorphismes avec le contenu en lignines, l ’efficience
d’utilisation de l ’eau et la hauteur, qui sont des caractères adaptatifs,
ii)
l ’implication dans des réponses au stress,
83
iii)
la déviation observée par rapport à la neutralité sélective,
permettent de proposer cette enzyme comme l ’un des gènes majeurs impliqué dans le
déterminisme génétique du contenu en lignines.
VI.2.1.3- CAD : un gène impliqué dans le déterminisme moléculaire de la
densité ?
Les résultats obtenus au cours de cette étude ont mis en évidence des effets des
polymorphismes de la CAD, une enzyme de la voie spécifique de biosynthèse des lignines,
sur la densité du bois et les propriétés des fibres. Des résultats convergents ont été obtenus
chez le peuplier, pour lequel une modification de la densité du bois a été mise en évidence
chez des plantes sous exprimant ce gène (P. Rozenberg et G. Pilate, communication
personnelle).
L’implication de la CAD dans la voie de biosynthèse des lignines, pourrait laisser supposer
son implication dans le déterminisme génétique de leur quantité. Néanmoins, les études de
plantes transformées et d’un mutant naturel de pin taeda ont montré que ce gène était plus
fortement impliqué dans le déterminisme de la composition des lignines plutôt que dans leur
quantité (Boerjan et al. 2003, Lapierre et al. 2000, MacKay et al. 1997, MacKay et al.
2001, Ralph et al.1997). Conformément à ces résultats, aucune liaison entre le
polymorphisme de la CAD et le contenu en lignines n ’a été mise en évidence.
Parallèlement, les études de diversité nucléotidique n’ont pas pour l ’instant permis de
mettre en évidence une signature moléculaire nette de la sélection naturelle au sein de ce
gène (P. Garnier Géré, communication personnelle). Les associations observées avec la
densité du bois et les propriétés des fibres seraient en accord avec ces résultats. En effet, au
vu des résultats obtenus lors de l ’analyse du test de provenances, aucune différence n’a pu
être mise en évidence entre les différentes provenances pour la densité, ce qui laisserait donc
penser que cette composante de la qualité du bois n ’a pas de signification adaptative.
VI.2.1.4- Une Glycine Rich Protein associée à la variabilité de la composition
chimique des parois ?
Une association significative entre le polymorphisme d ’une GRP (Pp1) et la variation du
contenu en cellulose a été mise en évidence. Cette association coïncide avec les résultats
obtenus précédemment :
84
i)
Expression différentielle de cette GRP entre bois initial et bois final (Le Provost
et al. 2003a) et entre bois de compression et bois opposé (Le Provost et al. 2003a,
Zhang et al. 2000; Allona et al. 1998)
ii)
les GRP ont un rôle supposé dans l ’élasticité et la résistance des parois (Cassab,
1998)
Bien qu ’un lien direct entre le polymorphisme de cette GRP et la biosynthèse de cellulose
ne soit pas évident, le rôle de chaperonne des GRP dans la construction des parois végétales
(http://employees.csbsju.edu/ssaupe/biol327/cell-wall.htm)
pourrait
expliquer
le
lien
observé.
La mise en évidence d’une structure de diversité non neutre de ce gène chez le pin maritime
(paragraphe V.3.3.5) coïncide de plus parfaitement avec la liaison observée entre le
polymorphisme de ce gène et le contenu en cellulose. En effet, la teneur en cellulose est très
corrélée à la teneur en lignines (annexes 1, 2, Eveno 2003), dont l ’implication dans les
processus adaptatifs semble claire (Casler et al 2002…).
