CONSERVACION DE LOS EMBRIONES J

Conservación de embriones
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CONSERVACION DE LOS EMBRIONES
J. Cabodevila
Introducción
Los embriones bovinos son recolectados en una solución salina buffer fosfato (PBS Dulbecco)
suplementada con 1% de suero o 0,1% de albúmina sérica (PBSS). A medida que los embriones son
localizados bajo la lupa estereoscópica, se los coloca en PBSS con un porcentaje mayor de suero (10 ó
20%) o albúmina 4%. Permanecen en este medio, a la temperatura del laboratorio 20-25ºC hasta que
se realiza la transferencia o se lleva a cabo otra manipulación.
La manipulación de los embriones in vitro se lleva a cabo siguiendo las disposiciones establecidas por
la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria (IETS) a fin de prevenir la transmisión de
enfermedades (Manual de la Soc. Int. de Transferencia Embrionaria, cap. XVI)
Una evaluación morfológica detallada, a mayor aumento, considerando estadios de desarrollo y
cualidades estructurales permite determinar que embriones están en condiciones de ser transferidos
(LINDNER y col., 1983). La transferencia en fresco debe ser realizada dentro de las 3-4 hs postrecolección (GARCIA y col., 1986).
Los embriones pueden ser conservados in vitro para su posterior transferencia mediante: Cultivo a 37o
C, refrigeración entre 0o C y 4o C o congelación a -196oC (TROUNSON y col., 1976).
A continuación, se analiza en detalle cada una de estas técnicas:
Cultivo a 37oC
Los embriones bovinos pre-implantados generalmente son recolectados entre el sexto y octavo día de
vida, empleando el método no quirúrgico. El cultivo es utilizado para evaluar el resultado de distintas
manipulaciones (congelación, micromanipulación, etc.) que se efectúan con los embriones pero no
como un paso previo a la transferencia. Esto obedece a dos razones principales: En primer lugar, a que
los embriones continúan desarrollando durante el cultivo, por lo tanto, esta técnica no puede ser
utilizada para conservar un embrión hasta que una receptora asincrónica alcance el sincronismo óptimo
(WRIGHT, 1976). Por otra parte, se ha observado que los porcentajes de preñez disminuyen cuando se
transfieren embriones que han sido cultivados (WHITTINGHAM, 1975 y 1976; HEYMAN, 1984).
ELSDEN (1984), sostiene que la viabilidad embrionaria se ve seriamente disminuida cuando la
extensión del cultivo es mayor de 24 horas.
El cultivo de embriones se realiza en medios cuyo pH oscila entre el 7,2 y 7,6 y cuya osmolaridad varía
entre 270 y 310 mOsm.
El PBSS modificado por WHITTINGHAM (1971) es el medio utilizado comúnmente cuando el cultivo no
se extiende por más de 24 horas. Los medios conteniendo bicarbonato, tal es el caso del Ham F-10 y
del B2 de Menezo, son más apropiados para el cultivo de embriones pero requieren una atmósfera
controlada, con presencia de CO2 para mantener el pH fisiológico. Estos medios son utilizados en
cultivos cuya duración es mayor de 24 horas
(RAJAMAHENDRAN y col, 1985).
Al medio de cultivo, al igual que al de recolección, se le incorpora una fuente de proteínas. Esta se
efectúa con la suplementación del medio de cultivo con 10% de suero ó 0,4% de albúmina.
La suplementación proteica tiene distintos fines, los más importantes son:
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- Reducir la tensión superficial para favorecer la sedimentación de los embriones y evitar que estos se
adhieran a algún elemento utilizado para su manipulación.
- Incorporar sustancias promotoras del crecimiento que favorecen el desarrollo embrionario.
- Absorber e inhibir metales pesados tóxicos que pueden estar presentes en el medio.
El medio de cultivo se esteriliza por medio de filtración a través de membranas de 0,22µm de diámetro
de poro. Además, se le adicionan antibióticos, generalmente penicilina, estreptomicina y kanamicina.
