peste du canard

CHAPITRE 2.7.10.
PESTE DU CANARD
RÉSUMÉ
L’entérite virale ou peste du canard est une maladie contagieuse aiguë due à un herpèsvirus qui
affecte les canards, les oies et les cygnes (oiseaux de l’ordre des Ansériformes). Le diagnostic
repose sur les signes cliniques, les lésions macroscopiques et histologiques et est confirmé par la
mise en évidence de l’agent étiologique par isolement ou amplification en chaîne par polymérase
(PCR).
Identification de l’agent pathogène : le virus peut être isolé à partir du foie, de la rate et des reins
d’animaux morts de l’infection. L’isolement peut être réalisé sur canetons sensibles, qui expriment
les signes de la maladie ; sur membrane chorio-allantoïdienne d’œufs embryonnés de canards de
Barbarie ou sur cultures de cellules embryonnaires de canard. L’identification du virus est possible
grâce à un antisérum spécifique qui inhibe soit le processus pathologique chez les embryons soit
les effets cytopathogènes (ECP) sur cellules en culture. Une alternative consiste en l’utilisation
d’épreuves d’immunofluorescence directe ou indirecte sur cellules en culture. Il est également
possible de mettre l’ADN viral en évidence par PCR dans l’oesophage, le foie et la rate d’animaux
infectés ou sur cellules ou embryons dans le cadre du protocole d’isolement du virus.
Épreuves sérologiques : les épreuves sérologiques présentent peu d’intérêt pour le diagnostic de
la maladie. Des tests de séroneutralisation sur œufs ou sur culture cellulaire ont été utilisés pour
décrire l’exposition au virus d’oiseaux sauvages.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
un vaccin vivant atténué par voie sous-cutanée ou intramusculaire est disponible pour les animaux
âgés d’au moins 2 semaines. Le virus vaccinal ne semble pas diffuser. Un vaccin inactivé s’est
avéré efficace expérimentalement mais n’a pas été testé à large échelle et n’est pas autorisé.
A. INTRODUCTION
La peste du canard est une affection virale aiguë, parfois chronique qui affecte les canards, les oies et les cygnes,
tous membres de la famille des Anatidés dans l’ordre des Ansériformes. L’agent étiologique, un herpesvirus, fait
partie de la sous-famille des alphaherpesvirinae dans la famille des Herpesviridae. La peste du canard est
également dénommée herpesvirose des anatidés, eendenpest ou entenpest. L’infection n’a pas été décrite chez
d’autres espèces d’oiseaux, ni chez les mammifères ou l’homme.
Chez le canard domestique, la peste du canard a été décrite de l’âge de 7 jours à l’âge de la reproduction. Dans
des élevages indemnes, l’expression clinique débute généralement par l’apparition d’une mortalité brutale, forte et
persistante associée à une chute de ponte marquée. Dans des troupeaux partiellement immunisés et
chroniquement infectés la mortalité est plus rare. Les animaux qui survivent peuvent excréter du virus dans les
fientes ou à la surface des oeufs pendant des années. Récemment, une forme de peste concernant seulement
les canards de Barbarie a été décrite aux États-Unis d’Amérique (2, 5).
Les signes cliniques et les lésions macroscopiques sont variables en fonction de l’espèce, de l’âge, du sexe des
oiseaux atteints, ainsi que selon la virulence de la souche virale. Chez les canards reproducteurs, on observe des
écoulements oculaires, des paupières collées avec de la photophobie, de la polydypsie, une anorexie, une
diarrhée liquide et du jetage. Les oiseaux présentent souvent des plumes ébouriffées et les orifices souillés. Les
oiseaux malades se maintiennent debout en prenant appui sur leurs ailes, mais ils sont faibles et apathiques.
Chez les canetons de 2 à 7 semaines, la mortalité peut être plus faible que chez des animaux plus âgés et les
symptômes sont de la déshydratation, une perte de poids, une cyanose du bec et la présence de sang au niveau
des orifices.