VI.2.1.5- KORRIGAN : un mutant d’Arabidopsis contrôlant la variabilité de
la qualité du bois chez le pin maritime
Des associations entre le polymorphisme de KORRIGAN, le contenu en lignines (SNP 8) et
l ’efficience d’utilisation de l ’eau (SNP 14) ont été mises en évidence. Ces résultats
coïncident avec les différents résultats obtenus sur ce gène :
o implication dans la voie de biosynthèse des polysaccharides (plus
particulièrement hémi et alpha-cellulose) dont les quantités sont très corrélées
au contenu en lignines,
o co-localisation avec des QTL de composition chimique du bois (Figure 12) et
de δ13C,
o et structure de diversité nucléotidique concordante avec l ’effet de la sélection
(paragraphe V).
La mise en évidence d ’une liaison entre le polymorphisme de KORRIGAN et le contenu en
lignines plutôt qu ’avec celui en polysaccharides peut sembler surprenant. Néanmoins, ce
résultat est aisément explicable. Les contenus en cellulose et en hemicellulose présentent des
coefficients de variation très faibles (2,87 et 1.78 % respectivement), encore inférieurs à
85
celui en lignines (4.06 %). Or ces différents caractères sont très fortement corrélés au niveau
génétique. La mise en évidence d ’une liaison entre le contenu en lignines et le
polymorphisme de KORRIGAN peut donc résulter de l ’effet indirect que KORRIGAN a
sur ce caractère au travers de son action sur la biosynthèse des polysaccharides, action non
détectable en raison d’un niveau de variation génétique plus faible.
La détection simultanée d ’une déviation par rapport à la neutralité du gène KORRIGAN et
de ses associations avec des caractères adaptatifs constitue donc un signe très fort du rôle
qu ’il semble jouer dans la composition chimique du bois.
VI.2.1.6- Mais des résultats sur des marqueurs neutres dérangeants…
Parallèlement aux gènes candidats, 48 marqueurs AFLP ont été génotypés sur les 12 parents
du diallèle.
Au sein du pedigree de cartographie, 24 de ces marqueurs étaient liés avec les caractères : 4
étaient cartographiés au sein de l ’intervalle constitué par le pic de LOD obtenu sur les
données réelles et le pic de LOD obtenu par Bootstrap. Les 20 marqueurs restant étaient
situés dans l ’intervalle de confiance à 95% des QTL.
Seuls 2 de ces marqueurs présentaient des associations identiques dans le pedigree de
cartographie et le demi-diallèle. A36-298, qui est cartographié sur le GL8f, co-localise avec
un « cluster » de QTL incluant des propriétés chimiques du bois (alfacel, hemicel) et des
propriétés des fibres (wfl, afl, fw, coars) et présente des associations avec certaines propriétés
des fibres (wfl, fw, coars) dans le demi-diallèle. Il est d’ailleurs intéressant de noter que ce
cluster de QTL a aussi été observé chez le pin taeda (annexe 4). De la même façon, A118370 (GL1m) co-localise avec des QTL de lignines et d ’extractibles et présente des
associations avec le contenu en lignines, en alpha-cellulose et l ’hétérogénéité du bois dans
le demi-diallèle. Le manque de stabilité des associations détectées pour les marqueurs AFLP
au cours de l ’approche pedigree et de l ’approche « population » tendrait donc à indiquer,
comme attendu, une réduction de la fenêtre de déséquilibre de liaison au sein du demidiallèle.
Néanmoins, le nombre d’associations détectées avec les marqueurs AFLP (Tableau 30 : 37
tests significatifs sur 624 au total, significatifs à 5% mais non significatifs lorsque la
correction de Bonferroni est appliquée) est quelque peu surprenant. En effet, les 12 parents
du diallèle étant non-apparentés, la fenêtre de déséquilibre de liaison attendue est très étroite,
86
et aucune association entre des marqueurs AFLP, qui sont considérés comme neutres,
n’aurait dû être observée. Pourtant, 20 des 48 marqueurs présentent des associations avec la
qualité du bois. Cinq hypothèses peuvent être avancées pour expliquer ces associations :
i)
les marqueurs AFLP se trouvent dans les gènes candidats
ii)
du déséquilibre de liaison physique à longue distance persiste dans la population
naturelle de pin maritime landaise
iii)
les 12 parents sont issus de populations différenciées au niveau phénotypique et
génétique (par effet de dérive), et les associations révèlent simplement des
associations statistiques n ’ayant aucune validité biologique
iv)
Les 37 associations détectées sur les 624 testées avec les marqueurs AFLP, ce qui
correspond a 5.9 % des tests, correspondent simplement au nombre de tests
significatifs attendus par chance (5.9 % non significativement différent des 5%
attendus par chance ?)
v)
Un problème statistique ?