La temperatura corporal de la especie embrionaria en cuestión es la ideal para el desarrollo de los
embriones in vitro. Sin embargo, cuando las condiciones de cultivo dejan de ser ideales -ocurre
fácilmente cuando se utilizan soluciones salinas balanceadas- es conveniente que la temperatura del
cultivo esté debajo de la corporal (no más de 4ºC). De esta manera, los efectos tóxicos del medio son
menos pronunciados y también es menor la evaporación (HEATH, 1990).
Refrigeración 0-4oC
La refrigeración se efectúa vehiculizando los embriones en PBSS envasados en pajuelas de 0,25 ml y
colocadas en un refrigerador (común o portátil) Se utiliza hielo y agua para regular el descenso de la
temperatura, de manera similar a como se realiza la estabilización durante la congelación de semen.
En los últimos años, con la transferencia no quirúrgica de embriones refrigerados durante uno a tres
días, se han obtenido porcentajes de preñez que oscilan entre el 44 y el 50% (Tabla 1). Estos
resultados superan claramente a los obtenidos previamente (BON DURANT y col., 1982; BOUYSSOU y
CHUPIN, 1982; LIDNER y col., 1982). A partir de los avances registrados, la refrigeración de embriones
puede ser considerada como una alternativa interesante cuando no sea posible recurrir a la
congelación. Por ejemplo, puede ser utilizada para enviar embriones a ser transferidos en lugares
distantes de donde se encuentran las donantes (LEIBO y WINNINGER, 1986, REFSDAL y col., 1988).
También puede emplearse esta técnica para conservar embriones hasta que receptoras asincrónicas
alcancen la sincronización adecuada.
Tabla 1: Resultados obtenidos con la transferencia no quirúrgica de embriones refrigerados.
Duración de la
refrigeración
Embriones
transferidos
Receptoras
preñadas
Autor/res
24h
19
9 (47)
REFSDAL y col. (1988)
48h
16
8 (50)
BEZUGLY y col. (1988)
hasta 72h
222*
98 (44)
LINDNER (1985)
*De 227 embriones refrigerados, 5 fueron descartados en la evaluación morfológica realizada antes de la
transferencia.
Congelación a -196ºC
Es la técnica de elección para conservar embriones in vitro. Se considera que los embriones pueden ser
mantenidos a -196ºC durante doscientos años o más, sin afectar sus viabilidad y sin causarles cambios
genéticos (SCHNEIDER y MAZUR, 1986). Este hecho, convierte a la congelación de embriones en una
herramienta insustituible para el comercio internacional de reproductores.
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El empleo de los embriones congelados, entre otras cosas, posibilita:
- Utilizar eficientemente donante y receptoras.
- Incorporar progreso genético a bajo costo, comparando los valores del
embrión y el de su transporte frente a los animales en pie.
- Transferir algunos embriones y conservar el resto hasta poder analizar los
registros de producción de la descendencia.
- Controlar enfermedades exóticas, reemplazando la importación de
animales en pie por la de embriones congelados libres de ellas.
- Conservar razas en vías de extinción.
- Crear bancos de germoplasma de valor pecuario
LEIBO (1989) resume la congelación de embriones en cuatro etapas fundamentales comunes a los
distintos métodos utilizados. Ellas son:
- Exposición de los embriones a agentes crioprotectores.
- Enfriamiento desde temperaturas fisiológicas hasta temperaturas lo
suficientemente bajas como para causar un virtual cese de todas las
reacciones químicas inducidas térmicamente.
- Calentamiento desde la temperatura de conservación (-196oC) a
temperaturas fisiológicas.