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Chapitre 2.7.10. — Peste du canard
À l’autopsie, les canards adultes morts ont peu de signes d’émaciation. Chez les mâles reproducteurs, un
prolapsus du pénis est décrit. Chez les reproducteurs femelles, on observe des hémorragies au niveau des
follicules ovariens. Les lésions macroscopiques se caractérisent par une atteinte vasculaire avec des hémorragies
tissulaires et la présence de sang dans la cavité générale, des éruptions, des hémorragies en anneau ou la
présence de fausses membranes à la surface de la muqueuse digestive, des lésions des organes lymphoïdes et
des lésions dégénératives des viscères. Lorsqu’elles sont présentes simultanément, ces lésions sont
pathognomoniques de la peste du canard. Les lésions macroscopiques et microscopiques rencontrées chez le
canard Pékin ont été décrites (19). Les lésions histologiques se caractérisent par une atteinte vasculaire et ses
conséquences sur les viscères. Des inclusions intranucléaires éosinophiles et des inclusions intracytoplasmiques
sont présentes dans les cellules épithéliales du tube digestif de façon typique.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification de l’agent pathogène
Les prélèvements de choix pour l’isolement du virus de la peste du canard (VPC) sont le foie, la rate ou le rein,
après homogénéisation dans un tampon contenant des antibiotiques puis clarification par centrifugation à faible
vitesse (1 800 g). L’isolement est réalisé après inoculation des homogénats à des cellules en culture, des
canetons ou des œufs embryonnés de canard.
a)
Cellules en culture
Malgré des échecs rapportés, les cellules en culture sont le support de choix pour l’isolement du VPC. Les
essais d’isolement doivent être réalisés sur culture primaire de fibroblastes embryonnaires de canard (DEF)
(22), de préférence de canards de Barbarie (MDEF) (9, 14). Les cellules hépatiques d’embryon de canards
de Barbarie (MDEL) sont considérées comme encore plus sensibles à l’infection (R.E. Gough,
communication personnelle). Les tapis cellulaires cultivés en MEM (Eagle’s Minimal Essential Medium)
contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de glutamine, 0,17 % de bicarbonate de sodium et de la
gentamicine sont lavés avec du MEM sans sérum, puis inoculés avec l’échantillon homogénéisé et clarifié,
potentiellement contaminé avec le virus. Après une incubation de 1 h à 37°C pour permettre l’adsorption du
virus, les cellules sont cultivées en milieu MEM supplémenté avec 2 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de
glutamine, 0,17 % de sodium bicarbonate et de la gentamicine sous une atmosphère contenant 5 % de CO2.
L’effet cytopathogène (ECP) se caractérise par l’apparition de cellules arrondies et coalescentes qui
augmentent de taille et se nécrosent en 2 à 4 jours. L’identification du virus en culture est possible par une
méthode d’immunofluorescence directe ou indirecte (voir Chapitre B.1.d.). Les cellules peuvent également
être fixées puis colorées avec de l’hématoxyline-éosine afin de visualiser la formation des syncytiums, les
inclusions intranucléaires ainsi que la granulation marquée du cytoplasme. Il a été décrit (1) que l’isolement
du virus de la peste du canard sur cellules MDEF est facilité par l’incubation à une température de 39,5 à
41,5°C. Toutefois, une température aussi élevée ne semble pas indispensable pour l’isolement viral qui est
souvent réalisé à 37°C. Il peut être nécessaire de réaliser plusieurs passages sur cellules afin d’isoler le
virus. La méthode d’isolement peut être adaptée à la méthode de détection des plages de lyse en utilisant
un milieu de culture contenant 1 % d’agarose. Du fait que le virus peut être en position intracellulaire, les
passages de culture doivent être réalisés en trypsinant les cellules potentiellement infectées et en les
repiquant, ainsi qu’en inoculant des cellules fraîches avec du surnageant de culture infecté d’un passage
précédent.
b)
Canetons
Des canetons sensibles âgés de 1 jour inoculés par voie intramusculaire meurent en 3 à 12 jours ; des
canetons témoins non inoculés et élevés séparément doivent être utilisés comme témoins. Les canetons de
Barbarie (Cairina moschata) sont plus sensibles que les canetons Pékin blancs. Des lésions
macroscopiques et microscopiques caractéristiques doivent être observées à l’examen post mortem. Le
diagnostic peut être confirmé soit en vaccinant les canetons avant une infection avec l’isolat viral soit en
utilisant une méthode d’immunofluorescence. Néanmoins le vaccin peut s’avérer inefficace contre certaines
souches virales (13). L’expérience des auteurs les conduit à penser qu’en cas d’infection naturelle cette
méthode est plus sensible que l’isolement en culture cellulaire.