La première hypothèse est peu plausible. En effet, il est peu probable que sur 48 marqueurs
testés, 20 se trouvent dans les gènes impliqués dans les caractères analysés !!!
La seconde hypothèse peut elle aussi être rejetée. En effet des études en cours (P. Garnier
Géré, communication personnelle) menées au sein de la provenance Aquitaine montrent que
les déséquilibres de liaison diminuent généralement très rapidement.
Les études de génétique des populations ont montré que la différenciation était très faible au
sein de cette même provenance (<4%), ce qui permet donc de rejeter la troisième hypothèse.
La quatrième hypothèse semble relativement pertinente : un taux de 5.9% des tests
significatifs n’étant probablement pas différent des 5% attendus par chance, ces
associations ne sont sans doute pas réelles. Néanmoins si l ’on accepte cette explication le
nombre d’associations mis en évidence avec les gènes candidats n ’excède pas non plus ce
niveau de 5%, leur validité ne sera donc pas complètement statistiques mais dépendra du fait
que l ’on sait que ces gènes « doivent » être impliqués dans les caractères étudiés.
La dernière hypothèse qui permettrait d expliquer ce nombre d association détecté avec des
marqueurs supposés neutres serait l ’existence d ’un problème statistique qui biaiserait les
résultats obtenus au sein de cet essai. Des permutations ont permis de montrer que les
résultats n’étaient pas obtenus par chance. Le biais pourrait donc provenir de l ’échantillon
87
de faible taille de parents sélectionnés, qui par chance présenteraient des caractéristiques
phénotypiques variables et corrélées à la variabilité des marqueurs AFLP. Une telle
explication remettrait donc en cause la validité des associations mises en évidence pour les
différents gènes candidats. Néanmoins, les associations observées entre gènes candidats et
caractères de qualité du bois sont cohérentes avec l ’ensemble des résultats obtenus dans la
bibliographie et les différentes analyses réalisées au cours de cette étude, ce qui tendrait donc
à prouver qu ’au moins certaines d’entre elles sont valides. Il est donc maintenant crucial
de tester ces polymorphismes dans des plans d’expériences contenant un plus large effectif
de géniteurs. Ces travaux ont été initiés dans le cadre du projet Européen GEMINI, et
quelques résultats marquants sont présentés dans le paragraphe suivant.
VI.2.2- Validation des résultats au sein d’un test clonal
De nombreuses études de génétique humaine font état du manque de répétabilité des
résultats obtenus au cours des études d’associations (Emahazion et al. 2001). L’une des
clés de la mise en évidence de l ’effet d ’un gène sur un caractère est donc sa détection
multiple.
Au sein du projet européen GEMINI une première étude d’association impliquant 180
clones issus de 70 parents a été réalisée. Cette étude constitue un test totalement indépendant
des analyses réalisées au cours de cette thèse. La mise en évidence de résultats concordants
avec ceux obtenus lors de ce travail constituerait donc des signes très forts de leur validité.
L’ensemble de ces analyses a été réalisé par Emmanuelle Eveno lors de son stage de DEA
au sein de l ’équipe.
Les effets de quatre des gènes étudiés dans cette thèse (CAD, PAL, Pr2 et la GRP) ont été
analysés, et des associations significatives entre leurs polymorphismes et différentes
composantes de la qualité du bois ont été mise en évidence :
effets de la PAL sur la composition chimique du bois et la croissance,
effet de la Pr2 sur la composition chimique du bois,
effet de KORRIGAN sur la biosynthèse des polysaccharides,
effet de la CAD sur la croissance.