Si bien el resultado de la congelación depende fundamentalmente de la forma en que se llevan a cabo
estos procedimientos, está condicionado previamente por dos factores. Ellos son: la calidad del embrión
y el tiempo que transcurre desde la recolección hasta que comienza la congelación. Cuando se
congelan embriones de calidades muy buena y buena (grado I y II) se obtienen mejores resultados que
cuando se congelan aquellos de calidad regular (grado III) (KENNEDY y col., 1983; LEIBO, 1984;
HUMBLOT y col., 1987). Por su parte, los porcentajes de preñez resultantes de la transferencia de
embriones congelados son inversamente proporcionales al tiempo transcurrido desde la recolección
hasta el comienzo de la congelación (WRIGHT, 1985). La viabilidad embrionaria disminuye significativamente cuando dicho período es mayor de 3 h (PETIT, 1985).
Los embriones pueden ser conservados a -196oC utilizando el método de congelación standard, la
vitrificación o el método de congelación rápida. La principal diferencia que tiene el método de
congelación standard con respecto a los otros es que en él, el descenso de temperatura se efectúa de
manera controlada utilizando equipos programables (fotos 1 y 2). A continuación, se analiza más
detalladamente cada uno de estos métodos:
Método de congelación standard
Este método posibilitó a WILMUT y ROWSON (1973) obtener el primer ternero nacido de la
transferencia de un embrión congelado. Al método standard se le han efectuado desde entonces
distintas modificaciones tendientes a su simplificación (CABODEVILA y col., 1991). En la actualidad, los
embriones son congelados y descongelados de manera rápida. Esto hace necesario deshidratarlos
parcialmente antes de la congelación a fin de evitar la formación de cristales que lesionan los
blastómeros (MAZUR, 1977). La deshidratación parcial de los embriones se logra incorporando un
agente crioprotector al medio de congelación (SCHNEIDER y MAZUR, 1986).
En la congelación de embriones se utilizan dos tipos de crioprotectores:
1. Permeables: glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2 propanodiol, etanol y otros alcoholes.
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2. Impermeables: polivinilpirrolidona (PVP), sucrosa, glucosa, y otros azúcares.
El glicerol, en una concentración 1,4M (10%), es el más utilizado en la congelación de embriones
bovinos. La exposición de los embriones al medio de congelación (PBSS + glicerol) debe realizarse a la
temperatura del laboratorio (25o C), en un sólo paso, de 10 a 30 minutos de duración (CHUPIN y
PROCURER, 1984; NIEMANN, 1985). Este período incluye el envasado de los embriones,
generalmente en pajuelas plásticas.
Las pajuelas o pajillas de 0,25 ml constituyen el envase de elección porque tienen menor tamaño,
paredes más delgadas y menor volumen que las ampollas y los tubos. Estas propiedades permiten
realizar más rápidamente y con mayor precisión la inducción de la cristalización o "seeding". Es ésta,
una maniobra clave para evitar que la viabilidad embrionaria sea afectada durante la congelación
(MAURER, 1978). Pueden ser colocadas en el equipo de congelación a la temperatura a la que se
efectúa el seeding (aproximadamente -7o C). Es conveniente en este caso que transcurran cinco
minutos para que se equilibre la temperatura de las pajuelas con la del equipo de congelación. Algunos
equipos de congelación utilizan nitrógeno líquido como agente refrigerante. En otros más económicos,
el refrigerante es etanol u otro alcohol enfriado por medio de un compresor (foto 1). NIEMANN (1985)
efectuó un estudio comparativo entre ambos sistemas obteniendo porcentaje de preñez similar.
Foto 1: Equipo de congelación por medio de baño de alcohol
HAAKE Mess-Technik GmbH u. Co., Kalsruhe, Alemania
Una vez efectuado el seeding, se mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (período de
estabilización) y luego se la desciende a una velocidad que oscila entre 0,3 y 0,5o C hasta -30 ó -35o C.
En ese momento, las pajuelas pueden ser retiradas del equipo de congelación y sumergidas en
nitrógeno líquido (LEHN-JENSEN y GREVE, 1982). Se considera que entre -30 y -35º C se establece
un adecuado balance entre deshidratación y formación de hielo intracelular (NIEMANN, 1985). No
obstante ello, PETIT (1985) recomendó reducir la velocidad de congelación a 0,1 C/min entre -35 y 38ºC antes de retirar las pajuelas del equipo. WRIGHT (1985) por su parte, prefiere detener la
congelación a -30 ó -35º C y mantener la temperatura constante durante quince minutos antes de
sumergir las pajuelas en nitrógeno.