c)
Embryons de canard
L’isolement de virus peut être réalisé par inoculation d’oeufs embryonnés de canard de Barbarie âgés de 9 à
14 jours sur la membrane chorio-allantoïdienne. Les embryons peuvent mourir, présentant des hémorragies
étendues caractéristiques 4 à 10 jours après l’inoculation. 2 à 4 passages successifs utilisant des
homogénats de membranes chorio-allantoïdiennes peuvent être nécessaires pour isoler le virus. Cette
méthode est moins sensible que l’inoculation de canetons de 1 jour.
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Les oeufs embryonnés de poulet sont peu sensibles à l’infection par des souches sauvages de virus de la
peste du canard. Toutefois, le virus peut être adapté aux œufs embryonnés de poulet par passages
successifs. Les embryons de canard Pékin présentent une sensibilité variable aux souches du VPC.
d)
Méthodes immunologiques
L’identification d’un virus nouvellement isolé est possible par la méthode de séroneutralisation sur œufs
embryonnés ou sur cultures cellulaires. Un test de formation de plages de lyse sur cellules d’embryon de
canard a été décrit (4). Dans le laboratoire des auteurs, une méthode en microplaques utilisant des cultures
primaires de cellules MDEF ou MDEL est utilisée. Sous réserve que le titre du sérum soit assez élevé, une
épreuve d’immunofluorescence directe ou indirecte sur cellules DEF, MDEF ou MDEL s’avère l’épreuve la
plus sensible après l’isolement sur des canetons âgés de 1 à 9 jours (8). Il est possible d’utiliser une épreuve
d’hémagglutination passive inversée (6) qui semble moins sensible que l’immunofluorescence et que le test
de formation des plages de lyse. Une épreuve de détection du virus sur coupes paraffinées de foie et de rate
de canards infectés expérimentalement par coloration des antigènes par une méthode d’immunopéroxydase
a été décrite (12) et pourrait être utilisée pour le diagnostic. L’identification du virus peut également être
confirmée par microscopie électronique négative, mais cette méthode n’est pas suffisante pour certifier que
l’herpesvirus observé est le virus de la peste du canard. Une méthode utilisant un sérum hyperimmun en
microscopie électronique a récemment été mise au point (15).
e)
Méthodes moléculaires
Récemment, la mise en évidence du virus de la peste du canard par réaction d’amplification en chaîne par la
polymérase (PCR) a été décrite (10, 11, 16, 17). Des amorces ont été définies qui permettent d’amplifier
l’ADN viral présent dans différents tissus tels que l’œsophage, le foie et la rate suite à un épisode clinique et
après passage du virus sur embryons de canard de Barbarie. Un exemple de protocole PCR est décrit
ci-après.
•
Méthode PCR1
La méthode d’extraction de l’ADN décrite ci-après peut être mise en œuvre soit sur des suspensions
cellulaires provenant de cultures infectées, soit sur un broyat de tissu en suspension à 10 %, soit à partir
d’écouvillons cloacaux placés dans un milieu de transport. Cette méthode permet de préparer de l’ADN viral
utilisé comme un témoin positif pour les tests de PCR.
•
Extraction d’ADN viral
Note : Toutes les manipulations de réactifs dans les étapes i à v doivent être réalisées dans un poste de
sécurité microbiologique.