Ces résultats correspondent donc à ceux mis en évidence lors de cette thèse. Ces gènes
seraient donc bien impliqués dans la variabilité génétique de la qualité du bois.
88
89
Chapitre VII- Conclusions et perspectives
90
Conclusions et perspectives
VII- Conclusions et perspectives
VII.1- L ’amélioration génétique de la qualité du bois
VII.1.1- Une amélioration traditionnelle efficace mais non optimale
Une amélioration significative de la qualité du bois est possible pour de nombreux
caractères. Néanmoins, les corrélations génétiques entre les différents caractères cibles de la
sélection (croissance en hauteur, rectitude du fût, densité du bois, composition chimique…)
devront être prises en compte.
La définition d ’un ou de plusieurs index de sélection pertinents et adaptés aux différentes
utilisations du bois de pin maritime ne sera néanmoins possible que lorsque les différents
acteurs de la filière bois-papier auront précisé leurs attentes. En l ’absence de telles
directives, la croissance, la rectitude, la densité et la composition chimique du bois peuvent
néanmoins être considérées comme des caractères cibles pertinents, affectant de manière
significative les propriétés du bois indépendamment de ses utilisations.
Par ailleurs, la stabilité temporelle du contrôle génétique de la qualité du bois laisse entrevoir
des possibilités de sélection précoce. La caractérisation des tests de descendances mis en
place depuis 7 ans par le Groupement d ’intérêt scientifique « pin maritime du futur »
pourraient d’ores et déjà permettre l ’identification des génotypes présentant une bonne
qualité du bois au sein de la population déjà sélectionnée pour la croissance et la rectitude du
fût. Dans ce contexte, une plate-forme technologique permettant la mesure de la qualité du
bois (densité par rayon X et composition chimique par SPIR) est en cours de construction
sur le site de l ’INRA de Pierroton.
Néanmoins la sélection traditionnelle sera toujours confrontée au coût des mesures
phénotypiques, et à l ’absence d’une connaissance précise du déterminisme génétique des
différentes composantes de la qualité du bois, ce qui réduira donc son efficacité.
VII.1.2- Utilisation de la SAM pour améliorer l ’efficacité de la sélection pour la
qualité du bois
Comme nous venons de le voir, une efficacité optimale de la sélection ne sera atteinte qu’au
travers de la compréhension précise du contrôle génétique de la qualité du bois. Dans ce
91
contexte, ce travail de thèse a contribué à la compréhension partielle de l ’architecture
génétique de quelques composantes de la qualité du bois, ainsi qu ’à l ’identification de
quelques gènes impliqués dans leur déterminisme moléculaire. Ces résultats ouvrent la voie
à l ’utilisation de la sélection assistée par marqueurs (SAM) pour la qualité du bois.
Bien que Lande et Strauss (1992) prévoyaient que la SAM aurait un intérêt restreint chez les
arbres forestiers (sélection au sein de pedigree uniquement), les résultats obtenus laissent
envisager une utilisation possible non seulement au niveau intra- mais aussi inter-famille. En
effet, l ’identification précise des gènes impliqués dans la variabilité des caractères
quantitatifs permet de contourner les problèmes liés au manque de déséquilibre de liaison au
sein des populations non apparentées.
Néanmoins, un affranchissement complet et immédiat des mesures phénotypiques serait sans
doute une grave erreur. En effet :
i)
les effets des gènes candidats sont pour l ’instant estimés de façon imprécise, et il
serait très hasardeux d ’avancer des gains génétiques attendus grâce à la SAM.
Contrairement à Wilcox et al. (2001) qui basaient leurs estimations de gains
génétiques sur des QTL à effet identique et fort (5%) nous aurons probablement
dans notre cas à gérer des marqueurs diagnostiques présentant des effets variables
et faibles (<5%)
ii)
les gènes identifiés ne représentent qu ’une portion des gènes impliqués dans la
qualité du bois. De plus, une large proportion de la variabilité génétique observée
résulte sans doute des effets d ’interaction entre les gènes (épistasie). Aussi une
sélection basée uniquement sur les effets principaux de quelques gènes ne
permettrait-elle pas un gain maximal.