La descongelación se efectúa de manera rápida, sumergiendo las pajuelas en un baño María a 30-35º
C durante 20-30 segundos. RALL y MAYER (1989) informaron que exponiendo las pajuelas al aire a 20º
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C durante 10 segundos antes de colocarlas en el baño María, disminuye el número de embriones que
sufren rotura de la zona pelúcida.
La extracción del glicerol puede efectuarse luego de retirar el embrión de la pajuela o dentro de la
misma. En el primer caso, se la lleva a cabo en una sola etapa utilizando sucrosa o en forma
escalonada, empleando concentraciones decrecientes de glicerol o una mezcla de glicerol y sucrosa en
PBSS (HEATH, 1990). En la elección de una de estas opciones generalmente priva el criterio personal
dado que cada una de ellas tiene ventajas relativas. El embrión descongelado es evaluado
morfológicamente para eliminar aquellos con daños provocados por los procedimientos utilizados. Con
esta técnica de extracción del glicerol se obtienen porcentajes de preñez que generalmente superan el
50% (NIEMANN, 1985). LEIBO (1982) y RENARD y col. (1982) desarrollaron dos técnicas similares que
permiten extraer el glicerol dentro de la pajuela. Esta modificación es conocida como método "one step",
en realidad no se trata de un método distinto del standard sino de una modificación introducida en la
técnica de extracción del crioprotector.
Para utilizar esta técnica, es necesario envasar los embriones tal como se indica en la Figura 1.
embrión
Compartimiento
Superior
Medio
Inferior
Extracción del crio-protector fuera de la
pajuela
1,4 M glicerol
en PBSS
1,4 M glicerol
en PBSS
1,4 M glicerol en
PBSS
Extracción del crio-protector dentro de la
pajuela (LEIBO, 1982)
0,24 M
sucrosa en
PBSS
1,4 M glicerol
en PBSS
0,25 M sucrosa
en PBSS
Extracción del crioprotector dentro de la
pajuela (RENARD, 1982)
Medio B2 de
Menezo
1,4 glicerol en
PBSS
0,25 M sucrosa
en PBSS
Figura 1: Disposición de las distintas soluciones en la pajuela, según la técnica de extracción del
crioprotector utilizada
Una vez efectuada la descongelación, la pajuela debe ser agitada vigorosamente para desplazar el aire
hacia los extremos y permitir que las soluciones se mezclen. La solución de sucrosa isoosmolar con el
medio de congelación, provoca que el glicerol salga del embrión. Esta técnica permite transferir
embriones congelados a campo sin necesidad de equipos y laboratorios costosos (MUNAR y col.,
1988). Se obtienen tasas de preñez que oscilan entre el 30 y el 50% (NIEMANN, 1985). Al prescindirse
de la evaluación morfológica, es lógico que los porcentajes de preñez resulten inferiores a los que se
obtienen con el método standard convencional.
El medio B2 de Menezo es más nutritivo que el PBSS. RENARD y col. (1982, 1983) lo utilizan para
extraer algún resto de glicerol que pudiese haber quedado en el embrión, una vez que este se
encuentra en el útero de la receptora. A pesar de que las diferencias no fueron significativas, CHUPIN y
col. (1984) obtuvieron con esta técnica un mayor porcentaje de preñez que con la propuesta por LEIBO.
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Cuando el glicerol es extraído dentro de la pajuela, la viabilidad embrionaria puede ser afectada si no se
logra mezclar homogéneamente las distintas soluciones (NIEMANN, 1985). Para evitar tener que
realizar esta maniobra, MASSIP y col. (1987) utilizaron como medio de congelación una solución mixta
de glicerol y sucrosa en PBSS. A pesar de haberse obtenido porcentajes de preñez aceptables, esta
técnica no ha alcanzado difusión aún.