1
i)
Placer dans un microtube 400 µl d’un broyat de tissu en suspension à 10 %, centrifuger à 16 000 g
pendant 5 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et passer à l’étape ii ;
ii)
Pour les cultures cellulaires ou les écouvillons cloacaux, ajouter 400 µl de l’échantillon ou le
surnageant obtenu à l’étape i ci-dessus dans un microtube de 1,5 ml et centrifuger entre 16 000 et
20 000 g pendant 45 min afin de culoter le virus ;
iii)
Éliminer le surnageant et reprendre le culot dans 200 µl de tampon Tris/acide éthylène diamine
tétra-acétique (EDTA) (10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) ;
iv)
Ajouter 10 µl d’une solution de protéinase K à 5 µg/µl pour obtenir une concentration finale de
0,2 µg/µl, mélanger vigoureusement et incuber à 56°C pendant 1 h ;
v)
Ajouter 25 µl d’une solution de sodium dodécyl sulfate (SDS) à 10 % pour obtenir une concentration
finale en SDS de 1 %, mélanger vigoureusement et incuber à 37°C pendant 1 h ;
vi)
Ajouter 15 µl de NaCl 5 M pour obtenir une concentration finale 0,3 M et mélanger vigoureusement ;
vii)
Ajouter 300 µl de phénol froid tamponné avec du Tris/HCl, pH 8,0, et mélanger en retournant le tube 50
fois ;
Fournie par Dr W.R. Hansen, US Geological Survey, Biological Resources Division, National Wildlife Health Center,
6006, Schroeder Road, Madison, WI 53711, États-Unis d’Amérique. Cette méthode nécessite les produits commerciaux
suivants : GeneAmp PCR Reagent Kits comprenant dNTPs, 10× amplification buffer for hot start PCR, Taq DNA
polymerase, Lambda PCR control reagents, et des billes Ampliwax (Applied Biosystems), ainsi qu’un marqueur de poids
moléculaire (échelle100 pb) (Invitrogen)
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Chapitre 2.7.10. — Peste du canard
viii) Centrifuger le microtube à 16 000 g pendant 5 min et transférer la phase aqueuse superficielle
(contenant l’échantillon) dans un nouveau tube ;
ix)
Renouveler l’extraction phénolique (étapes vii et viii) ;
x)
Ajouter 500 µl d’éther dans le tube, mélanger vigoureusement, et centrifuger à 16 000 g pendant
1 min ;
xi)
Éliminer la phase aqueuse superficielle (éther) et renouveler l’extraction à l’éther (étape x) ;
xii)
Chauffer le tube avec le couvercle ouvert à 56°C pendant environ 15 min jusqu’à disparition de l’odeur
d’éther ;
xiii) Séparer en deux le contenu du tube et ajouter 2,25 fois le volume de chaque échantillon d’éthanol
absolu, mélanger les tubes en les retournant plusieurs fois et laisser à température ambiante (22°C)
pendant 30 min ;
xiv) Centrifuger le tube à 16 000 g pendant 45 min et éliminer le surnageant ;
xv)
Ajouter 200 µl d’éthanol à 70 % pour laver doucement le culot puis centrifuger à 16 000 g pendant
15 min ;
xvi) Éliminer le surnageant et sécher le culot à 56°C pendant 30 à 45 min avec le couvercle du tube ouvert ;
xvii) Reprendre l’ADN dans 30 µl d’eau distillée exempte de RNase et DNase ;
xviii) Stocker l’échantillon à 4°C jusqu’à l’amplification (si elle a lieu dans les jours suivants) ou à –20°C en
cas de stockage plus long.
•
Amplification en chaîne par polymérase
Un premier mélange réactionnel (tampon d’amplification 10 x, amorces, dNTPs) est préparé dans un poste
de sécurité microbiologique en suivant les recommandations du fabricant de la trousse de diagnostic pour
une PCR « hot start » et déposé dans les microtubes correspondant aux échantillons à amplifier, y compris
le témoin d’amplification Lambda (Lambda control). Les tubes sont scellés par l’ajout de billes de cire
Ampliwax® suivi d’un chauffage à 80°C. Ils peuvent ensuite être stockés à 4°C pendant 1 à 2 mois.