Les techniques de génotypage haut-débit pourront être appliquées à l ’ensemble des tests
déjà disponibles afin d ’estimer précisément les effets des gènes candidats identifiés lors de
cette étude. La poursuite des études d ’association devrait permettre l ’identification
d’autres gènes impliqués dans le déterminisme de la qualité du bois, réduisant de ce fait la
variation génétique non expliquée.
L’accumulation de ces informations devrait finalement permettre la mise en place d ’un
index de sélection basé sur le génotype des individus (si tant est que les objectifs précis de
92
sélection soient identifiés). L ’efficacité d ’un tel indice de sélection en comparaison à une
sélection traditionnelle dépendra ensuite :
i)
du coût de mesures des caractères (sélection traditionnelle) ;
ii)
du délai nécessaire avant leur mesure (sélection traditionnelle) ;
iii)
du coût du génotypage (SAM) ;
iv)
du nombre de gènes identifiés et de leur pourcentage de variation individuel
(SAM) ;
v)
de la vitesse de fixation de l ’haplotype favorable (haplotype multi-génique) dans
la population sélectionnée (SAM) ;
vi)
de la stabilité de l ’effet des gènes en fonction de l ’environnement (SAM) ;
vii)
du gain minimum nécessaire pour que la sélection soit économiquement
intéressante.
D’ores et déjà, même en l ’absence de réponses claires à chacune de ces questions, il paraît
raisonnable d ’avancer que la sélection basée sur les marqueurs sera intéressante pour des
caractères tels que le contenu en lignines ou en cellulose. En effet ces caractères présentent
des caractéristiques justifiant l ’utilisation de la sélection basée sur les marqueurs :
i)
Coût relativement élevé des mesures, même si de nouvelles technologies
basées sur la SPIR sont maintenant disponibles et utilisables en routine chez le
pin maritime ;
ii)
Caractères importants pour l ’industrie de la pâte et du papier mais aussi pour
la filière bois d’œuvre. Des améliorations même faibles de ces derniers
pourront avoir des conséquences importantes sur l ’efficacité de la
production.
iii)
Des gènes candidats ont été identifiés (KORRIGAN, PAL, GRP, Pr2)
VII.2- Identification des gènes contrôlant les caractères quantitatifs : une
démarche obligatoirement intégrative
La plupart des caractères d ’intérêt agronomique sont, comme la qualité du bois, sous le
contrôle de nombreux gènes, dont l ’expression est soumise à des effets ontogéniques et
environnementaux. Dans certains cas ces caractères sont ou ont été modelés par la nature
(sélection naturelle) et/ou par l ’homme (sélection artificielle). L ’identification de ces gènes
93
passe donc par la compréhension de leur histoire, de leur rôle précis, de leur mode d’action
et de leur cinétique d ’expression.
Comme nous l ’avons vu précédemment, les méthodes classiques de la génétique
quantitative, si elles nous permettent d’estimer la part de variation attribuable à des effets
génétiques, restent inefficaces pour fournir des informations sur la nature, les effets et la
localisation des gènes impliqués dans le contrôle des caractères quantitatifs.
L’apparition des marqueurs moléculaires a fourni à cette discipline un nouvel essor en lui
permettant d ’accéder à la localisation et aux effets des zones chromosomiques responsables
de la variabilité observée. Néanmoins, sans les apports de la physiologie moléculaire, qui
s ’attache quant à elle a étudier le rôle et la cinétique d ’expression des gènes,
l ’identification des gènes sous-jacents n’aurait pas été possible.
L’approche « gène candidat » résulte donc de la synergie de ces différentes disciplines.