Protocolo de congelación y descongelación (según Niemann)
Congelación
1. Preparar la solución de glicerol (1,4 M), colocar 3-4 ml de la solución, esterilizada por medio de
filtración, en una placa de Petri pequeña (35 mm) y conducir a la misma temperatura de los
embriones.
2. Los embriones deben ser clasificados estrictamente y lavados por lo menos 5 veces (para la
exportación 10 veces) y finalmente en una solución de tripsina 0,25%.
3. Los embriones son colocados a posteriori directamente en la solución 1,4 molar de glicerol. Se deja
un tiempo de equilibración de 20' aproximada-mente sobre una platina térmica.
4. Durante ese tiempo identificar las pajuelas con marcador indeleble.
5. Cargado de los embriones en las pajuelas con la solución de glicerol.
6. Conducir las pajuelas al baño de alcohol a -5 C. Esperar 1-2 minutos. Efectuar luego el seeding e
iniciar el programa de congelación a una velocidad de 0,5 C/min hasta -35 C.
7. Colocar las pajuelas en el contenedor con nitrógeno líquido.
Descongelación
1. Mezclar partes iguales (p.e. 2 ml + 2 ml) de las soluciones de glicerol (1,4 M) y sucrosa (1,4 M). De
ello resulta una concentración de 0,7 M de ambas soluciones. Esterilizar por medio de filtración y
conducir a temperatura ambiente.
2. Preparar una solución de sucrosa 0,7 M.
3. Preparar una solución de cultivo con 1% de BSA.
4. Descongelación de las pajuelas a temperatura ambiente (demora aprox. 60-90 segundos).
5. Secar la pajuela, separar el stick y colocar el embrión, con ayuda de una jeringa de tuberculina con
unión de goma, en la solución de glicerina y sucrosa (0,7 M).
6. Esperar 5 min y colocar los embriones en la solución de cultivo durante 10 min para su reexpansión.
7. Evaluación morfológica, colocación en el catéter de transferencia y transfe-rencia a una receptora.
Sustancias necesarias: PBS + antibióticos (p.e. gentaminicina 80mg/l) y 1% BSA.
Glicerol para análisis, puro (98-100%) libre de agua.
Sucrosa para análisis
Albúmina bovina (BSA), fracción V (96-99% de albúmina)
Vitrificación
Es un proceso físico de solidificación utilizado para conservar órganos y tejidos y más recientemente
embriones (FAHY y col., 1984; RALL y FAHY, 1985).
El medio de vitrificación lleva incorporado crioprotectores en alta concentración. Al ser enfriado no
cristaliza sino que se torna viscoso y pasa del estado líquido a un estado sólido no estructurado similar
a un vidrio, de ahí toma este método la denominación de vitrificación.
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La solución de vitrificación debe tener alta concentración de uno o más crioprotectores permeables.
Para vitrificar embriones bovinos, se ha utilizado una solución mixta de glicerol y 1-2 propanodiol en
PBSS. La elección del 1-2 propanodiol se debió fundamentalmente a que es estable y a que tiene poca
tendencia a cristalizar durante el enfriamiento (BOUTRON y KAUFMANN, 1979).
En primera instancia, los embriones son expuestos al medio de vitrificación intracelular (10% glicerol +
20% 1-2 propanodiol) durante 10 minutos. Luego, se los envasa en el medio de vitrificación extracelular
(25% glicerol + 25% 1-2 propanodiol). Si la pajuela se completa con una solución 1M de sucrosa en
PBSS, posibilita transferir los embriones a campo de manera similar a lo que ocurre en el denominado
método one step. Inmediatamente después de cerrada, la pajuela debe ser introducida lenta y
progresivamente en el nitrógeno para que se produzca simultáneamente la vitrificación de los
compartimientos extra e intracelular.