Les amorces permettant l’amplification du gène de la polymérase du virus de la peste du canard sont les
suivantes :
Amorce 1 :
5’-GAA-GGC-GGG-TAT-GTA-ATG-TA-3’ (sens)
Amorce 2:
5’-CAA-GGC-TCT-ATT-CGG-TAA-TG-3’ (antisens)
i)
Un second mélange réactionnel contenant la Taq polymérase, est préparé selon les recommandations
du fabricant de la trousse le jour du test et distribué dans les tubes, y compris les témoins (ADN viral et
contrôle Lambda) ;
ii)
Ajouter 10 µl de suspension d’ADN provenant des tubes stockés après l’étape d’extraction d’ADN dans
les tubes PCR contenant les premiers mélanges réactionnels adéquats et pré-identifiés ;
iii)
Placer de L’ADN du VPC à la concentration de 1 pg/10 µl dans un tube témoin positif et 10 µl d’eau
distillée dans le tube témoin sans ADN. Ajouter 10 µl d’ADN Lambda fourni dans la trousse et
10 µl d’eau dans les tubes témoins positif et négatif Lambda respectivement ;
iv)
Placer tous les tubes dans le thermocycleur programmé de la façon suivante :
Un cycle :
94°C pendant 2 min
37°C pendant 1 min
72°C pendant 2 min
35 cycles :
94°C pendant 1 min
55°C pendant 1 min
72°C pendant 3 min
Un cycle :
72°C pendant 7 min
4°C jusqu’à l’arrêt du thermocycleur.
Les tubes PCR doivent être stockés à 4°C jusqu’à révélation des produits d’amplification.
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•
Électrophorèse des produits de PCR
i)
Du tampon TAE 1 x (40 mM Tris acétate, 1 mM EDTA, pH 8,3) est préparé extemporanément à partir
d’une solution stock 10 x. Il sera utilisé pour la préparation du gel d’agarose ainsi que pour la migration
dans la cuve d’électrophorèse ;
ii)
Une solution d’agarose à 1 % est préparée en tampon TAE, chauffée pour dissoudre l’agarose et une
fois refroidie, coulée sur un support de gel muni d’un peigne ;
iii)
Le gel polymérisé est placé dans une cuve d’électrophorèse et du tampon TAE est ajouté ;
iv)
Les produits d’amplification, y compris l’ADN viral et les contrôles Lambda sont additionnés de 1 µl de
tampon de chargement (bleu de bromophénol 0,25 % [poids/vol.], xylène cyanol 0,25 % [poids/vol.],
0,01 M Tris/HCl, pH 8,0, et glycérol 50 % [vol./vol.]) et 10 µl de chaque échantillon sont déposés dans
les puits du gel. Un marqueur de poids moléculaire (échelle de 100 pb) est ajouté dans les puits aux
2 extrémités du gel ;
v)
Faire migrer le gel pendant 1 h à 120 volts puis le colorer par immersion dans une solution de bromure
d’éthidium à 1 % pendant 20 min. Décolorer le gel pendant 45 min dans de l’eau désionisée et
visualiser le gel sous UV. Photographier le gel afin de conserver les résultats.
•
Interprétation des résultats
Une bande correspondant à l’amplification d’un fragment de 500 pb pour le témoin Lambda indique le bon
déroulement de la phase d’amplification. Une bande de 446 pb dans le tube témoin positif viral confirme
l’amplification du VPC par les amorces sélectionnées. Une bande de 446 pb dans les tubes à tester indique
la présence d’ADN du VPC dans les échantillons. Aucun produit d’amplification ne doit être mis en évidence
dans les tubes témoins négatifs (Lambda et ADN viral). En cas de présence d’un produit d’amplification dans
les témoins négatifs, une contamination croisée s’est produite au cours de la manipulation et le test doit être
renouvelé.
f)
Variation des souches virales
Bien que les souches de virus diffèrent fortement en ce qui concerne la virulence, elles varient peu sur le
plan antigénique.
2.