Lorsqu ’elle est menée au sein d ’un pedigree unique, cette dernière est restreinte à une
recherche simple de co-localisation entre QTL et GC. Elle aboutit donc fréquemment à
l ’identification de plusieurs candidats positionnels pour un même QTL. La mise en
parallèle des données obtenues sur des cinétiques devrait permettre de définir de façon plus
précise les meilleurs candidats (Figure 34).
Dans le cas où le caractère étudié est soumis à la sélection naturelle, le pool de gènes
candidats à tester pourrait être restreint à ceux dont la structure de la diversité nucléotidique
est compatible avec l ’action de la sélection naturelle (Figure 35). L ’identification des
gènes candidats pertinents doit donc faire appel à la fois à la génomique, la génétique
évolutive et la génétique des populations. Une démarche complète doit aller non seulement
vers des études au niveau intra-spécifique, mais aussi inter-spécifique. L’estimation de la
variabilité d’expression des Gènes Candidats entre espèces différentes et entre individus au
sein d ’une espèce devrait ouvrir d’autres voies pour l ’identification des gènes candidats
les plus pertinents.
Dans le cadre de cette étude, il a été choisi d’étudier simultanément la diversité de plusieurs
gènes, en se focalisant pour chacun sur une portion. Cette stratégie est critiquable. Elle ne
fournit en effet qu’une information partielle sur la structure de la diversité nucléotidique des
gènes ciblés et nécessitera donc une validation sur une séquence plus étendue. Mais elle a
par contre le mérite d ’offrir une vue globale de la structure de la diversité sur plusieurs
94
gènes. La stratégie inverse qui s ’attacherait à analyser la totalité de la structure de la
diversité nucléotidique d’un gène unique (3000 pb pour un gène vs 600 pb pour 5 gènes)
permettrait de fournir une réponse plus précise quant à la neutralité du gène ou non, mais
restreindrait dans le même temps la portée de l ’étude. L’information contenue dans les
bases de données nucléotidiques devrait, via l ’utilisation de processus automatiques,
permettre une identification plus précise des gènes candidats véritablement pertinents, sur
lesquels un séquençage complet serait pleinement justifié. Néanmoins, l ’utilisation des
bases de données sera efficace si et seulement si l ’information qu ’elles contiennent est
adaptée (nombre de génotypes, populations, nombre d’EST, qualité des EST…) (annexe 7).
Même si l ’étude la diversité génétique a été réalisée sur des portions de gènes, la cohérence
des résultats obtenus est encourageante. En effet pour l ’ensemble des gènes présentant des
structures de diversité nucléotidique compatibles avec des effets de la sélection naturelle,
(KORRIGAN, GRP, déhydrine et PAL) des associations significatives avec des caractères
soumis à la sélection naturelle, ont été mises en évidence au sein du diallèle et/ou du test
clonal.
Néanmoins, comme cela a été souligné par Alain Palloix lors de la soutenance de thèse, dans
certains cas, aucune corrélation entre la mise en évidence de déviation par rapport a la
neutralité et les liaisons statistiques entre les polymorphismes des gènes candidats et les
caractères quantitatifs n ’a été mise en évidence. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées
pour expliquer ce résultat :
1- dans le cas d ’un gène présentant une structure de diversité révélant une déviation par
rapport à la neutralité et pour lequel aucune association statistique n ’est détectée avec le
caractère quantitatif :
- la première explication, qui est aussi la plus simple réside dans la non
implication de ce gène dans la variabilité de ce caractère quantitatif, ce gène est bien
impliqué dans la variation d ’un caractère soumis a la sélection naturelle mais pas
dans celle du caractère étudié,
- la seconde explication réside dans la puissance nécessaire pour détecter des
associations. Si dans le cas de sélection disruptive ou balancée, des proportions
importantes de la population présentent les différentes allèles ce qui fournit un test
avec une bonne puissance, dans le cas de selective sweep ou de background selection,
95
l ’une des allèles étant en très faible proportion, la puissance de détection est très
faible.