Utilizando las soluciones anteriormente descriptas, se han vitrificado con éxito mórulas, obteniéndose
porcentajes de preñez de alrededor del 50% (MASSIP y col. 1987; DOUCHI y col., 1990). Para vitrificar
blastocistos y obtener un porcentaje aceptable de supervivencia fue necesario agregar sucrosa al medio
de vitrificación (VAN DER ZWALMEN y col., 1989).
Recientemente, KASAI y col. (1990) han utilizado un medio de vitrificación que lleva incorporado ficoll
en su formulación. Este medio es menos tóxico que el anterior, si se repiten en otras especies los
resultados obtenidos con embriones de ratón, su aplicación resultará de sumo interés.
Método de congelación rápida
Este método fue desarrollado por CHUPIN en el año 1986. A diferencia de lo que ocurre en la
vitrificación, en la congelación rápida se produce la cristalización del agua intra- y extracelular.
Los embriones son deshidratados parcialmente tal cual ocurre en el método standard. Luego, se los
deshidrata nuevamente colocándolos en una solución mixta de glicerol y sucrosa en PBSS. Esta
segunda deshidratación, deja a los embriones en condiciones de ser enfriados rápidamente.
Las pajuelas son colocadas en el cuello del contenedor de nitrógeno líquido. Existe un lugar óptimo para
colocar la pajuela según el nivel de nitrógeno existente en el contenedor, para que la cristalización
ocurra espontáneamente sin producirse la elevación de temperatura relacionada con el cambio de fase.
Las pajuelas, luego de permanecer cinco minutos en el cuello del termo, son sumergidas en el
nitrógeno.
El método de congelación rápida ha sido utilizado con éxito para congelar embriones de animales de
laboratorio (TAKAHASHIA y KANAGAWA, 1990; ZUH y col., 1990). En bovinos, se lo ha evaluado
únicamente cultivando los embriones descongelados in vitro, los resultados obtenidos fueron dispares
según el estadio de desarrollo del embrión congelado (CHUPIN, 1986). Para unificar los resultados, fue
necesario modificar el tiempo de exposición a la segunda solución deshidratante o variar la temperatura
a la que ésta ocurría (CHUPIN, 1987).
Conclusiones
Cuando se hace la evaluación morfológica, puede ocurrir que sea difícil definir si algunos embriones son
o no transferibles. En ese caso, puede resultar útil cultivarlos por algunas horas para observar su
evolución. Es ésta, la única aplicación práctica que tiene el cultivo en los programas de TE que se
desarrollan en la actualidad.
En algunos países, se han montado recientemente centros de producción de embriones en gran escala,
utilizando la fecundación in vitro (GORDON, 1990). El desarrollo de esta técnica, fue acompañado por el
de sistemas de cultivo que permiten que el embrión producido por esta vía alcance los estadios de
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mórula o blastocisto in vitro. De esta manera, es posible transferirlos utilizando el método no quirúrgico,
que resulta simple y práctico, ver capítulo XI.
Teniendo en cuenta que en los centros de TE es difícil poder alojar el lote de receptoras, la refrigeración
puede resultar útil para transportar los embriones hasta donde éstas se encuentren, especialmente si se
trata de lugares distantes.
Antes de refrigerar embriones hasta que receptoras asincrónicas alcancen el sincronismo óptimo, será
necesario comparar la pérdida de viabilidad que ocasiona
la transferencia asincrónica con respecto a la que causa la refrigeración.
Los embriones bovinos, en los estadios de mórula y blastocisto, son congelados exitosamente utilizando
el método standard obteniéndose un porcentaje de preñez promedio del 50%. La vitrificación y el
método de congelación rápida no han alcanzado aún un grado de desarrollo que permita utilizarlos en
programas comerciales de transferencia de embriones.
El advenimiento de técnicas tales como: la producción in vitro, el clonado y el diagnóstico del sexo de
embriones, la transferencia de genes, etc., hace necesario centralizar esfuerzos para lograr la
congelación de estadios tempranos de desarrollo como así también de embriones micromanipulados,
con un éxito similar al obtenido con las mórulas y los blastocistos.
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