Épreuves sérologiques
Les épreuves sérologiques présentent peu d’intérêt pour le diagnostic des infections aiguës par le virus de la
peste du canard, mais des tests basés sur une séroneutralisation sur œufs embryonnés ont été développés pour
mettre en évidence une réponse sérologique chez les oiseaux sauvages. La réponse immunitaire humorale en
cas d’infection naturelle est souvent de faible intensité et les anticorps sont peu persistants (7) ; il est supposé
que l’immunité à médiation cellulaire joue également un rôle dans l’infection (18). Toutefois, la détection
d’anticorps neutralisants dans le sérum est possible. Des tests de séroneutralisation (21) à virus variable et sérum
constant peuvent être mis en œuvre sur des embryons de poulet ou de canard en utilisant des souches virales
adaptées aux embryons, ainsi que sur culture cellulaire. Des index de séroneutralisation (21) de 0 à 1,5 ont été
mis en évidence sur des gibiers d’eau non-exposés au virus alors qu’un index ≥ 1,75 semble indiquer un contact
préalable avec le virus (3). Les sérums peuvent par ailleurs être testés par la méthode à virus constant et sérum
variable. Dans le laboratoire de l’auteur, une épreuve en microplaque sur cellules MDEF ou DEF est utilisée. Des
dilutions sériées au demi de chaque échantillon de sérum (préalablement inactivé à 56°C) sont préparées dans
50 µl de milieu de culture MEM sans sérum dans des plaques de microtitrage. Environ 102 DICT50 (Dose de virus
infectant 50 % de la culture tissulaire) de virus dans 50 µl de milieu sont ajoutées dans chaque puits et le mélange
est incubé pendant 1 h à 37°C. Une suspension de cellules MDEF ou DEF en milieu MEM supplémenté avec 2
mM de L-glutamine, 0,17 % de bicarbonate de sodium et 10 % de sérum de veau fœtal est ajustée à 3 x 105
cellules/ml. Les cellules sont ensuite ajoutées sur les plaques à raison de 100 µl de suspension cellulaire par puits
et sont incubées jusqu’à 96 h à 37°C en atmosphère humide enrichie en CO2 à 5 %. Après incubation, les cellules
sont examinées quotidiennement au microscope puis fixées en tampon salin formolé à 10 % et colorées avec
1 % de cristal violet. Les plaques sont observées macroscopiquement. Le titre d’activité neutralisante est exprimé
comme l’inverse de la dilution la plus élevée à laquelle l’ECP n’est plus visible, indiquant que la neutralisation du
virus a été totale. Un titre inférieur à 3 log2 est généralement considéré comme négatif. Un titre ≥ 8 est considéré
comme significatif et indique l’exposition au virus de la peste du canard (7). Les anticorps neutralisants peuvent
également être mis en évidence en utilisant des cultures cellulaires en mettant en contact du sérum à une seule
dilution, à savoir au 1/10, avec 100 à 200 DICT50 de virus puis en recherchant la présence de virus non neutralisé
dans la culture cellulaire par immunofluorescence. Bien que cette méthode ne soit pas quantitative, elle peut
s’avérer utile pour tester un grand nombre de sérums. Ces dernières méthodes, à virus constant et sérum
variable, sont beaucoup plus économiques en sérum que les méthodes de détermination d’index de
neutralisation.
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Chapitre 2.7.10. — Peste du canard
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS
BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Un vaccin vivant atténué est disponible pour la maîtrise de la peste du canard chez les oiseaux de plus de
2 semaines d’âge (18, 19). Les canards de chair ou les reproducteurs peuvent être vaccinés par voie souscutanée ou intramusculaire. Le vaccin ne semble pas diffuser par contact entre animaux vaccinés et canards
sentinelles non vaccinés puisque ces derniers restent sensibles à l’infection.
Un vaccin inactivé a été décrit comme étant aussi efficace que le vaccin vivant (20). Ce vaccin a été testé
uniquement en conditions expérimentales et non à grande échelle et n’est pas autorisé.
Les lignes directrices pour la production des vaccins vétérinaires sont décrites dans le Chapitre I.1.7., « Principes
de fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Les lignes directrices énoncées ci-après ainsi que dans le
Chapitre I.1.7. se veulent générales et peuvent être complétées par des recommandations nationales ou
régionales.
1.
Gestion des semences virales
a)
Caractéristiques de la semence virale
Le vaccin contre la peste du canard peut être préparé à partir d’une souche virale atténuée par passages
successifs sur oeufs embryonnés de poulet. Aux Etats-Unis d’Amérique, le lot de semence primaire a été
importé de Hollande et a subi 41 à 46 passages.
b)
Méthode de culture
Le lot de semence primaire doit être cultivé sur des oeufs embryonnés de poulets exempts d’organismes
pathogènes spécifiques (EOPS) par inoculation sur la membrane chorio-allantoïdienne puis incubation à
37°C. La souche doit être stockée à une température ≤ –70°C sous forme d’homogénat de membrane
chorio-allantoïdienne en tampon salin.
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
Le lot de semence primaire doit être indemne de virus exogène pathogène pour les canards, les poulets ou
les dindes. Il doit de plus être indemne de contaminants bactériens, fongiques et de mycoplasmes.