2- dans le cas où un gène ne présentant pas une structure de diversité compatible avec la
sélection se révèle être significativement associé avec la variabilité du caractère quantitatif
testé : deux hypothèses peuvent être avancées :
- soit ce gène vient de subir une mutation récente, il n est donc pas possible de
détecter de déviation par la neutralité, cette situation est néanmoins peu probable
étant donne que la fréquence d ’un des deux allèles est très faible ce qui conduit a
une faible puissance de détection.
- soit le polymorphisme testé correspond a une mutation qui est effectivement
non neutre mais qui est très âgée, des mutations neutres ont donc été accumulée á son
voisinage ce qui ne permet pas de mettre en évidence de déviation par rapport a la
neutralité.
Aussi si des liens directs ne sont pas toujours mis en évidence entre les gènes présentant des
déviations par rapport á la neutralité sélective et leurs associations avec les caractères
quantitatifs, ceci ne constitue pas une preuve de l ’inutilité de cette approche pour définir les
meilleurs gènes candidats mais souligne plutôt le fait que i) la diversité nucléotidique des
gènes impliqués dans le contrôle des caractères quantitatifs évolue et ii) que ce pool de gènes
évolue aussi au grés du processus d ’apparition et de disparition des différentes allèles.
VII.2.1- A la recherche de l ’explication moléculaire
Si cette étude a permis de mettre en évidence l ’existence probable d’associations entre les
polymorphismes de gènes candidats et la variabilité de caractères de qualité du bois, les
bases moléculaires de ces effets restent pour l ’instant inconnues. De plus, pour plusieurs
gènes, les mutations mises en évidence sont pour la plupart synonymes et n’ont donc pas de
conséquences au niveau protéique. Dans ce cas, soit ces polymorphismes induisent des
différences de niveau d ’expression des gènes entre les individus porteurs des différents
allèles, soit ils sont en déséquilibre de liaison avec une mutation non synonyme, responsable
de la modification de la structure protéique, qui se trouve hors du fragment analysé. Des
études complémentaires vont donc devoir être menées :
i)
Extension des zones séquencées et analyse des profils de déséquilibre de liaison ;
96
ii)
Etude de l ’effet du génotype sur l ’expression des gènes (recherche de
« Transcript Quantity Loci » : TQL). Des études récentes ont en effet montré
qu ’une forte variation individuelle existe à ce niveau (revue par Gibson 2003). Il
faut de plus noter que l ’analyse de la variabilité d ’expression des gènes entre
individus, entre populations et entre espèces devrait fournir des indications
complémentaires sur la sensibilité des gènes aux effets de la sélection naturelle.
VII.3- SAM et amélioration de l ’adaptabilité : deux objectifs incompatibles ?
L’identification des gènes et des sites impliqués dans la variabilité des caractères
quantitatifs fournira au sélectionneur la possibilité de fixer les allèles favorables beaucoup
plus rapidement au sein des variétés améliorées que ce que ne permet actuellement la
sélection traditionnelle. Néanmoins si le caractère d ’int érêt est un caractère qui est soumis a
la sélection naturelle, deux questions devront être soulevées :
i)
pourquoi le caractère a été soumis à la sélection, et l ’est- il encore ;
ii)
comment le gène agit sur la fitness des individus.
La connaissance précise des gènes et des sites impliqués dans le déterminisme génétique de
ce caractère devrait permettre au sélectionneur de contrôler exactement la diversité
génétique des variétés améliorées, ici l ’utilisation de la SAM ne serait pas seulement axée
vers « un gain a tout prix » mais permettrait la mise en place d’une amélioration génétique á
bénéfice durable combinant « conservation de la diversité » et « amélioration des
performances ».
La SAM offre donc des bénéfices multiples : possibilité de sélection plus rapide des allèles
favorables et gestion précise de la diversité génétique disponible au sein des variétés
améliorées.
En résumé, des travaux pour le futur :
Précision des effets des gènes identifiés (KORRIGAN, GRP, déhydrine et PAL) dans
d’autres plans d’expériences et d’autres espèces.