L’identité du virus doit être confirmée par un test de séroneutralisation avec un anticorps spécifique par la
méthode à sérum constant et virus variable. Ce test doit être réalisé sur œufs embryonnés de poulet.
L’anticorps doit réduire le titre viral au moins de 101,75 DLE50 (dose létale pour 50 % des embryons).
Le pouvoir immunogène du vaccin peut être évalué sur des canards sensibles à la peste du canard ou sur
des canetons par administration intramusculaire du vaccin puis inoculation de virus par voie intramusculaire
21 jours plus tard. Les oiseaux vaccinés doivent survivre à l’épreuve infectieuse alors que les non vaccinés
doivent mourir. Ce test doit être réalisé sur le lot de semence primaire puis régulièrement pour chaque lot de
vaccin produit. Pour la commercialisation des lots, le titre viral doit être une indication fiable de l’activité du
vaccin.
Après congélation à une température ≤ –70°C, le vaccin peut être stocké pendant au moins 1 an sans
diminution du titre viral. Après décongélation, le vaccin doit être conservé à 4°C et utilisé rapidement ; il ne
doit pas être recongelé.
2.
Méthode de fabrication
Le vaccin est produit sur oeuf embryonné de poulet EOPS inoculé sur la membrane chorio-allantoïdienne et
incubé à 37°C. La plupart des morts d’embryons surviennent dans les 48 à 96 h après l’inoculation. Les
embryons, les membranes chorio-allantoïdiennes ainsi que les fluides chorio-allantoïdiens sont prélevés,
mélangés, homogénéisés dans du tampon salin et clarifiés par centrifugation lente (1 800 g). La préparation est
diluée et un stabilisateur est ajouté. Elle est ensuite conditionnée en tubes et congelée à une température
maximale de –70°C.
3.
Contrôles en cours de fabrication
Les œufs inoculés sont mirés 24 h après afin d’écarter les embryons morts de façon non spécifique.
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Chapitre 2.7.10. — Peste du canard
4.
Contrôles des lots
a)
Stérilité
Les tests permettant de vérifier la stérilité et l’absence de contamination sont décrits dans le Chapitre I.1.5.,
« Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ».
b)
Innocuité
Un lot de canetons de 1 jour, sensibles à la peste du canard, sont infectés par voie sous-cutanée ou
intramusculaire avec une dose vaccinale 10 fois supérieure à celle recommandée et observés pendant 7 à
14 jours afin de détecter d’éventuels effets secondaires.
Le produit final doit être exempt de contamination bactérienne, fongique et de mycoplasmes ainsi que de
virus potentiellement pathogènes pour les volailles.
c)
Activité
Le titre viral du vaccin doit être déterminé sur des œufs embryonnés de poulet inoculés sur la membrane
chorio-allantoïdienne et incubés à 37°C. Le vaccin doit contenir au minimum 103,0 DLE50 par dose.
d)
Durée de l’immunité
L’immunité conférée par la vaccination doit durer au minimum jusqu’à la fin de la période de ponte. Il est
recommandé de revacciner les animaux tous les ans (19).
e)
Stabilité
Stocké à une température maximale de –70°C, le vaccin est stable pendant 1 an. Un test d’activité doit être
renouvelé à l’issue de cette période afin de déterminer si le titre viral est resté constant. Après
décongélation, le vaccin ne doit pas être recongelé mais doit être conservé à 4°C pendant au maximum
1 semaine. Les vaccins lyophilisés doivent être stockés entre 4 et 8°C et utilisés avant la date d’expiration.
f)
Agents de conservation
Le vaccin ne contient pas d’agents de conservation.
g)
Précautions d’emploi et mise en garde
Aucune.
5.
Contrôles du produit fini
Le vaccin se présente sous forme de flacons de vaccin concentré et de diluant stérile (PBS) sur lequel les tests
de stérilité ont été réalisés (voir Chapitre C.4.a.).
a)
Innocuité
Aucun test supplémentaire ne doit être réalisé après les contrôles de lots.
b)
Activité
Aucun test supplémentaire ne doit être réalisé après les contrôles de lots.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1.
BURGESS E.C. & YUILL T.M. (1981). Increased cell culture incubation temperatures for duck plague virus
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