Recherche des bases moléculaires des associations entre les gènes et les caractères :
o Modification de la structure des protéines ?
97
o Variation individuelle au niveau expressionnel ?
Héritabilité des niveaux de transcription,
Cartographie des régions génomiques impliquées dans la variation
d’expression (Trancript Quantity Loci : TQL, Protein Quantity Loci :
PQL),
Différenciation au niveau expressionnel ? (concordance avec les
données de diversité nucléotidique ?)
Réflexion sur les stratégies d ’intégration de la SAM aux programmes
d’amélioration
o Dans quel contexte appliquer la SAM ?
o Quels seront les gains de la SAM par rapport à la sélection traditionnelle,
sachant que les effets des gènes seront variables et probablement faibles ?
o Comment utiliser la SAM dans le cadre de caractères soumis a la sélection
naturelle ?
98
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Springer-Verlag, NY. 363pp.
121
122
Annexes
123
Cette thèse a contribué à la publication de différents articles. Les
contributions à ces derniers sont présentées ci dessous
Annexe 1 : Pot D., Chantre G., Raffin A., Rozenberg P., Rodrigues J-C., Da Silva Perez D.,
Plomion C. (2002). Perspectives d ’amélioration génétique de la qualité du bois du pin
maritime. Compte rendus du Colloque ARBORA. Bordeaux juin 2002.
Annexe 2 : Pot D., Chantre G., Rozenberg P., Rodrigues J-C., Jones Gwynn L., Pereira H.,
Hannrup B., Cahalan C., Plomion C. (2002). Genetic control of pulp and timber properties in
maritime pine (Pinus pinaster Ait.). Annals of Forest Science. 59: 563-575.
Annexe 3 : Pot D., Eveno E., Rodrigues J-C., Rozenberg P., Chantre G., Tibbits J., Cahalan
C., Pichavant F., Garnier Géré P., Plomion C. (2003). QTL and candidate gene mapping for
wood quality traits in Pinus pinaster. En préparation
Annexe 4: Chagné D., Brown G., Lalanne C., Madur D., Pot D., Neale D., Plomion C.
(2003). Comparative genome and QTL mapping between maritime and loblolly pines.
Molecular Breeding 12: 185-195.
i)
Extension du génotypage de la famille de cartographie utilisée de 90 à 202
individus
ii)
Détection de QTL de qualité du bois
Annexe 5 : Le Provost G., Paiva J., Pot D., Brach J, Plomion P. (2003). Seasonal variation in
transcript accumulation in wood-forming tissues of maritime (Pinus pinaster Ait.) with
emphasis on a cell wall glycine-rich protein. Planta 217: 820-830.
i)
Analyse statistique des données d’expression
ii)
Etude de la diversité nucléotidique de la Glycine Rich Protein
Annexe 6: Pot D., McMillan L., Echt C., Le Provost G., Cato S., Plomion C. (2003).
Nucleotide variation in two pine species. Soumis à New Phytologist.
Le Dantec L., Chagné D., Pot D., Cantin O., Garnier-Géré P., Bedon F., Frigerio J-M.,
Chaumeil P., Léger P., Garcia V., Laigret F., de Daruvar A., Plomion P. (2004). Automated
SNP detection in expressed sequence tags: statistical considerations and application to
maritime pine sequences. Plant Molecular Biology 54(3) : 461-470.
i) Analyse statistique des probabilités de détection des SNP selon les caractéristiques
de la base de données de séquence.
Annexe 8: Brendel O., Pot D., Plomion C., Rozenberg P., Guehl J-M. (2002). Genetic
parameters and QTL analysis of δ13C and ring width in maritime pine. Plant, Cell and
Environment. 25 : 945-953.
i)
Analyse des paramètres génétiques
124
ii)
Réalisation des mesures phénotypiques de microdensitométrie sur le pedigree de
cartographie
iii)
Détection de QTL
125

Déterminisme génétique de la qualité du bois chez le pin

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